Materiali in metode - Sheme in modeli prvih načrtovanih struktur iz ovitih vijačnic. S

Slika 2: Sheme in modeli prvih načrtovanih struktur iz ovitih vijačnic. S spreminjanjem zaporedja in načina vezave ovitih vijačnic so raziskovalci načrtovali in

2. Materiali in metode

Zaporedja peptidnih segmentov v proteinih in aminokislinska 2.1.

zaporedja

Aminokislinska zaporedja proteinov s predstavljenimi domenami 2.1.1.

fluorescenčnih proteinov GFP (G) ali RFP (R)

Ime konstrukta: TET12SN-GFP

15 Ime konstrukta: TET12SN-RRRR

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-RFP-APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-RFP-P5SN-P8SN-RFP-BCRSN-P6SN-RFP

Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGMASSED VIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWD ILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSL QDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKMRL KLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERRH STGAGSGLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGS PEDEIQQLEEKNSQLKQEISQLEEKNQELKYGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLEN EVERLKKLVGSGPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQLEEENSQLEYGSGMASSE DVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAW DILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDS SLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKM RLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYER RHSTGAGSGSPEDENSQLEEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGSPEDKISEL KEENQQLEQKIQQLKEENSQLEYGSGMASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEF EIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPD YLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGP VMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAK KPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERRHSTGAGSGDIEQELERAKESIR RLEQEVNQERSRMQYLQTLLEKGSGPGSPEDKNSELKEEIQQLEEENQQLEEKI SELKYGSGMASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAK LKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMN FEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERM YPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITS HNEDYTIVEQYERRHSTGAGSGLEHHHHHHHH

Aminokislinska zaporedja proteinov z vključenimi domenami 2.1.2.

SpyCatcher (Sc)/, TET12SN-SpyTag (St) in fluorescenčnimi domenami GFP (G) ali RFP (R)

Ime konstrukta: TET12SN-3xScG

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-Sc-APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-Sc-P5SN-P8SN-Sc-BCRSN-P6SN-GFP

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-Sc(v2)-APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-Sc(v2)-P5SN-P8SN-Sc(v2)-BCRSN-P6SN-GFP

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-Sc(v3)-APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-P5SN-P8SN-GFP-BCRSN-P6SN-GFP

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-Sc(v3)-APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-Sc(v3)-P5SN-P8SN-GFP-BCRSN-P6SN-GFP Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-Sc(v3)-APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-Sc(v3)-P5SN-P8SN-Sc(v3)-BCRSN-P6SN-GFP

19 Ime konstrukta: TET12SN-I-StR

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-St-APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-P5SN-P8SN-BCRSN-P6SN-RFP

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-St-P5SN-P8SN-BCRSN-P6SN-RFP

20 Ime konstrukta: TET12SN-III-StR

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-P5SN-P8SN-St-BCRSN-P6SN-RFP

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-St-APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-St-P5SN-P8SN-BCRSN-P6SN-RFP

21 Ime konstrukta: TET12SN-II,III-2xStR

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-St-P5SN-P8SN-St-BCRSN-P6SN-RFP

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-St-APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-St-P5SN-P8SN-St-BCRSN-P6SN-RFP

22 Ime konstrukta: Sc(v3)-GFP

Zaporedje peptidnih segmentov: Sc(v3)-GFP Aminokislinsko zaporedje:

MDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKY TFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGSGMSKGEELFTGVVPILVELDG DVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLGYGVQCFSR YPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELK GIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLAD HYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGM DELYKGSGSAWSHPQFEK

Ime konstrukta: St-RFP

Zaporedje peptidnih segmentov: St-RFP Aminokislinsko zaporedje:

MAHIVMVDAYKPTKGSGMASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEG RPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPE GFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTM GWEASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGA YKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERRHSTGAGSGSAWSHPQFEK

Aminokislinska zaporedja nove serije proteinov TET12SN z 2.1.3.

vključenimi domenami fluorescenčnih proteinov (TET12SN-new)

Ime konstrukta: TET12SN-new-GGGG

WDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQD SSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIK MRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQY ERRHSTGAGSGSPEDEIQQLEEKNSQLKQEISQLEEKNQELKYGSGPGQLEDKV EELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQLEEENS QLEYGSGMASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKL KVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNF EDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMY PEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSH NEDYTIVEQYERRHSTGAGSGSPEDENSQLEEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGS GPGSPEDKISELKEENQQLEQKIQQLKEENSQLEYGSGMASSEDVIKEFMRFKV RMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSK AYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVK LRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYD AEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERRHSTGAGSGDIE QELERAKESIRRLEQEVNQERSRMQYLQTLLEKGSGPGSPEDKNSELKEEIQQL EEENQQLEEKISELKYLEHHHHHHHH

Aminokislinska zaporedja proteinov s ponovljenimi segmenti 2.1.4.

Ime konstrukta¹⁵: TET12SN

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-P5SN-P8SN-BCRSN-P6SN

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P5SN-BCRSN-P3SN-APHshSN-P7SN-P4SN-P6SN-P5SN-P8SN-BCRSN-P6SN

Para P3SN:P4SN in P5SN:P6SN uporabljena dvakrat

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P5SN-BCRSN-P3SN-APHshSN-P3SN-P4SN-P6SN-P5SN-P4SN-BCRSN-P6SN

Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDENS QLEEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS

Pari APHshSN:APHshSN, P3SN:P4SN in P5SN:P6SN uporabljeni dvakrat

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P5SN-APHshSN-P3SN-APHshSN-P3SN-P4SN-P6SN-P5SN-P4SN-APHshSN-P6SN

Par P5SN:P6SN uporabljen trikrat v optimalni topologiji

Zaporedje peptidnih segmentov: P3SN-P6SN-P5SN-APHshSN-P5SN-BCRSN-P4SN-APHshSN-P6SN-BCRSN-P6SN-P5SN

31 Ime konstrukta: TET12SN(3CC)-neg

Par P5SN:P6SN uporabljen trikrat v najmanj optimalni topologiji

Zaporedje peptidnih segmentov: P5SN-P6SN-P6SN-APHshSN-P5SN-BCRSN-P6SN-APHshSN-P3SN-BCRSN-P5SN-P4SN

Aminokislinsko zaporedje:

MSPEDENSQLEEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGSPEDKNSELKEEIQQLE EENQQLEEKISELKYGSGPGSPEDKNSELKEEIQQLEEENQQLEEKISELKYGSG PGLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEN SQLEEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGPGSPEDKNSELKEEIQQLEEENQQLEEKISELKYGSGPGLE EELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQQLEE EISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERSRMQ YLQTLLEKGSGPGSPEDENSQLEEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGSPEDK ISQLKEKIQQLKQENQQLEEENSQLEYGLEHHHHHHHH

Aminokislinska zaporedja nove serije proteinov TET12SN(22CC) z 2.1.5.

vključenimi domenami fluorescenčnih proteinov (TET22CC-new)

Ime konstrukta: TET22CC-new-GGGR

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-GFP-P5SN-BCRSN-P3SN-APHshSN-GFP-P3SN-P4SN-P6SN-GFP-P5SN-P4SN-RFP-BCRSN-P6SN

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-GFP-P5SN-BCRSN-P3SN-APHshSN-GFP-P3SN-P4SN-P6SN-RFP-P5SN-P4SN-RFP-BCRSN-P6SN

LPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVT VTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALK GEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIV EQYERRHSTGAGSGSPEDEIQQLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGSPED KISQLKEKIQQLKQENQQLEEENSQLEYGSGPGSPEDKNSELKEEIQQLEEENQQ LEEKISELKYGSGMASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGT QTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWE RVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEAS TERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIK LDITSHNEDYTIVEQYERRHSTGAGSGSPEDENSQLEEKISQLKQKNSELKEEIQ QLEYGSGPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQLEEENSQLEYGSGMASSEDVIKEF MRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQ FQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGE FIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKD GGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERRHSTGA GSGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERSRMQYLQTLLEKGSGPGSPEDKNSELK EEIQQLEEENQQLEEKISELKYGLEHHHHHHHH

37 Bakterijski sevi

2.2.

Pri molekulskem kloniranju smo uporabljali dva seva bakterije Escherichia coli: DH5a (F^– φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rK–, mK+) phoA supE44 λ^– thi-1 gyrA96 relA1) (NEB) in Top10 (F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZΔM15 Δ lacX74 recA1 araD139 Δ(araleu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG). Za namen produkcije proteinov so bile produkcijske kulture pripravljene iz E.coli, sev Nico (can: : CBD fhuA2 [lon] ompT gal (λ DE3) [dcm] arnA: : CBD slyD: : CBD glmS6Ala ∆hsdS λ DE3 = λ sBamHIo ∆EcoRI-B int: : (lacI: : PlacUV5: : T7 gene1) i21 ∆nin5) (NEB).

Metode molekulskega kloniranja 2.3.

Konstrukti so bili pripravljeni s kombiniranjem treh metod molekulskega kloniranja: (I) z metodo lepljenja po Gibsonu (angl. Gibson assembly⁶¹), (ii) z uporabo klasičnih metod kloniranja in (iii) kombinatorno sintezo genov z uporabo restrikcijskih encimov tipa IIS (angl. Golden Gate assembly)^62,63. V kolikor načrtovanega genskega konstrukta ni bilo moč sklonirati ali pa bi bil postopek prezahteven, smo načrtovane genske konstrukte naročili kot sintetične gene (Twist Bioscience, GeneWiz, Gene9) ali kot gblock (IDT, Macrogen). Uspešnost molekulskega kloniranja smo preverjali z verižno polimerazno reakcijo na osnovi kolonij (angl. colony PCR). Ustreznost sekvence smo potrdili s sekvenciranjem (Twist, GeneWiz, Macrogen).

Lepljenje po Gibsonu 2.3.1.

Začetni oligonukleotidi so bili načrtovani na način, da smo s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (angl. polymerase chain reaction ali PCR) pridobili vsaj 20 baznih parov homologije med fragmenti DNA. PCR pomnožke smo preverili in očistili z agarozno gelsko elektroforezo in izolirali DNA fragmente ustrezne velikosti (FastGeneGel/PCR Extraction Kit, Nippon Genetic). Vektor akceptor je bil pripravljen s klasičnimi metodami kloniranja. V vnaprej pripravljeni reakcijski mešanici za lepljenje po Gibsonu smo v ustreznem razmerju združili ustrezne DNA fragmente in inkubirali pri temperaturi 50 °C. Čas inkubacije je bil odvisen od dolžine in števila DNA fragmentov.

Reakcijo smo nato prekinili z ohlajanjem na ledu in plazmide transformirali v E.coli TOP10 ali DH5a.

38 Standardne metode kloniranja 2.3.2.

DNA fragmente, pomnožene s PCR ali v bakterijah, smo rezali z ustreznimi restrikcijskimi encimi pod optimalnimi pogoji. DNA fragmente ustrezne velikosti smo izolirali iz DNA agarozne elektroforeze (Spin Miniprep Kit (QIAGEN)) ter jih ligirali z ligazo T4 (NEB/Thermo Scientific). Po 15-minutni inkubaciji na sobni temperaturi smo reakcijo ohladili na ledu, ji dodali enak volumen vode ter izvedli transformacijo z DH5a ali TOP10.

Kombinatorna sinteza genov z uporabo restrikcijskih encimov tipa 2.3.3.

IIS

Pred začetkom kombinatorne sinteze genov z uporabo restrikcijskih encimov tipa IIS (GGA) smo z uporabo ene izmed treh opisanih tehnik pripravili osnovne gradnike.

Osnovni gradniki so bili dveh tipov: (i) samo ovita vijačnica ali (ii) dve oviti vijačnici z vstavljeno proteinsko domeno. Vsem osnovnim gradnikom so bili skupni trije elementi:

(i) levi linker za Golden Gate (restrikcijsko mesto za NheI, BsaI, Golden Gate linker);

(ii) nukleotidni zapis za ovito vijačnico ali za dve oviti vijačnici z vstavljeno proteinsko domeno; (iii) desni linker Golden Gate (Golden Gate povezovalec, restrikcijsko mesto za BsaI, AvrII).

V ustreznem razmerju smo zmešali vse potrebne osnovne gradnike in akceptorski vektor (modificiran vektor pET41a+) ter dodali potrebne encime (BsaI-HF, DNA ligaza T4 (NEB) in DNA ligacijski pufer T4 (NEB)). Reakcija je potekala 25 ciklov (37 °C 5 min, 16 °C 10 min), čemur je sledila končna inaktivacija ligaze (37 °C 40 min) in BsaI-HF (75 °C 4 min). Vektorje smo nato transformirali v celice DH5a ali TOP10.

Transformacija, PCR na osnovi kolonije in sekvenciranje 2.3.4.

Transformacijo za namene molekulskega kloniranja smo izvajali po standardnem postopku: po dodatku DNA k 200 µL odmrznjenih kompetentnih celic smo le-te 25 minut inkubirali na ledu. Po 2-minutnem temperaturnem šoku na 42 °C smo reakcijsko zmes ohladili na ledu in dodali 800 µL tekočega LB gojišča (Sigma-Aldrich) ter celice inkubirali 50 min na 37 °C. Celice smo nanesli na trdna LB gojišča z ustreznim antibiotikom (kanamicin 50 µg/mL ali ampicilin 50 µg/mL). Po prekonočni inkubaciji na 37 °C smo izvedli PCR na osnovi kolonije (DreamTaq PCR Master Mix, Thermo Scientific) ter s kapilarno elektroforezo (QIAxcel Advanced sistem za kapilarno elektroforezo, QIAGEN) preverili velikost fragmentov. PCR pomnožke, ki so ustrezali

pričakovani velikosti, smo naknadno preverili s kontrolno restrikcijo: 10 uL PCR mešanici na osnovi bakterijske kolonije smo dodali 2 µL ustreznega restrikcijskega pufra in 0,25 µL ustreznega restrikcijskega encima. Sledili sta 30-minutna inkubacija na ustrezni temperaturi in analiza z agarozno gelsko elektroforezo. Bakterijske kolonije, katerih nerezani in rezani PCR pomnožki so ustrezali pričakovani velikosti, smo nacepili v tekoče LB gojišče (Sigma-Aldrich), dodali ustrezen antibiotik in naslednji dan izolirali DNA (GeneJet Plasmid Miniprep Kit, Thermo Scientific) ter pravilnost DNA sekvence potrdili s sekvenciranjem (GATC Biotech, GeneWiz, Macrogen).

Za namen produkcije proteinov je bil postopek transformacije skrajšan – odmrznjenim kompetentnim celicam NiCo21(DE3) smo dodali vektor in zmes 10 min inkubirali na ledu. Po 2-minutnem temperaturnem šoku pri 42 °C smo celice ohladili na ledu ter jim dodali 800 µL tekočega gojišča. Po 20-minutni inkubaciji na 37 °C smo celice centrifugirali ter jih nanesli na trdno LB gojišče z ustreznim antibiotikom.

Fermentacija in izolacija proteinov 2.4.

Izražanje proteinov 2.4.1.

Za proizvodnjo proteinov smo uporabljali celice E.coli NiCo21(DE3). Za inokulum smo 100 mL tekočega LB gojišča z dodanim kanamicinom (50 µg/mL) preko noči stresali v stresalniku pri 160 vrt./min pri temperaturi 37 °C. Inokulum smo pripravili tako, da smo prekonočno kulturo s tekočim LB medijem redčili do OD600 0,1. Kulture so rastle na 37

°C pri 160 vrt./min, dokler niso dosegle OD600 med 0,6 do 0,8, čemur je z dodatkom 0,5 mM IPTG sledila indukcija izražanja proteinov pri znižani temperaturi 30 °C. Po štirih urah smo celice zbrali s centrifugiranjem (5500 obratov na min, 10 °C) in jih shranili na -80 °C.

Liza celičnega peleta 2.4.2.

Pelet celic, zbran iz treh litrov kulture, smo resuspendirali v 35 mL hladnega liznega pufra (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol, 0,5 µL benzonaze (Merck, Nemčija) in 80 µL mešanice inhibitorjev proteaz brez EDTA (Sigma-Aldrich)). Celice smo lizirali s soniciranjem (sonikator Vibra-cell VCX, Sonics) s 4-8 cikli (1 min efektivnega časa soniciranja na cikel; 1 s ON, 3 s OFF, 55 % amplituda) oz. dokler se lizat ni zbistril. Lizat smo 20 min centrifugirali pri 16000 vrt./min in temperaturi 4 °C in tako ločili topno frakcijo od netopne. Topno frakcijo smo dodatno filtrirali skozi 0,45 µm filter (Sartorius Stedim, Nemčija) in jo tako pripravili za nadaljnji korak.

40 Afinitetna NiNTA-kromatografija 2.4.1.

Na gravitacijsko kolono smo nanesli 7 mL NiNTA polnila (Goldbio). Nanešeno polnilo smo ekvilibrirali z NiNTA-pufrom A (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol) in dodali filtrirano topno frakcijo bakterijskega lizata. Sledilo je spiranje z NiNTA- pufrom A in NiNTA-pufrom B (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 20 mM imidazol), dokler ni vsakič A280 nm padla pod 0,1. Elucijo vezane frakcije smo izvedli z NiNTA- elucijskim pufrom (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 250 mM imidazol).

Strep-trap tekočinska kromatografija za hitro ločevanje proteinov 2.4.2.

V kolikor je bil potreben korak dodatnega afinitetnega ločevanja, smo vzorec po NiNTA- gravitacijski kromatografiji (v primeru dvojno označenih proteinov) ali topno frakcijo celičnega lizata nanesli na Strep-trap kolone (4x 5mL Strep-trap, GE Healthcare), ekvilibrirane s Strep-pufrom A (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA). Po nanosu vzorca in spiranju nevezane frakcije iz kolone smo vezano frakcijo eluirali s Strep- elucijskim pufrom (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2'5 mM D-desthibiotin (Sigma-Aldrich)). Ustrezne zbrane frakcije smo združili in pripravili za naslednji korak. Vse korake tekočinske kromatografije Strep-trap smo izvedli na AktaPURE sistemu (GE Healthcare).

Gelska filtracija 2.4.3.

Kromatografske kolone dimenzij 16/600 XK ali 26/600 XK (GE Healthcare) so bile napolnjene s polnilom HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) in ekvilibrirane s SEC- pufrom (20 mM Tris pH 7'5, 150 mM NaCl, 10 % (V/V) glicerol) po navodilih proizvajalca. Predhodno očiščene vzorce smo po filtraciji (0,22 µm filter (Millex, Sigma-Aldrich)) nanesli na kolono in zbirali frakcije v ustreznih volumnih ob pričakovanem elucijskem času. Ustrezne frakcije smo združili in jih koncentrirali s centrifugalnimi koncentratorji s porami ustrezne velikosti glede na izoliran protein (Millipore, Merck). Tako pripravljene vzorce smo zamrznili v tekočem dušiku in jih shranili na temperaturi -80 °C.

Karakterizacija proteinov 2.5.

Proteini so bili do analize shranjeni na -80 °C. Pred analizo smo jih čim hitreje odmrznili pod tekočo vodo, jih filtrirali skozi 0,1 μm centrifugacijski filter (Millipore, Merck) ter do uporabe hranili na ledu ali na +4 °C. Koncentracije proteinov smo

določili spektrofotometrično z uporabo ekstinkcijskega koeficienta, ocenjenega z orodjem ProtParam⁶⁴.

NaDS-PAGE 2.5.1.

Analizo NaDS-PAGE smo opravili z Bio-Rad mini-PROTEAN kadičko in 8-12 % poliakrialmidnimi geli pri konstantni napetosti 200 V. Proteine smo detektirali z uporabo InstantBlue (Abcam) po navodilih proizvajalca.

Nativna-PAGE 2.5.2.

Nativno-PAGE smo opravili z Bio-Rad mini-PROTEAN kadičko in 8 % poliakrilamidnimi geli pri konstantni napetosti 80 V. Celoten poskus je bil izveden ali na ledu ali pa v hladilniku pri +4 °C.

Analitska gelska filtracija 2.5.3.

Analitsko gelsko filtracijo smo izvedli na HPLC sistemu (Waters), sklopljenem z UV-detektorjem (Waters) ter z UV-detektorjema Dawn8+ MALS (Wyatt) in RI (Shodex).

Vzorce smo filtrirali skozi 0,1 μm centrifugirne filtre (Millipore, Merck) in jih injicirali na kromatografsko kolono Superdex 200 Increase 10/300 (GE Healthcare), ki je bila predhodno ekvilibrirana z modificiranim SEC-pufrom (20 mM Tris pH 7'5, 150 mM NaCl).

Spektroskopija cirkularnega dikroizma 2.5.4.

Spektre cirkularnega dikroizma smo pomerili na Chirascan CD spektrometru, opremljenim s Peltier temperaturnim blokom (Applied Photopysics, UK). Tako za meritve spektra kot temperaturno denaturacijo smo pripravili proteine v koncentraciji od 0,25 do 0,35 mg/mL ter izvedli meritve v 1 mm kvarčnih kivetah (Hellma, Nemčija). Za temperaturno denaturacijo smo spreminjali temperaturo v območju od 5 °C do 95 °C s hitrostjo segrevanja 1 °C/min, čemur je sledilo hitro ohlajanje. Povprečno molarno eliptičnost za aminokislinski ostanek (angl. mean residue ellipticity, MRE) smo izračunali z uporabo enačbe:

𝑀𝑅𝐸 =

𝐿 × 𝑁 × 𝑐 × 10^𝑚^𝑜 (Enačba 1)

kjer je m^o pomerjena vrednost pri izbrani valovni dolžini, L dolžina optične poti skozi vzorec, N število aminokislin v eni molekuli proteina in c molarna koncentracija

proteina. Modelne funkcije krivulj prehoda smo izračunali kot ravnotežno reakcijo dveh stanj. Za izračun temperature prehoda heterodimernih ovitih vijačnic smo predpostavili AB ↔ A + B, za homodimerne pa A2 ↔ 2A. Temperaturo prehoda med zvitim in razvitim stanjem smo prav tako analizirali kot ravnotežno reakcijo Z ↔ R, kjer Z predstavlja protein v zvitem stanju in R v razvitem⁶⁵.

Konjugacija proteinov 2.5.5.

Proteine smo konjugirali s fluorescenčnima oznakama Sulfo-cy3 in Sulfo-cy5 (Lumiprobe) preko tiol-melamidne reakcije. Fluorescenčni oznaki cy3 in Sulfo-cy5 smo raztopili v DMSO ter ju smo zmešali med seboj v razmerju 1 : 1. Pripravili smo 1 mL proteina koncentracije 1 mg/mL v modificiranem SEC-pufru (20 mM Tris pH 7'5, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP) in dodali petkratni molarni presežek vsake fluorescenčne značke. Po prekonočni inkubaciji na +4 °C smo konjugiran protein ločili od prostega barvila s PD-10 kromatografskimi kolonami (GE Healthcare).

Meritve FRET na spektrofotometru z ustavljenim pretokom 2.5.6.

1 mL s fluorescenčno oznako označenimi proteinskimi kletkami smo dodali 478 mg gvanidin- hidroklorida (Gdn-HCl) in tako dosegli končno koncentracijo Gdn-HCl ~5 M.

Po enourni inkubaciji na sobni temperaturi smo FRET meritve izvedli na MOS-200 spektrometru z enoto za ustavljen pretok SFM-3000 (BioLogic, Francija). Vzorce smo s hitrim mešanjem redčili s pufrom (20 mM Tris pH 7'5, 150 mM NaCl) v razmerju 1 : 4 ter spremljali FRET signal z detektorjem, zasukanim za 90° glede na ekscitacijsko svetlobo. Podatki so bili analizirani z uporabo Python paketa Imfit.

Modeliranje 2.5.7.

In silico modeliranje smo izvedli z uporabo programa Modeller^66,67. Modeli so bili pripravljeni po načelu homologije že poznanih stuktur. Za vsako strukturo smo generirali 500 modelov, pri katerih so izhodiščne referenčne strukture ustrezale pričakovani orientaciji v končnem modelu, in 500 modelov, pri katerih so bile izhodiščne referenčne strukture zavrtene in naključno premaknjene v prostoru.

Sipanje rentgenskih žarkov pri nizkih kotih 2.5.8.

Profili sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih so bili pomerjeni na sinhrotronu PETRA-III (DESY, Nemčija) ali na sinhrotronu ALS (Berkeley lab, ZDA). Za vzorce, pomerjene v saržnem načinu na P12 (PETRA-III sinhrotron, DESY, Nemčija), smo za vsako redčitev pomerili vsaj 20 ekspozicij, vsako po 0,05 s. Krivulje sipanja, kjer

vzorec še ni bil poškodovan s sevanjem, smo povprečili in le-te uporabili za nadaljnje analize. Vzorce, pomerjene s sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih, sklopljeno z gelsko filtracijo, smo pomerili na P12, PETRA-III sinhrotronu ali na ALS (Berkeley lab). V vseh primerih smo uporabili kromatografsko kolono Superdex 200 Increase 10/300, predhodno ekvalibrirano z modificiranim SEC-pufrom (20 mM Tris pH 7'5, 150 mM NaCl, 3 % (V/V) glicerola) in pretokom 0,5 mL/min. Krivulje sipanja, ki so ustrezale vzorcu, smo povprečili in uporabili za nadaljnje analize. Krivulje sipanja smo analizirali z uporabo programskega paketa ATSAS⁶⁸, teoretične krivulje modelov pa smo izračunali in primerjali s programom PEPSI-SAXS⁶⁹.

Krio-elektronska mikroskopija 2.5.9.

3 uL vzorca smo nanesli na mrežice 200-mesh Quantifoil R1.2/1.3 (Spi supplies), ki so bile razžarčene (GloQube, Quorumtech) in hitro zamrznjene v tekočem etanu z Vitrobotom Mark IV (Thermo Fischer Scientific). Mrežice smo analizirali s krio elektronskim mikroskopom Glacios ThermoFisher (Thermo Scientific), s paralelnim žarkom pri 200 kV in vzorcem pri temperaturi tekočega dušika. Slike smo zbrali z detektorjem Falcon 3EC (DED, Thermo Scientific). Zbrane slike smo analizirali s programskim paketom Cryosparc.

3. Rezultati

Za predstavitev proteinskih domen na ogliščih proteinskega origamija obstaja več načinov – (i) preko tvorbe ovitih vijačnic dveh ločenih podenot (Slika 4, A), (ii) preko tvorbe vezi med cisteini dveh proteinov ali z uporabo klik kemije (Slika 4, B) in (iii) direktna genetska fuzija (Slika 4, C). Tekom doktorske naloge smo se osredotočili na predstavitev proteinskih domen na ogliščih proteinskega origamija preko genetske fuzije, saj le-ta omogoča stabilno ter od pogojev in koncentracije neodvisno predstavitev proteinskih domen. Poleg tega omenjeni sistem omogoča tudi neodvisne modifikacije posameznih oglišč, kar pomeni, da lahko natančneje kontroliramo število predstavljenih proteinskih domen ter razdalje med njimi.

Slika 4: Strategije predstavitve fluorescenčnih proteinov na ogliščih nanokletke v

In document PREDSTAVITEV PROTEINSKIH DOMEN NA OGRODJU PROTEINSKEGA ORIGAMIJA IZ OVITIH VIJAČNIC V OBLIKI TETRAEDRA (Strani 39-70)