PREDSTAVITEV PROTEINSKIH DOMEN NA OGRODJU PROTEINSKEGA ORIGAMIJA IZ OVITIH VIJAČNIC V OBLIKI TETRAEDRA

MEDICINSKA FAKULTETA

Žiga STRMŠEK

DOKTORSKA DISERTACIJA

PREDSTAVITEV PROTEINSKIH DOMEN NA OGRODJU PROTEINSKEGA ORIGAMIJA IZ OVITIH

VIJAČNIC V OBLIKI TETRAEDRA

Ljubljana, 2021

Interdisciplinarni doktorski študijski program Biomedicina Znanstveno področje Biokemija in molekularna biologija

Predstavitev proteinskih domen na ogrodju proteinskega origamija iz ovitih vijačnic v obliki tetraedra

DOKTORSKA DISERTACIJA

Presentation of protein domains on the scaffold of coiled- coil protein origami tetrahedron

DOCTORAL DISSERTATION

Žiga Strmšek

MENTORICA dr. Helena Gradišar SOMENTOR

prof. dr. Roman Jerala

Žiga STRMŠEK

PREDSTAVITEV PROTEINSKIH DOMEN NA OGRODJU PROTEINSKEGA ORIGAMIJA IZ OVITIH VIJAČNIC V OBLIKI TETRAEDRA

Imenovanje mentorice na seji senata UL dne 7. 11. 2017 Imenovaje somentorja na seji senata UL dne 7. 11. 2017

Imenovanje komisije za spremljanje doktorskega študenta na seji senata UL MF dne 10.

4. 2017

Datum zagovora: 26. 8. 2021

MENTORICA: dr. Helena Gradišar

Kemijski inštitut, Odsek za sintezno biologijo in imunologijo SOMENTOR: prof. dr. Roman Jerala

Kemijski inštitut, Odsek za sintezno biologijo in imunologijo KOMISIJA:

predsednik komisije: prof. dr. Jurij Lah

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Katedra za fizikalno kemijo

član komisije: prof. dr. Janko Kos

Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko biologijo član komisije: prof. dr. Gregor Anderluh

Kemijski inštitut, Odsek za molekularno biologijo in nanobiotehnologijo

Rezultati, predstavljeni v tej doktorski nalogi, so rezultat mojega dela na Kemijskem inštitutu v Ljubljani med avgustom 2015 in aprilom 2021, opravljeni pod mentorstvom dr. Helene Gradišar in somentorstvom prof. dr. Romana Jerale, razen za sledeče:

- dr. Duško Lainšček in Anja Perčič sta izvedla imunizacijo miši in odvzem krvne plazme;

- dr. Jana Aupič, dr. Fabio Lapenta in Jaka Snoj so pomerili del sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih na sinhrotronu PETRA III;

- skupaj z dr. Jano Aupič in dr. Fabiom Lapento smo pomerili FRET na spektrofotometru z ustavljenim pretokom;

- dr. Jana Aupič je izvedla vse in silico simulacije zvijanja, analizo FRET na spektrofotometru z ustavljenim pretokom in sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih proteinskega origamija s ponovljenimi ovitimi vijačnicami;

- s Saro Vidmar sva skupaj zbrala podatke krio-elektronske mikroskopije;

- pri karakterizaciji in kloniranju SpyCatcher/SpyTag proteinskih konstruktov mi je pomagala Neža Pavko, ki je del optimizacije sistema uporabila za svojo diplomsko nalogo.

Elektronska oblika doktorske naloge je identična tiskani obliki.

Del doktorske disertacije temelji na izvirnem znanstvenem članku:

Aupič, J.‡, Strmšek, Ž.‡, et al. Designed folding pathway of modular coiled-coil- based proteins. Nat Commun. 2021

‡ deljeno prvo avtorstvo

Aupič, J. ‡, Strmšek, Ž. ‡, Lapenta, F., Pahovnik, D., Pisanski, T., Drobnak, I., Ljubetič, A., Jerala, R. Designed folding pathway of modular coiled-coil-based proteins. Nature communications. 2021

Lapenta, F., Aupič, J., Vezzoli, M., Strmšek, Ž., Da Vela, S., Svergun, D. I., Carazo, J.

M., Melero, R., Jerala, R. Self-assembly and regulation of protein cages from pre- organised coiled-coil modules. Nature communications. 2021

Majerle, A., Hadži, S., Aupič, J., Satler, T., Lapenta, F., Strmšek, Ž., Lah, J., Loris, R., Jerala, R. A nanobody toolbox targeting dimeric coiled-coil modules for functionalization of designed protein origami structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2021

Lainšček, D., Fink, T., Forsterič, V., Hafner Bratkovič, I., Orehek, S., Strmšek, Ž., Manček Keber, M., Pečan, P., Eeih, H., Malenšek, Š., Aupič, J., Dekleva, P., Plaper, T., Vidmar, S., Kadunc, L., Benčina, M., Omersa, N., Anderluh, G., Pojer, F., Lau, K., Hacker, D., Correia, B., Peterhoff, D., Wagner, R., Bergant, V., Herrmann, A., Pichlmair, A., Jerala, R. A nanoscaffolded spike-RBD vaccine provides protection against SARS-CoV-2 with minimal anti-scaffold response. Vaccines. 2021

Sušjan, P., Lainšček, D., Strmšek, Ž., Hodnik, V., Anderluh, G., Hafner Bratkovič, I.

Selective inhibition of NLRP3 inflammasome by designed peptide originating from ASC. The FASEB journal. 2020

Golob Urbanc, A., Rajčević, U., Strmšek, Ž., Jerala, R. Design of split superantigen fusion proteins for cancer immunotherapy. The Journal of biological chemistry. 2019

signaling and logic circuits in mammalian cells. Nature chemical biology. 2019

Ljubetič, A., Lapenta, F., Gradišar, H., Drobnak, I., Aupič, J., Strmšek, Ž., Lainšček, D., Hafner Bratkovič, I., Majerle, A., Krivec, N., Benčina, M., Pisanski, T., Ćirković- Veličković, T., Round, A. R., Carazo, J. M., Melero, R., Jerala, R. Design of coiled-coil protein-origami cages that self-assemble in vitro and in vivo. Nature biotechnology.

2017

Aupič, J., Lapenta, F., Strmšek, Ž., Jerala, R. Towards designing new nano-scale protein architectures. Essays in Biochemistry. 2016

Iskreno se zahvaljujem prof. dr. Romanu Jerali za enkratno priložnost za delo na odličnem Odseku za sintezno biologijo in imunologijo na Kemijskem inštitutut v Ljubljani. Hvala, da ste si vedno vzeli čas za diskusije, čeprav sem se pogosto nenajavljen pojavil na vratih vaše pisarne.

Zahvaljujem se dr. Heleni Gradišar za mentoriranje in pregled doktorske disertacije.

Zahvaljujem se članom komisije prof. dr. Juriju Lahu, prof. dr. Janku Kosu in prof. dr.

Gregorju Anderluhu za hiter pregled doktorske disertacije ter potrpežljivost pri iskanju datuma predstavitve faznega poročila in končnega zagovora v časovno in situacijsko zelo neugodnem obdobju.

Zahvaljujem se (sedanjim in bivšim) članom CC skupine ter D12 za pomoč in diskusije – brez vas bi bili dnevi v laboratoriju suhoparni in dolgočasni. Posebno bi se rad zahvalil dr.

Jani Aupič in dr. Fabiu Lapenti za dolgoletno sodelovanje, za preneseno znanje ter neskončne diskusije pri iskanju rešitev.

Zahvaljujem se prof. Vesni Golob, prof. dr. Tanji Kunej in izr. prof. dr. Tomažu Bratkoviču. Hvala vam za usmerjanje moje radovednosti in pomoč pri razvoju na poti do znanstvenika.

Ogromna zahvala gre staršem za dolgoletna vlaganja in odrekanja. Hvala vama za pomoč, podporo in priložnosti skozi vsa leta. Brez vajine pomoči bi bila pot še bolj trnava. Posebna zahvala gre materi, ki mi omogoča, da še naprej skrivam svoje neznanje slovenskega pravopisa in popravlja moje dislektične blodnje.

Zahvaljujem se 'priženjeni' družini, da ste me navkljub tattoojem, vegetarijanstvu in kosmati bradi sprejeli.

Največja zahvala pa gre seveda Evi – hvala ti za potrpljenje in razumevanje vse dni, ko je doktorat zahteval svoje - predvsem ko Python, modeli in proteini niso ubogali. Hvala ti, ker prenašaš mojo norost in neprestano 'mozganje' vsaj 13 stvari istočasno. Hvala ti, da slediš mojemu miselnemu procesu navkljub procesni moči moje možganske celice, ki je veliko večja od moje sposobnosti tvorjenja celih, povezanih in logičnih stavkov. Hvala ti, ker me podpiraš in se vedno iskreno nasmejiš mojim slabim 'štosom'.

Odin gave his eye to acquire knowledge... but I would give far more. – Ragnar Lodbrok

% (V/V) Volumski odstotek topljenca v volumnu celotne raztopine 2-D, 3-D Dvodimenzionalen, tridimenzionalen

Å Angstrem

A280 nm, Absorbanca pri 280 nm

Abs 0,1 % Absorbanca proteina pri 280 nm, če bi bil v koncentraciji 1 mg/ml

angl. Angleško

BSA Goveji serumski albumin (standard)

CCPO Proteinski origami z ovitimi vijačnicami (angl. Coiled-coil protein-origami)

CD Cirkularni dikroizem

CoCoPOD Spletna platforma za oblikovanje proteinskega origamija z ovitimi vijačnicami (angl. Coiled-coil protein-origami design)

Da Dalton

DNA Deoksiribonukleinska kislina E.coli Escherichia coli

EDTA Etilendiamintetraocetna kislina

FPLC Tekočinska kromatografija za hitro ločevanje proteinov (angl. Fast protein liquid chromatography)

GCN4 angl. General control protein

HCl Klorovodikova kislina

HPLC Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (angl. High performance liquid chromatography)

IPTG Izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozid

Kd Konstanta disociacije

LB Gojišče Luria-Bertani

MALS Večkotno sipanje laserske svetlobe (angl. Multiple angle light scattering) Milli-Q Dodatno očiščena, deionizirana voda

MRE Povprečna eliptičnost na aminokislinski ostanek (angl. Mean residue ellipticity)

NaCl Natrijev klorid

NaDS-PAGE Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata

Native-PAGE Poliakrilamidna gelska elektroforeza pod nativnimi pogoji NiNTA Polnilo za nikljevo afinitetno kromatografijo

OD 600 nm Optična gostota pri 600 nm

PCR Verižna reakcija s polimerazo (angl. Polymer chain reaction)

pET Ekspresijski vektor

Rg Radij giracije

SAXS Sipanje rentgenskih žarkov pri nizkih kotih

Sc SpyCatcher

SN Topen, z negativnim nabojem (angl. Soluble, negative)

St SpyTag

TET12 Proteinski kontrukt v obliki tetraedra iz 12 peptidnih segmentov povezanih

Tris Tris(hidroksimetil)aminometan UV Ultravijolični del spektra ε Molarni ekstinkcijski koeficient

Compared to other biopolymers, polypeptide nanostructures are able to form highly complex structures that are defined by the aminoacid sequence. Nature explored only a small portion of all protein folds, while huge regions of 'protein space' remain unexplored. There are several approaches to discovering or creating new protein folds – coiled-coil protein origami (CCPO) is one of such. CCPO is de novo rationally designed protein fold from linked coiled-coil (CC) forming modules. CCPO is modular, composed of CCs that form the edges around the internal hydrophilic cavity and can form diverse polyhaedral shapes. In the presented thesis we explored the strategies of presenting protein domains at the vertices of tetrahedral CCPOs by direct genetic fusion. As a proof of principle, four tetrahedral CCPO (TET12SN) constructs were decorated either with one green fluorescent protein (GFP), one green and one red fluorescent protein (RFP) or four GFPs or four RFPs. All constructs expressed well and were characterised by small-angle X-ray scattering (SAXS), which, coupled with in silico modelling, revealed that there was some undesired flexibility of the fourth presented protein domain. The mobility was reduced by modifying the insertion site – and to further explore the developed system, seven additional constructs, with different ratios of GFP : RFP were prepared and analysed with SAXS and analytical gel filtration. Moreover, TET12SN-RRRR, tetrahedral CCPO decorated with four RFPs, was used as a vaccine for antigen presentation. Mice immunised with an antigen, presented on a scaffold (TET12SN-RRRR), developed IgG antibodies against RFP faster and with higher titer compared to mice immunised with a monomeric antigen. As an alternative strategy of protein domain grafting onto the CCPO scaffold, TET12SN was decorated with SpyCatcher/SpyTag protein domains, that were used to create bigger protein complexes of a tetrahedron decorated with (i) one, (ii) two or (iii) three additional ligand tetrahedral CCPO.

Currently, the complexity of polyhaedral CCPOs are limited by the number of available orthogonal CCs. We investigated if the same CC pair could be used several times within the same structure. We successfully designed and characterised a tetrahedral CCPO with one (TET12SN(2CC)), two (TET12SN(22CC)) or three (TET12SN(222CC)) CC pair that occured two times in the sequence. In order to prove that protein domains could still be presented on CCPO with repeated CC pairs, seven protein constructs with varying ratios of GFP : RFP were created utilizing newly designed CCPO

four RFPs was characterised in more detail with cryoelectron microscopy. The developed system for presenting protein domains at the vertices of tetrahedral CCPO offers a powerful tool in expanding toolkit of protein origami, that could one day be used in medical, industrial and/or biotechnological applications.

Glavna prednost polipeptidnih nanostruktur, v primerjavi z večino ostalih polimerov, je tvorba zelo kompleksnih struktur, ki jih določa zaporedje aminokislin. Narava je tekom evolucije raziskala le majhen del teoretično možnih proteinskih zvitij, medtem ko večji del t. i. proteinskega vesolja ostaja neraziskan. Pristopov k razvoju in raziskovanju proteinskih zvitij, ki v naravi niso prisotna, je več. Eden od pristopov k racionalnemu načrtovanju de novo proteinskih zvitij je proteinski origami na osnovi ovitih vijačnic.

Proteinski origami iz ovitih vijačnic je načrtovan po principu modularnosti in daljnosežnih interakcij med segmenti ovitih vijačnic. Za to proteinsko zvitje so značilne raznolike poliedrske kletke, pri katerih stranice tvorijo ovite vijačnice, ki so med seboj povezane z gibljivimi proteinskimi povezovalci in s hidrofilno votlino na sredini nanokletke. V doktorskem delu smo raziskali strategije predstavitve proteinskih domen na ogliščih tetraedrične nanokletke z direktno genetsko fuzijo. Delovanje razvitega sistema smo preizkusili s predstavitvijo ene (GFP), dveh (GFP in RFP) ali štirih (štiri GFP ali RFP) proteinskih domen. Na podlagi in silico modeliranja in analize sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih se je pokazalo, da je proteinska domena, predstavljena na četrtem oglišču kot fuzija na C-koncu verige, gibljiva. Z zamenjavo mesta fuzije znotraj zaporedja TET12SN smo predstavljeno proteinsko domeni prestavili v notranjost polipeptidne verige in tako zmanjšali njeno gibljivost. Po učvrstitvi vseh štirih domen smo pripravili serijo sedmih konstruktov z različnimi razmerji GFP in RFP, pri katerih smo dokazali uspešno predstavitev proteinskih domen z analitsko gelsko filtracijo in s sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih.

TET12SN-RRRR, tetraedrično proteinsko ogrodje, dekorirano s štirimi RFP proteinskimi domenami smo uspešno uporabili kot cepivo za predstavitev antigenov.

Miši, imunizirane s TET12SN-RRRR, so razvile IgG protitelesa proti antigenu RFP hitreje in bolj zanesljivo kot miši, ki so bile imunizirane z monomernim antigenom. Kot alternativno strategijo predstavljanja proteinskih domen na proteinskem origamiju smo TET12SN dekorirali s proteinskimi domenami SpyCatcher/SpyTag, katere smo uporabili za izgradnjo centralnega tetraedra, dekoriranega z (i) enim, (ii) dvema ali (iii) tremi ligandi, vključenimi v tetraedrične proteinske kletke.

Trenutno sta velikost in kompleksnost poliedričnih proteinskih origamijev omejena s številom dostopnih ortogonalnih ovitih vijačnic. Da bi se izognili tej omejitvi, smo raziskali, če lahko uspešno načrtujemo tetraedričen proteinski origami, pri katerem isti

načrtovali in okarakterizirali tetraedrično nanokletko s ponovljenimi pari ovitih vijačnic enkrat (TET12SN(2CC)), dvakrat (TET12SN(22CC)) in trikrat (TET12SN(222CC)).

Da bi dokazali modularnost razvitega sistema predstavljanja proteinskih domen na ogliščih, smo pripravili serijo sedmih konstruktov z različnimi razmerji GFP in RFP, le da smo za osnovno ogrodje uporabili TET12SN(22CC). Uspešno izolirane proteine iz te serije smo okarakterizirali z analitsko gelsko filtracijo in s sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih, medtem ko smo konstrukt, dekoriran s štirimi rdečimi fluorescenčnimi proteini, še dodatno vizualizirali s krio-elektronsko mikroskopijo. Predstavljen sistem dekoriranja oglišč proteinskih origamijev s proteinskimi domenami ima potencial za uporabo v medicinske, industrijske in biotehnološke namene.

1. UVOD ... 1

DNA nanostrukture ... 2 1.1.

Proteinski origami iz ovitih vijačnic ... 2 1.2.

Ovite vijačnice ... 2 1.2.1.

Ortogonalni nizi ovitih vijačnic ... 4 1.2.2.

Načrtovana proteinska zvitja iz ovitih vijačnic... 6 1.2.3.

Proteinski origami iz ovitih vijačnic ... 8 1.2.4.

Stanje proteinskih origamijev ... 9 1.2.5.

Namen ... 11 1.3.

Hipoteza ... 11 1.4.

2. MATERIALI IN METODE ... 13

Zaporedja peptidnih segmentov v proteinih in aminokislinska zaporedja ... 13 2.1.

Aminokislinska zaporedja proteinov s predstavljenimi domenami fluorescenčnih proteinov 2.1.1.

GFP (G) ali RFP (R) ... 13 Aminokislinska zaporedja proteinov z vključenimi domenami SpyCatcher (Sc)/, TET12SN- 2.1.2.

SpyTag (St) in fluorescenčnimi domenami GFP (G) ali RFP (R) ... 16 Aminokislinska zaporedja nove serije proteinov TET12SN z vključenimi domenami

2.1.3.

fluorescenčnih proteinov (TET12SN-new) ... 23 Aminokislinska zaporedja proteinov s ponovljenimi segmenti ... 29 2.1.4.

Aminokislinska zaporedja nove serije proteinov TET12SN(22CC) z vključenimi domenami 2.1.5.

fluorescenčnih proteinov (TET22CC-new) ... 32

Bakterijski sevi ... 37 2.2.

Metode molekulskega kloniranja ... 37 2.3.

Lepljenje po Gibsonu ... 37 2.3.1.

Standardne metode kloniranja ... 38 2.3.2.

Kombinatorna sinteza genov z uporabo restrikcijskih encimov tipa IIS ... 38 2.3.3.

Transformacija, PCR na osnovi kolonije in sekvenciranje ... 38 2.3.4.

Fermentacija in izolacija proteinov... 39 2.4.

Izražanje proteinov ... 39 2.4.1.

Strep-trap tekočinska kromatografija za hitro ločevanje proteinov ... 40 2.4.2.

Gelska filtracija ... 40 2.4.3.

Karakterizacija proteinov ... 40 2.5.

NaDS-PAGE ... 41 2.5.1.

Nativna-PAGE ... 41 2.5.2.

Analitska gelska filtracija ... 41 2.5.3.

Spektroskopija cirkularnega dikroizma ... 41 2.5.4.

Konjugacija proteinov ... 42 2.5.5.

Meritve FRET na spektrofotometru z ustavljenim pretokom ... 42 2.5.6.

Modeliranje ... 42 2.5.7.

Sipanje rentgenskih žarkov pri nizkih kotih ... 42 2.5.8.

Krio-elektronska mikroskopija ... 43 2.5.9.

3. REZULTATI ... 44

Predstavitev proteinskih domen na ogliščih proteinskega origamija ... 45 3.1.

Primeri uporabe ... 50 3.2.

Vezava antigena na proteinsko ogrodje in imunizacija ... 51 3.2.1.

Predstavitev domen na proteinsko ogrodje preko sistema SpyCatcher/SpyTag ... 54 3.2.2.

Nadaljnji razvoj sistema ... 75 3.3.

Proteinski origami s ponovljenimi ovitimi vijačnicami ... 80 3.4.

Go simulacije in eksperimentalni poskus ... 81 3.4.1.

Načrtovanje proteinskih kletk s ponovljenimi pari ovitih vijačnic ... 84 3.4.2.

Karakterizacija tetraedrskih nanokletk s ponovljenimi ovitimi vijačnicami ... 84 3.4.3.

Predstavitev domen fluorescenčnih proteinov na novem ogrodju ... 91 3.5.

4. DISKUSIJA ... 98

Predstavitev proteinskih domen na ogliščih proteinskega origamija ... 98 4.1.

Vezava antigena na proteinsko ogrodje in imunizacija ... 98 4.2.

Predstavitev domen sistema SpyCatcher/SpyTag na proteinsko ogrodje ... 99 4.3.

Proteinski origami s ponovljenimi ovitimi vijačnicami ... 102 4.5.

Predstavitev domen fluorescenčnih proteinov na novem ogrodju ... 102 4.6.

5. ZAKLJUČEK ... 105 6. BIBLIOGRAFIJA ... 107

Slika 1: Shematski prikaz interakcij med dvema (A) antiparalelnima in (B) paralelnima ovitima vijačnicama. ... 3 Slika 2: Sheme in modeli prvih načrtovanih struktur iz ovitih vijačnic.. ... 7 Slika 3: Modeli nanokletk v obliki tetraedra (TET12SN (A)), štiristrane piramide (PYR16SN (B)) in tristrane prizme (TRIP18SN (C)) na podlagi sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih. ... 10 Slika 4: Strategije predstavitve fluorescenčnih proteinov v ogliščih nanokletke v obliki tetraedra.. ... 44 Slika 5: Karakterizacija TET12SN-GFP.. ... 46 Slika 6: Karakterizacija TET12SN-GFP-RFP. ... 48 Slika 7: Karakterizacija proteinov TET12SN-GGGG in TET12SN-RRRR s sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih. ... 49 Slika 8: Elucijske krivulje analitske gelske filtracije TET12SN, TET12SN-GFP, TET12-GFP-RFP, TET12SN-GGGG in TET12SN-RRRR. ... 50 Slika 9: Časovnica imunizacij miši. ... 51 Slika 10: Rezultati direktne ELISE imunizacije miši s TET12SN-RRRR, TET12SN in RFP. ... 53 Slika 11: Biofizikalna analiza TET12SN-3xScG. ... 54 Slika 12: Odstranjene regije proteinske domene SpyCatcher v sekvenci in modelu. .... 55 Slika 13: Analiza TET12SN-3xSc(v2)G in TET12SN-3xSc(v3)G. ... 56 Slika 14: Aktivnost SpyCatcher(v3)-GFP (Sc(v3)-GFP) in SpyTag-RFP (St-RFP). ... 57 Slika 15: Tvorba proteinskega kompleksa med TET12SN-3xSc(v3)G in SpyTag-RFP.

... 58 Slika 16: Tvorba proteinskega kompleksa med TET12SN-3xStR in Sc(v3)GFP. ... 59 Slika 17: Tvorba proteinskega kompleksa med TET12SN-I-StR in Sc(v3)-GFP (A in B) ter TET12SN-II-StR in Sc(v3)-GFP (C in Č). ... 61 Slika 18: Tvorba proteinskega kompleksa med TET12SN-III-StR in Sc(v3)-GFP. 62 Slika 19: Tvorba proteinskega kompleksa med TET12SN-I, II-2xStR in Sc(v3)-GFP (A in B) ter TET12SN-II, III-2xStR in Sc(v3)-GFP (C in Č). ... 64 Slika 20: Sheme načrtovanih proteinskih kompleksov... 65 Slika 21: Tvorba proteinskega kompleksa med TET12SN-1xSc(v3)GG in St-RFP (A in B) ter TET12SN-2xSc(v3)G in St-RFP (C in Č). ... 67

(C in E). ... 68 Slika 23: Rezultati analize nastanka proteinskega kompleksa med TET12SN- 1xSc(v3)GG in TET12SN-II-StR.. ... 70 Slika 24: Rezultati analize nastanka proteinskega kompleksa med TET12SN-2xSc(v3)G in TET12SN-II-StR. ... 71 Slika 25: Rezultati analize nastanka proteinskega kompleksa med TET12SN-3xSc(v3)G in TET12SN-II-StR. ... 73 Slika 26: Rezultati analize nastanka proteinskega kompleksa med TET12SN-3xStR in TET12SN-1xSc(v3)GG. ... 75 Slika 27: Mesta vstavitve proteinskih domen v TET12SN. ... 76 Slika 28: Elucijske krivulje proteinskih konstruktov, pri katerih sta mesta vstavitve v verigo TET12SN za oglišči I in IV spremenjeni. ... 77 Slika 29: Rezultati sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih. ... 79 Slika 30: Strukturni modeli, ki najbolj ustrezajo eksperimentalno izmerjeni krivulji sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih proteinskih konstruktov. ... 80 Slika 31: Primer zvijanja polipeptidne verige v tetraedrsko strukturo TET12SN. ... 81 Slika 32: Rezultati meritev FRET na spektrofotometru z ustavljenim pretokom ... 82 Slika 33: Rezultati merjenja talilne krivulje s CD spektroskopijo. ... 83 Slika 34: Rezultati analize TET12SN(2CC) (A, C, D in F) ter TET12SN(22CC) (B, Č, E in G). ... 86 Slika 35: Rezultati analize TET12SN(222CC) (A, Č, F in I), TET12SN(3CC) (B, D, G in J) ter TET12SN(3CC-neg) (C, E, H in K). ... 88 Slika 36: Analiza sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih in pripadajoči strukturni modeli. ... 90 Slika 37: Poravnava zaporedij konstruktov, osnovanih dveh ogrodij – TET12SN (A) in TET12SN(22CC) (B). ... 91 Slika 38: Elucijske krivulje proteinskih konstruktov, pri katerih sta mesta vstavitve v verigo TET12SN(22CC) za oglišči I in IV spremenjeni.. ... 92 Slika 39: Rezultati sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih za proteinske konstrukte..

... 94 Slika 40: Strukturni modeli, ki najbolj ustrezajo eksperimentalno pomerjeni krivulji sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih proteinskih konstruktov.. ... 95

Triton X-100 (B). ... 97

1

1. Uvod

Biologija je na nano-nivoju večinoma zgrajena iz štirih tipov biomolekul: nukleinskih kislin, lipidov, sladkorjev ter aminokislin. Izmed štirih osnovnih biomolekul aminokisline tvorijo najbolj raznolike in raznovrstne biopolimere – proteine. Le-ti opravljajo različne in pomembne funkcije, kot so omogočanje in pospeševanje kemijskih reakcij (encimi), tvorba ogrodij (citoskelet), pretvorba svetlobe v kemično energijo (proteini fotosinteznega kompleksa) itd. Proteini, ki opravljajo različne funkcije, se med seboj zelo razlikujejo, vendar so večinoma sestavljeni iz 20 osnovnih aminokislin in so podrejeni enakim naravnim zakonitostim. Problem visoke raznolikosti polipeptidnih verig in njihovih struktur je elegantno opisan z Levinthalovim paradoksom proteinskega zvijanja, ki opisuje miselni eksperiment: če izračunamo vsa možna proteinska zvitja za kratek polipeptid iz 150 aminokislin, bi moral tak polipeptid raziskati 10³⁰⁰ različnih konformacij. Da bi takšen polipeptid raziskal vse možne konformacije, bi trajalo dalje, kot je vesolje staro¹. Glede na to, da naravni proteini tvorijo pravilno proteinsko zvitje v mikro- do milisekundah, lahko zaključimo, da zvijanje polipeptidov v končno strukturo vodijo naravne zakonitosti.

Načrtovanje proteinskega zvitja na podlagi sekvence je zelo težavno, predvsem če niso poznane strukture homolognih proteinskih zvitij². Kljub temu pa napredek na tem področju omogoča načrtovanje novih proteinskih zvitij z visoko natančnostjo, tudi če homologne strukture niso poznane^3,4. Navkljub težavam pri načrtovanju in razvoju novih proteinskih zvitij raziskovanje in odkrivanje le-teh obeta načrtovanje novih proteinskih zvitij z želenimi lastnostmi. Proteini so s svojo naravno biokompatibilnostjo in prostorsko plastičnostjo idealen material za razvoj tako biotehnoloških kot tudi medicinskih aplikacij. Vendar je, kljub relativno preprosti proizvodnji proteinov, omejen nabor naravnih proteinskih zvitij omejujoč faktor pri razvoju kompleksnejših aplikacij. Po drugi strani pa DNA nanotehnologija s poznanimi zakonitostmi parjenja baznih parov omogoča preprost razvoj kompleksnih nanostruktur, katerim lahko v sekvenco sprogramiramo želene lastnosti in odzive na okolje; a ker so osnovni gradniki v DNA nanostrukturah kemijsko zelo podobni, je mogoče načrtovati strukture samo v ozkem območju biokemijskih in fizikalnih lastnosti.

2 DNA nanostrukture

1.1.

V naravi RNA tvori strukture, kot so npr. aptamere, medtem ko lahko v kombinaciji s polipeptidi tvorijo eno največjih in najkompleksnejših molekularnih struktur – ribosom⁵. Osnovni gradniki polimerov iz nukleinskih kislin so biokemijsko in fizikalno zelo podobni – zato je tekom evolucije narava nukleinske kisline izbrala za shranjevanje in prenašanje informacij, medtem ko je kompleksnejšo in raznoliko skupino aminokislin uporabila za strukturne in funkcionalne naloge. Zaradi stabilnosti, preprostih pravil parjenja ter zmožnosti sinteze želene velikosti in sekvence so raziskovalci že uspešno razvili 2D in 3D strukture^6–8, in to ne samo v nano-, ampak tudi mikrometrskih velikostih^9–11. Za izgradnjo DNA nanodelcev se večinoma uporablja (i) več kratkih polinukleotidnih verig ali (ii) ena daljša polinukleotidna veriga, v kombinaciji s krajšimi verigami. Obema strategijama zvijanja DNA nanostruktur je skupno, da se jih najprej denaturira: ali z visoko temperaturo, čemur sledi počasno ohlajanje, ali pa kemično z dializo^12,13.

Proteinski origami iz ovitih vijačnic 1.2.

Združitev robustnosti DNA nanostruktur in uporabnosti polipeptidov bi omogočila razvoj novega tipa proteinskih zvitij. Združitev pristopov obeh svetov je mogoča z nizanjem osnovnih gradnikov ovitih vijačnic v verigo, ki nato tvori načrtovano poliedrsko proteinsko kletko^14,15. Kot v primeru DNA nanostruktur je tudi 3D struktura polipeptida določena z daljnosežnimi interakcijami, le da gonilna sila zvijanja ni komplementarnost kot pri DNA verigi, temveč so to ortogonalne interakcije med segmenti ovitih vijačnic^14–17. Na takšen način načrtovane proteinske nanokletke imenujemo proteinski origami iz ovitih vijačnic.

Ovite vijačnice 1.2.1.

Mehanizem in pravila zvijanja ter tvorjenje ovitih vijačnic so dobro poznani, zato so le- te odlične kot osnovni gradniki proteinskih origamijev. Ovite vijačnice so eden izmed najpogostejših proteinskih motivov v naravi; ocenjujejo, da zasedajo 10 % eukariontskega proteoma¹⁸. Vloga ovitih vijačnic je predvsem zagotavljanje strukturne rigidnosti, poleg tega so odgovorne tudi za interakcije med proteini ali pa delujejo kot DNA vezavne domene¹⁹. Ovite vijačnice opisuje interakcija med dvema ali več alfa vijačnicami, ki praviloma zajemajo levosučno strukturo s ponavljajočo osnovno enoto sedmih aminokislin²⁰. Ob tvorbi ovite vijačnice se idealna periodičnost alfa vijačnice s

3

3,6 aminokisline na zavoj spremeni v 3,5 aminokisline na zavoj. Kot je prvi opazil Francis Crick, te lastnosti omogočajo tesno pakiranje stranskih verig na t. i. način 'gumb-v-praznine' (angl. knob-into-hole), ki definira tesne interakcije ovitih vijačnic^19,21,22. Značilno ponovitev sedmih aminokislin v vijačnici, ki se skladajo s periodo strukture ovitih vijačnic, imenujemo heptada, pri čemer aminokisline označimo z abcdefg (Slika 1). Znotraj klasične ovite vijačnice se hidrofobne aminokisline nahajajo na pozicijah a in d in so odgovorne za vzpostavljanje hidrofobnih interakcij na način 'gumb-v-praznini', medtem ko polarne aminokisline na pozicijah e in g tvorijo solne mostičke med dvema vijačnicama^23,24 (Slika 1). Zaradi periodičnosti in jasno določenih vlog posameznih aminokislin so ovite vijačnice zelo plastične, načrtovanje novih ovitih vijačnic je precej olajšano, zaradi česar so bile v raziskavah v zadnjih desetletjih kot strukturni modul uporabljene za različne namene.

Slika 1: Shematski prikaz interakcij med dvema (A) antiparalelnima in (B) paralelnima ovitima vijačnicama. Prirejeno po ²⁵.

Po razrešitvi kristalne strukture paralelnega homodimernega transkripcijskega faktorja v kvasovkah, GCN4²⁶, so zakonitosti tvorjenja ovitih vijačnic postale znane²⁷, kar je vodilo v razvoj novih, načrtovanih ovitih vijačnic. Ena takšnih je ovita vijačnica Velcro²⁸, ki predstavlja prvo načrtovano heterodimerno ovito vijačnico. Načrtovana je bila z uvedbo lizina in glutamata na pozicije e in g, kar dokazuje pomembno vlogo elektrostatskih interakcij na teh pozicijah. Drug primer sta peptida, poimenovana EE in KK, ki prav tako izkoriščata elektrostatske interakcije na pozicijah e in g, in imata visoko specifičnost pri tvorbi heterodimerne ovite vijačnice²⁹. Naboje polarnih aminokislin lahko uporabimo tudi za nadzor orientacije ovite vijačnice – spreminjanje vzorca naboja na pozicijah e in g vpliva na paralelno ali antiparalelno orientacijo. APH je primer ovite vijačnice, ki ima naboje razporejene na način, da tvorijo antiparalelno orientacijo³⁰. Zaradi teh relativno preprostih pravil o interakcijah in načina vezave kot

4

'gumbov-v-praznine' ovite vijačnice spominjajo na parjenje med baznimi pari v DNA.

Kljub temu da je pravilna postavitev solnih mostičkov termodinamično zelo pomembna, pa na oligomerno stanje ovitih vijačnic vplivajo tudi Van der Waalsove sile in sterično oviranje; npr. s sistematično zamenjavo aminokislinskih ostankov na pozicijah a in d z levcinom opazimo nastanek različnih oligomernih stanj²⁷. Presenetljivo lahko tudi na tradicionalno hidrofobnih pozicijah a in d najdemo polarne aminokisline^31,32. Takšen primer je nadaljnji razvoj peptida Velcro, kjer so z zamenjavo hidrofobnih asparaginov vplivali na orientacijo ovitih vijačnic in spremenili orientacijo iz paralelne v antiparalelno³³. Sposobnost nadzorovanja oligomernosti ovitih vijačnic je bila dokazana z razvojem različnih proteinskih zvitij, pri katerih oligomerna stanja ovitih vijačnic segajo od dimernih do tetramernih, kar so dosegli samo z zamenjavo aminokislinskih ostankov na pozicijah a in d³⁴. Dimerne ovite vijačnice predstavljajo samo en del ovitih vijačnic – z razširitvijo hidrofobnega jedra na poziciji e in g alfa vijačnice namreč tvorijo sveženj vijačnic. Opisani so bili de novo načrtovani svežnji ovitih vijačnic vse do heksa- in heptramernih struktur^35–38. V dimernih ovitih vijačnicah aminokislinski ostanki na pozicijah b, c in f ne vplivajo na interakcije med segmentoma, ki tvorita ovito vijačnico, ampak preko tvorbe solnih mostičkov znotraj iste vijačnice vplivajo na vijačnost in topnost dimernih ovitih vijačnic³⁹.

Ortogonalni nizi ovitih vijačnic 1.2.2.

Za načrtovanje kompleksnih modularnih proteinskih struktur je potrebno najprej sestaviti niz osnovnih gradnikov. Čeprav se v naravi nahaja ogromen niz ovitih vijačnic in so pravila vezave ovitih vijačnic znana, je načrtovanje večjega niza ortogonalnih ovitih vijačnic zelo problematično. Načrtovanje je težavno zaradi nizke razlike med prosto energijo želenih in neželenih interakcij. V zadnjih desetletjih so raziskovalci razvili ortogonalne nize ovitih vijačnic različnih velikosti, dolžin in orientacij, kar je olajšalo razvoj proteinskih struktur iz ovitih vijačnic.

Eden prvih ortogonalnih nizov je bil niz šestih peptidov, dolgih tri heptade, ki so paroma tvorili tri paralelne heteromerne ovite vijačnice⁴⁰. Gradišar s sodelavci je s spreminjanjem vzorca nabojev na pozicijah e in g ter uvedbo asparaginov na pozicijo a ter levcinov na pozicijo d uspešno razvila niz štirih ortogonalnih ovitih vijačnic⁴¹. Nizi ortogonalnih ovitih vijačnic lahko izvirajo tudi iz že vzpostavljenih nizov sinteznih peptidov, kot je npr. zbirka peptidov SYNZIP⁴². SYNZIP so zbirka peptidov, ki so bili originalno načrtovani za vezavo na levcinsko zadrgo transkripcijskega faktorja bZIP⁴³.

5

Izkazalo se je, da so ti peptidi nagnjeni k tvorbi heteromernih struktur. Bolj podrobna karakterizacija 14-ih peptidov SYNZIP je pokazala, da lahko tvorijo 22 različnih kombinacij heteromernih ovitih vijačnic – med temi peptidi so lahko izluščili samo štiri pare, ki so tvorili niz ortogonalnih ovitih vijačnic. Peptidi v nizu so bili dolgi od 5 do 7 heptad. Njihova dolžina se je odražala v visokih afinitetah (izmerjene KD vrednosti so se nahajale v nM območju). Ker je za načrtovanje struktur iz ovitih vijačnic zaželeno, da so le-te enake dolžine, so raziskovalci razvili tudi niz osmih paralelnih heteromernih ovitih vijačnic, dolgih štiri heptadne ponovitve⁴⁴. Sedem od osmih parov ovitih vijačnic je imelo temperaturo prehoda nad 70 °C, pri teh parih je bila razlika med temperaturo prehoda tarčnih in netarčnih parov le 10 °C, zato omenjeni niz ni bil dovolj ortogonalen za razvoj struktur, osnovanih na ovitih vijačnicah.

Za načrtovanje proteinskih struktur iz ovitih vijačnic je razvoj niza ovitih vijačnic zelo pomemben. Načrtovanje niza paralelnih ovitih vijačnic je precej težavno, načrtovanje niza antiparalelnih pa predstavlja izreden izziv. V literaturi obstaja samo en niz načrtovanih, antiparalelnih, ortogonalnih dimernih ovitih vijačnic – APH. Niz vsebuje peptide, dolge šest heptadnih ponovitev, ki tvorijo tri homodimerne antiparalelne ovite vijačnice⁴⁵.

Pri načrtovanju opisanih nizov ovitih vijačnic so se raziskovalci posluževali kombinacije racionalnih strategij in algoritemskega načrtovanja. Čeprav obstaja za razvoj ovitih vijačnic več različnih orodij, so si ta med seboj podobna in posledično omejena na enak način. Načrtovanje novih ovitih vijačnic s pomočjo računalniških orodij je omejeno na že poznane zakonitosti tvorjenja ovitih vijačnic. V prej opisanih primerih^40,41,46 je bil nabor aminokislin na pozicijah e in g omejen na lizin in glutaminsko kislino, na pozicijah a se je nahajal asparagin ali izolevcin, medtem ko je pozicije d zasedal levcin. Pozicije b, c in f niso bile del raziskave in so vsebovale aminokisline, ki spodbujajo visoko vijačnost segmentov. Načrtovana zaporedja so bila ovrednotena na podlagi hidrofobnih in elektrostatskih interakcij med peptidoma, ki tvorita ovito vijačnico. Glavna razlika med razvitimi algoritmi je predvsem v doprinosu hidrofobnih in elektrostatskih interakcij h končnemu rezultatu ter v dodatnih kriterijih, ki so specifični glede na uporabljen algoritem.

Pri večini opisanih študij^40,41,46 so na podlagi znanih zakonitosti tvorjenja ovitih vijačnic načrtovali možna zaporedja, pri čemer so poizkušali z računalniškimi algoritmi čim bolj

6

povečati razliko med tarčnimi in netarčnimi interakcijami^43,45, kar poveča ortogonalnost med ovitimi vijačnicami. Načrtovane peptide so nato in silico ovrednotili za interakcijo z vsemi ostalimi načrtovanimi peptidi, na podlagi uporabljene rezultatske funkcije pa so identificirali najboljše ortogonalne peptidne pare.

Načrtovana proteinska zvitja iz ovitih vijačnic 1.2.3.

Po uspešnem razvoju ortogonalnih nizov ovitih vijačnic so raziskovalci pričeli z načrtovanjem in karakterizacijo novih proteinskih zvitij iz ovitih vijačnic. Prvi primer uspešnega načrtovanja modularnih proteinov z uporabo ortogonalnih nizov ovitih vijačnic je primer 6-9 nm dolgih helikalnih nanopaličic⁴⁰, ki so jih dizajnirali z nizanjem alfa vijačnic, povezanih s povezovalci (Slika 2, A). Z uporabo iste strategije načrtovanja so raziskovalci razvili tudi nove ovite vijačnice – dve paralelni in eno antiparalelno⁴⁷. Na podlagi tega niza so načrtovali trikrako zvezdo (Slika 2, B). Na podoben način so z nizanjem niza ovitih vijačnic iz knjižnice peptidov SYNZIP uspešno načrtovali in karakterizirali trikotno strukturo, veliko 10 nm, sestavljeno iz treh polipeptidnih verig, pri čemer vsaka vsebuje dva s povezovalcem povezana peptida (Slika 2, C)⁴⁸.

7

Slika 2: Sheme in modeli prvih načrtovanih struktur iz ovitih vijačnic. S spreminjanjem zaporedja in načina vezave ovitih vijačnic so raziskovalci načrtovali in okarakterizirali dve strukturi – (A) nanopaličice in (B) trikrako zvezdo. (C) Shematski prikaz nanotrikotnika iz ovitih vijačnic in struktura nanotrikotnika, določena s sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih. Prirejeno po ²⁵.

Do sedaj opisani primeri so dokazali, da lahko že z relativno majhnim nizom ortogonalnih ovitih vijačnic uspešno načrtujemo in okarakteriziramo de novo proteinske strukture različnih oblik. Vsem trem opisanim primerom je skupno, da so sestavljeni iz različnih polipeptidnih verig, ki tvorijo končno strukturo zaradi visoke afinitete med segmenti, ki tvorijo ovite vijačnice. Posledično so proteinski kompleksi vedno v ravnotežju s prostimi gradniki. S povezovanjem segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice v isto polipeptidno verigo, se temu lahko izognemo⁴⁹. Takšno strategijo so raziskovalci uspešno uporabili za načrtovanje proteinskega origamija iz ovitih vijačnic^14–17,50. Za načrtovanje poliedrskih nanokletk so uporabili niz paralelnih ovitih vijačnic, ki so ga

8

načrtovali^39,41, ter v literaturi opisane ovite vijačnice, antiparalelno APH⁴⁵ in modificirani naravni oviti vijačnici BCR⁵¹ in GCN⁵².

Proteinski origami iz ovitih vijačnic 1.2.4.

V osnovi je proteinski origami iz ovitih vijačnic struktura sestavljena iz ene polipeptidne verige, v kateri so segmenti ovitih vijačnic v pravilnem zaporedju povezani z ustreznimi proteinskimi povezovalci. Polipeptidne verige, načrtovane na tak način, se samozvijejo v poliedrske nanokletke, katerih stranice so dimerne ovite vijačnice, medtem ko imajo namesto hidrofobnega kompaktnega jedra, kot je običajno pri globularnih proteinih, votlo sredico. Načrtovanje zaporedja povezanih segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice, je kompleksen postopek, ki pa je poenostavljen z razvojem programskega paketa CoCoPOD (https://github.com/NIC-SBI/CC_protein_origami)¹⁵. Pri načrtovanju proteinskega origamija iz ovitih vijačnic je potrebno upoštevati sledeče parametre:

(i) izbira tarčnega poliedra – v teoriji bi lahko načrtovali polieder poljubne velikosti in kompleksnosti, vendar smo omejeni z velikostjo nizov ovitih vijačnic;

(ii) izbor ustrezne topologije – izračunati je potrebno optimalno pot verige skozi vsa oglišča tarčne strukture. Na izbor najustreznejše topologije vplivajo nizi ovitih vijačnic, saj je za izgradnjo skoraj vsakega poliedra potrebna uporaba tako paralelnih kot antiparalelnih osnovnih gradnikov. V tem koraku je tudi potrebno definirati, ali so uporabljene ovite vijačnice di-, tri- ali oligomerne, saj le-to vpliva na izračun topologije. Po izbiri želene topologije je potrebno izbrati tudi krožno permutacijo – torej kateri segment znotraj topologije predstavlja začetek in kateri konec polipeptidne verige. Bolj podrobno je postopek opisan v ⁵³;

(iii) izbor niza ovitih vijačnic in njihova razporeditev – v tem koraku se matematični deskriptorji za segmente ovitih vijačnic zamenjajo z aminokislinskimi zaporedji osnovnih gradnikov, ki so med seboj povezani z aminokislinskimi povezovalci. Večinoma so osnovni gradniki, uporabljeni za izgradnjo proteinskih origamijev, dimerne ovite vijačnice, ki pa se razlikujejo v naboju, stabilnosti, vijačnosti in dolžini. Poleg do sedaj opisanih pravil so pomembna tudi empirično določena pravila - npr. (a) za prvo in zadnjo ovito vijačnico se je dobro izogniti manj stabilnim ovitim

9

vijačnicam, da preprečimo odpiranje strukture¹⁵, in (b) segmenta, ki tvorita posamezno ovito vijačnico, naj znotraj verige ne bosta preveč oddaljena.

Izbor zaporedja proteinskih povezovalcev je arbitraren, dokler so le-ti dovolj gibljivi in prekinejo vijačni motiv, pri čemer naj vsebujejo polarne in manjše aminokislinske ostanke.

Stanje proteinskih origamijev 1.2.5.

Proteinski origamiji predstavljajo na novo načrtovano proteinsko zvitje, ki ima idejo visoke modularnosti vključeno v samo jedro strategije. Proteinski origamiji so osnovani na daljnosežnih, a načrtovanih interakcijah, ki so sprogramirane v aminokislinsko zaporedje ovite vijačnice. Tvorjene ovite vijačnice predstavljajo robove proteinske nanokletke okoli centralne votline, ki je značilna za takšen tip proteinskega zvitja. Ker je glavna pot zvijanja polipeptida v končno strukturo odvisna predvsem od moči in specifičnosti interakcij med ovitimi vijačnicami, se pri načrtovanju takšnih struktur izognemo načrtovanju kompleksnih hidrofobnih interakcij, značilnih za hidrofobna jedra globularnih proteinskih zvitij; posledično sta razvoj in podrobna karakterizacija nizov ovitih vijačnic glavna parametra, ki omogočata uspešen razvoj proteinskih origamijev.

Proteinski origamiji so v bistvu nanokletke, za katere so značilne pravilne geometrijske oblike, enostavne, modularne stranice in votlina v sredini – te lastnosti so odvisne od izbire načrtovanega poliedra in dolžine ovitih vijačnic. Prva uspešno okarakterizirana struktura, načrtovana po opisanem principu, je tetraedrska kletka¹⁴. Načrtovana je bila kot polipeptidna veriga iz 12-ih povezanih peptidov, ki ob vezavi tvorijo 6 ovitih vijačnic, ki predstavljajo stranice nanokletke. Protein za tetraedrsko nanokletko je bil izoliran iz netopne frakcije in do pravilne strukture zvit in vitro, kar je omejilo razvoj potencialnih aplikacij. Druga generacija proteinskih origamijev je rešila problem topnosti proteinov z zamenjavo aminokislinskih ostankov na pozicijah b, c in f z bolj polarnimi in nabitimi aminokislinskimi ostanki in tako omogočila in vivo zvijanje proteinov¹⁵. Razvoj niza ovitih vijačnic z več polarnimi aminokislinami je torej omogočil razširitev nabora proteinskih origamijev. Uspešno so bile načrtovane in okarakterizirane nanokletke v obliki tetraedra, štiristrane piramide in tristrane prizme (Slika 3), načrtovane iz 12-ih, 16-ih oz. 18-ih segmentov, ki tvorijo ovite vijačnice.

Njihove strukture so bile potrjene s sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih in z elektronsko mikroskopijo¹⁵. Izkazalo se je, da so strukture proteinskih origamijev delno

10

fleksibilne, kar se je pokazalo na Kratkyjevih grafih. Le-ti so potrdili prisotnost med seboj povezanih definiranih proteinskih domen, a imajo določeno mero gibljivosti, kar je v skladu z načrtovano strategijo – definirane proteinske domene predstavljajo ovite vijačnice, med seboj povezane s proteinskimi povezovalci, ki dovoljujejo določeno mero gibljivosti, kar privede do gibljive strukture. Za proteinski origami je značilno tudi ponovno zvitje v načrtovano, pravilno nanokletko po denaturaciji, pri čemer ohrani monomerno stanje. Proteinski origami je stabilen in ohranja monomerno stanje po več tednih inkubacije pri +4 °C. Robustnost strategije za načrtovanje proteinskih origamijev je bila pokazana tudi s podrobno analizo desetih variant tetraedrskega proteinskega origamija, ki so se razlikovali v topologiji, zaporedju ovitih vijačnic, dolžini proteinskega povezovalca itd., vendar so kljub temu izkazovali podobne biokemijske in strukturne značilnosti¹⁵.

Slika 3: Modeli nanokletk v obliki tetraedra (TET12SN (A)), štiristrane piramide (PYR16SN (B)) in tristrane prizme (TRIP18SN (C)) na podlagi sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih.

11 Namen

1.3.

Glavna prednost polipeptidnih nanostruktur pred večino ostalih polimerov je možnost načrtovanja zelo kompleksnih struktur, odvisnih samo od zaporedja gradnikov - aminokislin⁵⁴. Poleg tega se proteini v pogojih in vivo zvijajo v dobro definirane strukture s točno določeno prostorsko postavitvijo, kar omogoča razvoj zelo raznolikih de novo nanostruktur in proteinskih zvitij, ki niso prisotna v naravi^14,55–60. Ena izmed takšnih nanostruktur je nanokletka iz ovitih vijačnic v obliki tetraedra¹⁴. Tetraeder je sestavljen kot proteinski origami, tj. iz ene polipeptidne verige na osnovi določenega zaporedja vijačnih segmentov, ki v končni strukturi sestavijo šest parov ovitih vijačnic, glede na interakcije med seboj ortogonalnih. Ker je tetraeder osnovan na principu modularnosti, je mogoče njegovo stabilnost, velikost in maso spreminjati glede na zahteve aplikacije. Zaradi tega je proteinski tetraeder idealno ogrodje za predstavitev proteinskih domen, kot so encimi, antigeni in/ali vezavne domene, kar bi omogočilo vnos izbranih bioloških lastnosti v/na takšno ogrodje. Namen doktorskega dela je razviti in opredeliti lastnosti platforme za predstavitev proteinskih domen na predhodno načrtovani nanotetraeder. Takšna platforma bi imela potencialno terapevtsko vrednost tako pri ciljani dostavi učinkovin in razvoju cepiv kakor tudi pri razvoju aktivatorjev in inhibitorjev celičnih receptorjev.

Hipoteza 1.4.

1. Na nanokletki iz ovitih vijačnic v obliki tetraedra je mogoče v več ogliščih hkrati predstaviti različne domene fluorescenčnih proteinov.

Utemeljitev: Proteinski tetraeder, sestavljen kot proteinski origami, predstavlja robustno in modularno platformo za nadaljnjo funkcionalizacijo. V dosedanjih raziskavah proteinskega origami-tetraedra smo pokazali tako njegovo ponovno pravilno zvitje po temperaturni denaturaciji kot tudi pravilno zvitje proteina v bakterijah in v sesalskih celicah. Tudi pri uporabi različnih tetraedrskih topologij ali različnih ovitih vijačnic se polipeptidna veriga pravilno zvije v monomerne enote. Vse to nakazuje na robustnost razvite platforme, kar predstavlja idealno osnovo za nadaljnje modifikacije.

Uspešna predstavitev biološko pomembnih proteinov na ogliščih tetraedra bi lahko vodila do razvoja naprednih cepiv in novih tarčno-dostavnih sistemov. Na tetraedru bi bilo mogoče predstaviti do štiri proteinske domene na izbranih ogliščih. Pozicije domen bi lahko poljubno spreminjali, kar predstavlja prednost pred obstoječimi sistemi na

12

osnovi simetrije, kot so npr. virusom podobni delci (angl. virus-like particles) in konjugirana bivalentna protitelesa, ali predstavitev na bakteriofagih (angl. phage display).

13

2. Materiali in metode

Zaporedja peptidnih segmentov v proteinih in aminokislinska 2.1.

zaporedja

Aminokislinska zaporedja proteinov s predstavljenimi domenami 2.1.1.

fluorescenčnih proteinov GFP (G) ali RFP (R)

Ime konstrukta: TET12SN-GFP

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GFP-GCNshSN-APHshSN- P7SN-GCNshSN-P4SN-P5SN-P8SN-BCRSN-P6SN

Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDAT NGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQ ERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSH VYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLS TQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKGSGQLEDKVEELLSKNY HLENEVERLKKLVGSGPGLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQ LKEKLGSGPGSPEDEIQQLEEKNSQLKQEISQLEEKNQELKYGSGPGQLEDKVE ELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQLEEENSQ LEYGSGPGSPEDENSQLEEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGSPEDKISELKE ENQQLEQKIQQLKEENSQLEYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERSRMQ YLQTLLEKGSGPGSPEDKNSELKEEIQQLEEENQQLEEKISELKYGLEHHHHHH HH

Ime konstrukta: TET12SN-GRFP

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GFP-GCNshSN-APHshSN- RFP-P7SN-GCNshSN-P4SN-P5SN-P8SN-BCRSN-P6SN

Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDAT NGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQ ERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSH VYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLS TQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKGSGQLEDKVEELLSKNY HLENEVERLKKLVGSGPGLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQ LKEKLGSGDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTK GGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGG VVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDG ALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNED YTIVEQYERRHSGSGSPEDEIQQLEEKNSQLKQEISQLEEKNQELKYGSGPGQLE

14

DKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQLEE ENSQLEYGSGPGSPEDENSQLEEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGSPEDKIS ELKEENQQLEQKIQQLKEENSQLEYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGPGSPEDKNSELKEEIQQLEEENQQLEEKISELKYGLEHHH HHHHH

Ime konstrukta: TET12SN-GGGG

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-GFP-APHshSN- P7SN-GCNshSN-P4SN-GFP-P5SN-P8SN-GFP-BCRSN-P6SN-GFP

Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGMSKGEE LFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTL VTTLVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEG DTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHVYITADKQKNGIKANFKIRHNV EDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFV TAAGITHGMDELYKGSGLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQL KEKLGSGPGSPEDEIQQLEEKNSQLKQEISQLEEKNQELKYGSGPGQLEDKVEE LLSKNYHLENEVERLKKLVGSGPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQLEEENSQL EYGSGMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFIC TTGKLPVPWPTLVTTLVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDG TYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHVYITADKQKN GIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNE KRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKGSGSPEDENSQLEEKISQLKQKNSELKE EIQQLEYGSGPGSPEDKISELKEENQQLEQKIQQLKEENSQLEYGSGMSKGEELF TGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVT TLVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDT LVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHVYITADKQKNGIKANFKIRHNVED GSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTA AGITHGMDELYKGSGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERSRMQYLQTLLEKGSG PGSPEDKNSELKEEIQQLEEENQQLEEKISELKYGSGMSKGEELFTGVVPILVEL DGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLVQCFSRY PDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGI DFKEDGNILGHKLEYNFNSHVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHY QQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDE LYKLEHHHHHHHH

15 Ime konstrukta: TET12SN-RRRR

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-RFP-APHshSN- P7SN-GCNshSN-P4SN-RFP-P5SN-P8SN-RFP-BCRSN-P6SN-RFP

Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGMASSED VIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWD ILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSL QDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKMRL KLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERRH STGAGSGLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGS PEDEIQQLEEKNSQLKQEISQLEEKNQELKYGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLEN EVERLKKLVGSGPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQLEEENSQLEYGSGMASSE DVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAW DILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDS SLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKM RLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYER RHSTGAGSGSPEDENSQLEEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGSPEDKISEL KEENQQLEQKIQQLKEENSQLEYGSGMASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEF EIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPD YLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGP VMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAK KPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERRHSTGAGSGDIEQELERAKESIR RLEQEVNQERSRMQYLQTLLEKGSGPGSPEDKNSELKEEIQQLEEENQQLEEKI SELKYGSGMASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAK LKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMN FEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERM YPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITS HNEDYTIVEQYERRHSTGAGSGLEHHHHHHHH

16

Aminokislinska zaporedja proteinov z vključenimi domenami 2.1.2.

SpyCatcher (Sc)/, TET12SN-SpyTag (St) in fluorescenčnimi domenami GFP (G) ali RFP (R)

Ime konstrukta: TET12SN-3xScG

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-Sc-APHshSN- P7SN-GCNshSN-P4SN-Sc-P5SN-P8SN-Sc-BCRSN-P6SN-GFP

Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGDYDIPTT ENLYFQGAMVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATM ELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQG QVTVNGKATKGDAHIGSGLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLA QLKEKLGSGPGSPEDEIQQLEEKNSQLKQEISQLEEKNQELKYGSGPGQLEDKV EELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQLEEENS QLEYGSGDYDIPTTENLYFQGAMVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSK RDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGY EVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHIGSGSPEDENSQLEEKISQLKQKNSE LKEEIQQLEYGSGPGSPEDKISELKEENQQLEQKIQQLKEENSQLEYGSGDYDIP TTENLYFQGAMVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGAT MELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQ GQVTVNGKATKGDAHIGSGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERSRMQYLQTLL EKGSGPGSPEDKNSELKEEIQQLEEENQQLEEKISELKYGSGMSKGEELFTGVVP ILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLVQC FSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQL ADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITH GMDELYKLEHHHHHHHH

Ime konstrukta: TET12SN-3xSc(v2)G

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-Sc(v2)- APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-Sc(v2)-P5SN-P8SN-Sc(v2)-BCRSN-P6SN-GFP Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGDSATHIK FSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAP DGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHIGSGLEEELKQLEEELQAIEEQL AQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQQLEEKNSQLKQEISQLEEKN QELKYGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGPGSPEDKISQLKEK IQQLKQENQQLEEENSQLEYGSGDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSG

17

KTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNG KATKGDAHIGSGSPEDENSQLEEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGSPEDKI SELKEENQQLEQKIQQLKEENSQLEYGSGDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMEL RDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQV TVNGKATKGDAHIGSGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERSRMQYLQTLLEKGS GPGSPEDKNSELKEEIQQLEEENQQLEEKISELKYGSGMSKGEELFTGVVPILVE LDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLVQCFSR YPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELK GIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADH YQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMD ELYKLEHHHHHHHH

Ime konstrukta: TET12SN-Sc(v3)GG

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-Sc(v3)- APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-P5SN-P8SN-GFP-BCRSN-P6SN-GFP

Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGDSATHIK FSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAP DGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGSGLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQA RKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQQLEEKNSQLKQEISQLEEKNQELKYGSGPG QLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQ LEEENSQLEYGSGPGSPEDENSQLEEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGSPE DKISELKEENQQLEQKIQQLKEENSQLEYGSGMSKGEELFTGVVPILVELDGDV NGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLVQCFSRYPDHM KRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKE DGNILGHKLEYNFNSHVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNT PIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKG SGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERSRMQYLQTLLEKGSGPGSPEDKNSELKEE IQQLEEENQQLEEKISELKYGSGMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRG EGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLVQCFSRYPDHMKRHDFFKSA MPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKL EYNFNSHVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLL PDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKLEHHHHHHH H

Ime konstrukta: TET12SN-2xSc(v3)G

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-Sc(v3)- APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-Sc(v3)-P5SN-P8SN-GFP-BCRSN-P6SN-GFP Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS

18

RMQYLQTLLEKGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGDSATHIK FSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAP DGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGSGLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQA RKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQQLEEKNSQLKQEISQLEEKNQELKYGSGPG QLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQ LEEENSQLEYGSGDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQ VKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGSGSPEDENSQL EEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGSPEDKISELKEENQQLEQKIQQLKEEN SQLEYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERSRMQYLQTLLEKGSGPGSPE DKNSELKEEIQQLEEENQQLEEKISELKYGSGMSKGEELFTGVVPILVELDGDV NGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLVQCFSRYPDHM KRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKE DGNILGHKLEYNFNSHVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNT PIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKL EHHHHHHHH

Ime konstrukta: TET12SN-3xSc(v3)G

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-Sc(v3)- APHshSN-P7SN-GCNshSN-P4SN-Sc(v3)-P5SN-P8SN-Sc(v3)-BCRSN-P6SN-GFP Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGDSATHIK FSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAP DGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGSGLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQA RKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQQLEEKNSQLKQEISQLEEKNQELKYGSGPG QLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQ LEEENSQLEYGSGDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQ VKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGSGSPEDENSQL EEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGSPEDKISELKEENQQLEQKIQQLKEEN SQLEYGSGDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFY LYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGSGDIEQELERAKESIRR LEQEVNQERSRMQYLQTLLEKGSGPGSPEDKNSELKEEIQQLEEENQQLEEKISE LKYGSGMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFI CTTGKLPVPWPTLVTTLVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDD GTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHVYITADKQK NGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPN EKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKLEHHHHHHHH

19 Ime konstrukta: TET12SN-I-StR

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-St-APHshSN- P7SN-GCNshSN-P4SN-P5SN-P8SN-BCRSN-P6SN-RFP

Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGAHIVMV DAYKPTKGSGLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSG PGSPEDEIQQLEEKNSQLKQEISQLEEKNQELKYGSGPGQLEDKVEELLSKNYH LENEVERLKKLVGSGPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQLEEENSQLEYGSGPG SPEDENSQLEEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGSPEDKISELKEENQQLEQ KIQQLKEENSQLEYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERSRMQYLQTLLE KGSGPGSPEDKNSELKEEIQQLEEENQQLEEKISELKYGSGMASSEDVIKEFMRF KVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQY GSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIY KVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGG HYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERRHSTGALE HHHHHHHH

Ime konstrukta: TET12SN-II-StR

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-APHshSN- P7SN-GCNshSN-P4SN-St-P5SN-P8SN-BCRSN-P6SN-RFP

Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGPGLEEEL KQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQQLEEKN SQLKQEISQLEEKNQELKYGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGS GPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQLEEENSQLEYGSGAHIVMVDAYKPTKGSG SPEDENSQLEEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGSPEDKISELKEENQQLEQ KIQQLKEENSQLEYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERSRMQYLQTLLE KGSGPGSPEDKNSELKEEIQQLEEENQQLEEKISELKYGSGMASSEDVIKEFMRF KVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQY GSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIY KVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGG HYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERRHSTGALE HHHHHHHH

20 Ime konstrukta: TET12SN-III-StR

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-APHshSN- P7SN-GCNshSN-P4SN-P5SN-P8SN-St-BCRSN-P6SN-RFP

Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGPGLEEEL KQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQQLEEKN SQLKQEISQLEEKNQELKYGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGS GPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQLEEENSQLEYGSGPGSPEDENSQLEEKISQ LKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGSPEDKISELKEENQQLEQKIQQLKEENSQLEYG SGAHIVMVDAYKPTKGSGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERSRMQYLQTLLEK GSGPGSPEDKNSELKEEIQQLEEENQQLEEKISELKYGSGMASSEDVIKEFMRFK VRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGS KAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKV KLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHY DAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERRHSTGALEHH HHHHHH

Ime konstrukta: TET12SN-I,II-2xStR

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-St-APHshSN- P7SN-GCNshSN-P4SN-St-P5SN-P8SN-BCRSN-P6SN-RFP

Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGAHIVMV DAYKPTKGSGLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSG PGSPEDEIQQLEEKNSQLKQEISQLEEKNQELKYGSGPGQLEDKVEELLSKNYH LENEVERLKKLVGSGPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQLEEENSQLEYGSGAH IVMVDAYKPTKGSGSPEDENSQLEEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGSPED KISELKEENQQLEQKIQQLKEENSQLEYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQ ERSRMQYLQTLLEKGSGPGSPEDKNSELKEEIQQLEEENQQLEEKISELKYGSG MASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGP LPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVT VTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALK GEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIV EQYERRHSTGALEHHHHHHHH

21 Ime konstrukta: TET12SN-II,III-2xStR

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-APHshSN- P7SN-GCNshSN-P4SN-St-P5SN-P8SN-St-BCRSN-P6SN-RFP

Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGPGLEEEL KQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQQLEEKN SQLKQEISQLEEKNQELKYGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGS GPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQLEEENSQLEYGSGAHIVMVDAYKPTKGSG SPEDENSQLEEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGSPEDKISELKEENQQLEQ KIQQLKEENSQLEYGSGAHIVMVDAYKPTKGSGDIEQELERAKESIRRLEQEVN QERSRMQYLQTLLEKGSGPGSPEDKNSELKEEIQQLEEENQQLEEKISELKYGS GMASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGG PLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVV TVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGAL KGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTI VEQYERRHSTGALEHHHHHHHH

Ime konstrukta: TET12SN-3xStG

Zaporedje peptidnih segmentov: APHshSN-P3SN-BCRSN-GCNshSN-St-APHshSN- P7SN-GCNshSN-P4SN-St-P5SN-P8SN-St-BCRSN-P6SN-RFP

Aminokislinsko zaporedje:

MLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSGPGSPEDEIQ QLEEEISQLEQKNSELKEKNQELKYGSGPGDIEQELERAKESIRRLEQEVNQERS RMQYLQTLLEKGSGPGQLEDKVEELLSKNYHLENEVERLKKLVGSGAHIVMV DAYKPTKGSGLEEELKQLEEELQAIEEQLAQLQWKAQARKEKLAQLKEKLGSG PGSPEDEIQQLEEKNSQLKQEISQLEEKNQELKYGSGPGQLEDKVEELLSKNYH LENEVERLKKLVGSGPGSPEDKISQLKEKIQQLKQENQQLEEENSQLEYGSGAH IVMVDAYKPTKGSGSPEDENSQLEEKISQLKQKNSELKEEIQQLEYGSGPGSPED KISELKEENQQLEQKIQQLKEENSQLEYGSGAHIVMVDAYKPTKGSGDIEQELE RAKESIRRLEQEVNQERSRMQYLQTLLEKGSGPGSPEDKNSELKEEIQQLEEEN QQLEEKISELKYGSGMASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYE GTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFK WERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGW EASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYK TDIKLDITSHNEDYTIVEQYERRHSTGALEHHHHHHHH

22 Ime konstrukta: Sc(v3)-GFP

Zaporedje peptidnih segmentov: Sc(v3)-GFP Aminokislinsko zaporedje:

MDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKY TFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGSGMSKGEELFTGVVPILVELDG DVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLGYGVQCFSR YPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELK GIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLAD HYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGM DELYKGSGSAWSHPQFEK

Ime konstrukta: St-RFP

Zaporedje peptidnih segmentov: St-RFP Aminokislinsko zaporedje:

MAHIVMVDAYKPTKGSGMASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEG RPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPE GFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTM GWEASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGA YKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERRHSTGAGSGSAWSHPQFEK