mesta vstavitve v verigo TET12SN(22CC) za ogljišči I in IV spremenjeni.
Za direktno vizualizacijo proteinske strukture smo si izbrali TET22CC-new-RRRR in ga analizirali s krio-elektronskim mikroskopom. Za prve analize je bil protein v SEC- pufru (20 mM Tris pH 7'5, 150 mM NaCl, 10 % (V/V) glicerol) in nanešen na mrežice Quantifoil R2/2 Micromachined Holey Carbon Grids 200 Mesh Copper. Na mikrografih smo opazili interakcijo med TET22CC-new-RRRR in mrežico, kar je najbrž povzročilo agregacijo proteina (Slika 41). Kljub temu je bilo vidnih dovolj posamičnih delcev, da smo lahko izvedli analizo posamičnih delcev s programom CryoSparc. Izračunane strukture ustrezajo pričakovani strukturi in njeni velikosti (Slika 42).
96
Slika 41: Mikrograf krio-elektronske mikroskopije vzorca TET22CC-new-RRRR, ki dokazuje nagnjenost proteinskega nanodelca k agregaciji pod pogoji zamrzovanja.
Zaradi neželene agregacije proteina TET22CC-new-RRRR pri nanosu na mrežice smo pufru dodali detergent. Ob dodatku detergenta Tween-20 ali Triton X-100 v kritični micelarni koncentraciji smo opazili manjšo agregacijo na površini mrežice (Slika 42).
Uspelo nam je slikati dovolj posamičnih delcev, da smo naredili 2D klasifikacijo, pri
97
kateri smo opazili tetraedrske strukture z večjo gostoto na ogliščih (Slika 42), kar je skladno z ugotovitvami sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih in modeliranja.
Slika 42: Primera mikrografov TET22CC-new-RRRR ob dodatku Tween-20 (A) ali Triton X-100 (B). Ob dodatku omenjenih detergentov smo opazili zmanjšano nagnjenost delcev k agregaciji. Na podlagi zbranih podatkov smo lahko delce klasificirali v 2D razrede.
98
4. Diskusija
Predstavitev proteinskih domen na ogliščih proteinskega origamija 4.1.
Za proteinski origami je značilna visoka modularnost, robustnost in zmožnost načrtovanja. Te lastnosti smo želeli izkoristiti za razvoj rigidnega, a modularnega ogrodja, na katerem bi lahko v ogliščih predstavili proteinske domene. Kot izhodiščno ogrodje smo izbrali dobro okarakteriziran TET12SN15. Z metodo direktne genetske fuzije smo načrtovali tetraedrski proteinski origami, na katerem smo uspešno predstavili proteinske domene GFP (TET12SN-GFP), GFP in RFP (TET12SN-GRFP) ter štiri GFP (TET12SN-GGGG) in štiri RFP (TET12SN-RRRR). Zvite proteine v ustrezno strukturo smo pokazali s CD spektroskopijo, analitsko gelsko filtracijo in meritvami sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih. Analiza Kratkyjevih grafov v vseh primerih dokazuje prisotnost več, med seboj gibljivo povezanih proteinskih domen, kar je v skladu s CCPO strategijo načrtovanja proteinov.
Vezava antigena na proteinsko ogrodje in imunizacija 4.2.
Uspešna predstavitev proteinskih domen na ogliščih tetraedrskega CCPO omogoča razvoj mnogih aplikacij. Tekom doktorske naloge smo se odločili za bolj podroben vpogled v dve potencialni aplikaciji: (i) CCPO kot sistem za predstavljanje antigenov in (ii) CCPO kot orodje za razvoj kompleksnejših struktur. Za imunizacijo smo izbrali konstrukt TET12SN-RRRR, saj je v primerjavi s TET12SN-GGGG med zamrzovanjem bolje ohranil monomerno stanje. Z direktno ELISO smo pokazali, da so 3 od 5 miši, ki so bile imunizirane s TET12SN-RRRR, razvile imunski odziv proti antigenu RFP že 10 dni po prvem imuniziranju, medtem ko v tem časovnem okvirju miši, imunizirane z RFP, niso razvile IgG imunskega odziva. Po prvem poživitvenem odmerku (angl.
booster dose) je vseh 5 mišk, imuniziranih s TET12SN-RRRR, razvilo protitelesa IgG proti RFP, medtem ko sta protitelesa IgG razvili samo 2 od 5 miši, imuniziranih z RFP.
Do konca eksperimenta so protitelesa IgG proti RFP razvile vse miši, imunizirane s TET12SN-RRRR, v primerjavi s 3 mišmi, imuniziranimi z RFP. Na podlagi teh rezultatov lahko zaključimo, da je protein TET12SN-RRRR odgovoren za uspešno predstavitev antigena, kar privede do hitrejšega in zanesljivejšega razvoja protiteles IgG v primerjavi s prostim antigenom RFP. Ta razlika v odzivu je še bolj navdušujoča, ko upoštevamo, da so bile miši injicirane z enako masno količino proteinov, vendar je bila množina antigena pri injiciranju z RFP v primerjavi s TET12SN-RRRR 1,5-krat večja.
99
Opazili smo tudi razvoj protiteles IgG proti ogrodnemu proteinu, kar je lahko posledica prisotnosti imunogenih epitopov, kar bi bilo v tem tipu proteinov morda možno zmanjšati. V ločenih eksperimentih smo ugotovili, da je znotraj TET12SN najbolj imunogena ovita vijačnica APHshSN. Glede na tvorbo nanoteles proti CCPO, ki vsebujejo APHshSN segment, sklepamo, da igra pomembno vlogo Trp na f mestu72, katerega bi lahko brez posledic odstranili. V kolikor bi bila imunogenost ogrodja nezaželena za aplikacijo, bi bila zamenjava problematične ovite vijačnice v hipoalergeno zaradi modularnosti proteinskega origamija enostavna. Poleg tega opisani sistem predstavitve proteinskih domen na ogliščih proteinskega origamija omogoča modifikacijo posameznih proteinskih domen, kar bi lahko izkoristili za predstavitev do štirih različnih antigenov v točno določenem razmerju in razdalji. Ker je proteinski origami struktura z veliko notranjo votlino, bi nadaljnji razvoj lahko omogočil enkapsulacijo učinkovin v hidrofilno jedro proteinskega ogrodja, iz katerega bi lahko z ustreznim signalom (npr. spremembo pH) učinkovino sprostili in tako razvili sistem za tarčno dostavo učinkovin.
Predstavitev domen sistema SpyCatcher/SpyTag na proteinsko 4.3.
ogrodje
Na ogliščih tetraedrske kletke smo predstavili tudi proteinske domene sistema SpyCatcher/SpyTag. Lastnosti sistema SpyCatcher/SpyTag smo uspešno uporabili za izgradnjo kompleksnejših struktur. Na primeru vgradnje proteinske domene smo uspešno pokazali prednosti modularnosti, pri čemer smo lahko spreminjali vse tri predstavljene proteinske domene SpyCatcher na način, da smo z odstranitvijo N' konca (SpyCatcher(v2)) ter N' in C' konca (SpyCatcher(v3)) odstranili nestrukturirane regije in tako zmanjšali neželeno gibljivost predstavljene domene SpyCatcher. Z nativno-PAGE in analitsko gelsko filtracijo smo potrdili visoko aktivnost vseh treh predstavljenih SpyCatcher(v3) domen, saj so pri ekvimolarnem razmerju SpyTag:SpyCatcher vse SpyCatcher(v3) domene zasedene. Na ogliščih tetraedrske nanokletke smo uspešno predstavili tudi tri proteinske domene SpyTag, vendar aktivnost vseh treh domen SpyTag ni bila enaka. Določili smo aktivnost proteinskih domen SpyTag v posameznih ogliščih in ugotovili, da je najbolj aktivna domena na oglišču II, medtem ko ima manjšo aktivnost na oglišču I in najmanjšo na oglišču III. Pokazali smo tudi, da istočasna predstavitev dveh domen SpyTag na različnih ogliščih ne vpliva na aktivnost posamezne proteinske domene SpyTag. Razlika v aktivnosti med oglišči predstavitve
100
verjetno izhaja iz dejstva, da je domena SpyTag kratka in da jo lahko tekom zvijanja ogrodja ostali deli polipeptidne verige maskirajo oz. prekrijejo, kar vpliva na njeno dostopnost. Tega pojava nismo opazili pri predstavitvi drugih proteinskih domen, saj so se le-te zvile ločeno od ogrodja.
Načrtovali smo tri strukture: (i) dva tetraedra, med seboj povezana preko izopeptidne vezi, (ii) centralen tetraeder, dekoriran z dvema dodatnima tetraedroma, z vsakim v svojem oglišču in (iii) centralen tetraeder, dekoriran s tremi dodatnimi tetraedri, z vsakim v svojem oglišču. Uspešno smo pripravili posamezne gradnike ter jim določili strukturo in aktivnost. Načrtovane strukture lahko opišemo tudi kot centralni tetraeder, ki je povezan preko SpyCatcher/SpyTag izopeptidne vezi, z (i) enim, (ii) dvema ali (iii) s tremi dodatnimi tetraedri. Pripravili smo dodatne osnovne gradnike (TET12SN-Sc(v3)GG in TET12SN-2xSc(v3)G), jih okarakterizirali in pokazali, da imajo vsi visoko aktivnost, primerljivo s prosto domeno SpyCatcher. Proteine smo uspešno izolirali ter z nativno-PAGE in analitsko gelsko filtracijo pokazali prisotnost vseh načrtovanih struktur. Pri vseh treh strukturah smo opazili odsotnost osnovnih gradnikov pri ekvimolarnem razmerju SpyTag:SpyCatcher, kar ponovno potrjuje visoko aktivnost domen in posledično visok izkoristek reakcije. Pri vseh reakcijah smo opazili, da je izmed reagentov ostal v raztopini le tisti, ki je bil dodan v presežku, medtem ko je drugi osnovni gradnik popolnoma reagiral. V kolikor je imel centralni osnovni gradnik (TET12SN-2xSc(v3) ali TET12SN-3xSc(v3)G) več reaktivnih mest, kot je bilo prostih ligandov, smo opazili zmanjševanje deleža najvišjega konjugata v prid manjšim konjugatom ob presežku gradnika, ki vsebuje proteinsko domeno SpyCatcher. Vse največje proteinske konjugate smo potrdili tudi z analizo sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih.
Kot dokaz, da sta domeni SpyCatcher in SpyTag zamenljivi, smo najbolj kompleksno strukturo (osnovni tetraeder, dekoriran s tremi dodatnimi tetraedri) pripravili z osnovnimi gradniki, katerim smo zamenjali domeni SpyCatcher in SpyTag. Pri reakciji med TET12SN-3xStR in TET12SN-Sc(v3)GG smo ponovno opazili zmanjšano aktivnost domene SpyTag pri TET12SN-3xStR, kar je privedlo do slabšega izkoristka reakcije, saj smo pri tej kombinaciji v ekvimolarnem razmerju SpyTag:SpyCatcher opazili prisotnost dikonjugiranega proteinskega kompleksa. S predstavljenimi eksperimenti smo postavili temelje, na podlagi katerih bomo lahko v prihodnjih raziskavah razvili tudi kompleksnejše strukture. Razvit sistem bi lahko izkoristili tudi za
101
razvoj različnih medicinskih aplikacij (npr. dvokomponentna tarčna dostava), uporaben bi bil v personalizirani medicini (npr. konjugacija želenih molekul preko SpyCatcher/SpyTag sistema na CCPO ogrodje glede na personalizirane potrebe pacienta) in industriji (npr. reakcijsko inženirstvo) itd.
Nadaljnji razvoj sistema 4.4.
Na osnovnem ogrodju TET12SN smo uspešno predstavili domene GFP, RFP, SpyCatcher in SpyTag ter pridobljene konstrukte obsežno okarakterizirali. Pri analizi sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih in in silico modeliranju se je izkazalo, da je proteinska domena, predstavljena na oglišču IV, gibljivejša kot ostale proteinske domene na drugih ogliščih. Za aplikacije, kjer bi to lahko predstavljalo težavo, smo razvili sistem, da bi bila proteinska domena na oglišču IV tudi fiksirana. Ker je bila povečana gibljivost posledica dejstva, da je proteinska domena vezana na ogrodje samo s svojim N' koncem, smo rigidizacijo dosegli s prestavitvijo mesta vstavitve v polipeptidno verigo za predstavitev na oglišču IV med APHshSN in P7SN – posledično smo prestavili tudi mesto vstavitve v polipeptidno verigo za oglišče I med prvi APHshSN in P3SN. Konstrukte z novim zaporedjem smo poimenovali TET12SN-new.
S kombinatornim sestavljanjem z uporabo Golden Gate encimov smo pripravili serijo konstruktov s predstavljenimi proteinskimi domenami fluorescenčnih proteinov GFP in RFP v različnih razmerjih, od vključno štirih GFP do vključno štirih RFP. Za razmerja GFP : RFP 1 : 3 in 2 : 2 smo pripravili po dva konstrukta za vsako razmerje za dodatno potrditev, da izbira oglišča za predstavitev ne vpliva na strukturo. Vseh sedem konstruktov smo uspešno izolirali in okarakterizirali z analitsko gelsko filtracijo in s sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih, sklopljenih z analitsko gelsko filtracijo.
Primerjava elucijskih profilov analitske genske filtracije je potrdila nagnjenost TET12SN-new-GGGG k tvorbi di- in trimerov po enem ciklu zamrzovanja in odmrzovanja, kar je posledica nagnjenosti GFP k tvorbi dimerov73. Z zmanjševanjem deleža GFP v konstruktu se je nagnjenost k di- in trimerizaciji zmanjševala. Primerjava rezultatov analitske gelske filtracije in sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih, sklopljenih z analitsko gelsko filtracijo parov z enakim razmerjem med GFP in RFP (new-RRGR in GRRR ter new-GGRR in TET12SN-new-GRGR), ni pokazala opaznih razlik. Na podlagi tega lahko trdimo, da proteinsko ogrodje TET12SN omogoča prosto izbiro oglišča predstavitve proteinske domene.
102
Proteinski origami s ponovljenimi ovitimi vijačnicami 4.5.
Uspešna dekoracija tetraedrske nanokletke je samo prvi korak k razvoju realne aplikacije. Za razvoj medicinsko in industrijsko uporabnih dekoriranih proteinskih origamijev bi bilo predhodno potrebno razviti večje proteinske nanokletke. Največji omejujoči faktor pri razvoju večjih poliedrskih struktur je omejen niz ovitih vijačnic.
Ker je razširitev niza ovitih vijačnic dolgotrajen in kompleksen postopek, nas je zanimalo, ali lahko isti par ovitih vijačnic znotraj iste strukture uporabimo večkrat. Za uspešno načrtovanje modelov smo najprej preverili mehanizem zvijanja tetraedrskih nanokletk iz ovitih vijačnic. Kot glavni prispevek pri mehanizmu zvijanja se je izkazala intramolekulska razdalja osnovnih gradnikov. Na podlagi razvitega modela zvijanja proteinskih origamijev, osnovanega na intramolekulski razdalji osnovnih gradnikov, smo uspešno načrtovali več proteinskih origamijev v obliki tetraedra z več kopijami enega ali več parov ovitih vijačnic in tako pokazali, da lahko iste osnovne gradnike uporabimo večkrat. Uporaba enega ali več parov ovitih vijačnic dvakrat ni vplivala na uspešnost izolacije niti na strukturo ali na ponovno in vitro zvijanje proteinske kletke po temperaturni denaturaciji. Poleg tega je analiza s sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih pokazala, da so proteinski origamiji z enim ali več parov ovitih vijačnic, ponovljenimi dvakrat, bolj podobni idealnemu tetraedru kot izhodiščna struktura TET12SN. To je lahko posledica zamenjave ovite vijačnice GCNshSN, ki je za 6 aminokislinskih ostankov krajša od ostalih vijačnic, kar je omogočilo enakomernejšo razdaljo med oglišči tetraedrske nanokletke. S povečevanjem deleža ponovljenih parov ovitih vijačnic se je v skladu s pričakovanji povečeval tudi delež trimerov in večjih oligomerov, ko smo proteine po temperaturni denaturaciji ponovno zvili – to lahko pripišemo večji možnosti za tvorbo medmolekulskih interakcij zaradi visoke ponovljivosti zaporedja.
Načrtovanje konstruktov s tremi ponovitvami parov ovitih vijačnic ni bilo uspešno kljub načrtovanju dveh različnih variant (TET12SN(3CC) in TET12SN(3CC-v2)). Protein s tremi kopijami para P5SN:P6SN smo lahko uspešno izolirali, vendar je analiza sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih razkrila, da protein nima tetraedrske oblike.
Predstavitev domen fluorescenčnih proteinov na novem ogrodju 4.6.
Ena glavnih prednosti predstavljenega sistema predstavitve proteinskih domen na ogliščih tetraedrskega proteinskega origamija je visoka modularnost osnovne strukture,
103
zato smo TET12SN v nadaljnjih raziskavah zamenjali s TET12SN(22CC).
TET12SN(22CC) ima strukturo, ki je bolj podobna idealnemu tetraedru, pa tudi izkoristek izolacije proteina je večji. Poleg tega je TET12SN(22CC) sestavljen iz manjšega števila različnih ovitih vijačnic, kar bi omogočilo hitrejši razvoj struktur za specifične aplikacije, kot so npr. nizko imunogene proteinske kletke, saj za hipoalergeno ogrodje ne potrebujemo šestih novih parov ovitih vijačnic, ampak samo štiri. Pri načrtovanju serije TET12SN(22CC)-new (okrajšano na TET22CC-new) smo ohranili enaka relativna mesta vstavitve v polipeptidno verigo, razmerja in zaporedja predstavljenih proteinskih domen GFP in RFP kot pri seriji konstruktov TET12SN-new.
Izolacija proteina TET22CC-new-GGGG ni bila uspešna, saj je bil delež monomerov premajhen za uspešno karakterizacijo. Poleg tega je bil protein nagnjen k tvorbi vidnih agregatov pri koncentraciji višji od 0,5 mg/mL, zato smo to strukturo izključili iz nadaljnjih analiz. Karakterizacija ostalih uspešno izoliranih konstruktov z analitsko gelsko filtracijo in s sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih, sklopljenih z analitsko gelsko filtracijo, je potrdila ujemanje struktur s strategijo načrtovanja.
Primerjava konstruktov, ki vsebujejo enako razmerje GFP in RFP (TET22CC-new-RRGR in TET22CC-new-GRRR ter TET22CC-new-GRGR in TET22CC-new-GGRR), podaja enake zaključke kot primerljivi konstrukt serije TET12SN-new. Primerjava elucijskih profilov analitske gelske filtracije konstruktov TET12SN-new in TET22CC-new z enakim zaporedjem predstavljenih fluorescenčnih proteinov je pokazala večjo nagnjenost TET22CC-new serije k di- in trimerizaciji, kar je lahko posledica večje ponovljivosti zaporedja.
Ker sipanje rentgenskih žarkov pri nizkih kotih ne omogoča direktne vizualizacije strukture proteina, smo en konstrukt analizirali še s krio-elektronsko mikroskopijo. Na podlagi preliminarnih poskusov smo se odločili za ogrodje TET12SN(22CC) in ne TET12SN, saj se je izkazalo, da je vizualizacija TET12SN(22CC) s krio-elektronsko mikroskopijo boljša zaradi večje rigidnosti strukture. Iz serije TET22CC-new proteinov smo se odločili za karakterizacijo TET22CC-new-RRRR zaradi boljšega ohranjanja monomernosti po zamrzovanju ter zadovoljive produkcije. Z dodatkom detergentov Tween-20 ali Triton X-100 v raztopino smo uspešno preprečili interakcijo med vzorcem in mrežicami do te mere, da smo lahko opazili monomerne nanodelce. Zaradi tanke in dolge strukture ovitih vijačnic, ki nimajo visoke optične gostote, struktur na neanaliziranih mikrografijah skoraj ni bilo opaziti – opazili pa smo jih po povprečenju
104
in formiranju 2D razredov. Uspešno prepoznavanje proteinov na mikrografih je bilo omogočeno z RFP proteinskimi domenami, ki so služile kot sidra, s pomočjo katerih smo lahko uspešno analizirali vzorec. Na podlagi 2D razredov povprečnih struktur lahko prepoznamo štiri RFP, razporejene v obliki tetraedra, povezane med seboj z ovitimi vijačnicami. Pridobljeni 2D razredi se skladajo s pričakovano obliko strukture.
Poskusi 3D rekonstrukcije niso bili uspešni zaradi slabe resolucije, nizke optične gostote ovitih vijačnic in majhnega vzorca mikrografov.
S pomočjo razvitega sistema smo na tetraedrskem ogrodju uspešno predstavili različne proteinske domene, ki imajo različne strukture ter različne biokemijske in fizikalne lastnosti, poleg tega pa ohranjajo specifične lastnosti predstavljenega proteina, kot sta fluorescenca (GFP, RFP) in katalitična aktivnost (SpyCatcher/SpyTag). V nadaljevanju smo opisani sistem uporabili tudi za uspešno predstavitev antigena RFP, ki je dosegel večjo imunizacijo miši v primerjavi s prostim antigenom. Razviti sistem ima potencial za raznolike aplikacije tako na področjih medicine (imunizacija, personalizirana medicina) in industrije (reakcijsko inženirstvo) kot tudi za razvoj biosenzorjev ter označevalcev za krio-mikroskopijo in korelacijsko krio-elektronsko mikroskopijo.
Poleg tega je opisani sistem predstavitve proteinskih domen na ogliščih osnovan na proteinskem origamiju, ki omogoča še dodatne priložnosti za prilagoditev ogrodja vsaki specifični aplikaciji.
105
5. Zaključek
V doktorskem delu smo razvili sistem predstavitve proteinskih domen na ogliščih tetraedrskega proteinskega origamija. Razviti sistem smo uporabili za uspešno predstavitev antigena RFP na proteinskem ogrodju TET12SN-RRRR, ki je v miših izzval tvorbo protiteles IgG robustneje in zanesljivejše kot sam prosti antigen. Opazili smo tudi razvoj IgG protiteles proti ogrodnemu proteinu TET12SN, čemur bi se lahko izognili z uporabo manj imunogenih ovitih vijačnic.
Na ogrodnem proteinu TET12SN smo uspešno okarakterizirali in predstavili proteinske domene SpyCatcher in SpyTag. Aktivnost proteinske domene SpyCatcher se je ohranila, medtem ko se je aktivnost domene SpyTag, predstavljene na oglišču TET12SN, spreminjala glede na oglišče predstavitve. Kljub temu smo opazili visoko učinkovitost tvorjenja večjih proteinskih kompleksov, ki jih lahko opišemo s centralnim tetraedrskim proteinskim origamijem, na katerega so z izopeptidno vezjo preko domen SpyCatcher/SpyTag vezana (i) eno, (ii) dve ali (iii) tri ligandna tetraedrska proteinska ogrodja. Nastali kompleksi predstavljajo do sedaj največje okarakterizirane proteinske origamije.
Tekom doktorske naloge smo se spopadli tudi z vprašanjem možnosti večkratne uporabe ovitih vijačnic znotraj istega tetraedrskega proteinskega origamija in uspešno načrtovali protein, sestavljen iz treh različnih parov ovitih vijačnic, pri čemer je vsak uporabljen dvakrat TET12SN(222CC), kar bo olajšalo razvoj večjih proteinskih origamijev iz ovitih vijačnic. Istočasno smo razvili tudi tetraedrsko nanokletko TET12SN(22CC), ki ima dva para ovitih vijačnic ponovljena dvakrat, in se zaradi visoke monomernosti, večjih izkoristkov izolacije in idealne tetraedrske oblike uporablja kot osnova za nadaljnje študije.
Na podlagi in silico analiz smo potrdili, da ima proteinska domena, predstavljena na oglišču IV, visoko gibljivost, katero smo odpravili s prestavitvijo mesta vstavitve v polipeptidno verigo. Da bi potrdili uspešnost odstranitev gibljivosti, smo naredili serijo sedmih proteinskih konstruktov, pri katerih smo spreminjali razmerje med domenama GFP in RFP od 4 : 0 do 0 : 4. Pripravili smo tudi homologno serijo konstruktov, pri katerih smo ogrodje TET12SN zamenjali s TET12SN(22CC). Z uporabo obeh ogrodij smo pokazali, da izbira oglišča za predstavitev proteinske domene ne vpliva na
106
uspešnost dekoracije. Protein TET22CC-new-RRRR smo tudi uspešno vizualizirali s krio-elektronsko mikroskopijo.
Visoko modularnost in robustnost razvitega sistema smo pokazali (i) s predstavitvijo različnih proteinskih domen (RFP, GFP, SpyCatcher in SpyTag), (ii) z odstranjevanjem odvečne gibljivosti proteinske domene, predstavljene na oglišču IV (TET12SN v TET12SN-new in TET22CC-new), (iii) z zamenjavo proteinskega ogrodja (TET12SN v TET12SN(22CC)) in (iv) z zamenjavo oglišč za predstavitev proteinskih domen (npr.
TET12SN-new-RRGR in TET12SN-new-GRRR). Poleg tega smo vzporedno razvili tudi sistem hierarhičnega sestavljanja z uporabo Golden gate, ki nam je omogočil hitro kloniranje večje količine konstruktov.
Razvit sistem predstavitve proteinskih domen na ogliščih proteinskega origamija predstavlja korak k razvoju realnih aplikacij za medicinske (imunizacija, personalizirana
Razvit sistem predstavitve proteinskih domen na ogliščih proteinskega origamija predstavlja korak k razvoju realnih aplikacij za medicinske (imunizacija, personalizirana