Odstranjene regije proteinske domene SpyCatcher v sekvenci in modelu

SpyCatcher(v1) zajema zelen, vijoličen in oranžen del prikazanega modela, SpyCatcher(v2) samo vijoličen in zelen, medtem ko SpyCatcher(v3) opisuje samo vijoličen del prikazanega modela.

TET12SN-3xSc(v2)G in TET12SN-3xSc(v3)G smo uspešno izolirali in ju karakterizirali z analitsko gelsko filtracijo in sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih (Slika 13). Daljši elucijski čas analitske gelske filtracije je potrdil, da sta TET12SN-3xSc(v2)G in TET12SN-3xSc(v3)G manjši molekuli (Slika 13, D), medtem ko je analiza sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih potrdila strukturi pričakovane oblike (Slika 13, A-Č). Na podlagi modelov, ki so se najbolje prilegali eksperimentalno

pomerjeni krivulji sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih, smo potrdili, da je odstranitev odvečnih regij v predstavljeni domeni SpyCatcher uspešno zmanjšala neželeno fleksibilnost dobljene strukture. Ker ima TET12SN-3xSc(v3)G najmanjšo gibljivost predstavljenih domen, smo v nadaljnjih korakih uporabljali le-tega.

Slika 13: Analiza TET12SN-3xSc(v2)G in TET12SN-3xSc(v3)G. Analiza sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih proteina 3xSc(v2)G (A) in TET12SN-3xSc(v3)G (B). Strukturna modela, ki najbolj ustrezata eksperimentalno pomerjeni krivulji sipanja rentgenskih žarkov za vzorec 3xSc(v2)G (C) in TET12SN-3xSc(v3)G (Č). Ogrodje je prikazano v modri, GFP v zeleni in SpyCatcher v vijolični barvi. (E) Elucijski profil TET12SN-3xScG (zelena), TET12SN-3xSc(v2)G (oranžna) in TET12SN-3xSc(v3)G (vijolična).

Da bi potrdili, da skrajšana domena SpyCatcher(v3) ohrani aktivnost, smo pripravili fuzijo SpyCatcher(v3)-GFP (Sc(v3)-GFP) in SpyTag-RFP (St-RFP) ter produkte reakcije analizirali z nativno-PAGE (Slika 14).

Slika 14: Aktivnost SpyCatcher(v3)-GFP (Sc(v3)-GFP) in SpyTag-RFP (St-RFP), analizirana z nativno poliakrilamidno elektroforezo.

Po uspešni potrditvi aktivnosti domene SpyCatcher(v3) smo želeli potrditi, da se je aktivnost ohranila tudi po predstavitvi domene v oglišča TET12SN. Pripravili smo reakcijske mešanice TET12SN-3xSc(v3)G in StR v različnih razmerjih in jih analizirali z nativno-PAGE in analitsko gelsko filtracijo. Z nativno-PAGE smo pokazali tvorbo mono-, di- in trikonjugiranega produkta TET12SN-3xSc(v3) in StR (Slika 15, A).

Reakcija je potekla s skoraj 100 % učinkovitostjo. Opazili smo manjši delež dikonjugata, ki se ni pretvoril v trikonjugat kljub dodanemu presežku prostega StR.

Analiza z analitsko gelsko filtracijo je potrdila dognanja nativne-PAGE (Slika 15, B).

Slika 15: Tvorba proteinskega kompleksa med TET12SN-3xSc(v3)G in SpyTag-RFP.

(A) Nativna-PAGE dokazuje visoko aktivnost TET12SN-3xSc(v3)G. Na levi strani je prikazan neobarvan gel, zelene lise pripadajo TET12SN-Sc(v3)G, rdeče SpyTag-RFP, medtem ko oranžne lise pripadajo nastalim proteinskim kompleksom. (B) Elucijske krivulje gelske filtracije na Superdex 200 Increase 10/300 koloni: zelena črtkana krivulja pripada TET12SN-3xSc(v3)G, rdeča črtkana SpyTag-RFP, medtem ko ostale prikazujejo vzorce z različnimi molarnimi razmerji med proteinskimi domenami SpyCatcher in SpyTag.

59 Integracija SpyTag na TET12SN

Po uspešni predstavitvi SpyCatcher sistema na TET12SN smo želeli preveriti uspešnost predstavitve SpyTag na ogliščih TET12SN. Po vzoru TET12SN-3xSc(v3)G smo pripravili konstrukt, ki je imel predstavljene tri domene SpyTag na ogliščih ogrodja TET12SN, združenega z rdečim fluorescenčnim proteinom in ga poimenovali TET12SN-3xStR. Aktivnost nove proteinske variante smo preverili s proteinom Sc(v3)-GFP. Na podlagi analize nativne-PAGE smo določili, da pri molarnem razmerju SpyTag:SpyCatcher 1 : 1 izkoristek nastanka trikonjugiranega produkta ni 100 % - s povečevanjem presežka do molarnega razmerja 1 : 4 v prid liganda nakazuje slabšo aktivnost SpyTag predstavljenega na TET12SN v primerjavi s prosto proteinsko domeno SpyTag (Slika 16, A). Da bi določili, ali gre za steričen efekt ali pa je to intrinzična lastnost posamičnih oglišč, smo pripravili serijo variant, kjer smo na vsakem posamičnem oglišču predstavili domeno SpyTag. Dobljene kontrukte smo poimenovali v skladu z ogliščem predstavitve – npr. TET12SN-I-StR vsebuje domeno SpyTag, predstavljeno na oglišču I (Slika 16, B).

Slika 16: Tvorba proteinskega kompleksa med TET12SN-3xStR in Sc(v3)GFP. (A) Nativna-PAGE dokazuje slabšo aktivnost TET12SN-3xStR. Na levi strani je prikazan neobarvan gel, zelene lise pripadajo Sc(v3)-GFP, rdeče TET12SN-3xStR, medtem ko oranžne ali svetlo zelene lise pripadajo nastalim proteinskim kompleksom. (B) Zaporedje osnovnih gradnikov z označenimi mesti, ki vplivajo, se ujemajo z oznakami oglišč, ki so dekorirana s proteinskimi domenami SpyTag.

Aktivnost proteinskih konstruktov TET12SN-I-StR, TET12SN-II-StR in TET12SN-III-StR smo okarakterizirali z nativno-PAGE in analitsko gelsko filtracijo (Slika 17 in 18).

V vseh treh primerih smo opazili tvorbo konjugiranega kompleksa, vendar smo opazili razliko v reaktivnosti – domena SpyTag, predstavljena na oglišču II, je tvorila samo monokonjugiran proteinski kompleks pri dvakratnem pribitku (Slika 17, C in Č). Nižjo učinkovitost tvorbe monokonjugiranega proteinskega kompleksa ima TET12SN-I-StR, pri katerem prosti TET12SN-I-StR popolnoma reagira šele pri trikratnem presežku ligandnega proteina (Slika 17, A in B). Najslabšo aktivnost ima domena SpyTag, predstavljena na oglišču III, ki ne reagira popolnoma niti pri šestkratnem presežku ligandnega proteina (Slika 18, A in B).

Slika 17: Tvorba proteinskega kompleksa med TET12SN-I-StR in Sc(v3)-GFP (A in B) ter TET12SN-II-StR in Sc(v3)-GFP (C in Č). Nativna-PAGE dokazuje nastanek monokonjugiranega proteinskega kompleksa med TET12SN-I-StR in Sc(v3)-GFP (A), vendar TET12SN-II-StR tvori monokonjugiran proteinski kompleks s Sc(v3)-GFP uspešneje (Č). Na levi strani je prikazan neobarvan gel, zelene lise pripadajo Sc(v3)-GFP, rdeče TET12SN-I-StR (A) ali TET12SN-II-StR (Č), medtem ko oranžne lise pripadajo nastalim proteinskim kompleksom. (B in C) Elucijske krivulje po gelski filtraciji: zelena črtkana krivulja pripada Sc(v3)-GFP, rdeča pa TET12SN-I-StR (B) ali TET12SN-II-StR (C), medtem ko ostale prikazujejo vzorce z različnimi molarnimi razmerji med proteinskimi domenami SpyCatcher in SpyTag.

Slika 18: Tvorba proteinskega kompleksa med TET12SN-III-StR in Sc(v3)-GFP. (A) Nativna-PAGE dokazuje nastanek monokonjugiranega proteinskega kompleksa med TET12SN-III-StR in Sc(v3)-GFP, vendar je izkoristek reakcije slabši od prej opisanih primerov. Na levi strani je prikazan neobarvan gel, zelene lise pripadajo Sc(v3)-GFP, rdeče TET12SN-III-RFP, medtem ko oranžne lise pripadajo nastalim proteinskim kompleksom. (B) Elucijske krivulje po gelski filtraciji: zelena črtkana krivulja pripada Sc(v3)-GFP, rdeča pa TET12SN-III-StR, medtem ko ostale prikazujejo vzorce z različnimi molarnimi razmerji med proteinskimi domenami SpyCatcher in SpyTag.

Da bi raziskali, ali prihaja do kompeticije med proteinskimi domenami SpyTag, smo pripravili tudi dva proteinska konstrukta z dvema domenama SpyTag. Ker ima oglišče II najboljšo aktivnost, smo se odločili, da bomo kombinirali oglišči I in II ter II in III.

Pridobljene konstrukte smo poimenovali po ogliščih vstavitve proteinske domene SpyTag– TET12SN-I, II-2xStR in TET12SN-II, III-2xStR. Tudi te konstrukte smo z vezavo na Sc(v3)-GFP testirali na aktivnost (Slika 19). Analiza tvorbe mono- in dikonjugiranih proteinskih kompleksov med TET12SN-I, II-2xStR in Sc(v3)-GFP je potrdila tvorbo dikonjugiranih proteinskih kompleksov, ki ustrezajo vezavi liganda na

obe oglišči, ter monokonjugiranega proteinskega kompleksa, ki ustreza vezavi ligandnega proteina samo na domeno SpyTag na oglišču II (Slika 19, A in B), kar je primerljivo z aktivnostjo TET12SN-I-StR in Sc(v3)-GFP. TET12SN-II, III-2xStR prav tako tvori dikonjugirane proteinske komplekse, ki ustrezajo vezavi Sc(v3)-GFP na obe proteinski domeni SpyTag, medtem ko monokonjugiran proteinski kompleks predstavlja Sc(v3)-GFP, vezan na proteinsko domeno SpyTag na oglišču II (Slika 19, C in Č). Na podlagi nativne-PAGE in analitske gelske filtracije smo potrdili, da ne prihaja do tekmovanja med domenami SpyTag, saj je učinkovitost tvorbe mono- in dikonjugiranih proteinskih kompleksov primerljiva z aktivnostjo domen SpyTag na posamičnih ogliščih.

Slika 19: Tvorba proteinskega kompleksa med TET12SN-I, II-2xStR in Sc(v3)-GFP (A in B) ter TET12SN-II, III-2xStR in Sc(v3)-GFP (C in Č). Nativna-PAGE dokazuje nastanek mono- in dikonjugiranega proteinskega kompleksa med TET12SN-I, II-2xStR in Sc(v3)-GFP (A) s primerljivo aktivnostjo TET12SN-I-StR in TET12SN-II-StR. Analiza tvorbe mono- in dikonjugiranih proteinskih kompleksov TET12SN-II,III-2xStR in Sc(v3)-GFP z nativno-PAGE prav tako nakazuje primerljivo aktivnost domene SpyTag na posamičnih ogliščih (Č). Na levi strani je prikazan neobarvan gel, zelene lise pripadajo Sc(v3)-GFP, rdeče TET12SN-I,II-2xStR (A) ali TET12SN-II,III-2xStR (Č), medtem ko oranžne lise pripadajo nastalim proteinskim kompleksom. (B in C) Elucijske

krivulje po gelski filtraciji: zelena črtkana krivulja pripada Sc(v3)-GFP, rdeča pa TET12SN-I,II-2xStR (B) ali TET12SN-II,III-2xStR (C), medtem ko ostale prikazujejo vzorce z različnimi molarnimi razmerji med proteinskimi domenami SpyCatcher in SpyTag.

Sestavljanje kompleksnejših struktur

Kombiniranje različnih razmerij predstavljenih dimerizacijskih domen SpyCatcher in SpyTag omogoča načrtovanje tudi kompleksnejših struktur, kot je npr. bipiramidalna kletka. Vsem večjim, kompleksnejšim strukturam je skupno to, da je potrebno povezati v isto molekulo več monomernih enot. Da bi bolje pokazali obvladovanje SpyCatcher/SpyTag sistema v CCPO strukturah, smo načrtovali tri strukture: (i) dva tetraedra, povezana med seboj z eno domeno SpyCatcher/SpyTag (Slika 20, A), (ii) centralni tetraeder, ki je povezan z dvema tetraedroma (Slika 20, B) in (iii) centralni tetraeder, ki je povezan s tremi dodatnimi tetraedri (Slika 20, C).

Slika 20: Sheme načrtovanih proteinskih kompleksov, kjer je centralno ogrodje dekorirano z eno (A), dvema (B) ali tremi (C) SpyCatcher(v3) proteinskimi domenami, na katere se veže tetraedrska nanokletka, dekorirana s SpyTag. Struktura (D) je

homologna strukturi (C), le da je centralno ogrodje dekorirano s tremi proteinskimi domenami SpyTag, medtem ko je ligandno ogrodje dekorirano s proteinsko domeno SpyCatcher(v3). Proteinska domena SpyCatcher(v3) je prikazana z vijolično, SpyTag z oranžno, GFP z zeleno, RFP z rdečo, medtem ko je tetraedrski proteinski origami svetlo moder, če ima na ogliščih predstavljeno proteinsko domeno SpyCatcher(v3), ali temno moder, če ima na ogliščih predstavljeno proteinsko domeno SpyTag.

Karakterizacija osnovnih gradnikov

Za pripravo zgoraj opisanih struktur smo dodatno načrtovali sledeče konstrukte:

proteinsko ogrodje TET12SN z eno (TET12SN-Sc(v3)GG) in dvema domenama SpyCatcher (TET12SN-2xSc(v3)G). Aktivnost proteinov, ki so vsebovali proteinsko domeno SpyCatcher, smo ovrednotili z dodatkom St-RFP v različnih razmerjih. Analizi z nativno-PAGE in analitsko gelsko filtracijo sta potrdili nastanek monokonjugata Sc(v3)GG in St-RFP (Slika 21, A in B) ter dikonjugata TET12SN-2xSc(v3)G in dveh St-RFP (Slika 21, C in Č) pri razmerju SpyTag:SpyCatcher 1 : 1. Pri TET12SN-2xSc(v3)G in St-R v razmerju SpyTag:SpyCatcher 0,5 : 1 smo, v skladu s pričakovanji, opazili nastanek monokonjugata.

Slika 21: Tvorba proteinskega kompleksa med TET12SN-1xSc(v3)GG in St-RFP (A in B) ter TET12SN-2xSc(v3)G in St-RFP (C in Č). Nativna-PAGE dokazuje nastanek monokonjugiranega proteinskega kompleksa med TET12SN-1xSc(v3)GG in St-RFP s praktično popolnim izkoristkom (A). Analiza tvorbe mono- in dikonjugiranih proteinskih kompleksov TET12SN-II,III-2xStR in Sc(v3)-GFP z nativno-PAGE prav tako nakazuje praktično popolno reaktivnost (Č). Na levi strani je prikazan neobarvani gel, zelene lise pripadajo TET12SN-1xSc(v3)GG (A) in TET12SN-2xSc(v3)G (Č), rdeče StR, medtem ko oranžne lise pripadajo nastalim proteinskim kompleksom. (A in Č) Elucijske krivulje po gelski filtraciji: zelena črtkana krivulja pripada TET12SN-1xSc(v3)GG (B) in TET12SN-2xSc(v3)G (Č), rdeča St-RFP, medtem ko ostale prikazujejo vzorce z različnimi molarnimi razmerji med proteinskimi domenami SpyCatcher in SpyTag.

Izmed vseh pripravljenih variant TET12SN, ki imajo oglišča dekorirana s proteinsko domeno SpyTag, smo za nadaljnjo karakterizacijo izbrali TET12SN-II-StR, saj ima le-ta največjo aktivnost.

Vse dodatne osnovne gradnike smo analizirali s sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih (Slika 22). Vse tri strukture so imele Rg in Dmax večji od osnovnega ogrodja TET12SN (Dmax = 10,3 nm, Rg = 3,5 nm), kar nakazuje na uspešno predstavitev želenih proteinskih domen. Poleg tega Kratkyjevi grafi ponovno dokazujejo gibljivo strukturo z več proteinskimi domenami, kar je v skladu z uporabljeno strategijo načrtovanja.

Uspešna predstavitev proteinskih domen je bila potrjena tudi s primerjavo teoretičnih krivulj z eksperimentalnimi podatki.

Slika 22: Rezultati analize sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih za konstrukte TET12SN-1xSc(v3)GG (A in Č), TET12SN-2xSc(v3)G (B in D) ter TET12SN-II-StR (C in E). Analiza eksperimentalnih krivulj dokazuje prisotnost gibljivih proteinskih domen, kar je v skladu z načrtovano strategijo (A-C). Prikazani so strukturni modeli, ki najbolj ustrezajo eksperimentalno izmerjeni krivulji za proteinske konstrukte TET12SN-1xSc(v3)GG (Č), TET12SN-2xSc(v3)G (D) ter TET12SN-II-StR (E). Vijolično so

obarvane proteinske domene SpyCatcher(v3), oranžno SpyTag, zeleno GFP, rdeče RFP in modro TET12SN.

TET12SN-1xSc(v3)GG+TET12SN-II-StR

Po uspešni potrditvi aktivnosti vseh osnovnih gradnikov smo pripravili prvo strukturo dveh tetraedrov, ki sta med seboj povezana preko ene SpyCatcher/SpyTag izopeptidne vezi. Izvedli smo reakcije med TET12SN-II-StR in TET12SN-Sc(v3)GG v molarnih razmerjih SpyTag:SpyCatcher od 1 : 3 do 2 : 1. Analiza z nativno-PAGE in analitsko gelsko filtracijo je potrdila robustnost reakcije z nastankom monokonjugata v vseh pripravljenih razmerjih (Slika 23, A in B). Ob presežku katerega koli reagenta je druga komponenta reagirala v celoti. Eksperimentalna krivulja sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih se ujema s teoretično krivuljo monokonjugiranega kompleksa (Slika 23, C in Č). Dmax in Rg sta v primerjavi s posamičnimi komponentami večja (Slika 22, A in C). Med in silico generiranjem modelov smo opazili večjo mero prostega gibanja med posamičnimi nanokletkami.

Slika 23: Rezultati analize nastanka proteinskega kompleksa med TET12SN-1xSc(v3)GG in TET12SN-II-StR. Rezultati nativne-PAGE (A) in analitske gelske filtracije (B) dokazujejo nastanek monokonjugiranega proteinskega kompleksa v molarnem razmerju SpyTag:SpyCatcher 1 : 1. Nastanek proteinskega kompleksa pričakovane velikosti in oblike smo potrdili tudi s sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih (Č). Prikazan je tudi strukturni model, ki najbolje ustreza eksperimentalni krivulji sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih (C).

TET12SN-2xSc(v3)G+TET12SN-II-StR

Za potrditev strukture centralnega tetraedra, dekoriranega z dvema tetraedroma, smo izvedli reakcije med TET12SN-2xSc(v3)G in TET12SN-II-StR v razmerju SpyTag:SpyCatcher od 1 : 3 do 3 : 1. Analiza z nativno-PAGE in analitsko gelsko filtracijo je potrdila nastanek mono- in dikonjugata. Pri reakcijah s presežkom TET12SN-2xSc(v3)G smo opazili več mono- kot dikonjugata, medtem ko je pri

ekvimolarnem razmerju in presežku TET12SN-II-StR delež monokonjugata zanemarljiv, prisotni so samo dikonjugati (Slika 24, A in B). Kot prejšnjega smo tudi ta proteinski kompleks analizirali s sipanjem rentgenskih žarkov. Na eksperimentalno krivuljo smo prilegali modele posamičnih gradnikov mono- in dikonjugata. Najboljše ujemanje smo opazili s primerjavo modelov dikonjugiranega proteinskega kompleksa (Slika 24, C). Dejstvo, da gre res za dikonjugat, smo potrdili tudi s primerjavo Dmax in Rg, kjer sta obe vrednosti višji kot pri monokonjugiranem proteinskem kompleksu TET12SN-Sc(v3)GG+TET12SN-II-StR (Slika 23, Č; Slika 24, Č).

Slika 24: Rezultati analize nastanka proteinskega kompleksa med TET12SN-2xSc(v3)G in TET12SN-II-StR. Rezultati nativne-PAGE (A) in gelske filtracije (B) dokazujejo nastanek mono- in dikonjugiranega proteinskega kompleksa, medtem ko je že pri ekvimolarnem razmerju med SpyCatcher in SpyTag prisoten samo dikonjugiran proteinski kompleks. Nastanek proteinskega kompleksa pričakovane velikosti in oblike smo potrdili tudi s sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih (Č). Prikazan je tudi

strukturni model, ki najbolje ustreza eksperimentalni krivulji sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih (C).

TET12SN-3xSc(v3)G+TET12SN-II-StR

Naslednja načrtovana struktura je tetraeder, dekoriran s tremi dodatnimi tetraedri.

Nastanek trikonjugata smo ovrednotili pri različnih razmerjih TET12SN-3xSc(v3)G in TET12SN-StR, v končnem molarnem razmerju SpyTag:SpyCatcher od 1 : 4 do 5 : 1.

Nastanek trikonjugata smo opazili pri vseh preizkušenih razmerjih, vendar je bil izkoristek reakcije boljši pri presežku TET12SN-II-StR (Slika 25, A in B). Analiza sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih je potrdila prisotnost trikonjugiranega proteinskega kompleksa. V primerjavi z dikonjugiranim proteinskim kompleksom TET12SN-2xSc(v3)G + 2xTET12SN-II-StR se Dmax ni povečal, medtem ko je Rg rahlo narastel s 7,9 na 8,3 nm (Slika 25, C in Č).

Slika 25: Rezultati analize nastanka proteinskega kompleksa med TET12SN-3xSc(v3)G in TET12SN-II-StR. Rezultati nativne-PAGE (A) in gelske filtracije (B) dokazujejo nastanek mono-, di- in trikonjugiranega proteinskega kompleksa, medtem ko je v ekvimolarnem razmerju med SpyCatcher in SpyTag ter presežku TET12SN-II-StR

prisoten samo trikonjugiran proteinski kompleks. Nastanek proteinskega kompleksa pričakovane velikosti in oblike smo potrdili tudi s sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih (Č). Prikazan je strukturni model, ki najbolje ustreza eksperimentalni krivulji sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih (C).

TET12SN-3xStR+TET12SN-Sc(v3)GG

Ker smo želeli dokazati, da sta domeni SpyCatcher in SpyTag med seboj zamenljivi, smo želeli pripraviti homologno strukturo TET12SN-3xSc(v3)G, dekorirano s tremi domenami SpyTag (TET12SN-3xStR), le da smo med seboj zamenjali domeni SpyCatcher in SpyTag na način, da ima osrednji tetraeder predstavljene tri domene SpyTag (TET12SN-3xStR), periferni tetraedri pa vsebujejo samo eno domeno SpyCatcher (TET12SN-Sc(v3)GG). Na podlagi rezultatov analitske gelske filtracije in nativne-PAGE analize smo potrdili, da pri presežku TET12SN-Sc(v3)GG nastanejo izključno trikonjugati, medtem ko se delež trikonjugatov zmanjšuje v prid monokonjugatov s povečevanjem presežka TET12SN-3xStR (Slika 26).

Slika 26: Rezultati analize nastanka proteinskega kompleksa med TET12SN-3xStR in TET12SN-1xSc(v3)GG. Rezultati nativne-PAGE (A) in gelske filtracije (B) dokazujejo nastanek mono-, di- in trikonjugiranega proteinskega kompleksa, medtem ko je v presežku TET12SN-1xSc(v3)GG prisoten praktično samo trikonjugiran proteinski kompleks.

Nadaljnji razvoj sistema 3.3.

Modeliranje in analize sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih so pokazale, da ima četrta domena, ki smo jo predstavili na koncu polipeptidne verige, večjo mobilnost kot ostale tri. Da bi bila celotna struktura bolj rigidna, smo pripravili nove konstrukte na način, da so vse štiri predstavljene domene z osnovnim ogrodjem povezane preko svojih N’ in C’ koncev, in ne samo tri. Konstrukte nove serije smo poimenovali TET12SN-new. Pri načrtovanju novih mest vstavitve domen v polipeptidno verigo smo se držali načela, da sta zaporedni predstavljeni domeni oddaljeni vsaj dva peptidna segmenta, ki tvorita ovito vijačnico. Mesto vstavitve za predstavitev na oglišču I smo prestavili za

prvi APHshSN, mesto za oglišče IV pa za drugi APHshSN, medtem ko sta mesti za oglišči II in III ostali enaki (Slika 27).

Slika 27: Mesta vstavitve proteinskih domen v TET12SN. (A) Mesta vstavitve proteinskih domen v TET12SN na način, da ima proteinska domena, predstavljena na oglišču, večjo gibljivost v primerjavi z ostalimi. (B) Mesto vstavitve proteinskih domen za predstavitev na ogliščih I in IV je bilo spremenjeno na način, da je gibljivost predstavljene proteinske domene primerljiva z ostalimi.

S kombinatornim hierarhičnim sestavljanjem s pomočjo Golden Gate smo pripravili serijo konstruktov s štirimi predstavljenimi proteinskimi domenami. Izbrali smo domene GFP in RFP, ki smo jih v različnih razmerjih predstavili v vseh štirih ogliščih proteinske kletke TET12SN. Pripravljene konstrukte smo poimenovali po zaporedju oglišč predstavljenih fluorescenčnih proteinov v sekvenci: TET12SN-new-GGGG, new-GGGR, new-GGRR, new-GRGR, TET12SN-new-GRRR, TET12SN-new-RRGR in TET12SN-new-RRRR. Vse proteine smo izolirali iz topne frakcije celičnega lizata bakterije E.coli z uporabo NiNTA- afinitetne kromatografije in gelske filtracije. Analiza proteinov z analitsko gelsko filtracijo je potrdila, da so vsi izolirani konstrukti monomerni s primerljivimi elucijskimi volumni, ki ustrezajo pričakovanemu (Slika 28). Nadaljnja primerjava elucijskih profilov je pokazala na nagnjenost proteinov z večjim številom kopij domene GFP k tvorjenju di- in trimernih struktur po zamrzovanju, česar nismo opazili pri proteinih z večjim deležem RFP (Slika 28).

Slika 28: Elucijske krivulje proteinskih konstruktov, pri katerih sta mesta vstavitve v verigo TET12SN za oglišči I in IV spremenjeni. Opazili smo povečevanje nastanka di- in trimerov pri zamrzovanju s povečevanjem deleža GFP proteinskih domen znotraj nanodelcev.

Zaradi večje gibljivosti sistema smo za vsak konstrukt in silico po principu homolognega modeliranja generirali 1000 modelov, med katerimi smo nato iskali najboljše prileganje eksperimentalnim rezultatom, izmerjenih s sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih, sklopljenim z gelsko filtracijo. 500 izmed 1000 modelov je bilo namenoma načrtovanih z večjo mero gibljivosti, medtem ko je bilo preostalih 500 načrtovanih kot bolj rigidnih. Z analizo krivulj sipanja smo za vse načrtovane proteine potrdili pričakovano strukturo, ki ustreza obliki tetraedrskega ogrodja s predstavljenimi fluorescenčnimi proteini na ogliščih (Sliki 29 in 30). Kratkyjevi grafi za posamezne proteine potrjujejo fleksibilno strukturo z več proteinskimi domenami, kar je v skladu s strategijo CCPO. TET12SN-new-GGGG in TET12SN-new-RRRR imata najnižjo vrednost Dmax (17,0 in 16,5 nm), medtem ko so vrednosti Dmax ostalih konstruktov višje (od 18,5 do 21,0 nm). Enak trend se pokaže tudi pri primerjavi vrednosti Rg (5,2 nm za TET12SN-new-GGGG in 5,3 nm za TET12SN-new-RRRR, ostali proteinski konstrukti

15 20 25 30

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

1.0 TET12SN-new-RRRR TET12SN-new-RRGR TET12SN-new-GRRR TET12SN-new-GGRR TET12SN-new-GRGR TET12SN-new-GGGR TET12SN-new-GGGG

min Normalizirana A280nm

imajo Rg vrednosti od 5,5 do 6,0 nm). Na podlagi modelov in sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih smo potrdili tudi povečano rigidnost zadnje fluorescenčne domene. Analiza krivulj P(r) dokazuje prisotnost dveh različnih proteinskih domen – prvi vrh pri 4 nm ustreza ogrodnemu proteinu TET12SN, medtem ko vrhova pri 6 in 8 nm ustrezata domenama GFP in RFP. Primerjava krivulj P(r) razkrije premik drugega vrha glede na razmerje med GFP in RFP v molekuli. Poleg tega se krivulje P(r)

In document PREDSTAVITEV PROTEINSKIH DOMEN NA OGRODJU PROTEINSKEGA ORIGAMIJA IZ OVITIH VIJAČNIC V OBLIKI TETRAEDRA (Strani 81-106)