Izkazalo se je, da imajo ovite vijačnice znotraj TET12SN različno kinetiko zvijanja (A) od prostih (B), na podlagi katerih smo rekonstruirali zaporedje tvorbe ovitih vijačnic (C in Č), ki se sklada z intramolekulsko razdaljo med posamičnimi segmenti znotraj verige.
Da bi pokazali, da je zvijanje proteinskega origamija na osnovi ovitih vijačnic odvisno od intramolekulske razdalje med peptidnima segmentoma, ki tvorita posamezno ovito vijačnico, smo izmerili zvijanje posamičnih prostih osnovnih gradnikov. Meritve FRET z ustavljenim tokom so pokazale, da imajo osnovni gradniki drugačno kinetiko tvorjenja
83
od tiste, ki smo jo opazili v proteinskem origamiju (Slika 33). Izmerili smo tudi temperaturo prehoda za posamezne ovite vijačnice (Slika 32, C in D). Rezultati kažejo na dejstvo, da vrstni red tvorjenja ovitih vijačnic znotraj polipeptidne verige ni v skladu s hitrostjo zvijanja posamičnih ovitih vijačnic ali s temperaturo prehoda, ampak je v sorazmerju z intramolekulsko razdaljo med peptidnima segmentoma, ki tvorita posamezno ovito vijačnico.
Slika 33: Rezultati merjenja talilne krivulje s CD spektroskopijo. (A) prikazuje eksperimentalno pomerjene vrednosti z modeli za vsak par prostih ovitih vijačnic. (B) prikazuje izračunane temperature prehoda.
84
Načrtovanje proteinskih kletk s ponovljenimi pari ovitih vijačnic 3.4.2.
Dejstvo, da je zvijanje proteinskih nanokletk odvisno predvsem od intramolekulske razdalje med peptidnima segmentoma, ki tvorita ovito vijačnico, omogoča načrtovanje novih struktur na način, da se ista ovita vijačnica uporabi več kot enkrat. Za preučevanje vpliva ponavljanja osnovnih gradnikov smo naredili poenostavljen model zvijanja (Slika 32, C). Vsi modeli so začeli zvijanje v razvitem stanju in v vsakem koraku se je tvorila ovita vijačnica med ustreznima peptidnima segmentoma, ki sta imela v danem koraku najkrajšo intramolekulsko razdaljo. Če sta bili na razpolago dve ali več enakovrednih možnosti, se je pot zvijanja razčlenila in v naslednjih korakih je bila vsaka možnost upoštevana posamično. Po vsakem koraku smo ponovno preračunali intramolekulske razdalje, ki so bile uporabljene v naslednjem koraku. Iz simulacije zvijanja smo sklepali, ali se je protein zvil v načrtovano strukturo ali pa pravilno zvitje ni bilo možno.
Karakterizacija tetraedrskih nanokletk s ponovljenimi ovitimi 3.4.3.
vijačnicami
Na zgoraj opisani način smo uspešno načrtovali aminokislinsko zaporedje tetraedrske kletke, sestavljene iz ovitih vijačnic: z eno (TET12SN(2CC)) ali dvema ponovljenima ovitima vijačnicama (TET12SN(22CC)). Na osnovi in silico simulacij zvijanja smo se odločili za topologijo 1.10, ki je enaka kot pri varianti TET12SN, kar olajša primerjavo proteinskih konstruktov. Pri izboru ovitih vijačnic smo se omejili na niz ovitih vijačnic iz konstrukta TET12SN, prednostno pa smo izbrali heterodimerne pare z visoko temperaturo prehoda. TET12SN(2CC) smo načrtovali s ponovitvijo para P5SN:P6SN, ki je nadomestil homodimer GCNSN:GCNSN, pri TET12SN(22CC) pa smo z dodatno ponovitvijo P3SN:P4SN nadomestili P7SN:P8SN.
Proteina TET12SN(2CC) in TET12SN(22CC) smo izrazili v bakterijskem ekspresijskem sevu E.coli NiCo ter ju očistili z NiNTA-afinitetno kromatografijo in gelsko filtracijo. Analiza CD spektrov je pokazala visoko vijačnost v strukturi (85-90
%) (Slika 34, C in Č). Kot je značilno za proteinske origamije, sta tudi TET12SN(2CC) in TET12SN(22CC) po hitrem ohlajanju po temperaturni denaturaciji ohranila visoko vijačnost (Slika 34, C in Č). Merjenje CD spektrov tekom temperaturne denaturacije kaže na kooperativno razvijanje strukture (Slika 34, D in E). Temperatura prehoda je bila 52 °C za TET12SN(2CC) in 56 °C za TET12SN(22CC), kar je primerljivo s temperaturo prehoda osnovnega TET12SN. Po temperaturni denaturaciji smo raztopino
85
proteina hitro ohladili, da bi se protein ponovno zvil. Ker pa proteina vsebujeta eno ali dve ponovljeni oviti vijačnici, smo menili, da bi lahko pri hitrem ohlajanju prišlo do interakcije med segmentoma dveh različnih parov ovitih vijačnic in posledično do tvorjenja večjih oligomerov. Analiza z analitsko gelsko filtracijo, sklopljeno z MALS, je pokazala, da se pri hitrem ohlajanju z večanjem števila ponovljenih ovitih vijačnic poveča tudi stopnja agregacije, vendar je le-ta primerljiva s stopnjo oligomerizacije osnovnega TET12SN (Slika 34, F in G).
86
Slika 34: Rezultati analize TET12SN(2CC) (A, C, D in F) ter TET12SN(22CC) (B, Č, E in G). Prikazana sta shematska izrisa TET12SN(2CC) (A) in TET12SN(22CC) (B), iz
87
katerih je razvidno zaporedje osnovnih gradnikov znotraj polipeptidne verige in končno zvitje. Analiza CD spektrov je potrdila visoko vijačnost konstruktov TET12SN(2CC) (C) in TET12SN(22CC) (Č), ki je primerljiva z izhodiščnim konstruktom TET12SN. Talilne krivulje TET12SN(2CC) (D) in TET12SN(22CC) (E) se prav tako skladajo s TET12SN.
Elucijske krivulje gelske filtracije, sklopljene z MALS, potrjujejo za TET12SN(2CC) (F) in TET12SN(22CC) (G) konstrukte pričakovane velikosti.
Ko smo pokazali, da lahko tetraedrsko nanokletko zgradimo tudi z uporabo ene ali dveh ponovljenih ovitih vijačnic, smo želeli preizkusiti, ali lahko uspešno načrtujemo tudi konstrukt, ki je sestavljen iz treh ponovljenih ovitih vijačnic (TET12SN(222CC)), ali takšnega, v katerem se ena ovita vijačnica ponovi trikrat (TET12SN(3CC)). Na podlagi in silico simulacij smo ponovno določili, da je topologija 1.10 ustrezna in TET12SN(222CC) načrtovali na enak način kot TET12SN(2CC) in TET12SN(22CC).
Za osnovne gradnike smo izbrali pare ovitih vijačnic P3SN:P4SN, P5SN:P6SN ter antiparalelni par APHshSN. Na podlagi in silico simulacij zvijanja za različne permutacije se je izkazalo, da permutacija 1.10 ni več ena najbolj ugodnih – bolj ustrezna je bila permutacija 1.5. Kot ponovljeni par smo izbrali P5SN:P6SN. Na podlagi in silico simulacij smo izbrali najboljše zaporedje segmentov za TET12SN(3CC), najslabšega pa smo pripisali TET12SN(3CC-neg). Proteine TET12SN(222CC), TET12SN(3CC) in TET12SN(3CC-neg) smo izrazili v bakteriji in jih izolirali iz topnega dela celičnega lizata. Na podlagi spektrov CD sklepamo, da imajo izolirani proteini visok delež vijačnosti, ki ob denaturaciji pri 90 °C preide v naključne klobčiče, vendar se ob ponovnem ohlajanju visoka vijačnost povrne (Slika 35, Č-E). Pri temperaturni denaturaciji je opaziti dva prehoda v območju od 44 °C do 68 °C (Slika 35, F-H). Kot je pokazala analiza analitske gelske filtracije, sklopljene z MALS, sta se oba proteina, TET12SN(222CC) in TET12SN(3CC), po temperaturni denaturaciji in hitrem ohlajanju v večjem deležu zvila nazaj v monomerne strukture, opazili smo pa povečan delež oligomernih frakcij (Slika 35, I in J). Kot smo pričakovali, je negativna kontrola TET12SN(3CC-neg) po hitrem ohlajanju tvorila večje oligomere v večjem deležu (Slika 35, K).
88
Slika 35: Rezultati analize TET12SN(222CC) (A, Č, F in I), TET12SN(3CC) (B, D, G in J) ter TET12SN(3CC-neg) (C, E, H in K). Prikazani so shematski izrisi TET12SN(222CC) (A), TET12SN(3CC) (B) in TET12SN(3CC-neg) (C), iz katerih je razvidno zaporedje osnovnih gradnikov znotraj polipeptidne verige in končno zvitje.
Analiza CD spektrov je potrdila visoko vijačnost konstruktov TET12SN(222CC) (Č), TET12SN(3CC) (D) in TET12SN(3CC-neg) (E), kar je primerljivo z izhodiščnim konstruktom TET12SN. Talilne krivulje TET12SN(222CC) (F), TET12SN(3CC) (G) in TET12SN(3CC-neg) (H) se prav tako skladajo s TET12SN. Točke predstavljajo eksperimentalno pomerjene podatke, krivulje pa modelne funkcije, ki se jim najbolje prilegajo. Elucijske krivulje gelske filtracije, sklopljene z MALS, potrjujejo konstrukte pričakovane velikosti za TET12SN(222CC) (I), TET12SN(3CC) (J) in TET12SN(3CC-neg) (K).
89
Z meritvami sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih smo želeli ovrednotiti učinek ponovljenih ovitih vijačnic na obliko tetraedrske strukture. Sipalne krivulje za proteine TET12SN(2CC), TET12SN(22CC) in TET12SN(222CC) izkazujejo enake značilnosti z Rg = 3,43 ± 0,01 nm in Dmax = 10,0 ± 0,5 nm (Slika 36, A-C). Kratkyjev graf ustreza strukturi več domen, ki so med seboj povezane z gibljivimi povezovalci, kar je značilno za proteinski origami na osnovi ovitih vijačnic (Slika 36, A-C). Med seboj smo primerjali tudi krivulje in modele posameznih struktur ter izračunali SAXS podobnostno matrico (angl. SAXS similarity matrix) (Slika 36, F)71. Primerjava je pokazala visoko podobnost med strukturami. V analizo smo vključili tudi model idealnega tetraedra - pokazalo se je, da so vsi proteini z dvema ponovljenima ovitima vijačnicama strukturno bolj podobni idealnemu tetraedru kot pa izhodiščni TET12SN (Slika 36, Č-E). Presenetljivo se je izkazalo, da je TET12SN(22CC) strukturno najbolj podoben idealnemu tetraedru, poleg tega pa ima tudi veliko lastnosti, ki so zaželene pri razvoju novih struktur (odlično izražanje, visoka topnost, stabilnost ter idealnejša tetraedrska oblika). Profila krivulj sipanja proteinov s tremi ponovitvami parov ovitih vijačnic (TET12SN(3CC) in TET12SN(3CC-neg)) nista bila značilna za proteinske origamije na osnovi ovitih vijačnic.
90
Slika 36: Analiza sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih in pripadajoči strukturni modeli proteinov TET12SN(2CC) (A in Č), TET12SN(22CC) (B in D) in TET12SN(222CC) (C in E); SAXS podobnostna matrica za idealizirano tetraedrsko strukturo TET12SN ter eksperimentalno potrjene strukture TET12SN, TET12SN(2CC), TET12SN(22CC) in TET12SN(222CC) (F).
91
Predstavitev domen fluorescenčnih proteinov na novem ogrodju 3.5.
Po uspešni rigidizaciji vseh štirih predstavljenih proteinskih domen na ogrodju TET12SN nas je zanimalo, ali lahko strategijo predstavitve proteinskih domen prenesemo tudi na kakšno drugo varianto tetraedrskega ogrodja CCPO. Za testno ogrodje smo izbrali TET12SN(22CC), v katerem se peptidna para P3:P4 in P5:P6 ponovita dvakrat. Na podlagi predhodnih analiz smo potrdili, da ima protein TET12SN(22CC) boljše izkoristke izolacije, je bolj podoben idealnemu tetraedru in ima povečano rigidnost. Ker imata TET12SN in TET12SN(22CC) isto topologijo, smo ohranili mesta za predstavitev proteinskih domen (Slika 37).
Slika 37: Poravnava zaporedij konstruktov osnovnih dveh ogrodij – TET12SN-new (A) in TET12SN(22CC)-new (B), ki je okrajšan v TET22CC-new. Končnica 'new' označuje spremenjeno mesto vstavitve proteinskih domen za predstavitev na ogliščih I in IV.
Po vzoru TET12SN-new smo pripravili serijo proteinov z različnimi razmerji med GFP in RFP: TET22CC-new-GGGR, TET22CC-new-GGRR, TET22CC-new-GRGR, TET22CC-new-GRRR, TET22CC-new-RRGR in TET22CC-new-RRRR. Zaradi nizkih izkoristkov pri izolaciji TET22CC-new-GGGG nismo uspeli pripraviti. Proteine, izolirane iz topne frakcije E.coli, smo po NiNTA-afinitetni kromatografiji nanesli na kolono za gelsko filtracijo. Monomerne frakcije smo nanesli na analitsko gelsko filtracijo, ki je potrdila prisotnost monomernih proteinov. Tudi elucijski časi so bili primerljivi s tistimi za proteine serije TET12SN-new. Tudi tu smo opazili nagnjenost k tvorjenju di- in trimerov, ki je naraščala s povečevanjem števila proteinskih domen GFP v strukturi.
92
Slika 38: Elucijske krivulje proteinskih konstruktov, pri katerih sta mesta vstavitve v verigo TET12SN(22CC) za oglišči I in IV spremenjeni. Opazili smo povečevanje nastanka di- in trimerov pri zamrzovanju s povečevanjem deleža GFP proteinskih domen znotraj nanodelcev. Izolacija in karakterizacija TET22CC-new-GGGG ni bila mogoča.
Tudi za proteine iz serije TET22CC-new smo za vsak konstrukt pripravili 1000 modelov pod enakimi pogoji kot za TET12SN-new. Med modeli smo poiskali tistega, katerega krivulja se najbolje prilega eksperimentalno pomerjenemu sipanju rentgenskih žarkov pri nizkih kotih. Z analizo krivulje sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih smo pokazali, da so v vseh primerih fluorescenčne domene predstavljene na ogliščih tetraedrskega ogrodja (Sliki 39 in 40). Tudi Kratkyjev graf se sklada s strategijo načrtovanja, saj opisuje tudi strukturo, sestavljeno iz več domen, ki so med seboj povezane, a gibljive. Vrednosti za Dmax in Rg so v skladu s tistimi za proteine serije TET12SN-new. TET22CC-new-RRRR ima najmanjše vrednosti Dmax in Rg, medtem ko večji vsebnosti GFP praviloma sledita tudi večji vrednosti za Dmax in Rg. Sama oblika krivulj sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih za TET22CC-new v primerjavi s TET12SN-new vsebuje izrazitejši minimum, kar je posledica uporabe drugega
15 20 25 30
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
1.0 TET22CC-new-RRRR TET22CC-new-RRGR TET22CC-new-GRRR TET22CC-new-GGRR TET22CC-new-GRGR TET22CC-new-GGGR
min Normalizirana A280nm
93
ogrodnega proteina. Krivulja P(r) s tremi vrhovi ponovno nakazuje prisotnost dveh ali treh proteinskih domen – vrh pri 4 nm ustreza ogrodju TET22CC, vrh pri 6 nm GFP in vrh pri 8 nm RFP. Kot pri seriji proteinov TET12SN-new lahko tudi pri TET22CC-new na krivulji P(r) opazimo vrhove, ki ustrezajo številu kopij med GFP in RFP v analiziranem konstruktu. Poleg tega so krivulje P(r) konstruktov, ki vsebujejo enako razmerje GFP in RFP, vendar na drugih ogliščih (TET22CC-new-GGRR in -GRGR ter TET22CC-new-GRRR in -RRGR), med seboj primerljivi.
94
Slika 39: Rezultati sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih za proteinske konstrukte, pri katerih sta mesta vstavitve v verigo TET12SN(22CC) za oglišči I in IV spremenjeni.
95
Slika 40: Strukturni modeli, ki najbolj ustrezajo eksperimentalno pomerjeni krivulji