HPV je zaradi bioloških posebnosti (virus se produktivno razmnožuje le v diferenciranih epitelnih celicah) mogoče gojiti le v posebnih celičnih kulturah (angl. organotypic raft culture). Zaradi tega so celotna genomska zaporedja novih genotipov PV tradicionalno pridobivali direktno iz epitelijskih lezij z uporabo direktnega kloniranja, kar je bilo mogoče le pri tistih genotipih, ki so bili v kliničnih vzorcih prisotni v visokem številu kopij (de Villiers in sod., 2004).
Kloni celotnega genoma novih genotipov PV dodatno predstavljajo preprost način trajnega shranjevanja referenčnega nukleotidnega zaporedja, tako da pridobitev t.i. referenčnega klona ostaja nujen pogoj za uraden sprejem vsakega novega genotipa PV (de Villiers in sod., 2004; Bernard in sod., 2010).
Sočasno s hitrim razvojem na področju molekularnih metod so se pri opredeljevanju novih genotipov postopoma uveljavile tudi novejše metode, kot so verižna reakcija s polimerazo (angl. polymerase chain reaction, PCR), metoda krožnega pomnoževanja (angl. rolling-circle amplification, RCA; whole genome amplification, WGA) in celo t.i. hitri postopek določanja nukleotidnega zaporedja (angl. shot-gun sequencing) (Li in sod., 2009). Ravno te novejše tehnologije so omogočile identifikacijo in karakterizacijo mnogih izmed novoodkritih PV, posebej tistih, ki so v kliničnih vzorcih prisotni v zelo majhnih količinah.
Kljub velikemu tehnološkemu napredku na področju metodologije, opredeljevanje novih genotipov HPV pogosto ostaja težavno predvsem zaradi pogoste sočasne prisotnosti različnih genotipov HPV v izolatih iz kliničnih sprememb, majhnega števila kopij virusa v določenih kužninah (npr. dlačni mešički) in ne nazadnje tudi zaradi prisotnosti drugih, še neopredeljenih genotipov HPV z neznanim kliničnim pomenom.
2.4.1 Direktno kloniranje
Direktno kloniranje je ena prvih metod, ki se je uporabljala tako za določanje nukleotidnega zaporedja kot tudi za shranjevanje novih genotipov HPV. Izvedba direktnega kloniranja je mogoča le, če je v klinični leziji prisotna zadostna količina virusa (slika 9). Pri tej metodi je najprej potrebna izolacija celotne DNA iz klinične lezije, ki ji sledi iskanje restrikcijskih nukleaz, ki krožni virusni genom cepijo na enega ali manjše število fragmentov. Pripravi fragmentov sledi vključitev (ligacija) le-teh v plazmide ter kloniranje v bakterije, kar omogoča pridobitev večje količine kloniranih fragmentov in določanje njihovega nukleotidnega zaporedja.
Z direktnim kloniranjem brez predhodne uporabe PCR so se raziskovalci v osemdesetih letih prejšnjega stoletja poskušali izogniti napakam, ki bi jih v nukleotidno zaporedje lahko vnesle prve, še ne natančne, polimeraze (Stewart in sod., 1995). Zaradi napak, ki bi jih v nukleotidno zaporedje lahko vnesla PCR, so leta 2004 predlagali poimenovanje novih genotipov, opredeljenih na ta način, kot ‘kandidatne’ genotipe HPV (angl. candidate HPV, candHPV) (de Villiers in sod., 2004), vendar pa zaradi izjemne natančnosti novodobnih polimeraz v najnovejši klasifikaciji PV odpravljajo tako poimenovanje (Bernard in sod., 2010).
Čeprav je direktno kloniranje včasih bilo zlati standard, lahko pri restrikciji celotnega genoma pride do izgube krajših odsekov genoma iz referenčnih klonov, kar ima za posledico obstoj nekaterih napak v referenčnih zaporedjih prvih genotipov HPV (Meissner, 1995; Kocjan in sod., 2009a).
2.4.2 Kloniranje s pomočjo pomnoževanja s polimerazo
Kloniranje s pomočjo predhodnega PCR je omogočilo opredelitev novih genotipov HPV, ki v kliničnih spremembah niso prisotni v veliki količini (slika 9). Da bi zagotovili vključitev celotnega genoma v referenčne klone, sta se pri kloniranju s pomočjo PCR uveljavili metodi t.i. reverznega PCR (angl. reverse PCR) in prekrivajočih se pridelkov PCR (angl. overlapping PCR).
Pri metodi reverznega PCR na podlagi krajšega poznanega nukleotidnega zaporedja novega genotipa pripravimo tipsko specifične oligonukleotidne začetnike, ki krožni genom HPV pomnožujejo v nasprotni smeri. S tem zagotovimo, da smo s PCR pomnožili celotni genom, ki mu lahko nato določimo nukleotidno zaporedje in ga vključimo v referenčne klone.
Metoda prekrivajočih se pridelkov PCR je po svoje nadgradnja metode reverznega PCR in temelji na pripravi dveh ali več pridelkov PCR, katerih konci se prekrivajo, kar zagotavlja vključitev celotnega genoma v referenčne klone (Forslund in Hansson, 1996).
Tako pri metodi reverznega PCR kot pri metodi prekrivajočih se pridelkov PCR gre za pomnoževanje relativno dolgih pridelkov PCR (od 4000-8000 bp). To zahteva uporabo t.i.
long-range polimeraz, ki so na srečo dostopne tudi v komercialnih kompletih kemikalij.
Poleg specifičnih pogojev pomnoževanja, ki ga take polimeraze zahtevajo, je za pridobitev tako dolgih pridelkov PCR nujna zadostna količina izhodiščne DNA. Ta količina je sicer bistveno manjša, kot je potrebno za direktno kloniranje, vendar pa v določenih kliničnih
vzorcih kljub temu pogosto ne zadostuje, posebej kadar gre za nove genotipe iz rodov Betapapillomavirus in Gammapapillomavirus.
2.4.3 Krožno pomnoževanje celotnega genoma po principu kotalečega se kroga
Izotermalno krožno pomnoževanje po principu kotalečega se kroga (angl. rolling circle amplification, RCA), poimenovano tudi pomnoževanje celotnega genoma (angl. whole genome amplification, WGA), temelji na pomnoževanju vseh krožnih molekul DNA s pomočjo bakteriofagne polimeraze (Rector in sod., 2004). Tovrstno pomnoževanje ni odvisno od nukleotidnega zaporedja krožne DNA molekule, zato je zelo uporabno, kadar želimo pomnožiti izjemno majhno količino neznane DNA (slika 9).
Pridelki izotermalne RCA oz. WGA reakcije so konkatemerne ponovitve krožnega genoma v količini, ki omogoča direktno določanje nukleotidnega zaporedja, nadaljnje pomnoževanje s PCR, analizo s pomočjo restrikcijskih endonukleaz ter ‘direktno’
kloniranje.
Ravno uporaba RCA oz. WGA reakcije je v zadnjem času omogočila opredelitev velikega števila novih genotipov, predvsem tistih iz virusnih rodov (Betapapillomavirus in Gammapapillomavirus), ki so v kliničnih spremembah prisotni v zelo nizkih koncentracijah ali pa so prisotni kot komenzali (Köhler in sod., 2011).
Slika 9: Shematski prikaz molekularnih metod v uporabi pri opredeljevanju novih virusov papiloma Figure 9: Molecular methods used in the characterization of novel papillomaviruses.
3 MATERIALI IN METODE
3.1 IZVOR IZHODIŠČNIH KANDIDATNIH IZOLATOV IN OBRAZLOŽITEV IZBIRE