3.7.1 Izbira začetnih oligonukleotidov in prob za PCR v realnem času
Začetne oligonukleotide in probe za tipsko specifične PCR v realnem času smo izbrali s pomočjo spletnega programa ProbeFinder (Roche Applied Science). Program omogoča izbiro med že pripravljenimi in testiranimi reagenti za PCR v realnem času, kar olajša postopek optimizacije oz. priprave testa in prenos le-tega na pol-avtomatiziran sistem.
3.7.1.1 Izbira začetnih oligonukleotidov in prob za HPV-125 tipsko specifični PCR v realnem času
Za HPV-125 tipsko specifični PCR v realnem času smo izbrali začetna oligonukleotida 125-RT-L1-F (5'-GGT TAC CCG ACC CAA ATA AGT-3', nukleotidna mesta 5851-5871) in 125-RT-L1-R (5'-TCG GCG TCA GGA TTA TAG ATG-3', nukleotidna mesta 5891-5911), ki pomnožujeta 61 bp veliko zaporedje znotraj gena L1. Za detekcijo pridelka PCR v realnem času smo uporabili univerzalno probo, označeno s FAM barvilom Universal Probe #14 (Roche Applied Science).
3.7.1.2 Izbira začetnih oligonukleotidov in prob za HPV-150 tipsko specifični PCR v realnem času
Za HPV-150 tipsko specifični PCR v realnem času smo izbrali začetna oligonukleotida RT-150-F (5'-AGG CCT TAC CTT GTG CTG AA-3', nukleotidna mesta 6355-6374) in RT-150-R (5'-TTA ATT CTA AAG GAG GAC ATG AAC C -3', nukleotidna mesta 6390-6414), ki pomnožujeta 60 bp veliko zaporedje znotraj gena L1. Za detekcijo pridelka PCR v realnem času smo uporabili univerzalno probo, označeno s FAM barvilom Universal Probe #50 (Roche Applied Science).
3.7.1.3 Izbira začetnih oligonukleotidov in prob za HPV-151 tipsko specifični PCR v realnem času
Za HPV-151 tipsko specifični PCR v realnem času smo izbrali oligonukleotidna začetnika RT-151-F (5'-ATC AGC AAC AGA TGG AGC AA-3', nukleotidna mesta 5838-5857) in RT-151-R (5'-GCT CTA TAC TGG TTC CCT GAC AC-3', nukleotidna mesta 5875-5897), ki pomnožujeta 60 bp veliko zaporedje znotraj gena L1. Za detekcijo pridelka PCR
v realnem času smo uporabili univerzalno probo, označeno s FAM barvilom Universal Probe #127 (Roche Applied Science).
3.7.2 Optimizacija kvantitativnih tipsko specifičnih PCR v realnem času
Za optimizacijo kvantitativnih tipsko specifičnih PCR v realnem času smo uporabili referenčne klone treh novih genotipov. Količino plazmidne DNA smo določili z uporabo naprave NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (Nanodrop Technologies, Oxfordshire, Velika Britanija), število kopij plazmida/µl pa smo izračunali s pomočjo enačbe Whelana in sod. (Whelan in sod., 2003).
Vse tri kvantitativne tipsko specifične PCR v realnem času smo izvedli s pomočjo kompleta kemikalij LightCycler® Probes Master (Roche Applied Science) na napravi LightCycler® 480 real-time PCR instrument (Roche Applied Science). Pri tej napravi PCR v realnem času poteka na posebni plastični ploščici, ki jo zapremo s prozorno folijo, njena dodatna prednost pa je, da omogoča sočasno pomnoževanje 96 vzorcev.
3.7.2.1 Kvantitativni HPV-125 tipsko specifični PCR v realnem času
Optimizirana reakcijska mešanica za HPV-125 tipsko specifični PCR v realnem času je vsebovala 10 µl LightCycler® Probes Master 2x conc., 0.2 µM vsakega od začetnih oligonukleotidov, 0.05 µM Universal Probe #14, 1 U LightCycler® Uracil-DNA Glycosylase (Roche Applied Science), tarčno DNA in vodo do končnega volumna 20 µl.
HPV-125 tipsko specifični PCR v realnem času so sestavljali naslednji koraki: aktivacija N-uracil-glikozilaze 10 min pri 40 °C, predinkubacija 10 min pri 95 °C, 45 ciklov pomnoževanja; 10 s pri 95 °C (denaturacija) in 30 s pri 60 °C (naleganje/podaljševanje).
Merjenje fluorescenčnega signala (valovna dolžina FAM 465-510 nm) je potekalo med vsako stopnjo naleganja/podaljševanja na t.i. 'single mode' način. Po končanem cikličnem pomnoževanju smo reakcijsko mešanico ohladili na 4 °C.
3.7.2.2 Kvantitativni HPV-150 tipsko specifični PCR v realnem času
Optimizirana reakcijska mešanica za HPV-150 tipsko specifični PCR v realnem času je vsebovala 10 µl LightCycler® Probes Master 2x conc., 0.2 µM vsakega od začetnih oligonukleotidov, 0.05 µM Universal Probe #50, 1 U LightCycler® Uracil-DNA Glycosylase, tarčno DNA in vodo do končnega volumna 20 µl.
HPV-150 tipsko specifični PCR v realnem času so sestavljali naslednji koraki: aktivacija N-uracil-glikozilaze 10 min pri 40 °C, predinkubacija 10 min pri 95 °C, 45 ciklov pomnoževanja; 10 s pri 95 °C (denaturacija), 30 s pri 59 °C (naleganje) in 1 s pri 72 °C (podaljševanje). Merjenje fluorescenčnega signala (valovna dolžina FAM 465-510 nm) je potekalo med vsako stopnjo naleganja/podaljševanja na način 'single mode'. Po končanem cikličnem pomnoževanju smo reakcijsko mešanico ohladili na 4 °C.
3.7.2.3 Kvantitativni HPV-151 tipsko specifični PCR v realnem času
Optimizirana reakcijska mešanica za HPV-151 tipsko specifični PCR v realnem času je vsebovala 10 µl LightCycler® Probes Master 2x conc., 0.2 µM vsakega od začetnih oligonukleotidov, 0.05 µM Universal Probe #127, 1 U LightCycler® Uracil-DNA Glycosylase, tarčno DNA in vodo do končnega volumna 20 µl.
HPV-150 tipsko specifični PCR v realnem času so sestavljali naslednji koraki: aktivacija N-uracil-glikozilaze 10 min pri 40 °C, predinkubacija 10 min pri 95 °C, 45 ciklov pomnoževanja; 10 s pri 95 °C (denaturacija), 30 s pri 59 °C (naleganje) in 1 s pri 72 °C (podaljševanje). Merjenje fluorescenčnega signala (valovna dolžina FAM 465-510 nm) je potekalo med vsako stopnjo naleganja/podaljševanja na način 'single mode'. Po končanem cikličnem pomnoževanju smo reakcijsko mešanico ohladili na 4 °C.
Pogoji za pomnoževanje tipsko specifičnega PCR v realnem času za HPV-150 in HPV-151 so bili namenoma identični, saj je to omogočalo istočasno testiranje vzorcev za oba genotipa in bolj optimalno uporabo naprave LightCycler® 480.
3.7.3 Evaluacija kvantitativnih tipsko specifičnih PCR v realnem času
Vse serijske redčine referenčnih plazmidov HPV-125, HPV-150 in HPV-151, ki smo jih uporabili za evaluacijo, smo pripravili v vodni raztopini s prenašalno oz. 'carrier' RNA (1 µl/ml) v 1,5 ml DNA LoBind tubicah (Eppendorf, Hamburg, Nemčija).
3.7.3.1 Ugotavljanje linearnosti kvantitativnih tipsko specifičnih PCR v realnem času Linearnost vseh treh kvantitativnih tipsko specifičnih PCR v realnem času smo določali s testiranjem desetkratnih serijskih redčin referenčnih plazmidov HPV-125, HPV-150 in HPV-151 v triplikatu.
3.7.3.2 Določanje meje detekcije kvantitativnih tipsko specifičnih PCR v realnem času
Mejo detekcije (angl. limit-of-detection, LOD) smo določali na podlagi testiranja 15 replikatov redčin referenčnih plazmidov, ki so ustrezali 25, 13, 6, 3, 1,5, 0,8 in 0,4 kopijam na reakcijo. Mejo detekcije s 95 % intervalom zaupanja smo izračunali z uporabo analize Probit s pomočjo programskega paketa PASW Statistics v.18.0.0.0. software (SPSS Software, Munich, Nemčija).
3.7.3.3 Določanje ponovljivosti kvantitativnih tipsko specifičnih PCR v realnem času Ponovljivost znotraj enega testiranja in med različnimi testiranji (angl. intra- and inter-assay reproducibility) smo določali tako, da smo testirali triplikate plazmidnih redčin, ki so ustrezale 100 oziroma 10 kopijam referenčnega plazmida na reakcijo v treh neodvisnih poskusih. Koeficient variacije (angl. coefficient of variation, CV) smo izračunali po formuli:
CV (%) = (standardna deviacija/povprečni Ct)*100
3.7.3.4 Določanje specifičnosti in preverjanje navzkrižne reaktivnosti kvantitativnih tipsko specifičnih PCR v realnem času
Specifičnost HPV-125 tipsko specifičnega PCR v realnem času smo ugotavljali tako, da smo testirali 107-108 kopij referenčnih klonov (za katere se zahvaljujemo prof. de Villiers, prof. Matsukura in prof. Burk) ali sintetičnih L1 zaporedij 2, 3, 7, HPV-10, HPV-27, HPV-28, HPV-29, HPV-40, HPV-43, HPV-77, HPV-78 in HPV-91 (po naročilu vstavljenih v plazmid pUC57 s strani podjetja Genscript, Piscataway, ZDA).
Specifičnost HPV-150 in HPV-151 tipsko specifičnih PCR v realnem času smo ugotavljali tako, da smo testirali 107-108 kopij sintetičnih L1 zaporedij HPV-9, HPV-15, HPV-17, HPV-22, HPV-23, HPV-37, HPV-38, HPV-80, HPV-92, HPV-96, HPV-100, HPV-111, HPV-113, HPV-120 in HPV-122 (vstavljenih v plazmid pUC57 s strani podjetja Genscript).