Najprej smo želeli preveriti občutljivost celic MMTV-PyMT na tretiranje s H2O2. S tem namenom smo celice tretirali z različnimi koncentracijami H2O2 (0-5 mM) in v različnih časovnih okvirjih (0, 4 in 24 h ) (slika 3 in slika 4). Na podlagi pridobljenih podatkov smo izračunali delež̌ mrtvih celic za posamezen parameter. Na koncu smo izbrali eno koncentracijo H2O2 (3 mM) in eno časovno točko (4 h) za nadaljnje delo (slika 4), saj smo tu imeli najbolj konsistentne rezultate. Nižje koncentracije namreč niso imele enakega učinka v vseh izvedenih poskusih (rezultati niso prikazani). Da bi preverili, kdaj točno pride do celične smrti, smo določili delež mrtvih celic po inkubaciji s 3 mM H2O2 v različnih časovnih točkah v prvih 4 urah (slika 4). Vidno je, da pride pri celicah z izbitim genom za stefin B že po 60 minutah do približno 50 % celične smrti (slika 4), pri celicah divjega tipa pa pride do takšnega deleža celične smrti šele po 24 urah (slika 3). Za apoptotske celice je značilno, da se obarvajo aneksin V-FITC pozitivno in PI negativno.
Pri naših poskusih smo pokazali, da niti pri 30 minutni inkubaciji s H2O2, ko imajo celice
39
z izbitim genom za stefin B približno 30 % smrtnost, ni vidnih aneksin V-FITC pozitivnih celic in PI negativnih celic (slika 4B).
Da pri izbranih pogojih res ne pride do apoptoze, smo dodatno preverili z merjenem aktivnosti kaspaz 3 in 7, ki sta efektorski kaspazi pri intrinzični in ekstrinzični poti apoptoze. Iz slike 5 je razvidno, da v prvih štirih urah ne pride do povišane aktivnosti kaspaz 3 in 7. To kaže, da pri izbranih pogojih ni prišlo do apoptotične celične smrti. To je lahko posledica uporabe (pre)visoke koncentracije H2O2. Večinoma se za sprožitev apoptoze uporabljajo koncentracije do 1 mM H2O2, nekatere raziskave pa omenjajo tudi koncentracije do 2 mM H2O2 [94,96,97]. Na obliko celične smrti poleg vrste induktorja, vpliva tudi vrsta celic. Pri nekaterih celičnih kulturah tudi pri nizkih koncentracijah H2O2
ne pride do apoptoze [98].
V zadnjih dvajsetih letih so definirali kar nekaj novih oblik celične smrti [12,15]. Glede na to, da nismo potrdili apoptotične celične smrti, nas je zanimalo, za katero obliko celične smrti gre. Na podlagi rezultatov iz slike 4 smo se osredotočili na dogajanje v prvih 60 minutah. S tem namenom smo spremljali poškodbe lizosomov in mitohondrijev ter nastanek znotrajceličnih ROS, ki so pogosto vpleteni v različne celične smrti (npr.
feroptozo) [90].
V naslednjem koraku smo preverili, ali lahko H2O2 vpliva na spremembo pH lizosomov (slika 6A). Pri celicah divjega tipa po 30 minutni inkubaciji s H2O2 ni bilo spremembe v pH lizosomov. Pri celicah z izbitim genom za stefin B pa je prišlo do 50 % zvišanja pH.
Kisel pH v lizosomih je pomemben za delovanje cisteinskih katepsinov in zato tudi natančno uravnan. Do povišanja pH v lizosomih lahko pride zaradi različnih razlogov [99]. Tak primer je povečana prepustnost lizosomske membrane in posledično lahko pride do razlitja vsebine lizosomov v citosol. Katepsini prisotni v citosolu bi nato lahko sodelovali pri celični smrti. V primeru zmanjšane aktivnost stefina B, pa je aktivnost katepsinov B, S in L še dodatno povečana [87]. Zato smo z dodatkom inhibitorja cisteinskih katepsinov preverili, kakšna je njihova vloga pri celični smrti pri izbranih pogojih (slika 7). Vidne ni nobene razlike tako pri celicah divjega tipa kot tudi pri celicah z izbitim genom za stefin B v prisotnosti ali odsotnosti inhibitorja. Na podlagi teh rezultatov smo sklepali, da najverjetneje cisteinski katepsini nimajo glavne vloge pri celični smrti sproženi s H2O2, ampak pride zgolj do povišanja pH znotraj kislih veziklov, lizosomska membrana pa ostane nepropustna za katepsine. Da katepsini ostanejo ujeti v lizosomih in ne sodelujejo pri poteku celične smrti, bi morali dodatno potrditi s pripravo citosolnih in popolnih lizatov, v katerih bi lahko izmerili aktivnost katepsinov in določili njihovo prisotnost s prenosom po Westernu.
Nadalje smo preverili še nastanek ROS, ki so pogosto povezane z različnimi oblikami celičnih smrti [100]. Pri celicah z izbitim genom za stefin B je vidno statistično značilno povišanje ROS že v prvih 60 minutah, pri celicah divjega tipa pa do povišanja v prvi uri ni prišlo (slika 8A). Na podlagi tega smo sklepali, da bi lahko stefin B vplival ali na
40
povečan nastanek ROS ali pa nevtralizacijo le-teh in s tem vplival na smrtnost celic. V prvih 4 urah je bila smrtnost pri celicah z izbitim genom za stefin B veliko večja kot pri celicah divjega tipa (slika 4). Mehanizem po katerem bi prisotnost ali odsotnost stefina B vplivala na nastanek ROS še ni natančno znan. Povišanje ROS znotraj celice lahko vodi do poškodb mitohondrijev in kaže na aktivacijo vnetnega odziva celice, ki lahko vodi v celično smrt [101]. Pomanjkanje stefina B pa vodi v povečano destabilizacijo mitohondrijskega membranskega potenciala in nastanka mitohondrijskih ROS [66]. Zato smo preverili poškodbe mitohondrijev še s spremljanjem sprememb v oksidaciji kardiolipina. Znano je namreč, da povečan nastanek znotrajceličnih ROS vodi v peroksidacijo kardiolipina in nakazuje na poškodbe mitohondrijev [91], kar je ena izmed značilnosti tako za apoptozo kot za nekrozo. [102]. Zato smo preverili tudi oksidacijo kardiolipina po tretmaju s H2O2. Pri celicah z izbitim genom za stefin B je pri 120 minutah prišlo do statistično značilnega povečanja oksidacije kardiolipina v primerjavi s celicami divjega tipa (slika 9A). Ti rezultati kažejo, da v kolikor pride do povišanja ROS, pride tudi do oksidacije kardiolipina.
Pokazali smo, da pri izbranih pogojih ne pride do apoptoze, ampak verjetno do druge oblike celične smrti. Povišani ROS pa so povezani z različnimi oblikami celičnih smrti (npr. s feroptozo). Do povišanja ROS pa bi lahko prišlo zaradi reakcije H2O2 z intralizosomskim železom, kjer nastane zelo reaktiven hidroksilni radikal. Ta vrsta ROS pa lahko vodi tudi v peroksidacijo lipidov [88]. Za feroptozo so torej značilne poškodbe lizosomov, povišani ROS in oksidacija lipidov, kar bi ustrezalo našim rezultatom (slike 7, 8 in 9). Če pri našem izbranem modelu dejansko pride do feroptoze, bi lahko preverili z dodatkom znanega inhibitorja feroptoze Ferrostatina-1 [19]. Feroptoza pa je povezana tudi z vnetnim odzivom [103,104].
Povišani ROS in poškodbe mitohondrijev pa so ključni pri aktivaciji NLRP3 inflamasoma in vnetnega odziva v celici [101,105]. Stefin B in aktivacijo inflamasoma so povezali že na več načinov. Prva možnost, kako bi lahko stefin B vplival na njegovo aktivacijo, je posredno z inhibicijo cisteinskih katepsinov v celici. Znana je namreč povezava med aktivnostjo katepsina B in aktivacijo NLRP3 inflamasoma pri oksidativnem stresu [75].
Stefin B je endogeni inhibitor katepsina B, zato bi prav tako lahko preprečil aktivacijo NLRP3 inflamasoma. Pokazali so namreč, da pri inhibiciji katepsina B s kemijskim inhibitorjem ni prišlo do aktivacije NLRP3 inflamasoma [106]. Vendar pri naših rezultatih inhibitor cisteinskih katepsinov E64d (slika 7) ni vplival na celično smrt. To kaže, da na podlagi poskusov na našem modelu, katepsini niso ključni pri aktivaciji inflamasoma, kot so tudi že pokazali [66].
V drugem primeru pa bi lahko imel stefin B direkten vpliv. Pomanjkanje stefina B vodi v povečano destabilizacijo mitohondrijskega membranskega potenciala in nastanka mitohondrijskih ROS [66]. Tekom naše raziskave smo pokazali, da pride pri tretmaju s H2O2 samo pri celicah z izbitim genom za stefin B do povišanja znotrajceličnih ROS (slika 8) in oksidacije kardiolipina (slika 9), kar kaže na poškodbe mitohondrijev in bi
41
lahko pomenilo, da pride pri celicah z izbitim genom za stefin B do aktivacije inflamosoma. Miši z izbitim genom za stefin B imajo tudi aktivirano NF-κB signalno pot, kar vodi v povečano ekspresijo kaspaz 11 in povečano količino provnetnih citokinov [66].
Poleg tega pa TLR/ NF-κB signalna pot inducira nastanek pro-IL-1β in aktivacijo proteina NLRP3 [107]. Pokazali so tudi, da pri LPS stimulaciji pride do translokacije stefina B v mitohondrij, kjer najverjetneje ščiti njegovo integriteto [66].
Lokalizacija stefina B ni bila del naše raziskave, tako da ne moremo z gotovostjo trditi, da H2O2 tako kot LPS sproži translokacijo stefina B v mitohondrij, kjer bi ga ščitil pred poškodbami. Bi pa odsotnost stefina B in posledično manjša zaščita mitohondrijev lahko bila razlog, da je pri celicah z izbitim genom za stefin B večja smrtnost kot pri celicah divjega tipa. Našo raziskavo bi lahko nadaljevali še z uporabo specifičnih inhibitorjev, da bi lahko preverili, do katere oblike celične smrti dejansko pride na našem modelu. Za feroptozo bi lahko uporabili ferrostatin [19] in za nekroptozo Nec-1 [17]. Z uporabo NLRP3 specifičnega inhibitorja MCC950 bi lahko preverili, če dejansko pride do aktivacije NLRP inflamasoma [108]. Pri aktivaciji inflamasoma pa niso pomembne le poškodbe mitohondrijev, ampak tudi drugih organelov. Pokazali so, da je za aktivacijo inflamasoma pomembna tudi relokacija NLRP3 kompleksa na membrano ER [109]. Stres v ER pa lahko aktivira t. i. odziv na nezvite proteine (UPR). Gre za proces singalizacije, kjer se zmanjša sinteza proteinov in odstrani napačno zvite proteine za vzdrževanje homeostaze ER [110]. Stres v ER lahko aktivira NF-κB, kar privede do ekspresije interferonov tipa 1 in vnetnih citokinov (npr. TNF) ter bi lahko tako tudi prispeval k celični smrti [111].