1.5 Katepsinski inhibitorji
1.5.1 Stefin B
Stefin B je neglikoziliran enoverižni protein, ki je sestavljen iz 98 aminokislinskih preostankov. Njegova molekulska masa je 11 kDa [65]. Izraža se v različnih človeških celicah in tkivih. V celici ga najdemo v citosolu, mitohondriju in jedru. Njegova glavna naloga je zaščita celic pred izlitimi lizosomalnimi katepsini [66,67]. Stefin B je reverzibilni in kompetitivni inhibitor, ki inhibira papainu podobne cisteinske proteaze.
Katepsine S, H in L inhibira s pM konstanto inhibicije, katepsin B pa z nM konstanto inhibicije [46].
8 1.5.2 Stefin B in bolezni
Poleg svoje inhibitorne vloge v celicah je znano, da stefin B igra pomembno vlogo tudi pri progresivni mioklonični epilepsiji (EPM1) ali Unverricht_Lundborgovi bolezni [68,69]. Gre za avtosomno recesivno bolezen, ki se najverjetneje razvije zaradi mutacij v genu za stefin B. Najpogostejša mutacija je dodekamerna ponovitev v promotorski regiji, ki povzroči zmanjšano količino mRNA in posledično tudi manj proteina stefina B ali celo njegovo odsotnost. To mutacijo najdemo pri 90 % bolnikov z EPM1. Pokazali so, da izbitje gena za stefin B iz genoma miši vodi do nevrološke bolezni, s podobnimi simptomi kot pri človeku [69,70]. Epilepsije so povezane tudi z oksidativnim stresom, ki je lahko povezan tako z nastankom bolezni ali pa je le posledica njenega razvoja [71]. Pokazali so tudi, da izbitje gena za stefin B poveča občutljivost cerebralnih granulnih nevronov na celično smrt sproženo z oksidativnim stresom. Možno je, da je povečana občutljivost na oksidativni stres v nevronih pri pomanjkanju stefina B, ker ta ne inhibira katepsina B.
Pokazali so namreč tudi, da je povečana ekspresija katepsina B povečala občutljivost nevronov na celično smrt sproženo s H2O2. Nasprotno pa je izbitje katepsina B zaščitilo nevrone pred oksidativnim stresom [72].
Poleg povezave z EPM1 pa raziskujejo tudi povezavo med stefinom B in rakom. Zaenkrat v literaturi ni veliko študij o vlogi stefina B pri različnih rakavih obolenjih. Pokazali pa so, da znižane koncentracije stefina B v tumorjih in povišane serumske koncentracije korelirajo s slabo prognozo pacientov pri različnih malignih obolenjih [56].
1.5.3 Stefin B in oksidativni stres
Vlogo stefina B pri razvoju raka so preučevali tudi z uporabo mišjega modela raka mlečne žleze (MMTV-PyMT) z izbitim genom za stefin B. Ugotovili so, da izbitje gena ni vplivalo na invazijo tumorja in metastaziranje tumorja, ampak je bil razvoj tumorjev upočasnjen. Pokazali so tudi povišan delež mrtvih celic, kar bi lahko bilo povezano s povečano preobčutljivostjo tumorskih celic na oksidativni stres v odsotnosti stefina B [74]. Oksidativni stres pa lahko v celicah sproži imunski odgovor. Pokazali so, da je po dodatku H2O2 v celicah mikroglije prišlo do povečane aktivnosti katepsina B in aktivacije NLRP3 inflamasoma [75]. Nekatere raziskave pa nakazujejo, da bi stefin B lahko imel mitohondrijsko zaščitno funkcijo. Miši z odsotnim stefinom B so bile namreč bolj občutljive na sepso povzročeno z lipopolisaharidom, kjer je prišlo do aktivacije NLRP inflamasoma in povišanja mitohondrijskih ROS [66].
9
2 Namen dela in hipoteza
Stefin B je endogeni inhibitor cisteinskih katepsinov B, S, H in L, ki po sprostitvi iz lizosomov lahko sodelujejo pri apoptotični celični smrti. Do celične smrti lahko pride tudi zaradi oksidativnega stresa, kjer je porušeno razmerje med oksidanti in antioksidanti.
Butinar in sodelavci so pokazali, da bi stefin B lahko imel pomemben vpliv na občutljivost MMTV-PyMT celic na oksidativni stres [74].
Namen magistrskega dela je bil določiti vpliv odsotnosti stefina B na celično smrt sproženo s H2O2 na primarnih MMTV-PyMT rakavih celicah. Želeli smo preveriti vpliv tretiranja celic s H2O2 na posamezne celične komponente in opredeliti vrsto sprožene celične smrti. Preveriti smo želeli tudi vpliv antioksidantov na potek sprožene celične smrti. V ta namen smo uporabili dva antioksidanta, NAC in vitC, ki imata terapevtski potencial [76,77].
Delovne hipoteze:
• Celice z izbitim genom za stefin B so bolj občutljive na tretiranje s H2O2 kot celice divjega tipa.
• H2O2 sproži apoptozo v izbranem celičnem modelu.
• H2O2 povzroči poškodbe celičnih komponent.
• Antioksidanta NAC in vitC preprečita celično smrt in omejita poškodbe sprožene s H2O2.
• NAC bo bolj učinkovito zmanjšal vpliv H2O2 kot vitC.
10
3 Materiali in metode 3.1 Materiali
3.1.1 Celična kultura
V raziskavi smo uporabili divji tip primarnih celic iz tumorja mlečne žleze MMTV-PyMT (DT) in primarne celice iz tumorja mlečne žleze MMTV-PyMT z izbitim genom za stefin B (StfB-/-). Primarne MMTV-PyMT tumorske celice so pripravili iz transgenih miši na Institutu »Jožef Stefan« na odseku za Biokemijo, molekularno in strukturno biologijo po metodi opisani v [78].
3.1.2 Gojišče
Uporabili smo obogateno gojišče DMEM z dodanim 1 % penicilin/streptamicinom (v/v), 1 % glutaminom (v/v) in 10 % FBS (v/v).
3.1.3 Kemikalije
• Ac-DEVD-AFC (Bachem)
• Akridin oranž (AO) (Sigma)
• akrilamid (Serva)
• amonijev persulfat (APS) (Serva)
• Borova kislina (Sigma)
• Goveji serumski albumin (BSA) (Sigma)
• CHAPS (Sigma)
• CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Scientific)
• deoksiholna kislina (Sigma)
• dH2O
• dimetil sulfoksid (DMSO) (Sigma)
• Dulbeccov fosfatni pufer (DPBS) (Lonza)
• ditiotreitol (DTT) (Sigma)
• aloksistatin (E64d) (Peptide Research Institute)
• etilendiamintetraocetna kislina (EDTA) (Serva)
• etanol (Carlo Erba)
• fetalni goveji serum (FBS) (Gibco)
• glicerol (Serva)
• Dulbeccov spremenjeni medij Eagle (DMEM) (Gibco)
• H2O2 (LabExpert)
• Hepes (Sigma)
• L-glutamin (Sigma)
• metanol (Merck)
• N-acetil cistein (NAC) (Sigma)
• NaCl (Merck)
• natrijev dodecil sulfat (NaDS) (Sigma)
• Na2HPO4 x 2H2O (Acros organics)
11
• NaH2PO4 x 2H2O (Sigma)
• NAO (Thermo Scientific)
• NaOH (Merck)
• nitrocelulozna membrana NC45 (Serva)
• NP-40 (Roche diagnostics)
• označevalec velikosti O'GeneRuler Express DNA Ladder (Thermo Scientific)
• označevalec velikosti proteinov PageRulerTM Prestained Protein Ladder (Fermentas)
• penicilin/streptamicin (Sigma)
• Phire Tissue Direct PCR Master Mix (Thermo Scientific)
• propidijev jodid (PI) (Sigma)
• posneto mleko v prahu (Pomurske mlekarne)
• pufer za Trans Blot Turbo (Biorad)
• reagent Bradford (BioRad)
• reagent ECL za kemiluminiscenco (GE Healthcare Amersham)
• saharoza (Merck)
• set reagentov za razvijanje slik prenosa western ECL (Sigma)
• SYBR™ Safe barvilo za DNA na gelu (Thermo Scientific)
• Tetramethylethylenediamine (TEMED) (Merck)
• primarna kunčja monoklonska protitelesa proti GAPDH (Cell Signaling Technology)
• primarna kunčja monoklonska protitelesa proti stefinu B (Abcam)
• sekundarna kozja anti-kunčja protitelesa, konjugirana s hrenovo preoksidazo (Jackson ImmunoResearch)
3.1.5 Laboratorijska oprema
3.1.5.1 Aparature
• aparatura za PCR 2720 Thermal cycler (Applied Biosystems)
• bralnik mikrotitrskih plošč TECAN Infinite M1000in Saphire (Tecan)
• centrifugi 5810R (Eppendorf) in Centric200R (Tehtnica)
• inkubator s kontrolirano atmosfero: 37 °C in 5 % CO2 (Binder)
12
• kadička za NaDS PAGE (BioRad)
• kadička za agarozno elektroforezo (Owl Separation system)
• laminar M18 (Iskra PIO)
• ledomat AF200 (Scotsman)
• naprava za NaDS PAGE (Amersham Pharmacia Biotech)
• naprava za razvijanje filmov Gbox (Syngene)
• pretočni citometer FACSCalibur (Becton Dickinson)
• stresalnik Vibromix 314 EVT (Tehtnica)
• tehtnica Mettler PC 2000 (Lotrič)
• termomešalnik Thermomixer compact (Eppendorf)
• trans-blot turbo prenosni sistem za western prenos (BioRad)
• ultrazvočni razbijalec W-405D (Branson)
• vibracijski mešalnik Vibromix 10 (Tehtnica)
3.1.5.2 Plastični material
• mikrocentrifugirke (Eppendorf)
• centrifugirke za pretočni citometer (Falcon)
• sterilne pipete (Greiner)
• nastavki za pipete (Eppendorf)
• centrifugirke (Falcon)
• avtomatske pipete (Eppendorf)
• mikrotitrska ploščica s 96 vdolbinami, črna (Greiner)
• mikrotitrska ploščica s 96 vdolbinami, prozorna (Greiner)
• plošče za gojenje celic s premerom 10 cm (Greiner)
• plošče za gojenje celic z dvanajstimi vdolbinami(TPP)
• strgalo za celice (TPP)
3.1.5.3 Stekleni material
• steklenice 1 L
• krovno steklo (Blaubrand)
• Neubaeurjeva komora (Blaubrand)
• Pasteurjeve pipete (Brand)
13 3.1.6 Pufri
Preglednica 2: Uporabljeni pufri in njihova sestava.
Pufer Sestava
10-kratni elektroforezni pufer z borovo kislino
200 mM NaOH
z borovo kislino umerimo na pH 8
kaspazni pufer 100 mM HEPES
200 mM NaCl
10-kratni PBS pufer 145 mM NaCl
2,5 mM Na2HPO4 4-kratni koncentracijski pufer 6,1 % (w/v) TRIS/HCl
pH 6,8 10-kratni elektroforezni pufer za
NaDS-PAGE
3 % (w/v) TRIS 14,4 % (w/v) glicerol 1 % (w/v) NaDS
dH2O do končnega volumna 6-kratni nanašalni pufer za NaDS PAGE 30 % (w/v) glicerol
10 % (w/v) NaDS
0,012 % (w/v) bromfenol modro
4-kratni koncentracijski pufer do 10 mL 1 mM DTT
4-kratni ločevalni pufer 18,2 % (w/v) TRIS/HCl pH 8,8
14
3.2 Metode
3.2.1 Odmrzovanje celic
Vialo z zamrznjenimi celicami, ki so bile shranjene pri – 80 °C, smo hitro odmrznili pri 37 °C. Nato smo jih centrifugirali 4 minute pri 1300 rpm in jim odstranili supernatant.
Usedlino smo resuspendirali v 1 mL obogatenega gojišča DMEM in suspenzijo celic prenesli v 10-centimetrsko petrijevko z 9 mL obogatenega gojišča DMEM. Naslednji dan smo celicam zamenjali gojišče.
3.2.2 Gojenje in precepljanje celic
Celice smo gojili v inkubatorju s kontrolirano atmosfero pri temperaturi 37 °C in 5 % deležem CO2 v obogatenem gojišču DMEM. Ko so prerastle 90 % površine, smo gojišče odstranili in jih sprali s 5 mL PBS. Dodali smo jim 3 mL tripsina in inkubirali 5 minut pri 37 °C. Ko so se vse celice odlepile od podlage, smo jim dodali 3 mL DMEM, da smo ustavili tripsinizacijo. Celice smo ustrezno redčili z obogatenim gojiščem DMEM in jih prenesli na željeno število plošč.
3.2.3 Štetje celic
Na Neubarjevo komoro za štetje celic smo nanesli 10 μL suspenzije celic. Prešteli smo jih z uporabo fazno kontrastnega svetlobnega mikroskopa (Olympus CK 40-RPSL) pod 100-kratno povečavo. Po navodilih proizvajalca smo preračunali končno število celic v 1 mL suspenzije. Za poskuse smo celice gojili v koncentraciji 5 x 105 celic/mL v ustreznih ploščah.
3.2.4 Zamrzovanje celic
Pripravili smo zamrzovalno gojišče (10 % DMSO v FBS). Konfluentnim ploščam celic smo odstranili gojišče in jih sprali s 5 mL PBS. Dodali smo 3 mL tripsina in inkubirali 5 minut pri 37 °C. Ko so se vse celice odlepile od podlage, smo jim dodali 3 mL DMEM, da smo ustavili tripsinizacijo. Celice smo centrifugirali 5 minut pri 1000 rpm. Medij smo odsesali, usedlino pa resuspendirali v zamrzovalnem gojišču. Po 1 mL resuspendiranih celic smo prenesli v prej označene krioviale in jih do nadaljnje uporabe hranili pri – 80 °C.
3.2.5 Potrjevanje genotipa celic divjega tipa in celic z izbitim genom za stefin B Celice smo sprali s 5 mL PBS in jim dodali 3 mL tripsina. Ko so se odlepile od podlage, smo jim dodali 3 mL DMEM, da smo ustavili tripsinizacijo. Pripravili smo suspenzijo celic z 10 000 celicami, ki smo jo shranili pri – 20 °C do analize.
Za verižno reakcijo s polimerazo (PCR) smo uporabili Thermo Scientific Phire Tissue Direct PCR Master Mix po navodilih proizvajalca. V vzorce smo dodali 20 µL pufra in 1 µL raztopine za sprostitev DNA. Vzorce smo kratko centrifugirali in inkubirali na sobni temperaturi 5 minut. Sledila je 2-minutna inkubacija vzorcev pri 98 °C in kratko
15
centrifugiranje. Pripravili smo reakcijsko mešanico za PCR s končnim volumnom 20 µL (preglednica 3).
Preglednica 3: Sestava reakcijske mešanice za izvedbo PCR.
Komponenta Volumen [µL]
Temperatura prileganja oligonukleotidnih začetnikov je bila določena s strani proizvajalca (Sigma). Začetni oligonukleotidi so bili narejeni tako, da pomnožujejo 114 baznih parov (bp) velik fragment gena za stefin B z naslednjimi nukleotidnimi zaporedji:
- smerni začetni oligonukleotid (210F1)
5'-TGTCTTCAGCTTCTCCGTGCTAC-3' - protismernimerni začetni oligonukleotid (int1R1)
5'-CCTCACCTGGTCGGCGACCT-3' Potek PCR je naveden v preglednici 4.
Preglednica 4: Temperaturni program za izvedbo PCR.
Proces Temperatura barvilom. Elektroforeza je potekala 40 minut pri konstantni napetosti 130 V v 1-kratnem
16
pufru z borovo kislino. Uporabili smo označevalec velikosti O'GeneRuler Express DNA Ladder. Po končani elektroforezi smo za zaznavanje lis uporabili napravo Gbox.
3.2.6 Določanje vpliva H2O2, antioksidantov in inhibitorjev na celice
En dan pred tretiranjem smo nacepili 5 x 105 celic/mL na ustrezne plošče glede na predviden poskus. Na dan tretmaja pa smo zamenjali gojišče in dodali različne spojine v končnih koncentracijah navedenih v preglednici 5. Antioksidanta in inhibitor smo dodali dve uri pred dodatkom H2O2. Kontrolnim vzorcem smo dodali le novo sveže gojišče. Po zaključku inkubacije smo vzorce ustrezno pripravili za želeno analizo.
Preglednica 5: Uporabljene spojine za določanje vpliva H2O2, vitC, NAC in E64d na celice s končnimi koncentracijami v mediju.
Spojina Končna koncentracija Vloga spojine
H2O2 1, 3 ali 5 mM ROS
vitC 100 µM
antioksidant
NAC 1 mM
E64d 10 µM inhibitor cisteinskih proteaz
3.2.7 Meritve na pretočnem citometru
Za meritve na pretočnem citometru smo celice barvali z različnimi barvili (preglednica 6).
Preglednica 6: Pregled uporabljenih barvil za meritve na pretočnem citometru.
Barvilo Opazovanje
aneksin V-FITC in PI celična smrt
AO sprememba pH lizosomov
CM-H2DCFDA nastanek ROS
NAO oksidacija kardiolipina
3.2.7.1 Določanje deleža mrtvih celic
Ko je bila inkubacija končana, smo najprej prenesli gojišče v ustrezno označene centrifugirke. Nato smo celice sprali s PBS in ga prav tako prenesli v centrifugirke. Celice
17
smo inkubirali s tripsinom, dokler se niso odlepile od podlage. Tripsinizacijo smo ustavili z DMEM in celotno suspenzijo prenesli v centrifugirke. Vzorce smo centrifugirali 5 minut pri 1000 rpm. Supernatant smo odstranili, posamezni usedlini pa dodali 50 µL barvila aneksin V-FITC, ustrezno redčenega v 1 x vezavnem pufru, in inkubirali 15 minut.
Po inkubaciji smo dodali še ustrezno redčeno barvilo PI do celokupnega volumna 200 µL.
Vzorce smo do meritve hranili v temi. Fluorescenco PI smo izmerili s pretočnim citometrom na kanalu FL3, fluorescenco aneksina V-FITC pa na kanalu FL1. Podatke smo analizirali s programom FlowJo.
Pri apoptozi se zgodaj v signalni kaskadi fosfatidilserin prestavi iz notranje na zunanjo stran celične membrane. Barvilo aneksin V-FITC se veže specifično nanj, zato ga uporabljamo za detekcijo apoptoze [79]. PI pa je majhna fluorescentna molekula, ki se veže na DNA. Ker ne more pasivno prehajati skozi nepoškodovano celično membrano, ga uporabljamo za detekcijo celic s poškodovano membrano [80].
3.2.7.2 Določanje deleža celic s poškodovanimi lizosomi
15 minut pred iztekom inkubacije s H2O2 smocelicam dodali barvilo akridin oranž (AO) v končni koncentraciji 1 μg/mL. Gojišče smo nato prenesli v ustrezno označene centrifugirke. Nato smo celice sprali s PBS in ga prav tako prenesli v centrifugirke. Celice smo inkubirali s tripsinom, dokler se niso odlepile od podlage. Tripsinizacijo smo ustavili z DMEM in suspenzijo prenesli v centrifugirke. Vzorce smo centrifugirali 5 minut pri 1000 rpm. Supernatant smo odstranili, usedlinam pa dodali 200 μL PBS. Vzorce smo do meritve hranili v temi. Fluorescenco smo izmerili s pretočnim citometrom na kanalu FL3.
Podatke smo analizirali s programom FlowJo.
Barvilo AO je šibka baza in se kopiči v kislih veziklih. Ob povišanju pH v le-teh (npr. ob spremenjeni prepustnosti lizosomalne membrane), intenziteta rdeče fluorescence pade [81].
3.2.7.3 Določanje nastanka reaktivnih kisikovih spojin
Po končani inkubaciji smo najprej prenesli gojišče v ustrezno označene centrifugirke.
Nato smo celice sprali s PBS in ga prav tako prenesli v ustrezne centrifugirke. Celice smo inkubirali s tripsinom, dokler se niso odlepile od podlage. Tripsinizacijo smo ustavili z DMEM in celotno suspenzijo prenesli v centrifugirke. Vzorce smo centrifugirali 5 minut pri 1000 rpm. Supernatant smo odstranili, posamezni usedlini pa dodali barvilo CM-H2DCFDA, pripravljeno po navodilih proizvajalca, in inkubirali 30 minut. Po inkubaciji smo vzorce centrifugirali 5 minut pri 1000 rpm. Supernatant smo ponovno odstranili, usedlini pa dodali 200 µL PBS. Vzorce smo do meritve hranili v temi. Fluorescenco smo izmerili s pretočnim citometrom na kanalu FL1. Podatke smo analizirali s programom FlowJo.
18
Barvilo CM-H2DCFDA se uporablja za merjenje znotrajceličnih ROS. Celična esteraza barvilu odstrani acetatno skupino. Spojina potem reagira z intracelularnimi ROS. Sledi spontana oksidacija znotraj celice in barvilo začne fluorescirati [82].
3.2.7.4 Določanje oksidacije kardiolipina
30 minut pred iztekom inkubacije s H2O2 smocelicam dodali barvilo nonil akridin oranž (NAO) v končni koncentraciji 50 µM. Gojišče smo nato prenesli v ustrezno označene centrifugirke. Nato smo celice sprali s PBS in ga prav tako prenesli v centrifugirke. Celice smo inkubirali s tripsinom, dokler se niso odlepile od podlage. Tripsinizacijo smo ustavili z DMEM in suspenzijo prenesli v centrifugirke. Vzorce smo centrifugirali 5 minut pri 1000 rpm. Supernatant smo odstranili, usedlinam pa dodali 200 μL PBS. Vzorce smo do meritve hranili v temi. Fluorescenco smo izmerili s pretočnim citometrom na kanalu FL1.
Podatke smo analizirali s programom FlowJo.
Barvilo NAO se veže na kardiolipin, ki je na membrani mitohondrija. Če pride do oksidacije kardiolipina, NAO ne more biti več vezan na kardiolipin in intenziteta fluorescence pade [83].
3.2.8 Priprava celičnih lizatov in analiza proteinov
Po končani inkubaciji s H2O2, smo najprej prenesli gojišče z mrtvimi celicami v centrifugirko. Pritrjene celice pa smo sprali s 5 mL PBS in ga prenesli v isto centrifugirko.
Na pritrjene celice smo dodali 300 µL RIPA pufra. Celice smo postrgali s plošče s strgalom in jih prenesli v označeno mikrocentrifugirko, ki smo jo takoj dali na led.
Centrifugirke s suspenzijo mrtvih celic smo centrifugirali 5 minut pri 1000 rpm.
Supernatant smo previdno odstranili, usedlino pa resuspendirali v 20 µL RIPA pufra in ga prenesli v ustrezno mikrocentrifugirko. Do nadaljnje uporabe smo vzorce shranili pri – 20 °C.
Lizate smo odtajali na ledu in jih skozi celoten postopek priprave hranili na ledu. Odtajane vzorce smo sonificirali dvakrat po 10 sekund oziroma dokler se niso zbistrili. Nato smo jih 10 minut centrifugirali pri 4 °C in 13200 rpm. Supernatant smo prenesli v novo označeno mikrocentrifugirko, usedlino pa smo zavrgli.
3.2.8.1 Določanje koncentracije celokupnih proteinov v celičnih lizatih z Bradfordovo metodo
Za določitev koncentracije celokupnih proteinov v celičnih lizatih smo najprej pripravili umeritveno krivuljo z različnimi koncentracijami BSA. Volumne, ki so prikazani v preglednici 7, smo nanesli na mikrotitrsko ploščico s 96 vdolbinami.
19
Preglednica 7: Volumni komponent za pripravo umeritvene krivulje za določanje koncentracije proteinov z Bradfordovo metodo.
Absorbance vzorcev smo izmerili na TECAN spektrometru pri valovni dolžini 595 nm.
Iz dobljenih rezultatov smo izrisali umeritveno krivuljo, s katero smo določili koncentracijo celokupnih proteinov v celičnih lizatih.
Vzorce lizatov smo redčili z dH2O v razmerju 1:400 ali 1:600. V mikrotitrsko ploščico s 96 vdolbinami smo odpipetirali v vsako vdolbino 40 µL Bradford reagenta, potem pa še 160 µL redčenega vzorca. Absorbanco smo izmerili na TECAN spektrometru pri valovni dolžini 595 nm. Koncentracijo smo izračunali s pomočjo spodnje enačbe.
𝑐 = ( 𝐴 − 𝑛
𝑘 ) ∗ 𝑅
c …… koncentracija celokupnih proteinov A ……izmerjena absorbance redčenega lizata k, n ….koeficienta iz umeritvene krivulje R …… redčitev vzorca
3.2.8.2 Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti NaDS (NaDS-PAGE)
NaDS-PAGE smo uporabili za ločevanje proteinov. Najprej smo pripravili 12,5 % gel (sestava v preglednici 7). Komponente smo zmešali po navedenem vrstnem redu.
20
TEMED in APS smo dodali tik preden smo gel vlili med stekelca. Ko se je gel strdil, smo ga shranili pri 4 °C do naslednjega dne ali pa ga uporabili takoj.
Volumnu celičnih lizatov, ki je vseboval 50 µg proteinov, smo dodali 6 x nanašalni pufer z DTT. Vzorce smo segreli (5 minut pri 95 °C), jih centrifugirali in nato nanesli na 12,5 % gel (sestava v preglednici 8). Nanesli smo tudi označevalec velikosti proteinov PageRulerTM Prestained Protein Ladder. Elektroforeza je potekala 60 minut pri konstantnem toku 30 mA/gel.
Preglednica 8: Komponente za 12,5 % nanašalni in ločevalni poliakrilamidni gel.
nanašalni gel 12,5 % ločevalni gel
0,625 µL akrilamida 3,13 mL akrilamida
1,25 mL Tris pH 6.8 2,50 mL Tris pH 8.8
3,075 mL dH2O 4,27 mL dH2O
0,05 mL 10 %NaDS 0,10 mL 10 % NaDS
10 µL TEMED 20 µL TEMED
20 µL 10 % APS 40 µL 10 % APS
3.2.8.3 Detekcija proteinov s prenosom western
Ločene proteine iz NaDS-PAGE gela smo prenesli na nitrocelulozno membrano s hitrim prenosom western (Trans-Blot turbo). Prenos je potekal 7 minut pri toku 2,5 A in napetosti 25 V v pufru pripravljenem po navodilih proizvajalca. Po končanem prenosu smo membrane inkubirali 45 minut na sobni temperaturi v blokirnem pufru (5 % mleko v prahu v PBST). Membrane smo po blokadi inkubirali s primarnimi protitelesi proti GAPDH (redčena 1:3000 v PBST) in stefinu B (redčena 1:2000 v PBST) preko noči pri 4 °C na stresalniku. Po inkubaciji smo membrane spirali 3 x 15 minut s PBST in nato inkubirali 45 minut z ustreznimi sekundarnimi protitelesi (redčena 1:10000 v PBST).
Membrane smo ponovno spirali 3 x 15 minut s PBST. Po dodatku reagenta ECL, ki smo ga pripravili po navodilih proizvajalca, smo proteinske lise detektirali z napravo Gbox.
3.2.8.4 Merjenje kaspazne aktivnosti
Uporabili smo črno mikrotitrsko ploščico s 96 vdolbinami. Najprej smo v vsako vdolbino dodali 50 µL kaspaznega pufra z 20 µM DTT. Nato smo dodali dH2O in volumne lizatov s 50 µg proteinov (skupaj 40 µL). Mikrotitrsko ploščo smo inkubirali 10 minut pri 37 °C.
Po končani inkubaciji smo dodali še 10 µL substrata Ac-DEVD-AFC v končni koncentraciji 10 µM. Razgradnjo substrata v odvisnosti od časa smo spremljali fluorimetrično pri vzbujevalni valovni dolžini 400 nm in emisijski valovni dolžini 505 nm. Iz dobljenih rezultatov smo izrisali graf fluorescence v odvisnosti od časa ter iz naklona krivulje izračunali povprečno aktivnost kaspaz.
21 3.2.9 Statistična analiza rezultatov
Za izvedbo poskusov smo imeli različne biološke ponovitve. Pri celicah divjega tipa smo uporabili celične kulture iz treh različnih miši, pri celicah z izbitim genom za stefin B pa iz dveh. Vsak poskus, kjer ni drugače zavedeno, smo opravili v dveh neodvisnih eksperimentih z dvema tehničnima ponovitvama. Iz dobljenih rezultatov smo izračunali povprečje in standardni odklon meritev. Rezultate smo analizirali s programom Microsoft Excel 2016. Za ugotavljanje statističnih razlik smo uporabili Student t test v programu GraphPad Prism 8.4.3. Za statistično značilno razliko smo upoštevali, če je bila vrednost p < 0,05 (*).
22
4 Rezultati
4.1 Potrditev genotipa mišjih celic
Tekom raziskave smo opazovali razliko med primarnimi MMTV-PyMT tumorskimi celicami divjega tipa (DT) in primarnimi MMTV-PyMT tumorskimi celicami z izbitim genom za stefin B (StfB-/-). Primarne MMTV-PyMT tumorske celice so izolirali iz transgenih miši na Institutu »Jožef Stefan« na odseku za Biokemijo, molekularno in strukturno biologijo po predhodno opisani metodi [78]. Celične kulture so izolirali iz različnih miši, da smo dobili boljši vzorec in imeli tudi več ponovitev.
Najprej smo naredili genotipizacijo s PCR in tako potrdili, da so celice, ki smo jih uporabili v poskusih, bodisi celice divjega tipa bodisi celice z izbitim genom za stefin B.
Na sliki 1 je agarozni gel s produkti PCR. Pri vzorcih DT1, DT2 in DT3 so vidne lise različnih intenzitet v velikosti 114 bp pomnoženega fragmenta gena za stefin B, pri vzorcih StfB-/- 1 in StfB-/- 2 pa ne.
Slika 1: Produkti PCR za potrditev celic divjega tipa in celic z izbitim genom za stefin B.
Slika 1: Produkti PCR za potrditev celic divjega tipa in celic z izbitim genom za stefin B.