3.2 Metode
3.2.8 Priprava celičnih lizatov in analiza proteinov
Po končani inkubaciji s H2O2, smo najprej prenesli gojišče z mrtvimi celicami v centrifugirko. Pritrjene celice pa smo sprali s 5 mL PBS in ga prenesli v isto centrifugirko.
Na pritrjene celice smo dodali 300 µL RIPA pufra. Celice smo postrgali s plošče s strgalom in jih prenesli v označeno mikrocentrifugirko, ki smo jo takoj dali na led.
Centrifugirke s suspenzijo mrtvih celic smo centrifugirali 5 minut pri 1000 rpm.
Supernatant smo previdno odstranili, usedlino pa resuspendirali v 20 µL RIPA pufra in ga prenesli v ustrezno mikrocentrifugirko. Do nadaljnje uporabe smo vzorce shranili pri – 20 °C.
Lizate smo odtajali na ledu in jih skozi celoten postopek priprave hranili na ledu. Odtajane vzorce smo sonificirali dvakrat po 10 sekund oziroma dokler se niso zbistrili. Nato smo jih 10 minut centrifugirali pri 4 °C in 13200 rpm. Supernatant smo prenesli v novo označeno mikrocentrifugirko, usedlino pa smo zavrgli.
3.2.8.1 Določanje koncentracije celokupnih proteinov v celičnih lizatih z Bradfordovo metodo
Za določitev koncentracije celokupnih proteinov v celičnih lizatih smo najprej pripravili umeritveno krivuljo z različnimi koncentracijami BSA. Volumne, ki so prikazani v preglednici 7, smo nanesli na mikrotitrsko ploščico s 96 vdolbinami.
19
Preglednica 7: Volumni komponent za pripravo umeritvene krivulje za določanje koncentracije proteinov z Bradfordovo metodo.
Absorbance vzorcev smo izmerili na TECAN spektrometru pri valovni dolžini 595 nm.
Iz dobljenih rezultatov smo izrisali umeritveno krivuljo, s katero smo določili koncentracijo celokupnih proteinov v celičnih lizatih.
Vzorce lizatov smo redčili z dH2O v razmerju 1:400 ali 1:600. V mikrotitrsko ploščico s 96 vdolbinami smo odpipetirali v vsako vdolbino 40 µL Bradford reagenta, potem pa še 160 µL redčenega vzorca. Absorbanco smo izmerili na TECAN spektrometru pri valovni dolžini 595 nm. Koncentracijo smo izračunali s pomočjo spodnje enačbe.
𝑐 = ( 𝐴 − 𝑛
𝑘 ) ∗ 𝑅
c …… koncentracija celokupnih proteinov A ……izmerjena absorbance redčenega lizata k, n ….koeficienta iz umeritvene krivulje R …… redčitev vzorca
3.2.8.2 Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti NaDS (NaDS-PAGE)
NaDS-PAGE smo uporabili za ločevanje proteinov. Najprej smo pripravili 12,5 % gel (sestava v preglednici 7). Komponente smo zmešali po navedenem vrstnem redu.
20
TEMED in APS smo dodali tik preden smo gel vlili med stekelca. Ko se je gel strdil, smo ga shranili pri 4 °C do naslednjega dne ali pa ga uporabili takoj.
Volumnu celičnih lizatov, ki je vseboval 50 µg proteinov, smo dodali 6 x nanašalni pufer z DTT. Vzorce smo segreli (5 minut pri 95 °C), jih centrifugirali in nato nanesli na 12,5 % gel (sestava v preglednici 8). Nanesli smo tudi označevalec velikosti proteinov PageRulerTM Prestained Protein Ladder. Elektroforeza je potekala 60 minut pri konstantnem toku 30 mA/gel.
Preglednica 8: Komponente za 12,5 % nanašalni in ločevalni poliakrilamidni gel.
nanašalni gel 12,5 % ločevalni gel
0,625 µL akrilamida 3,13 mL akrilamida
1,25 mL Tris pH 6.8 2,50 mL Tris pH 8.8
3,075 mL dH2O 4,27 mL dH2O
0,05 mL 10 %NaDS 0,10 mL 10 % NaDS
10 µL TEMED 20 µL TEMED
20 µL 10 % APS 40 µL 10 % APS
3.2.8.3 Detekcija proteinov s prenosom western
Ločene proteine iz NaDS-PAGE gela smo prenesli na nitrocelulozno membrano s hitrim prenosom western (Trans-Blot turbo). Prenos je potekal 7 minut pri toku 2,5 A in napetosti 25 V v pufru pripravljenem po navodilih proizvajalca. Po končanem prenosu smo membrane inkubirali 45 minut na sobni temperaturi v blokirnem pufru (5 % mleko v prahu v PBST). Membrane smo po blokadi inkubirali s primarnimi protitelesi proti GAPDH (redčena 1:3000 v PBST) in stefinu B (redčena 1:2000 v PBST) preko noči pri 4 °C na stresalniku. Po inkubaciji smo membrane spirali 3 x 15 minut s PBST in nato inkubirali 45 minut z ustreznimi sekundarnimi protitelesi (redčena 1:10000 v PBST).
Membrane smo ponovno spirali 3 x 15 minut s PBST. Po dodatku reagenta ECL, ki smo ga pripravili po navodilih proizvajalca, smo proteinske lise detektirali z napravo Gbox.
3.2.8.4 Merjenje kaspazne aktivnosti
Uporabili smo črno mikrotitrsko ploščico s 96 vdolbinami. Najprej smo v vsako vdolbino dodali 50 µL kaspaznega pufra z 20 µM DTT. Nato smo dodali dH2O in volumne lizatov s 50 µg proteinov (skupaj 40 µL). Mikrotitrsko ploščo smo inkubirali 10 minut pri 37 °C.
Po končani inkubaciji smo dodali še 10 µL substrata Ac-DEVD-AFC v končni koncentraciji 10 µM. Razgradnjo substrata v odvisnosti od časa smo spremljali fluorimetrično pri vzbujevalni valovni dolžini 400 nm in emisijski valovni dolžini 505 nm. Iz dobljenih rezultatov smo izrisali graf fluorescence v odvisnosti od časa ter iz naklona krivulje izračunali povprečno aktivnost kaspaz.
21 3.2.9 Statistična analiza rezultatov
Za izvedbo poskusov smo imeli različne biološke ponovitve. Pri celicah divjega tipa smo uporabili celične kulture iz treh različnih miši, pri celicah z izbitim genom za stefin B pa iz dveh. Vsak poskus, kjer ni drugače zavedeno, smo opravili v dveh neodvisnih eksperimentih z dvema tehničnima ponovitvama. Iz dobljenih rezultatov smo izračunali povprečje in standardni odklon meritev. Rezultate smo analizirali s programom Microsoft Excel 2016. Za ugotavljanje statističnih razlik smo uporabili Student t test v programu GraphPad Prism 8.4.3. Za statistično značilno razliko smo upoštevali, če je bila vrednost p < 0,05 (*).
22
4 Rezultati
4.1 Potrditev genotipa mišjih celic
Tekom raziskave smo opazovali razliko med primarnimi MMTV-PyMT tumorskimi celicami divjega tipa (DT) in primarnimi MMTV-PyMT tumorskimi celicami z izbitim genom za stefin B (StfB-/-). Primarne MMTV-PyMT tumorske celice so izolirali iz transgenih miši na Institutu »Jožef Stefan« na odseku za Biokemijo, molekularno in strukturno biologijo po predhodno opisani metodi [78]. Celične kulture so izolirali iz različnih miši, da smo dobili boljši vzorec in imeli tudi več ponovitev.
Najprej smo naredili genotipizacijo s PCR in tako potrdili, da so celice, ki smo jih uporabili v poskusih, bodisi celice divjega tipa bodisi celice z izbitim genom za stefin B.
Na sliki 1 je agarozni gel s produkti PCR. Pri vzorcih DT1, DT2 in DT3 so vidne lise različnih intenzitet v velikosti 114 bp pomnoženega fragmenta gena za stefin B, pri vzorcih StfB-/- 1 in StfB-/- 2 pa ne.
Slika 1: Produkti PCR za potrditev celic divjega tipa in celic z izbitim genom za stefin B.
Na sliki so prikazani vzorci v naslednjem vrstnem redu: označevalec velikosti (ST), DT1, DT2, DT3, StfB-/-1 in StfB-/- 2.
Za preverjanje izražanja stefina B v celicah smo naredili imunodetekcijo s prenosom western na popolnih celičnih lizatih. Na poliakrilamidni gel smo nanesli po 25 µg proteina posameznega vzorca. Za kontrolo količine nanesenega proteina smo uporabili gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (GAPDH). Na sliki 2 je membrana po prenosu western in inkubaciji z ustreznimi protitelesi. Vidne so lise v velikosti stefina B pri celicah divjega tipa, pri celicah z izbitim genom za stefin B pa so odsotne. Pri celicah divjega tipa sta vidni dve lisi podobne velikosti. Možno je, da je prišlo do fragmentacije stefina B, saj so lise prisotne le pri celicah divjega tipa. Tako z genotipizacijo kot s prenosom Western smo potrdili, da je pri celicah divjega tipa stefin B prisoten, pri celicah z izbitim genom za stefin B pa odsoten.
23
Slika 2: Izražanje stefina B v primarni celični kulturi. Na sliki so prikazani vzorci v naslednjem vrstnem redu: označevalec velikosti (ST), DT1, DT2, DT3, StfB-/-1, StfB-/-2.
4.2 Določanje deleža mrtvih celic
V naslednjem koraku smo preverili občutljivost celic na tretiranje s H2O2. Butinar in sodelavci so namreč pokazali, da so celice divjega tipa MMTV-PyMT in z izbitim genom za stefin B različno odzivajo na tretiranje s H2O2 [74].
Celice smo 24 ur tretirali z različnimi koncentracijami H2O2 (0-5 mM). Po končani inkubaciji, smo celice najprej pogledali pod svetlobnim mikroskopom pod 40 x povečavo.
Že na prvi pogled je bilo vidno, da je pri celicah z izbitim genom za stefin B precej več mrtvih (odlepljenih) kot pri celicah divjega tipa tretiranih z enako koncentracijo H2O2. Ostalih morfoloških sprememb (npr. krčenje celic) nismo opazili.
Celice smo nato pobarvali v skladu s protokolom za aneksin V-FITC in PI. Pri apoptozi se namreč zgodaj v signalni kaskadi fosfatidilserin prestavi iz notranje na zunanjo stran celične membrane. Barvilo aneksin V-FITC se veže specifično nanj, zato ga uporabljamo za detekcijo apoptoze [79]. PI pa je majhna fluorescentna molekula, ki se veže na DNA.
Ker ne more pasivno prehajati skozi nepoškodovano celično membrano, ga uporabljamo za detekcijo celic s poškodovano membrano [80].
Po barvanju, smo vzorce pomerili na pretočnem citometru in rezultate analizirali s programom FlowJo. Rezultati so bili zbrani v točkovnih diagramih, ki na osi X prikazujejo intenziteto fluorescence za aneksin V-FITC, na osi y pa intenziteto fluorescence za PI. Kot mrtve celice smo pri izračunu upoštevali vse aneksin V-FITC in/ali PI pozitivne dogodke, ki so prikazani v kvadrantih Q1, Q2 in Q3.
Iz slike 3 je razvidno, da 1 mM H2O2 sproži celično smrt pri celicah z izbitim genom za stefin B v 70 %, pri celicah divjega tipa tretiranih z 1 mM pa ni velike razlike v primerjavi z netretiranimi (0 mM). Z višanjem koncentracije H2O2 pa se začne poviševati odstotek mrtvih celic tudi pri celicah divjega tipa (npr. pri 3 mM H2O2 je 45 % mrtvih celic), vendar je pri celicah z izbitim genom za stefin B odstotek mrtvih celic še višji (90 %). Iz slike 3 je tudi razvidno, da za podoben učinek na celice potrebujemo 5 mM H2O2 za celice divjega tipa, za celice z izbitim genom za stefin B pa je potreben zgolj 1 mM H2O2. Na podlagi teh rezultatov smo se odločili, da bomo za nadaljnje poskuse uporabljali 3 mM H2O2.
24 (A)
(B)
Slika 3: Določanje deleža mrtvih celic po tretiranju s H2O2. (A) Stolpični diagram prikazuje naraščanje deleža mrtvih celic v odvisnosti od koncentracije H2O2 po 24 h pri celicah divjega tipa (DT) in celicah z izbitim genom za stefin B (StfB-/-). Kot odstotek mrtvih celic so predstavljene aneksin V-FITC in/ali PI pozitivne celice. Pri celicah divjega tipa smo uporabili celične kulture iz treh različnih miši, pri celicah z izbitim genom za stefin B pa iz dveh. Opravili smo dva neodvisna eksperimenta z dvema tehničnima ponovitvama. Podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti s standardno napako teh meritev. Statistika je bila narejena s Student t testom (*; p < 0,05). (B) Prikaz reprezentativnih točkovnih diagramov za posamezno meritev na pretočnem citometru. V
0 20 40 60 80 100 120
0 1 3 5
Delež mrtvih celic [%]
Koncentracija H2O2[mM]
DT
StfB-/-*
* *
25
vsakem kvadrantu je zapisan pripadajoči delež celic. Leva dva histograma predstavljata kontrolno skupino, desna dva pa predstavljata 24-urno inkubacijo celic v prisotnosti 3 mM H2O2. Mrtve celice predstavljajo oba zgornja kvadranta ter spodnji desni kvadrant (PI in/ali aneksin V-FITC pozitivne celice).
V okviru raziskovalne naloge smo želeli določiti, kakšno obliko smrti sprožimo v celicah divjega tipa in celicah z izbitim genom za stefin B. Zato smo naredili poskus, v katerem smo merili porast deleža mrtvih celic v odvisnosti od časa tretiranja s 3 mM H2O2. Iz grafa na sliki 4 je razvidno, da v izbranem časovnem okvirju ne pride do porasta deleža mrtvih celic divjega tipa v prisotnosti H2O2. V nasprotju s tem, pa se delež mrtvih celic z izbitim genom za stefin B s časom povečuje. Po 30 minutah se delež celične smrti pri le-teh dvigne na skoraj 30 %, po 240 minutah pa je mrtvih več kot 70 % celic. Razlika med smrtnostjo celic divjega tipa in celic z izbitim genom za stefin B je v vseh časovnih točkah statistično značilna.
(B)
0 20 40 60 80 100 120
0 30 60 120 240
Delež mrtvih celic [%]
Čas inkubacije [min]
DT
StfB-/-(A)
*
*
* *
26
Slika 4: Določanje deleža mrtvih celic po tretiranju s H2O2 v odvisnosti od časa. (A) Stolpični diagram prikazuje naraščanje deleža mrtvih celic v odvisnosti od časa tretiranja s 3 mM H2O2. Kot odstotek mrtvih celic so predstavljene aneksin V-FITC in/ali PI pozitivne celice. Pri celicah divjega tipa smo uporabili celične kulture iz treh različnih miši, pri celicah z izbitim genom za stefin B pa iz dveh. Opravili smo dva neodvisna eksperimenta z dvema tehničnima ponovitvama. Podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti s standardno napako teh meritev. Statistika je bila narejena s Student t testom (*; p < 0,05). (B) Prikaz reprezentativnih točkovnih diagramov za posamezno meritev na pretočnem citometru. V vsakem kvadrantu je zapisan pripadajoči delež celic. Leva dva histograma predstavljata kontrolno skupino, srednja dva predstavljata 30-minutno inkubacijo celic v prisotnosti 3 mM H2O2, desna dva pa predstavljata 60-minutno inkubacijo celic v prisotnosti 3 mM H2O2. Mrtve celice predstavljajo oba zgornja kvadranta ter spodnji desni kvadrant (PI in/ali aneksin V-FITC pozitivne celice).
4.3 Kaspazna aktivnost
V nadaljevanju smo želeli določiti, kakšen tip celične smrti sproži H2O2 v naših celičnih modelih. Ugotovili smo, da ne pri celicah divjega tipa ne pri celicah z izbitim genom za stefin B že po 30 minut inkubaciji s H2O2 nimamo aneksin V-FITC pozitivnih celic in PI negativnih celic, ki so značilne za apoptotske celice (slika 4B). Da bi potrdili, da 3 mM H2O2 ne sproži apoptoze v naših celičnih modelih, smo izmerili še kaspazno aktivnost.
Njihova aktivnost je namreč značilna za apoptozo [84,85].
Na podlagi zgornjih rezultatov (slika 4) smo se osredotočili na dogajanje v prvih 4 urah tretmaja s 3 mM H2O2. Po različno dolgih inkubacijah smo pripravili celične lizate. S spremljanjem razgradnje substrata Ac-DEVD-AFC, smo določili aktivnost efektorskih kaspaz. Če so namreč efektorske kaspaze aktivne, razgradijo Ac-DEVD-AFC in pri tem nastane fluorescentni produkt [84]. Uporabili smo tudi pozitivno kontrolo, kjer smo celicam dodali STS, ki sproža apoptozo [86]. Iz slike 5 je razvidno, da pri pozitivni kontroli s STS, pride do povišanja kaspazne aktivnosti. Po inkubaciji s 3 mM H2O2 v prvih 4 urah ne pride do aktivacije efektorskih kaspaz niti pri celicah divjega tipa niti pri celicah z izbitim genom za stefin B. Iz tega lahko sklepamo, da 3 mM H2O2 v naših celičnih modelih ne sproži apoptoze.
27
Slika 5: Določanje kaspazne aktivnosti v celičnih lizatih po tretiranju s 3 mM H2O2 v različnih časovnih točkah. Za pozitivno kontrolo smo celice tretirali 2 h z 0,5 µM STS.
Izmerili smo razgradnjo substrata Ac-DEVD-AFC v celičnem lizatu v določenem času in iz dobljenih podatkov izračunali naklon rasti fluorescence v odvisnosti od časa. Ta predstavlja kaspazno aktivnost in je predstavljen na y-osi. Poskus smo naredili enkrat z dvema tehničnima ponovitvama in tremi (pri celicah divjega tipa) ali dvema (pri celicah z izbitim genom za stefin B) biološkima ponovitvama. Podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti s standardno napako.
4.4 Določanje deleža celic s poškodovanimi lizosomi
Na celično smrt bi lahko vplivala tudi prepustnost lizosomalne membrane in izlitje lizosomalnih katepsinov v citosol [87]. H2O2 namreč interagira z intralizosomskim železom, da nastane hidroksilni radikal. Ta pa vodi v peroksidacijo lipidov lizosomalne membrane in njeno prepustnost [88]. Integriteto lizosomov smo preverjali z barvilom AO.
Barvilo AO je šibka baza in se kopiči v kislih veziklih. Če pride do povišanja pH v le-teh (npr. ob spremenjeni prepustnosti lizosomalne membrane), intenziteta rdeče fluorescence pade [81]. Spremembo pH v lizosomih smo preverili z AO barvanjem po 30- in 60-minutni inkubaciji s 3 mM H2O2.
Iz slike 6A je razvidno, da pri celicah divjega tipa ne pride do spremembe intenzitete barvanja z AO po tretiranju s 3 mM H2O2 v odvisnosti od časa. Pri celicah z izbitim genom za stefin B pa pride do upada intenzitete fluorescence že po 30-minutni inkubaciji, kar je razvidno tudi iz diagramov, ki prikazujejo intenziteto fluorescence (slika 6B).
28 (A)
(B)
Slika 6: Vpliv 3 mM H2O2 na pH lizosomov v odvisnosti od časa tretiranja. (A) Celice divjega tipa in celice z izbitim genom za stefin B smo tretirali s 3 mM H2O2 za 30 in 60 min. Vzorce smo pobarvali z AO in nato izmerili intenziteto fluorescence AO (GeoMean) s pretočnim citometrom. Rezultati so normalizirani na kontrolni vzorec (0 min tretiranja) in podani v arbitrarnih enotah (a.e.). Pri celicah divjega tipa smo uporabili celične kulture iz treh različnih miši, pri celicah z izbitim genom za stefin B pa iz dveh. Opravili smo dva neodvisna eksperimenta z dvema tehničnima ponovitvama. Podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti s standardno napako teh meritev. Statistika je bila narejena s Student t testom (*; p < 0,05). (B) Prikaz intenzitete fluorescence AO po 30 minutnem tretiranju celicah divjega tipa in celic z izbitim genom za stefin B s H2O2 na reprezentativnih primerih. Na levem grafu je prikazana intenziteta fluorescence pri netretiranih in tretiranih celicah divjega tipa. Na desnem grafu pa je prikazana intenziteta fluorescence pri netretiranih in tretiranih celicah z izbitim genom za stefin B.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
0 30 60
Intenziteta fluorescence barvila AO [a.e.]
Čas inkubacije [min]
DT StfB-/- *
29
4.5 Določanje vpliva inhibitorja katepsinov
Pokazali smo, da pride do spremembe pH v lizosomih že v 30 minutah tretiranja s 3 mM H2O2 (slika 6A). V kolikor bi prišlo tudi do permeabilizacije lizosomske membrane, bi lahko cisteinski katepsini, sproščeni v citosol, imeli pomembno vlogo pri celični smrti [89].
Vlogo katepsinov v celični smrti sproženi s H2O2 smo želeli preveriti posredno z dodajanjem inhibitorja cisteinskih proteaz E64d. Če bi katepsini imeli pomembno vlogo pri tej celični smrti, bi v prisotnosti inhibitorja pričakovali zmanjšanje smrtnosti celic po dodatku H2O2 v primerjavi s celicami tretiranimi samo s H2O2. Iz slike 7 je razvidno, da ni razlike pri celicah divjega tipa tretiranih samo s H2O2 ali pa s predhodnim inkubiranjem z E64d. Prav tako pri celicah z izbitim genom za stefin B po dodatku inhibitorja ne pride do znižanja odstotka mrtvih celic v primerjavi s celicami, ki so tretirane zgolj s H2O2.
Slika 7: Vpliv inhibitorja E64d na celično smrt sproženo s H2O2. Celice divjega tipa in celice z izbitim genom za stefin B smo 2 h predhodno inkubirali z 10 µM E64d, kjer je to navedeno, in nato 4 h s 3 mM H2O2. Kot odstotek mrtvih celic so predstavljene aneksin V-FITC in/ali PI pozitivne celice. Pri celicah divjega tipa smo uporabili celične kulture iz 3 različnih miši, pri celicah z izbitim genom za stefin B pa iz dveh. Opravili smo dva neodvisna eksperimenta z dvema tehničnima ponovitvama. Podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti s standardno napako teh meritev. Statistika je bila narejena s Student t testom (*; p < 0,05).
0 20 40 60 80 100
Delež mrtvih celic [%]
DT
StfB-/-H2O2 - - + +
E64D - + - +
30
4.6 Določanje nastanka ROS
Znotrajcelične ROS so pogosto povezane z različnimi oblikami celične smrti [90].
Zanimalo nas je, ali tretma s 3 mM H2O2 po 60 in 120 minutah vpliva na porast znotrajceličnih ROS. To smo preverili z dodatkom barvila CM-H2DCFDA, ki zaznava le-te. Celična esteraza barvilu odstrani acetatno skupino. Spojina potem reagira z intracelularnimi ROS. Sledi spontana oksidacija znotraj celice in barvilo začne fluorescirati [82].
Iz slike 8A je razvidno, da pri celicah divjega tipa ne pride do velike razlike med posameznimi tretiranji. Pri celicah z izbitim genom za stefin B pa zaznamo povišanje znotrajceličnih ROS po 60 minutni inkubaciji s H2O2, kar je razvidno iz diagramov, ki prikazujejo intenziteto fluorescence (Slika 8B). Po 120-minutni inkubaciji pa nivo znotrajceličnih ROS začne upadati.
(A)
(B)
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
0 60 120
Intenziteta fluorescence barvila za zaznavanje ROS (a.e.)
Čas inkubacije [min]
DT
StfB-/-*
31
Slika 8: Časovni potek nastanka ROS po tretiranju s H2O2. (A) Stolpični diagram prikazuje nastanek ROS v odvisnosti od časa tretiranja s 3 mM H2O2. Za detekcijo ROS smo uporabili barvilo CM-H2DCFDA. Izmerjeni rezultati (GeoMean) so normalizirani na kontrolni vzorec (0 min) in podani v arbitrarnih enotah (a.e.). Pri celicah divjega tipa smo uporabili celične kulture iz 3 različnih miši, pri celicah z izbitim genom za stefin B pa iz dveh. Opravili smo dva neodvisna eksperimenta z dvema tehničnima ponovitvama.
Podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti s standardno napako. Statistika je bila narejena s Student t testom (*; p < 0,05). (B) Diagrami prikazujejo razliko med netretiranimi celicami (0 min) in celicami po 1-urnem tretiranju s 3 mM H2O2. Za celice divjega tipa in celice z izbitim genom za stefin B so prikazani reprezentativni diagrami.
4.7 Določanje oksidacije kardiolipina
Povišanje znotrajceličnih ROS pogosto vodi do peroksidacije lipidov [91]. Kardiolipin je pomemben fosfolipid notranje membrane mitohondrija. Predstavlja 15–20 % mitohondrijskih fosfolipidov. Ima velik delež nenasičenih maščobnih kislin, zaradi česar se hitro oksidira v prisotnosti ROS. Oksidiran kardiolipin se prestavi na zunanjo membrano mithondrija v prisotnosti mitohondrijskega stresa. Kardiolipin ima tudi vlogo pri signalizaciji apoptoze in prestavitvi citokroma c iz notranje na zunanjo membrano mitohondrija [92].
Ker pride do povišanja ROS po 60-minutnem tretiranju s H2O2 (slika 8), nas je zanimalo, kako je z oksidacijo kardiolipina. Celice smo tretirali s 3 mM H2O2 in nato po različno dolgih inkubacijah celice pobarvali z barvilom NAO, ki se veže na kardiolipin izključno na notranji membrani mitohondrija. Če pride do oksidacije kardiolipina, barvilo NAO ne mora biti več vezano na kardiolipin in intenziteta fluorescence pade, kar pomeni, da so mitohondriji pod stresom. Iz slike 9A je razvidno, da pri celicah divjega tipa zaznamo trend upadanja intenzitete fluorescence, a le to ni statistično značilno. Pri celicah z izbitim genom za stefin B pa pride do bistvenega povišanja oksidacije kardiolipina po 120 minutah in primerljiv nivo se ohrani tudi po 240 minutah. Oksidacija kardiolipina se je pokazala kot zmanjšanje intenzitete fluorescence po barvanju z NAO (slika 9B).
32 (A)
(B)
Slika 9: Časovni potek oksidacije kardiolipina po tretiranju s H2O2. (A) Stolpični diagram prikazuje oksidacijo kardiolipina v odvisnosti od časa tretiranja s 3 mM H2O2. Za zaznavanje oksidacije kardiolipina smo uporabili barvilo NAO. Izmerjeni rezultati (GeoMean) so normalizirani na kontrolni vzorec (0 min) in podani v arbitrarnih enotah (a.e.). Pri celicah divjega tipa smo uporabili celične kulture iz treh različnih miši, pri celicah z izbitim genom za stefin B pa iz dveh. Opravili smo dva neodvisna eksperimenta z dvema tehničnima ponovitvama. Podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti s standardno napako. Statistika je bila narejena s Student t testom (*; p < 0,05). (B) Diagrami prikazujejo razliko med netretiranimi celicami (0 min) in celicami po 2 h tretiranju s 3 mM H2O2. Za celice divjega tipa in celice z izbitim genom za stefin B so
Slika 9: Časovni potek oksidacije kardiolipina po tretiranju s H2O2. (A) Stolpični diagram prikazuje oksidacijo kardiolipina v odvisnosti od časa tretiranja s 3 mM H2O2. Za zaznavanje oksidacije kardiolipina smo uporabili barvilo NAO. Izmerjeni rezultati (GeoMean) so normalizirani na kontrolni vzorec (0 min) in podani v arbitrarnih enotah (a.e.). Pri celicah divjega tipa smo uporabili celične kulture iz treh različnih miši, pri celicah z izbitim genom za stefin B pa iz dveh. Opravili smo dva neodvisna eksperimenta z dvema tehničnima ponovitvama. Podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti s standardno napako. Statistika je bila narejena s Student t testom (*; p < 0,05). (B) Diagrami prikazujejo razliko med netretiranimi celicami (0 min) in celicami po 2 h tretiranju s 3 mM H2O2. Za celice divjega tipa in celice z izbitim genom za stefin B so