Peter Kopač

Peter Kopač

NAPOVEDNI DEJAVNIKI ZA TEŽKE SISTEMSKE ZAPLETE MED IMUNOTERAPIJO

PREDICTORS OF SEVERE ADVERSE EVENTS DURING IMMUNOTHERAPY

Imenovanje mentorja na seji senata: 27. 3. 2018 Imenovanje somentorja na seji senata: 27. 3. 2018

Komisija za oceno in zagovor imenovana na seji senata: 15. 4. 2019 Imenovan nadomestni član Komisije za oceno in zagovor: 20. 5. 2019

Sklep senata članice UL o ustreznosti teme doktorske disertacije: 16. 12. 2019 Soglasje senata UL k temi doktorske disertacije: 14. 1. 2020

Datum zagovora:

Mentor: prof. dr. Mitja Košnik Somentor: prof. dr. Peter Korošec Predsednik komisije: prof. dr. Alojz Ihan Član: prof. dr. Mojca Narat

Član: doc. dr. Vojko Berce

POVZETEK

Uvod: specifična imunoterapija je edini način zdravljenja pacientov, ki so imeli težko anafilaksijo po piku kožekrilca. Med imunoterapijo lahko pride do težkih zapletov, zato jo je pri nekaterih pacientih treba prekiniti.

Namen dela: ugotoviti dejavnike, ki napovedujejo težke zaplete med imunoterapijo s strupi kožekrilcev in ugotoviti, ali dodatno zdravljenje z omalizumabom omogoča varno uvedbo imunoterapije pri pacientih s ponavljajočimi se težkimi zapleti med imunoterapijo.

Metode: analizirali smo pojavnost in težo sistemskih zapletov med imunoterapijo pri pacientih, pri katerih smo na Univerzitetni kliniki Golnik uvedli imunoterapijo v letih 2005–2016, ter analizirali klinične (starost, spol, teža izvorne reakcije) in imunološke (koncentracija specifičnih IgE proti celotnemu ekstraktu strupa čebele in ose ter proti posameznim rekombinatno pridobljenim alergenom, bazalna triptaza, test aktivacije bazofilcev) dejavnike tveganja za pojav sistemskih zapletov.

Paciente, pri katerih smo imunoterapijo prekinili zaradi zapletov, smo zdravili z omalizumabom in ponovno poskušali uvesti imunoterapijo.

Rezultati: sistemski zapleti med imunoterapijo se pojavljajo pri 10,8 %, pri 1,3 % pa smo morali imunoterapijo zaradi zapletov prekiniti. Poglavitni dejavnik tveganja za zaplete med imunoterapijo je zdravljenje s strupom čebele: med imunoterapijo s strupom čebele je imelo zaplete 23,1 %, med imunoterapijo s strupom ose pa 1,8 % pacientov (P < 0,0001). Pacienti z zapleti med imunoterapijo s strupom čebele so imeli težjo izvorno reakcijo po piku čebele (P = 0,013). Pacienti, pri katerih smo imunoterapijo s strupom čebele prekinili zaradi zapletov, so imeli višjo bazalno koncentracijo triptaze (5,23 µg/ml) v primerjavi s pacienti z obvladljivimi zapleti (4,29 µg/ml) ter pacienti brez zapletov (4,35 µg/ml) (P ≤ 0,01). Prav tako so imeli pacienti, pri katerih smo imunoterapijo s strupom čebele prekinili zaradi zapletov, višjo aktivacijo bazofilcev s strupom čebele pri koncentracijo 0,1 µg/ml (79,1 % ) v primerjavi s pacienti brez zapletov (39,0 %) in z blagimi zapleti (62,6 %) (P ≤ 0,003).

Napovedni dejavnik za težke zaplete med imunoterapijo je visoka aktivnost bazofilcev pri stimulaciji z 0,1 µg/ml strupa čebele (OR (95 % CI) 1,041 (1,005–1,073), P=0,0004). Zdravljenje z omalizumabom omogoča varno in uspešno uvedbo imunoterapije pri 9 od 11 pacientov. Pojavnost zapletov med imunoterapijo je bila bistveno manjša, če je bila aktivnost bazofilcev pri stimulaciji z 0,1 µg/ml strupa čebele pod 20 % (P = 0,0004).

Zaključek: potrdili smo, da obstajajo napovedni dejavniki za težke sistemske zaplete med imunoterapijo – občutljivost bazofilcev in bazalni nivo serumske triptaze. Zdravljenje z omalizumabom zmanjša občutljivost bazofilcev ter omogoča varno uvedbo imunoterapije pri pacientih, ki so imeli več težkih sistemskih reakcij med imunoterapijo. Dinamika občutljivosti bazofilcev napoveduje tudi klinični uspeh zdravljenja z omalizumabom.

ABSTRACT

Introduction: Venom immunotherapy (VIT) is the only effective treatment to prevent further systemic reactions in patients with Hymenoptera venom allergy. However, during immunotherapy patients can develop systemic adverse events (SAEs) and in some cases, VIT has to be stopped due to recurrent and severe SAEs (VIT failure due to SAEs).

Objective: To investigate predictors of SAEs during VIT and to determine whether omalizumab as an adjunct to VIT reduces SAEs and allows the continuation of VIT.

Methods: We analysed the incidence and severity of SAEs during VIT in patients undergoing VIT at the University Hospital Golnik in 2005-2016 and analysed clinical (age, sex, severity of the initial reaction) and immunological (specific IgE for wasp and bee venom, recombinant IgE, basal tryptase, basophil activation test) risk factors for SAEs. Patients with VIT failure were then invited to participate in an open-label trial of omalizumab as an adjunct to VIT.

Results: Systemic adverse events during VIT occurred in 10.8%. In 1.3% we had to stop VIT due to recurrent severe SAEs. The main risk factor for systemic adverse events during immunotherapy is treatment with bee venom, 23.1% patients treated with bee venom and only 1.8% treated with wasp venom had adverse events (P < 0.0001). Patients with systemic adverse events during bee venom immunotherapy had a more severe initial reaction after bee sting (P = 0.013). Patients in whom bee venom immunotherapy was discontinued due to systemic adverse events had higher basal tryptase levels (5.23 mcg/ml) compared with patients with manageable adverse events (4.29 mcg/ml) and patients without adverse events (4.35 mcg/ml) (P ≤ 0.01). Also, patients in whom bee venom immunotherapy was discontinued due to systemic adverse events had higher basophil activation with bee venom at 0.1 mcg/ml (79.1%), compared with patients without adverse events (39.0%,) with manageable adverse events (62.6%) (P ≤ 0.003). High basophil activation with 0.1 mcg/ml honey-bee venom was a significant and independent predictor of SAEs and VIT failure during honey-bee VIT (OR (95% CI)1.041 (1.005-1.073), P = 0.0004). Adjunct treatment with omalizumab allowed the safe and successful introduction of immunotherapy in 9/11 patients. The incidence of SAEs during VIT was significantly lower when basophil activity was below 20% when stimulated with 0.1 mcg/ml bee venom (P = 0.0004).

Conclusion: We confirmed that there are predictive factors for SAEs during immunotherapy – basophil sensitivity and basal serum tryptase level. Omalizumab treatment reduces basophil sensitivity and allows the safe introduction of immunotherapy in patients with VIT failure due to SAEs. The dynamics of basophil sensitivity also predict the clinical success of adjunct omalizumab treatment.

Vsebina

SEZNAM SLIK ... 3

SEZNAM TABEL ... 4

SEZNAM UPORABLJENIH KRATIC ... 5

1 UVOD ... 6

1.1ALERGIJA NA STRUPE KOŽEKRILCEV ... 6

1.1.1 Patofiziologija alergije na strupe kožekrilcev ... 6

1.1.2 Klinična slika alergije na strupe kožekrilcev ... 7

1.1.3 Rizični faktorji za težji potek alergijske reakcije po piku kožekrilca ... 8

1.1.4 Bolezen mastocitov in vloga bazalne triptaze ... 9

1.2DIAGNOSTIKA ALERGIJE NA STRUPE KOŽEKRILCEV ... 10

1.2.1 Test aktivacije bazofilcev... 11

1.3SPECIFIČNA IMUNOTERAPIJA S STRUPOM KOŽEKRILCEV ... 12

1.3.1 Mehanizmi specifične imunoterapije s strupom kožekrilcev ... 12

1.3.2 Potek zdravljenja s specifično imunoterapijo s strupom kožekrilcev ... 12

1.4OMALIZUMAB V ZDRAVLJENJU ALERGIJSKIH BOLEZNI... 15

2. NAMEN DELA IN HIPOTEZE ... 17

3. METODE ... 18

3.1ZASNOVA RAZISKAVE ... 18

3.2PREISKOVANCI ... 18

3.3NAPOVEDNI DEJAVNIKI ZA TEŽKE SISTEMSKE ZAPLETE MED IMUNOTERAPIJO ... 20

3.4ZDRAVLJENJE Z OMALIZUMABOM ... 20

3.5DIAGNOSTIČNE METODE ... 21

3.5.1 Kožni testi ... 21

3.5.2 Določanje specifičnih IgE protiteles ... 22

3.5.3 Določanje bazalne serumske triptaze ... 22

3.5.4 Test aktivacije bazofilcev... 22

3.5.5 Merjenje števila receptorjev Fcε-RI in IgE na površini bazofilca... 22

3.6OBDELAVA PODATKOV ... 23

4. REZULTATI ... 24

4.1POTEK RAZISKAVE... 24

4.2ZAPLETI MED IMUNOTERAPIJO S STRUPOM ŽUŽELK ... 26

4.3KLINIČNI IN IMUNOLOŠKI NAPOVEDNI DEJAVNIKI ZA ZAPLETE IN NEUSPEH IMUNOTERAPIJE S STRUPOM ŽUŽELKE ... 38

4.3.1 Klinične razlike pacientov zdravljenih s strupom čebele... 44

4.3.2 Vrednosti specifičnih IgE pacientov zdravljenih s strupom čebele ... 44

4.3.3 Bazalna triptaza ... 44

4.3.5 Test aktivacije bazofilcev... 45

4.3.6 Napovedni dejavniki za zaplete med imunoterapijo ter za neuspeh imunoterapije s strupom čebele . 47 4.4ODPRTA PROSPEKTIVNA ŠTUDIJO DODATNEGA ZDRAVLJENJA Z OMALIZUMABOM OB IMUNOTERAPIJI S STRUPOM ČEBELE ... 47

4.4.1 Prvotni protokol / omalizumab 150 mg ... 50

4.4.2 Optimiziran protokol / omalizumab 300 mg ... 50

4.4.3 Vzdrževalna faza ... 51

4.4.4 Pojavnost zapletov med imunoterapijo in senzitivnost bazofilcev ... 52

5. RAZPRAVA ... 56

5.1NAPOVEDNI DEJAVNIKI ZA TEŽKE SISTEMSKE ZAPLETE MED IMUNOETRAPIJO ... 56

5.2POTEK ZDRAVLJENJA Z OMALIZUMABOM ... 58

5.3OMEJITVE RAZISKAVE ... 58

5.4ZAKLJUČEK ... 60

6. Reference ... 61

SEZNAM SLIK

SLIKA 1:POTEK IN VRSTA IMUNOTERAPIJE CELOTNE ŠTUDIJSKE POPULACIJE, PACIENTOV Z VSEMI LABORATORIJSKIMI PODATKI TER PACIENTOV Z NEUSPEHOM SIT ZARADI ZAPLETOV, KI SO BILI PRIMERNI ZA DODATNO ZDRAVLJENJE Z OMALIZUMABOM. ... 25 SLIKA 2:BAZALNA TRIPTAZA PACIENTOV KJER JE POTEKALA IMUNOTERAPIJA S STRUPOM ČEBELE BREZ ZAPLETOV, Z OBVLADLJIVIMI ZAPLETI

IN Z NEUSPEHOM IMUNOTERAPIJE ZARADI ZAPLETOV. ... 45 SLIKA 3:AKTIVACIJA BAZOFILCEV PACIENTOV KJER JE POTEKALA IMUNOTERAPIJA S STRUPOM ČEBELE BREZ ZAPLETOV, Z OBVLADLJIVIMI

ZAPLETI IN Z NEUSPEHOM IMUNOTERAPIJE ZARADI ZAPLETOV. ... 46 SLIKA 4:RAZMERJE ODZIVA BAZOFILCEV NA STRUP ČEBELE IN ODZIVA NA ANTI FCERI MAB PACIENTOV KJER JE POTEKALA IMUNOTERAPIJA

S STRUPOM ČEBELE BREZ ZAPLETOV, Z OBVLADLJIVIMI ZAPLETI IN Z NEUSPEHOM IMUNOTERAPIJE ZARADI ZAPLETOV. ... 46 SLIKA 5:PRVOTNI TER OPTIMIZIRAN PROTOKOL DODATNEGA ZDRAVLJENJA Z OMALIZUMAB OB IMUNOTERAPIJI S STRUPOM ČEBELE. . 49 SLIKA 6:POTEK DODATNEGA ZDRAVLJENJA Z OMALIZUMAB OB UVODNI FAZI IMUNOTERAPIJI S STRUPOM ČEBELE ... 50 SLIKA 7:POTEK DODATNEGA ZDRAVLJENJA Z OMALIZUMAB OB UVODNI FAZI IMUNOTERAPIJI S STRUPOM ČEBELE PRI 6 PACIENTIH KI SMO

JIH ZDRAVILI Z OMALIZUMAB 3X300MG/2 TEDNA. ... 50 SLIKA 8:DODATNO ZDRAVLJENJE Z OMALIZUMABOM 300 MG V VZDRŽEVALNI FAZI IMUNOTERAPIJE S STRUPOM ČEBELE PRI (A)6 PACIENTIH Z USPEŠNIM ZDRAVLJENJEM Z OMALIZUMABOM IN PRI (B) 3 PACIENTIH Z NEUSPEŠNIM ZDRAVLJENJEM Z OMALIZUMABOM IN PREKINITVIJO IMUNOTERAPIJE ZARADI POGOSTIH ZAPLETOV.52

SLIKA 9:AKTIVACIJA BAZOFILCEV GLEDE NA POJAVNOST ZAPLETOV MED UVODNIM DELOM IMUNOTERAPIJE Z DODATNIM ZDRAVLJENJEM Z OMALIZUMABOM. ... 53 SLIKA 10:POTEK DODATNEGA ZDRAVLJENJA Z OMALIZUMAB OB UVODNI FAZI IMUNOTERAPIJI S STRUPOM ČEBELE PRI 5 PACIENTIH KI

SMO JIH ZDRAVILI Z OMALIZUMAB 2X150MG/2 TEDNA, POJAVNOST ZAPLETOV TER APLIKACIJA OMALIZUMABA V POVEZAVI Z ŠTEVILOM RECEPTORJEV FCΕ-RI,IGE NA POVRŠINI BAZOFILCA TER AKTIVACIJO BAZOFILCEV. ... 54 SLIKA 11: AKTIVACIJA BAZOFILCEV GLEDE NA POJAVNOST ZAPLETOV MED VZDRŽEVALNIM DELOM IMUNOTERAPIJE Z DODATNIM

ZDRAVLJENJEM Z OMALIZUMABOM ... 55 SLIKA 12:POJAVNOST ZAPLETOV MED APLIKACIJO IMUNOTERAPIJE ČE JE BILA AKTIVACIJA BAZOFILCEV PRI KONCENTRACIJI STRUPA ČEBELE

0.1 µG/ML MANJŠA ALI VIŠJA OD 20% ... 55

SEZNAM TABEL

TABELA 1:ALERGENI STRUPOV DOMAČE ČEBELE IN NAVADNE OSE ... 7

TABELA 2:KLASIFIKACIJA TEŽE SISTEMSKE ALERGIJSKE REAKCIJE PO MUELLERJU (11)(12). ... 8

TABELA 3:KLASIFIKACIJA TEŽE SISTEMSKE ALERGIJSKE REAKCIJE PO RINGU IN MESSMERJU (13). ... 8

TABELA 4:TOČKOVNIK REMA ZA OCENO VERJETNOSTI BOLEZNI AKTIVACIJE MASTOCITOV (27). ... 10

TABELA 5:KLASIFIKACIJA STRANSKIH UČINKOV MED SPECIFIČNO IMUNOTERAPIJO (PO LINDI COX [6)]. ... 14

TABELA 6:HITRI IN ZELO HITRI UVODNI PROTOKOL IMUNOTERAPIJE S STRUPOM ŽUŽELK. ... 19

TABELA 7:VKLJUČITVENI IN IZKLJUČITVENI KRITERIJI ZA PROSPEKTIVNO ŠTUDIJO DODATNEGA ZDRAVLJENJA Z OMALIZUMABOM OB PONOVNI IMUNOTERAPIJI ... 21

TABELA 8:DEMOGRAFSKI PODATKI TER POTEK IMUNOTERAPIJE CELOTNE ŠTUDIJSKE SKUPINE, SKUPINE PACIENTOV Z VSEMI LABORATORIJSKIMI PODATKI IN PACIENTOV Z NEUSPEŠNO SIT, VKLJUČENIH V ODPRTO, PROSPEKTIVNO ŠTUDIJO DODATNEGA ZDRAVLJENJA Z OMALIZUMABOM PRED PONOVNO UVEDBO IMUNOTERAPIJE. ... 26

TABELA 9:PODROBNI DEMOGRAFSKI IN KLINIČNI PODATKI 23 PACIENTOV Z NEUSPEŠNO SIT ZARADI ZAPLETOV ... 37

TABELA 10:PRIMERJAVA DEMOGRAFSKIH ZNAČILNOSTI PACIENTOV Z VSEMI LABORATORIJSKIMI PODATKI, PACIENTOV, KI NISO BILI VKLJUČENI V ANALIZO ZARADI MANJKAJOČIH LABORATORIJSKIH PODATKOV, TER CELOTNE ŠTUDIJSKE POPULACIJE. ... 38

TABELA 11:DEMOGRAFSKI, KLINIČNI IN IMUNOLOŠKI PODATKI CELOTNE SKUPINE, TAKO PACIENTOV, KI SO SE ZDRAVILI S STRUPOM ČEBELE KOT PACIENTOV, KI SO SE ZDRAVILI S STRUPOM OSE. ... 40

TABELA 12:DEMOGRAFSKI IN KLINIČNI PODATKI, NIVOJI SPECIFIČNIH PROTITELES PROTI STRUPU ČEBELE IN OSE TER REKOMBINANTNIMA ALERGENOMA RAPIM 1 IN RAPIM 10, NIVO BAZALNE SERUMSKE TRIPTAZE IN RAZLIČNI PARAMETRI AKTIVACIJE BAZOFILCEV S STRUPOM ČEBELE PRI PACIENTIH, KI SO SE ZDRAVILI S STRUPOM ČEBELE. ... 42

TABELA 13:DEMOGRAFSKI IN KLINIČNI PODATKI, NIVOJI SPECIFIČNIH PROTITELES PROTI STRUPU ČEBELE IN OSE, NIVO BAZALNE SERUMSKE TRIPTAZE IN RAZLIČNI PARAMETRI AKTIVACIJE BAZOFILCEV S STRUPOM OSE PRI PACIENTIH, KI SO SE ZDRAVILI S STRUPOM OSE. ... 43

TABELA 14:LOGISTIČNA REGRESIJSKA ANALIZA DEJAVNIKOV, POVEZANIH Z ZAPLETI MED SIT IN NEUSPEŠNO SIT ZARADI ZAPLETOV, PRI 332 PACIENTIH, KI SO BILI ZDRAVLJENI Z IMUNOTERAPIJO S STRUPOM ČEBELE ... 47

SEZNAM UPORABLJENIH KRATIC

SIT specifična imunoterapija

SČ strup čebele

SO strup ose

BAT test aktivacije bazofilcev (ang. basophile activation test) CD63 označevalnik pripadnosti 63 (ang. cluster of differentiation) FITC fluorescein izotiocianat

fMLP formil-metionil-leucil fenilalanin

FcεRI visoko afinitetni receptor za Fc-regijo IgE sIgE specifična protitelesa IgE

BB zdravila iz skupine zaviralcev adrenergičnih receptorjev beta ACEi zdravila iz skupine zaviralcev encima angiotenzinske konvertaze

NN neznana žuželka

IQR kvartilni razpon (interquartile range)

1 UVOD

1.1 Alergija na strupe kožekrilcev

Piki kožekrilcev so pogosti. Vsaj 56,6–94,5 % ljudi doživi vsaj en pik kožekrilca v življenju (1). Večjo verjetnost za pik imajo čebelarji ter njihovi družinski člani, vrtnarji, gozdarji, sadjarji, motoristi in ljudje, ki veliko časa preživijo v naravi (2). Večina ljudi po piku kožekrilca nima zapletov, četrtina ljudi lahko razvije veliko lokalno reakcijo, pri 5–7,5 % pa se lahko razvije sistemska alergijska reakcija (3) (4).

1.1.1 Patofiziologija alergije na strupe kožekrilcev

V evropskem prostoru so čebela, osa, čmrlj in sršen glavni kožekrilci, katerih strupi povzročajo anafilaksijo. V Avstraliji in nekaterih predelih Azije pa je pogost vzrok anafilaksije še strup skakajoče mravlje. Žuželke ob piku sprostijo različne količine strupa: čebela ob enem piku sprosti 50–150 µg strupa, čmrlj pa 10–31 µg. Osa ob enem piku spusti 1,7–5 µg strupa, vendar lahko piči večkrat zapovrstjo. Količina strupa ob piku sršena ni znana, v vrečki pa vsebuje 260 µg strupa (5) (6). Strupi kožekrilcev so kompleksna mešanica različnih snovi, kot so biogeni amini, majhni peptidi ter proteini z višjo molekulsko maso, ki različno prispevajo k senzibilizaciji, klinični sliki in uspehu imunoterapije.

Strup čebel in čmrljev je podoben po sestavi, saj sodijo v skupno družino pravih čebel (Apidae), prav tako je podobna sestava strupa os in sršenov, ki sodijo v skupno družino pravih os (Vespidae). Najbolj raziskan je strup domače čebele (Apis mellifera), ki vsebuje več kot 100 različnih proteinov (7). Med njimi so najpomembnejši fosfolipaza (Api m 1), hialuronidaza (Api m 2), kisla fosfataza (Api m 3), dipeptidil peptidaza IV (Api m 5) in ikarapin (Api m 10), ki jih imenujemo glavni alergeni, s katerimi je senzibiliziranih več kot 50 % pacientov (7). Glavna alergena strupa ose in sršena pa sta fosfolipaza A1 (Ves v 1) in antigen 5 (Ves v 5) (7). Natančen seznam alergenov strupa domače čebele in navadne ose je naveden v Tabeli 1 (8).

Po piku kožekrilca se pri določenem številu posameznikov lahko tvorijo specifična protitelesa IgE (sIgE), ki so specifična za določeno komponento strupa. IgE se veže na receptor z visoko afiniteto (FcεRI) na površini krvnih bazofilcev in mastocitov, v manjši meri pa tudi na druge vrste celic, kot so nevtrofilci, eozinofilci, monociti, dendritične celice in trombociti (9). Ob ponovni izpostavitvi enakemu alergenu le-ta poveže dve protitelesi IgE, vezani na FcεRI, ter s tem sproži aktivacijo in degranulacijo mastocitov in bazofilcev. Klinično sliko alergije povzročajo sproščeni mediatorji, kot so histamin, levkotrieni, prostaglandini, citokini, triptaza in faktor, ki aktivira trombocite (9).

Alergen Ime

Domača čebela (Apis mellifera) Api m 1 fosfolipaza A2 Api m 2 hialuronidaza Api m 3 kisla fosfataza Api m 4 melitin

Api m 5 dipeptidil peptidaza IV Api m 6

Api m 7 serinska proteaza CUB Api m 8 karboksilesteraza

Api m 9 serinska karboksilpeptidaza Api m 10 ikarapin – različica 2

Api m 11 poglavitni protein matični mleček Api m 12 vitelogenin

Navadna osa (Vespula vulgaris) Ves v 1 fosfolipaza A1 Ves v 2 hialuronidaza

Ves v 3 dipeptidil peptidaza IV Ves v 5 antigen 5

Ves v 6 vitelogenin

Tabela 1: Alergeni strupov domače čebele in navadne ose (8)

1.1.2 Klinična slika alergije na strupe kožekrilcev

Normalno je, da na mestu pika nastane majhna, omejena lokalna reakcija z oteklino ter rdečino. Lahko je prisotna tudi bolečina ali srbež prizadetega dela. Težave izzvenijo v 24 urah.

Kadar reakcija vztraja več kot 24 ur ter je premer otekline večji od 10 cm, govorimo o veliki lokalni reakciji (5). Pojavljajo se pri 2,4–26,4 % po piku (10). Velike lokalne reakcije praviloma niso nevarne, so pa lahko zelo moteče, saj je lahko otečen cel ud, in vztrajajo več dni. Spremljajo jih lahko nespecifični sistemski znaki, kot so slabost, mrzlica, povišana telesna temperatura in glavobol. Pri takšnih pacientih dokažemo senzibilizacijo s strupom žuželke pri 70–90 % in ti pacienti lahko razvijejo sistemsko alergijsko reakcijo ob naslednjem piku pri 2–15 % (5)(10).

Sistemska alergijska reakcija pa se lahko razvije po piku kožekrilca pri 5–7,5 % odraslih in pri 3,4 % otrok (3) (4). Teža reakcije je zelo različna, od blage reakcije, ki je omejena samo na kožo, do težke sistemske reakcije, ki se lahko konča s smrtjo. Stopnjo sistemske alergijske reakcije ob piku kožekrilca razdelimo po Muellerju (11) (12) (Tabela 2) ali po Ringu in Messmerju (13) (Tabela 3). V evropskem prostoru praviloma bolj uporabljamo klasifikacijo po Muellerju.

Teža reakcije Klinični opis

I. stopnja Generalizirana urtikarija, srbenje, anksioznost

II. stopnja Poleg znakov I. stopnje še vsaj dva od naslednjih: angioedem mehkih tkiv, cmok v grlu, stiskanje v prsih, slabost, bruhanje, driska, bolečina v trebuhu, omotica, tahikardija

III. stopnja Poleg znakov II. stopnje še vsaj dva od naslednjih: hudo dušenje, piskanje, stridor, disfagija, disartrija, hripavost, zmedenost, tahikardija

IV. stopnja Poleg znakov III. stopnje še vsaj dva od naslednjih: hipotenzija, kolaps, izguba zavesti, inkontinenca vode in blata, cianoza Tabela 2: Klasifikacija teže sistemske alergijske reakcije po Muellerju (11) (12).

Teža reakcije Klinični opis

I. stopnja Generalizirana kožna simptomatika, angioedem

II. stopnja Blagi do srednje težki simptomi prizadetosti kardiovaskularnega, respiratornega ali gastrointestinalnega sistema

III. stopnja Anafilaktični šok, izguba zavesti

IV. stopnja Srčni zastoj, smrt

Tabela 3: Klasifikacija teže sistemske alergijske reakcije po Ringu in Messmerju (13).

Reakcija se večinoma pojavi hitro, v nekaj minutah do ene ure po piku, redko več ur po piku. Reakcija izzveni po zdravljenju z adrenalinom in antihistaminikom. Reakcije redko potekajo v dveh fazah in se ponovijo po 4–24 urah. Smrtnost zaradi anafilaksije po piku kožekrilca je ocenjena na 0,03–0,48 primera na milijon prebivalcev na leto (4). Izmed vseh primerov smrti zaradi anafilaksije je bil pik kožekrilca vzrok pri 20 % (14).

Ob piku večjega števila žuželk (več kot 50 pikov) pa lahko pride do sistemske toksične reakcije z rabdomiolizo, prizadetostjo srca, jeter, ledvic ter diseminirano intravaskularno koagulacijo. Smrtni toksični primeri so opisani po piku 200–1000 žuželk, pri otrocih pa že po piku 50 žuželk (5).

1.1.3 Dejavniki tveganja za težji potek alergijske reakcije po piku kožekrilca

Med najpomembnejšimi zunanjimi dejavniki za težji potek ali celo smrt zaradi anafilaksije po piku žuželke je prepozna aplikacija adrenalina (15), zato je pomembno, da so vsi pacienti, preobčutljivi za strup kožekrilcev, ves čas opremljeni z avtoinjektorjem adrenalina. Prav tako je pomemben položaj telesa: smrtnost zaradi anafilaksije je bila večja, če so pacienti med zdravljenjem sedeli v primerjavi s tem, če so ležali (15). S težjem potekom reakcije so povezani tudi fizični ali psihični stres pred pikom, sočasno uživanje alkohola ali acetilsalicilne kisline ter pik v predel glave (16). Reakcija poteka težje pri starejših, po nekaterih podatkih je rizični faktor celo že starost nad 40 let. Prav tako je več težjih reakcij pri moških kot pri ženskah (16). Opisane so težje reakcije po piku ose v primerjavi z reakcijami po piku čebele, kar je nenavadno, saj je imunoterapija s strupom čebele povezana z bistveno več zapleti kot imunoterapija s strupom ose (17).

Zdravila iz skupine zaviralcev adrenergičnih receptorjev beta inhibirajo vezavo endogeno sproščenega in terapevtsko apliciranega adrenalina ter povečajo sproščanje mediatorjev iz mastocitov (18). Prav tako zdravila iz skupine zaviralcev encima angiotenzinske konvertaze zmanjšujejo razgradnjo bradikinina ter neposredno vplivajo tudi na mastocite (18). Jemanje obeh vrst zdravil je povezano s težjim potekom anafilaksije ter je odsvetovano pacientom z alergijo na strupe žuželk [14] [15] (21) (22) (23). Obstajajo pa tudi nasprotna poročila, ki te povezave ne potrjujejo (24)(25) (26). Glavna omejitev teh študij je, da sočasna bolezen krvožilnega sistema, ki je v osnovi zahtevala zdravljenje z beta- blokatorji ali zaviralci ACE, ni bila zajeta v multivariantno analizo napovednih dejavnikov. Tako trenutno ni možno povedati, ali je anafilaksija težje potekala zaradi osnovne bolezni krvožilnega sistema ali zaradi jemanja omenjenih zdravil.

1.1.4 Bolezen mastocitov in vloga bazalne triptaze

Najpomembnejši dejavnik tveganja za težji potek anafilaksije je bolezen mastocitov. Motnje v aktivaciji mastocitov (angl. MCAD, mast cell activation disorders) so heterogena skupina bolezni, pri katerih mastociti neustrezno in prekomerno sproščajo kemične mediatorje. Simptomi, ki nastanejo zaradi prekomernega izločanja mediatorjev, so srbež, rdečica, urtikarija, palpitacije, slabost in predvsem pogostejše anafilaksije. Te se lahko pojavijo tudi spontano, brez zunanjih dejavnikov, ob psihičnem ali fizičnem stresu. Veliko pogostejše kot v splošni populaciji pa so tudi težje anafilaktične reakcije ob piku žuželke. Za te paciente je značilen klinično drugačen potek anafilaktične reakcije: reakcija se pojavi zelo hitro, v času do 5 minut po piku; je težka s takojšnjimi znaki prizadetosti kardiovaskularnega sistema, kot so vrtoglavica, hipotenzija, kolaps in izguba zavesti, ob tem pa pacienti pogosto nimajo znakov prizadetosti kože, kot so urtikarija ali angioedem (24,26,27).

Sistemska mastocitoza je bolezen, kjer pride do klonalne proliferacije morfološko in imunofenotipsko nenormalnih mastocitov, ki se kopičijo v več kot enem organu. Za diagnozo je potreben dokaz skupkov mastocitov v biopsiji kostnega mozga ali katerega koli drugega organa, najpogosteje kože. Poleg tega so diagnostični kriteriji določen imunofenotip mastocitov (CD25+), dokaz aktivirajoče mutacije cKIT D816V v krvi ali v kostnem mozgu ter zvišan nivo bazalne triptaze nad 20 ng/ml (28). Klinična slika je zelo različna in odvisna od stopnje prizadetosti posameznih organov. Najpogostejša oblika je indolentna mastocitoza, pri kateri ima pacient klinično samo simptome povečane aktivnosti mastocitov, redkejše pa so agresivne oblike sistemske mastocitoze, ki napredujejo v levkemijo.

Sistemska mastocitoza je redka bolezen, prevalenca v splošni populaciji je ocenjena na 0,96–

1,3/10.000 odraslih. Ocenjeno pa je, da ima celo do 7,9 % pacientov z alergijo na čebelji strup sistemsko mastocitozo in 8–15 % določeno motnjo v aktivaciji mastocitov, vendar pa ne dosegajo vseh kriterijev za postavitev diagnoze sistemske mastocitoze (2,23,25,28–30) (31) (32). Strupi žuželk so tudi najpogostejši vzrok anafilaksije med pacienti z mastocitozo in reakcija je lahko prvi znak bolezni.

Natančni mehanizmi za povečano večjo dovzetnost za anafilaktične reakcije na strup žuželk pri teh pacientih zaenkrat niso dokončno znani. Predvideva se, da povečano breme mastocitov privede do večjega sproščanja mediatorjev v primeru pika in da razporeditev mastocitov ob krvnih žilah povzroča neposredni vstop mediatorjev v sistemski krvni obtok. Aktivirajoča mutacija cKIT D816V preprečuje apoptozo ter povečuje delitev in diferenciacijo mastocitov. Komponenta strupa žuželk fosfolipaza A2 pa lahko povzroči tudi neposredno sproščanje mastocitnih mediatorjev (33).

Triptaza je encim, ki se sprošča iz mastocitov in bazofilcev ob degranulaciji. V mastocitih je prisotna oblika beta-triptaze, v bazofilcih pa alfa-triptaze. Obe kodira isti gen TPSAB1 (34). Meritev bazalne triptaze je enostavna in dostopna preiskava, ki kaže na višjo obremenitev posameznika z mastociti. S komercialno dostopnimi testi izmerimo skupno vrednost neaktivne oblike alfa-triptaze in beta-triptaze

ter encimsko aktivne zrele beta-triptaze. Študije dokazujejo, da je že koncentracija bazalne triptaze v visoko normalnem območju (pod 11,4 ng/ml) povezana s težjim potekom anafilaksije (25,35). Rueff s sodelavci je potrdila, da je povezava med koncentracijo bazalne triptaze in težo reakcije eksponentna (25). Zanimivo pa je, da tveganje za anafilaksijo upada pri pacientih z zelo visoko vrednostjo bazalne triptaze (nad 40 ng/ml) in zelo veliko obremenitvijo z mastociti, kar pripisujejo višji obremenitvi z nefunkcionalnimi mastociti (36). To je skladno tudi s podatki, da je med pacienti z indolentno sistemsko mastocitozo več težkih reakcij v primerjavi s pacienti z bolj agresivnimi oblikami mastocitne levkemije (37).

Na osnovi teh podatkov je oblikovan točkovnik REMA (Tabela 4), ki upošteva spol, klinične značilnosti ter bazalno triptazo. Dve točki ali več z veliko verjetnostjo (občutljivost 0,92, specifičnost 0,81) napovedujeta, da ima pacient lahko pridruženo bolezen aktivacije mastocitov (27).

Lastnost Točke

Spol Moški +1

Ženski -1

Klinična slika Odsotnost urtikarije, srbeža, angioedema +1 Prisotnost urtikarije, srbeža, angioedema -2

Presinkopa/sinkopa +3

Bazalna triptaza ˂ 15 ng/ml -1

> 25 ng/ml +2

Tabela 4: Točkovnik REMA za oceno verjetnosti bolezni aktivacije mastocitov (27).

1.2 Diagnostika alergije na strupe kožekrilcev

Diagnostika alergije na strupe kožekrilcev temelji na natančni anamnezi ter potrditvi ustrezne senzibilizacije s strupom žuželk. Z anamnezo ter razpoložljivimi kliničnimi podatki je treba izključiti diferencialne diagnoze anafilaktičnega šoka, kot so motnje srčnega ritma, hipertenzivna kriza, pljučna embolija, poslabšanje astme, karcinoidni sindrom, feokromocitom, hipoglikemija, psihične in somatoformne motnje, angioedem in urtikarija zaradi drugih vzrokov (38). Skladno s smernicami je smiselno in potrebno opraviti alergološko testiranje samo pri posameznikih, ki so doživeli alergijsko reakcijo po piku žuželke, saj je delež asimptomatske senzibilizacije s strupom žuželk pri zdravih posameznikih visok, od 27 % do 40 % (38) (39). Diagnostični postopek dodatno otežuje dejstvo, da veliko pacientov ne prepozna žuželke, ki je povzročila reakcijo, ter da je navzkrižna reaktivnost med strupoma čebele in ose visoka. Senzibilizacijo lahko potrdimo s kožnim testiranjem in različnimi laboratorijskimi testi: določanje specifičnih IgE za celoten ekstrakt strupa in posamezne komponente ter celični test aktivacije bazofilcev.

Za kožno testiranje uporabljamo prečiščen strup kožekrilca v več koncentracijah do najvišje koncentracije strupa 1 µg/ml pri intradermalnih testih. Testiranje je relativno enostavno ter cenovno ugodno. Občutljivost testa je 90 %, specifičnost pa je težko vrednotiti zaradi visokega deleža asimptomatske senzibilizacije (5). Žal se občutljivost kožnih testov z leti manjša, v povprečju za 12 % na leto po zadnjem piku, prav tako je 33 % kožnih testov negativnih po 2,5 leta (38). Z intradermalnim kožnim testom lahko tudi sprožimo anafilaksijo pri 0,6 % pacientov.

Specifične IgE (sIgE) lahko določamo za celoten ekstrakt strupa ali posamezne komponente.

Senzitivnost protiteles IgE za celotni ekstrakt je visoka za strup čebele: 98 %–100 % ter nekoliko nižja za strup ose: 83 %–93 % (38). Pri 45–50 % pacientov pa potrdimo senzibilizacijo z obema strupoma.

Težava nastane, če pacient ni z gotovostjo prepoznal žuželke, ki je povzročila reakcijo, potreboval pa bi zdravljenje s specifično imunoterapijo. V tem primeru si lahko pomagamo z določanjem prisotnosti specifičnih IgE proti posameznim komponentam strupa (rekombinantni alergeni), kar lahko izboljša specifičnost laboratorijskih preiskav. Trenutno so komercialno dostopni rekombinatni alergeni čebeljega strupa Api m 1, Api m 2, Api m 10 ter osjega strupa Ves v 1 in Ves v 5. Uporaba rekombinatnih alergenov strupa ose lahko dvigne senzitivnost na 97 %. Pacienti, senzibilizirani s hialuronidazo Api m 2, pa imajo zaradi navzkrižne reaktivnosti z Ves v 2 pozitivne sIgE za celoten ekstrakt strupa čebele in ose, čeprav so senzibilizirani samo s strupom čebele (38).

1.2.1 Test aktivacije bazofilcev

Bazofilci so granulociti, ki igrajo pomembno vlogo pri alergijskih boleznih. Po zgradbi in funkciji so zelo podobni mastocitom: obe vrsti celic imata na površini receptor FcεRI in se aktivirata ter degranulirata ob stiku z alergenom. Ena pomembnejših razlik je, da se mastociti nahajajo pretežno v tkivih, bazofilci pa v centralnem krvnem obtoku in so tako lažje dostopni za odvzem (40). Ob aktivaciji in degranulaciji se na površini izrazijo številni markerji, ki jih lahko zaznamo s pretočnim citometrom. V diagnostične namene najpogosteje uporabljamo merjenje markerjev CD63 in CD 203c (41), kar imenujemo test aktivacije bazofilcev (BAT, angl: basophil activation test). Aktivacijo bazofilcev sprožamo z draženjem z logaritemsko naraščajočimi koncentracijami alergena. Krivulja, ki ob tem nastane, je navadno sigmoidne oblike. Za opis uporabljamo pojma reaktivnost in občutljivost bazofilcev. Reaktivnost bazofilcev predstavlja stopnjo aktiviranosti ob najvišji koncentraciji alergena, ki doseže plato krivulje.

Občutljivost bazofilcev pa predstavlja stopnjo aktiviranosti ob nižji koncentraciji alergena na začetku krivulje (41). Kot pozitivno kontrolo uporabljamo protitelesa anti-FcεRI, ki simulirajo aktivacijo z alergenom. Približno 5–10 % ljudi ima neodzivne bazofilce za stimulacijo z anti-FcεRI (42). Za ugotavljanje viabilnosti bazofilcev pa kot pozitivno kontrolo uporabljamo tudi formil-metionil-leucil fenilalanin (fMLP), ki neposredno aktivira bazofilce preko G-beljakovinskega receptorja (FPR-1), ki aktivira pot MAPK in fosfolipazo C (42).

V alergologiji lahko test aktivacije bazofilcev uporabljamo v diagnostične in raziskovalne namene. Za diagnostične namene uporabljamo reaktivnost bazofilcev. Senzitivnost testa aktivacije bazofilcev s strupi žuželk je 89–97 % (38). V klinični praksi ga uporabljamo predvsem pri pacientih s prepričljivo anamnezo alergijske reakcije po piku kožekrilca, ki pa jim nismo uspeli potrditi senzibilizacije s kožnimi in serološkimi testi. Takšni so bili 4 % vseh pacientov in BAT je bil pozitiven pri 80 % od njih (43). Test aktivacije bazofilcev nam lahko pomaga tudi pri določitvi primernega strupa za imunoterapijo, kadar ima pacient prisotne specifične IgE za strup čebele in ose (41,44). Celični test pa ima v primerjavi z serološkimi testi določene omejitve. Izvaja se v izkušenem laboratoriju in je zato težje dostopen. Treba ga je izvesti v roku 24 ur po odvzemu krvi, je dražji in zahtevnejši za izvedbo. Prav tako ima 5–10 % ljudi slabo odzivne bazofilce in test v tej skupini ni uporaben (41).

Občutljivost bazofilcev lahko določimo na več načinov. Izrazimo jo lahko z izračunano koncentracijo alergena EC50, ki sproži 50 % maksimalnega odziva (45). V nekaterih raziskavah uporabljajo CDsens, kar je inverzna koncentracija alergena, ki sproži 50 % maksimalnega odziva, pomnožena s faktorjem 100 (46) (47). Najenostavneje pa spremljamo občutljivosti s stimulacijo s submaksimalnim odmerkom alergena (48)(49). Občutljivost bazofilcev je lahko povezana s težo in pragom za alergijsko reakcijo (50–

53). Senzitivnost bazofilcev pa se tudi spreminja med zdravljenjem z imunoterapijo. Ta dinamika nam omogoča vpogled v mehanizem imunoterapije ter je lahko povezana z uspehom in potekom imunoterapije in pojavom zapletov med imunoterapijo (45,50,54–56).

Poleg tega lahko test aktivacije bazofilcev analiziramo tudi kot razmerje med odstotkom bazofilcev CD63+ pri dani koncentraciji alergena in odstotkom bazofilcev CD63+ po stimulaciji z 0,55 µg/ml protiteles proti FcεRI (% CD63 alergen/anti-FcεRI). S to analizo se lahko odziv bazofilcev, specifičen za določen alergen, normalizira glede na stimulacijo s pozitivno kontrolo z anti-FcεRI (57) (58) (50).

1.3 Specifična imunoterapija s strupom kožekrilcev

Trenutno je edino vzročno zdravljenje preobčutljivosti za strupe kožekrilcev specifična imunoterapija s strupom žuželke. Zdravljenje je zapleteno, dolgotrajno in povezano z možnostjo zapletov. Uspešnost zdravljenja je 77–96 % (3).

1.3.1 Mehanizmi specifične imunoterapije s strupom kožekrilcev

Mehanizem delovanja specifične imunoterapije s strupom kožekrilcev je kompleksen in ni še dokončno raziskan. Med imunoterapijo se imunski odgovor tipa Th2 postopno premakne v Th1 in vzpostavi se za alergen specifična periferna toleranca. Spremembe zajamejo tako efektorske celice – mastocite in bazofilce, kot tudi regulatorne celice – limfocite B in T.

Število mastocitov in bazofilcev se prehodno zmanjša že v uvodni fazi imunoterapije. Prav tako se že v prvem tednu zmanjšata število FcεRI na površini bazofilcev in senzitivnost bazofilcev, zviša pa se prag za izločanje citokinov interlevkina 4 in interlevkina 13 (55,59). Senzitivnost bazofilcev se zmanjša nespecifično, delno tudi za alergene, ki jih ne apliciramo (54). Trajno zmanjšanje občutljivosti bazofilcev je povezano s kliničnim uspehom imunoterapije (56,60). Prav tako se nivo bazalne triptaze med imunoterapijo postopoma in minimalno, vendar vztrajno znižuje, kar lahko kaže na nadaljnjo zniževanje bremena mastocitov (35).

Vzpostavitev dolgotrajne večletne tolerance je povezana s spremembami limfocitov T in B ter premikom imunskega odgovora tipa Th2 v Th1. Spremenita se število in funkcija regulatornih T-celic, tako da izločajo manj interlevkina 4 in interlevkina 13, zviša pa se nivo interlevkina 10 ter interferona gama (32,61). Tudi B-celice začnejo izločati drugačen profil protiteles. Koncentracija specifičnih protiteles IgE se ob začetku imunoterapije prehodno zviša, nato pa se postopoma zniža ter ostane nizka tudi več let po zaključeni imunoterapiji (32). Med imunoterapijo z aeroalergeni (alergeni pršice, peloda) so potrdili tudi, da se začnejo tvoriti zaščitna blokirajoča protitelesa IgA, IgG1 in IgG4. Protitelesa IgG4 se lahko vežejo na alergen in s tem preprečijo vezavo na IgE (32)(62). Blokirajo lahko tudi nizko afinitetni receptor FcgRIIb na limfocitih B in s tem ustavijo sintezo protiteles IgE (32,63). Prav tako imajo čebelarji, ki imajo pogoste pike čebel in niso alergični na čebelji strup, zelo visoke vrednosti za čebelji strup specifičnih protiteles IgG4(5).

1.3.2 Potek zdravljenja s specifično imunoterapijo s strupom kožekrilcev

Imunoterapijo v Evropi izvajamo s strupom čebele ali ose, redko s strupom poljske ose (Polistes).

Praviloma uporabljamo samo en strup, čeprav je senzibilizacija z obema strupoma relativno pogosta.

Imunoterapijo z obema strupoma izvajamo samo, če ima pacient prepričljivo anafilaksijo tako po piku čebele kot ose ali pa ima težko reakcijo po piku neznanega kožekrilca in je prepričljivo potrjena dvojna senzibilizacija.

Imunoterapija je uspešna pri 77–84 % pacientov pri zdravljenju s strupom čebele in pri 91–96 % pri zdravljenju s strupom ose (3)(32). Najpogosteje se zapleta imunoterapija s strupom čebele. Poleg tega so napovedni dejavniki za neuspešno imunoterapijo še višji nivo bazalne triptaze (> 20 ng/ml), senzibilizacija z rekombinantnim alergenom strupa čebele Api m 10 ter jemanje zdravil iz skupine zaviralcev encima angiotenzinske konvertaze (64)(65). Večinoma pa so reakcije blažje v primerjavi z izvorno.

Zdravljenje je indicirano tako za otroke kot za odrasle, ki so doživeli težjo alergijsko reakcijo (III in IV stopnje po Muellerju (Napaka! Vira sklicevanja ni bilo mogoče najti.)) ter imajo potrjeno senzibilizacijo s strupom. Relativna indikacija je blaga reakcija (I in II stopnje po Muellerju (Napaka! Vira sklicevanja ni bilo mogoče najti.)), če ima pacient ob tem večjo možnost pika zaradi poklicne ali prostočasne izpostavljenosti ali če ima zaradi strahu pred reakcijo slabšo kakovost življenja (3). Zdravljenje pa ni indicirano pri pacientih z reakcijo, ki ne sodi v sklop takojšnje preobčutljivosti, ali če na noben način ne dokažemo senzibilizacije s strupom. Z imunoterapijo ne zdravimo niti velikih lokalnih reakcij.

Kontraindikacije za začetek imunoterapije so nosečnost in aktivna avtoimunska ali maligna bolezen.

Specifična imunoterapija je sestavljena iz uvodne in vzdrževalne faze. V uvodni fazi subkutano apliciramo strup žuželke v 15-minutnih intervalih. Prvi odmerek je zelo nizek, največkrat 0,1 µg.

Količino strupa podvajamo, dokler ne dosežemo ciljnega vzdrževalnega odmerka, ki je 100 µg strupa žuželke. Zaradi možnih zapletov je v uvodni fazi potrebna premedikacija z antihistaminiki (3).

Uvodno fazo lahko izvajamo po več različnih protokolih, ki se razlikujejo v času, ki je potreben, da dosežemo vzdrževalni odmerek. Pri običajnem protokolu dosežemo vzdrževalni odmerek v tednih ali mesecih in lahko se izvaja tudi ambulantno. Pri hitrem protokolu dosežemo vzdrževalni odmerek v dnevih, pri zelo hitrem protokolu pa dosežemo vzdrževalni odmerek v enem dnevu (3). Pri hitrejših protokolih se zaščita vzpostavi bistveno hitreje kot pri običajnem protokolu, vendar pa so povezani z večjim deležem zapletov in se zato izvajajo hospitalno.

V vzdrževalnem delu imunoterapije nadaljujemo z aplikacijo 100 µg strupa, kar odgovarja približno pikom dveh čebel ali petih os. V posebnih primerih lahko zvišamo vzdrževalni odmerek na 200 µg, predvsem pri pacientih s pogostimi zapleti med imunoterapijo, pacientih, ki imajo reakcije po piku kljub imunoterapiji, in pacientih, ki imajo več rizičnih faktorjev. Razmak med aplikacijami strupa postopno podaljšujemo, in sicer v prvem letu apliciramo strup na 4 tedne, v drugem letu na 6 tednov, v tretjem letu na 8 tednov, v četrtem letu na 10 tednov in v petem letu na 12 tednov. Vzdrževalno fazo imunoterapije lahko zaključimo po treh letih pri pacientih z blažjo izvorno reakcijo ter po petih letih pri pacientih s težjo izvorno reakcijo. Lahko pa jo izvajamo tudi doživljenjsko, npr. pri pacientih s sistemsko mastocitozo.

Tako med uvodno kot med vzdrževalno fazo lahko pride do stranskih učinkov. Stranski učinki med imunoterapijo so lahko lokalni ali sistemski. Približno 15 % pacientov ima med imunoterapijo veliko lokalno reakcijo, ki vztraja nekaj dni (66). Reakcije blažimo z lokalnim steroidom, kumulativno količino strupa apliciramo na več različnih mest.

Sistemski zapleti se pojavijo pri 8–20 % pacientov, vendar so bistveno pogostejši med zdravljenjem s čebeljim strupom (16–40 %) kot z osjim strupom (4–19 %) (3,6,17,53,67). Bistveno več sistemskih zapletov je med pacienti s potrjeno sistemsko mastocitozo, bolj pa so ogroženi tudi pacienti z višjim nivojem bazalne triptaze, četudi je ta še v normalnem območju (3,6). Več zapletov imajo tudi pacienti z višjo senzitivnostjo bazofilcev (53). Trenutne študije niso potrdile, da bi bilo več zapletov med pacienti, ki prejemajo zdravila iz skupine zaviralcev adrenergičnih receptorjev beta ter zaviralcev encima angiotenzinske konvertaze, tako da teh zdravil med imunoterapijo ne opuščamo (3).

Težo zapletov med imunoterapijo lahko ovrednotimo po Lindi Cox (68) (Tabela 5)

1. stopnja 2. stopnja 3. stopnja 4. stopnja 5. stopnja

Znaki prizadetosti 1 organskega

sistema

Znaki prizadetosti vsaj 2 organskih sistemov

Znaki prizadetosti: Znaki prizadetosti: Smrt

Koža:

srbenje, urtikarija, zardevanje ali občutek vročine ali

Angioedem (ne laringealni,

jezik ali edem uvule)

ali

Zgornja dihala Rinitis (npr.

kihanje,

rinoreja, srbenje nosu in/

ali nosna

kongestija) ali

pokašljevanje ali

Kašelj, ki izvira iz zgornjih dihal in ne iz spodnjih dihal ali

Očesne veznice Eritem, srbenje Drugo

Slabost, kovinski okus ali

glavobol

Spodnja dihala Astma: kašelj, sopenje,

kratka sapa (npr.

padec PEF ali FEV1 za manj kot 40 %, dober

odziv na

bronhodilatator) ali

Prebavila

Krči v trebuhu, bruhanje,

ali driska ali Drugo

Krči maternice

Spodnja dihala Astma: kašelj, sopenje,

kratka sapa (npr.

padec PEF ali FEV1 za 40 %, brez odziva na bronhodilatator) ali

Zgornja dihala Angioedem larinksa, uvule, jezika s stridorjem ali brez njega

Spodnja ali zgornja dihala

Odpoved dihanja z ali brez izgube zavesti

ali

Srčno-žilni sistem hipotenzija z ali brez

izgube zavesti

Tabela 5: Klasifikacija stranskih učinkov med specifično imunoterapijo (po Lindi Cox [6)].

Zaplete med imunoterapijo zdravimo po smernicah za anafilaksijo v prvi vrsti z adrenalinom ter po potrebi z antihistaminikom, bronhodilatatorjem, kisikom in tekočinami (68).

V primeru lažjih zapletov 1. stopnje med uvodno fazo imunoterapije nadaljujemo po prilagojeni postopni shemi z več vmesnimi koraki. Če se imunoterapija večkrat zaplete ali se pojavijo sistemski zapleti težje stopnje (2–4. stopnje), imunoterapijo začasno prekinemo in ponovno uvedemo po počasnejši shemi, z več premedikacije z antihistaminiki. Ciljni vzdrževalni odmerek je tedaj višji, 200 µg žuželčjega strupa (6,17,69–71).

Obstaja pa skupina pacientov, pri kateri kljub preventivnemu zdravljenju z antihistaminiki ter različnim prilagoditvam protokola in višjim vzdrževalnim odmerkom ne moremo nadaljevati z imunoterapijo zaradi pogostih, ponavljajočih se in težkih sistemskih zapletov. Takrat govorimo o neuspešni imunoterapiji zaradi stranskih učinkov. Pri teh pacientih obstaja večje tveganje za težjo anafilaksijo ob morebitnem naslednjem piku kožekrilca, zato je zdravljenje z imunoterapijo še toliko bolj pomembno.

Klinični učinek zdravljenja z imunoterapijo lahko preverjamo s pikom žive žuželke. Vsaj polovica pacientov doživi med zdravljenjem pik žuželke v naravi in o tem poroča ob naslednjem obisku. V nekaterih centrih opravljajo testiranje z nadzorovanim pikom žive žuželke za dokaz uspešnosti imunoterapije (3). Če pride ob ponovnem piku do reakcije, je treba zvišati vzdrževalni odmerek strupa, praviloma na 200 µg, v nekaterih centrih pa celo na 300 µg (3). Na Kliniki Golnik tega testiranja rutinsko ne izvajamo.

1.4 Omalizumab pri zdravljenju alergijskih bolezni

Omalizumab je rekombinantno monoklonsko protitelo razreda IgG1, ki se z visoko afiniteto veže na prosta protitelesa IgE in jih tako nevtralizira. Ker se veže na Cε3-del, se IgE ne more vezati na receptor FcεRI na bazofilcih, mastocitih in antigen predstavitvenih celicah ter jih zato tudi ne aktivira (72–74).

Znižanje koncentracije prostih IgE povzroči zmanjšanje števila receptorja FcεRI na omenjenih celicah.

Število FcεRI se najprej zmanjša na bazofilcih, lahko že 3. dan po aplikaciji omalizumaba. Število FcεRI na mastocitih pa se zmanjša kasneje, lahko šele po več tednih zdravljenja (73) (75). Omalizumab se od leta 2003 dalje uporablja v klinični praksi pri zdravljenju težke alergijske astme in kronične urtikarije (76),(77). Pri izbranih pacientih s težko, alergijsko eozinofilno astmo pomembno zmanjša število poslabšanj ter porabo sistemskih in inhalacijskih steroidov ter izboljša kakovost življenja. Še boljši uspeh ima zdravljenje z omalizumabom pri kronični spontani urtikariji, kjer učinkuje izredno hitro, v nekaj dnevih do tednih in povsem umiri bolezen do 80 % pacientov (78). Opisani so primeri uspešnega zdravljenja z omalizumabom pri pacientih z idiopatsko anafilaksijo, ki imajo težke reakcije spontano ali pa na neznan alergen(79–81).

Pacienti, ki imajo težje alergijske reakcije po hrani, kot so npr. arašidi ali kravje mleko, imajo višjo občutljivost bazofilcev v primerjavi s pacienti, ki imajo blažje reakcije ali pa so samo senzibilizirani z alergenom (50,82). Zdravljenje alergije na hrano lahko poteka z desenzibilizacijo. Pri pacientih s težjimi reakcijami pa zdravljenje z desenzibilizacijo za alergen pogosto ni uspešno ter je povezano s pogostimi in težkimi stranskimi učinki že ob aplikaciji majhnih količin alergena. Pacienti tako ne dosežejo tarčne vzdrževalne količine alergena ali pa za to potrebujejo zelo veliko časa. Sočasno zdravljenje z omalizumabom se je v študijah izkazalo za uspešno. Omogoča hitro in varno zviševanje alergena med desenzibilizacijo ter zmanjša pojav nevarnih stranskih učinkov (74,83–85). Žal pa uspešnost zdravljenja alergije na hrano z desenzibilizacijo ni vedno dolgotrajna in pri nekaterih pacientih se simptomi alergije vrnejo po ukinitvi zdravljenja z omalizumabom (85–87). Zaenkrat ni znano, pri katerih pacientih bo sočasno zdravljenje z omalizumabom med desenzibilizacijo imelo dolgotrajen uspeh.

Podobno imajo višjo občutljivost bazofilcev tudi pacienti, pri katerih med imunoterapijo s strupom žuželke pride do zapletov (53). Tudi v tej skupini pacientov so opisani uspešni (88–95) in tudi neuspešni (96) primeri sočasnega zdravljenja z omalizumabom pred in med imunoterapijo. Zdravljenje z omalizumabom se je izkazalo za uspešno tudi v skupini pacientov z mastocitozo in alergijo na strupe žuželk, kjer se mastociti in bazofilci lahko aktivirajo tudi po ne-imunološkem mehanizmu (37,88,94,97–

99). Protokoli zdravljenja z omalizumabom pa so se med seboj precej razlikovali glede na odmerek in interval med aplikacijami. V nekaterih primerih se je omalizumab odmerjal po protokolu za zdravljenje težke astme, glede na telesno težo in vrednost celokupnih IgE, v drugih pa po protokolu za zdravljenje

kronične urtikarije, v odmerku 150 ali 300 mg na 4 tedne. Razlikovalo se je tudi trajanje zdravljenja.

Tako zaenkrat ni znano, pri katerih pacientih bo sočasno zdravljenje z omalizumabom uspešno, po kakšnem protokolu naj se aplicira omalizumab in koliko časa naj traja zdravljenje.

2. NAMEN DELA IN HIPOTEZE

Osnovni namen dela je oceniti delež težkih sistemskih zapletov med imunoterapijo s strupi kožekrilcev, določiti neposredne dejavnike, ki napovedujejo težke zaplete med imunoterapijo, in ugotoviti, ali dodatno zdravljenje z omalizumabom omogoča varno uvedbo imunoterapije pri pacientih s ponavljajočimi se težkimi zapleti med imunoterapijo.

Delovne hipoteze:

 Obstajajo napovedni dejavniki za težke sistemske zaplete med imunoterapijo – teža izvorne reakcije, imunoterapija s strupom čebele, občutljivost bazofilcev in bazalni nivo serumske triptaze.

 Zdravljenje z omalizumabom omogoča varno uvedbo imunoterapije pri pacientih, ki so imeli več težkih sistemskih reakcij med imunoterapijo.

 S spremljanjem dinamike imunoloških faktorjev – občutljivosti bazofilcev, merjene z izražanjem CD63 na površini bazofilcev po spodbujanju s strupom žuželke – lahko spremljamo učinek zdravljenja z omalizumabom.

3. METODE

3.1 Zasnova raziskave

Raziskava je bila zasnovana v treh delih.

V prvem delu raziskave smo retrospektivno analizirali pojavnost in težo sistemskih zapletov med imunoterapijo pri vseh pacientih, pri katerih smo na Univerzitetni kliniki Golnik uvajali specifično imunoterapijo s strupom žuželke v letih 2005–2016.

V drugem delu raziskave smo analizirali klinične (spol, starost, teža reakcije ob piku žuželke, prejemanje blokatorjev beta adrenergičnih receptorjev ter zaviralcev angiotenzinove konvertaze) in imunološke dejavnike (bazalni nivo triptaze, specifični IgE za ekstrakt čebeljega in osjega strupa ter za posamezne komponente, test aktivacije bazofilcev), ali napovedujejo težke zaplete med imunoterapijo.

V tretjem delu raziskave smo prospektivno vključili paciente, pri katerih imunoterapije nismo uspeli uvesti zaradi pogostih težkih sistemskih zapletov. Takšnih pacientov je bilo v zadnjih 10 letih 23. Enajst pacientov se je odločilo za ponovno uvedbo imunoterapije. Zdravili smo jih z omalizumabom in ponovno poskušali uvesti imunoterapijo. Spremljali smo stranske učinke med ponovno uvedbo imunoterapije in imunološke parametre – aktivacijo bazofilcev ter število receptorjev FcεRI in IgE na površini bazofilca. Predvidevali smo, da bo zmanjšanje občutljivosti bazofilcev med zdravljenjem povezano z uspehom zdravljenja (51).

3.2 Preiskovanci

V prvem delu raziskave smo retrospektivno vključili 1820 pacientov, ki so se v času od januarja 2005 do junija 2016 zdravili s specifično imunoterapijo s strupom žuželk na Univerzitetni kliniki za pljučne bolezni in alergijo Golnik. Za pridobivanje informacij o vključenih pacientih smo uporabili bolnišnični informacijski sistem BIRPIS. Zbrali smo podatke o spolu, starosti ter poteku imunoterapije.

Imunoterapija s strupom žuželk je bila uvedena v skladu z evropskimi smernicami (3) pri pacientih, ki so imeli po piku žuželke sistemsko alergijsko reakcijo težje stopnje (III in IV stopnje po Muellerju) in pri posameznih pacientih z alergijsko reakcijo lažje stopnje (I in II stopnje po Muellerju) z dodatnimi dejavniki tveganja: večja možnost pika v naravi (čebelarji, vrtnarji, gozdni delavci, delavci na višini …) ali manjša kakovost življenja zaradi strahu pred reakcijo (Tabela 2). Senzibilizacija z alergenom strupa žuželke je bila dokazana s kožnimi vbodnimi ali intradermalnimi testi, serološko ali s testom aktivacije bazofilcev (5,22,70). Vsi diagnostični postopki so opisani spodaj.

Pri naših pacientih smo od januarja 2005 do julija 2008 za uvedbo imunoterapije uporabljali hitri uvodni protokol, od avgusta 2008 dalje pa uporabljamo zelo hitri uvodni protokol (Tabela 6).

Hitri uvodni protokol Zelo hitri uvodni protokol

Dan Čas (min) Odmerek

(µg) Dan Čas (min) Odmerek

(µg)

0 0,02 0 0,1

15 0,03 15 0,3

30 0,05 30 0,7

1 45 0,2 1 45 2

60 0,3 60 3

75 0,5 75 5

90 2 90 10

105 3 105 20

120 5 120 30

135 40

0 10

2 15 20 2 0 50

30 30 15 50

45 40

5 0 100

0 20

4 15 30

30 50

11 0 50

15 50

25 0 100

Tabela 6: Hitri in zelo hitri uvodni protokol imunoterapije s strupom žuželk.

Tako med uvodno kot med vzdrževalno fazo je prišlo do sistemskih zapletov, ki smo jih ovrednotili po Lindi Cox (68) (Tabela 5). Zaplete med imunoterapijo smo zdravili po smernicah za anafilaksijo. V primeru lažjih zapletov 1. stopnje med uvodno fazo smo nadaljevali po prilagojeni postopni shemi z več vmesnimi koraki. Če pa se je imunoterapija večkrat zapletla ali so se pojavili sistemski zapleti težje stopnje (2.–4. stopnje), pa smo imunoterapijo ponovno uvedli po počasnejši shemi, z več premedikacije z antihistaminiki. Ciljni vzdrževalni odmerek je bil v takem primeru višji, 200 µg žuželčjega strupa.

Imunoterapijo smo prekinili zaradi zapletov, če smo jo vsaj trikrat poskušali uvesti, pa so se zapleti kljub temu ponavljali.

3.3 Napovedni dejavniki za težke sistemske zaplete med imunoterapijo

V drugem delu raziskave smo analizirali klinične in laboratorijske podatke pri pacientih, ki so imeli opravljene vse laboratorijske preiskave (bazalna triptaza, specifični IgE za celotni ekstrakt čebeljega in osjega strupa ter za posamezne komponente, test aktivacije bazofilcev). Vsi diagnostični postopki so opisani spodaj. Za pridobivanje informacij o vključenih pacientih smo uporabili bolnišnični informacijski sistem BIRPIS. Zbrali smo podatke o spolu, starosti, teži izvorne reakcije ter poteku imunoterapije, jemanju zdravil iz skupine zaviralcev adrenergičnih receptorjev beta ter zaviralcev encima angiotenzinske konvertaze v času reakcije ob piku. Stopnjo najtežje sistemske alergijske reakcije ob piku kožekrilca smo ocenili po Muellerju (11) (12) (Tabela 2), prav tako smo ocenili, ali je šlo za težko anafilaksijo s presinkopo/kolapsom brez kožne simptomatike ali ne (100). Vključili smo tudi izvide laboratorijskih preiskav: nivo bazalne triptaze, nivo specifičnih IgE za celotni ekstrakt čebeljega in osjega strupa ter za posamezne komponente – rApi m 1 ter rApi m 10 (samo pri pacientih, zdravljenih s strupom čebele), test aktivacije bazofilcev s strupom čebele ali strupom ose, razmerje CD63+ strup čebele ali ose/anti-FcεRI.

3.4 Zdravljenje z omalizumabom

Vse paciente, pri katerih imunoterapije nismo uspeli uvesti zaradi pogostih težkih sistemskih zapletov, smo povabili v odprto, prospektivno študijo dodatnega zdravljenja z omalizumabom ob ponovni imunoterapiji. Upoštevali smo vključitvene in izključitvene kriterije (Tabela 7).

Vključitveni kriteriji:

 starost nad 18 let

 sistemska alergijska reakcija po piku kožekrilca stopnje III in IV po Muellerju

 dokazana senzibilizacija s strupom kožekrilca

 neuspešna imunoterapija zaradi stranskih učinkov:

 imunoterapija je bila prekinjena zaradi pogostih in/ali težkih sistemskih zapletov kljub temu, da smo vsaj trikrat poskušali uvesti imunoterapijo s počasnejšim protokolom, višjim vzdrževalnim odmerkom in intenzivnejšo premedikacijo z antihistaminiki

Izključitveni kriteriji:

 jemanje zdravil iz skupine zaviralcev adrenergičnih receptorjev beta

 nosečnost

Kriteriji za prekinitev študije:

 pogosti in težki stranski učinki med imunoterapijo kljub sočasnem zdravljenju z omalizumabom

 pacientova osebna želja

Tabela 7: Vključitveni in izključitveni kriteriji za prospektivno študijo dodatnega zdravljenja z omalizumabom ob ponovni imunoterapiji

Začetno odmerjanje omalizumaba smo povzeli po doslej objavljenih primerih (88–93,95,101).

Odmerka omalizumaba nismo prilagajali na vrednost celokupnih IgE, saj alergija na strup žuželk ni povezana z atopijo in so celokupni IgE pri teh pacientih praviloma nizki (102). Začeli smo zdravljenje z dvema aplikacija omalizumaba 150 mg v dvotedenskem razmaku in nato ponovno uvedli imunoterapijo po zelo hitri shemi. Ker se to ni izkazalo za klinično učinkovito in so vsi pacienti, zdravljeni po tem protokolu, imeli stranske učinke, smo protokol na podlagi lastnih izkušenj prilagodili ter intenzivirali: aplicirali smo omalizumab 300 mg trikrat v dvotedenskem razmaku pred uvedbo imunoterapije po zelo hitri shemi. V vzdrževalni fazi smo nadaljevali z aplikacijo omalizumaba 300 mg/4 tedne, dokler so pacienti še imeli občasne zaplete. Sam potek zdravljenja z omalizumabom in prilagoditev protokola je natančno opisan v rezultatih. Med zdravljenjem z omalizumabom smo spremljali stranske učinke med ponovno uvedbo imunoterapije in imunološke parametre – aktivacijo bazofilcev ter število receptorjev FcεRI in IgE na površini bazofilca. Študijo je odobrila Komisija za medicinsko etiko Republike Slovenije in je registrirana na ClinicalTrials.gov (NCT02968394).

3.5 Diagnostične metode

Kožne vbodne teste smo opravljali na volarni strani podlahti.

Pri kožnih vbodnih testih smo nanesli kapljico ekstrakta strupa žuželke v koncentraciji 100 µg/ml in 10 µg/ml (Venomhal, HAL Allergy, Leiden, Nizozemska). Uporabljali smo tudi negativno kontrolo (fiziološko raztopino) in pozitivno kontrolo s histaminom (HAL Allergy, Leiden, Nizozemska). Kapljico smo prebodli z lanceto ter test vrednotili po 15 minutah. Kot pozitiven test smo ocenili velikost urtike vsaj 3 mm.

Pri kožnih intradermalnih testih pa smo tik pod povrhnjico vbrizgali 0,05 ml ekstrakta strupa žuželke in s tem ustvarili 2–3 mm velik podkožni mehurček. Uporabljali smo koncentraciji 0,1 µg/ml in 1 µg/ml

ter negativno kontrolo (fiziološko raztopino) in pozitivno kontrolo s histaminom (HAL Allergy, Leiden, Nizozemska). Kot pozitiven test smo ocenili povečanje urtike za vsaj 3 mm od izhodnega mehurčka.

3.5.2 Določanje specifičnih protiteles razreda IgE

V serumu smo določali specifična protitelesa proti čebeljemu in osjemu strupu ter rekombinatnim alergenom rApi m 1 in rApi m 10 po navodilih proizvajalca s sistemom ImmunoCAP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) ali Immulite (Siemens, Erlangen, Nemčija). Kot pozitivno vrednost smo vrednotili sIgE ≥ 0,35 kU/l.

3.5.3 Določanje serumske triptaze

Triptazo v serumu smo določali po navodilih proizvajalca s sistemom ImmunoCAP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) ali Immulite (Siemens, Erlangen, Nemčija).

3.5.4 Test aktivacije bazofilcev

Test aktivacije bazofilcev smo izvajali po postopku, ki je opisan že v prejšnjih publikacijah (52,54,56,60,103). Heparinizirano polno kri smo predhodno inkubirali v stimulacijskem pufru bazofilcev z dodatkom IL-3 (Buhlmann Laboratories, Basel, Švica), ki je vseboval strup čebele ali ose v koncentraciji 0,001, 0,01, 0,1 in 1 µg/ml (HAL Allergy, Leiden, Nizozemska). Kot negativno kontrolo smo uporabili inkubacijski pufer. Uporabili smo dve pozitivni kontroli: stimulacijo z anti-FcεRI, kjer poteka aktivacija bazofilcev z enakim mehanizmom kot sicer pri stimulaciji z alergenom, ter stimulacijo s fMLP (formil-metionil-leucil fenilalanin), ki ni odvisna od receptorja FcεRI. Koncentracija anti-FcεRI je bila 0,55 µg/ml mAb (Buhlmann Laboratories), koncentracija fMLP pa 2 µM (N-Formil-Met-Leu-Phe, Sigma, St. Louis, MO, ZDA). Inkubacija je potekala 15 minut pri 37 °C. Degranulacijo smo ustavili z ohlajanjem na ledu. Po tem smo dodali FITC-konjugirani anti-CD63 mAb, PE-konjugirani anti-CD123 mAb in PerCP- konjugirani anti-HLA-DR mAb (BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA) in vzorec 20 minut inkubirali na ledu.

Po koncu postopka smo sonde s polno krvjo v roku dveh ur lizirali, sprali, fiksirali in analizirali na pretočnem citometru FACSCalibur (BD Biosciences). Analizirali smo vsaj 400 CD123-pozitivnih celic.

Bazofilce smo identificirali kot celice z nizkim stranskim sipanjem, CD123-pozitivne in HLA-DR- negativne celice, v FL1 (CD63) pa je bila izmerjen odstotek bazofilcev, ki so izražali CD63.

Razmerje CD63+ strup čebele ali ose/anti-FcεRI je bilo izračunano kot odstotek CD63+ bazofilcev pri dani koncentraciji strupa v odstotku CD63+ bazofilcev po stimulaciji z 0,55 µg/ml protiteles FcεRI.

Za izhodiščne vrednosti BAT so bile meritve opravljene pred uvedbo imunoterapije in najmanj 4 tedne po zadnji reakciji. Za spremljanje izražanja CD63 med zdravljenjem z omalizumabom je bil BAT opravljen pred aplikacijo imunoterapije.

3.5.5 Merjenje števila receptorjev FcεRI in IgE na površini bazofilca

Merjenje števila receptorjev FcεRI in IgE na površini bazofilca smo izvajali po postopku, ki je opisan že v prejšnjih publikacijah (54,103). Uporabili smo heparinizirano polno kri. Za označevanje bazofilcev smo uporabili FITC-konjugirana protitelesa proti FcεRI (Thermo Fisher Scientific) ali anti-IgE (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Nemčija). Inkubacija je potekala 15 minut pri 37 °C. Po koncu postopka smo sonde

s polno krvjo v roku dveh ur lizirali, sprali, fiksirali in analizirali na pretočnem citometru FACSCalibur (BD Biosciences). Rezultat smo preračunali s pomočjo standardne kalibracijske krivulje kalibracijskih mikrodelcev, ki so imeli na površini znano število molekul FITC (Agilent, Santa Clara, CA, ZDA) ter tako določili število FcεRI in IgE na površini bazofilca. Uporabili smo podatek, da se na eno protitelo veže ena molekula FcεRI ali IgE. Arbitrarne enote srednje intenzivnosti fluorescence (MFI) FITC smo pretvorili v absolutno število glede na dodeljene molekule ekvivalentnih vrednosti fluorokroma (MEF) za populacijo fluorescentnih mikrodelcev.

3.6 Obdelava podatkov

Obdelava podatkov je potekala s pomočjo programa GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, ZDA) in s programom R Statistical Computing. Distribucijo podatkov smo določili z d'Agostino- Pearsonovim testom normalne porazdelitve podatkov. Glede na porazdelitev podatkov smo za oceno pomembnosti razlike za kvantitativne (numerične) spremenljivke uporabili Mann-Whitney U test, za atributivne (opisne) pa Fisherjev natančni test ali test HI kvadrat. Za oceno napovednih dejavnikov za težke zaplete med imunoterapijo smo uporabili multivariantno logistično regresijsko analizo. Kot statistično pomembno smo uporabili P < 0,05.

4. REZULTATI

4.1 Potek raziskave

V prvi del raziskave smo vključili 1820 pacientov, ki so se v času od januarja 2005 do junija 2016 na Univerzitetni kliniki za pljučne bolezni in alergijo Golnik zdravili s specifično imunoterapijo s strupom žuželk. V drugem delu študije smo analizirali klinične in imunološke dejavnike pri 410 pacientih, ki so imeli opravljene vse laboratorijske preiskave. V tretjem delu raziskave smo prospektivno vključili 11 od 23 pacientov, pri katerih imunoterapije nismo uspeli uvesti zaradi pogostih težkih sistemskih zapletov.

Slika 1 predstavlja algoritem poteka raziskave, število vključenih pacientov ter vrsto in potek imunoterapije za vse tri skupine pacientov.

Tabela 8 prikazuje demografske podatke ter potek imunoterapije za vse tri skupine pacientov.

Slika 1: Potek in vrsta imunoterapije celotne študijske populacije, pacientov z vsemi laboratorijskimi podatki in pacientov z neuspešno SIT zaradi zapletov, ki so bili primerni za dodatno zdravljenje z omalizumabom.