Potek zdravljenja s specifično imunoterapijo s strupom kožekrilcev

1.3 S PECIFIČNA IMUNOTERAPIJA S STRUPOM KOŽEKRILCEV

1.3.2 Potek zdravljenja s specifično imunoterapijo s strupom kožekrilcev

Imunoterapijo v Evropi izvajamo s strupom čebele ali ose, redko s strupom poljske ose (Polistes).

Praviloma uporabljamo samo en strup, čeprav je senzibilizacija z obema strupoma relativno pogosta.

Imunoterapijo z obema strupoma izvajamo samo, če ima pacient prepričljivo anafilaksijo tako po piku čebele kot ose ali pa ima težko reakcijo po piku neznanega kožekrilca in je prepričljivo potrjena dvojna senzibilizacija.

Imunoterapija je uspešna pri 77–84 % pacientov pri zdravljenju s strupom čebele in pri 91–96 % pri zdravljenju s strupom ose (3)(32). Najpogosteje se zapleta imunoterapija s strupom čebele. Poleg tega so napovedni dejavniki za neuspešno imunoterapijo še višji nivo bazalne triptaze (> 20 ng/ml), senzibilizacija z rekombinantnim alergenom strupa čebele Api m 10 ter jemanje zdravil iz skupine zaviralcev encima angiotenzinske konvertaze (64)(65). Večinoma pa so reakcije blažje v primerjavi z izvorno.

Zdravljenje je indicirano tako za otroke kot za odrasle, ki so doživeli težjo alergijsko reakcijo (III in IV stopnje po Muellerju (Napaka! Vira sklicevanja ni bilo mogoče najti.)) ter imajo potrjeno senzibilizacijo s strupom. Relativna indikacija je blaga reakcija (I in II stopnje po Muellerju (Napaka! Vira sklicevanja ni bilo mogoče najti.)), če ima pacient ob tem večjo možnost pika zaradi poklicne ali prostočasne izpostavljenosti ali če ima zaradi strahu pred reakcijo slabšo kakovost življenja (3). Zdravljenje pa ni indicirano pri pacientih z reakcijo, ki ne sodi v sklop takojšnje preobčutljivosti, ali če na noben način ne dokažemo senzibilizacije s strupom. Z imunoterapijo ne zdravimo niti velikih lokalnih reakcij.

Kontraindikacije za začetek imunoterapije so nosečnost in aktivna avtoimunska ali maligna bolezen.

Specifična imunoterapija je sestavljena iz uvodne in vzdrževalne faze. V uvodni fazi subkutano apliciramo strup žuželke v 15-minutnih intervalih. Prvi odmerek je zelo nizek, največkrat 0,1 µg.

Količino strupa podvajamo, dokler ne dosežemo ciljnega vzdrževalnega odmerka, ki je 100 µg strupa žuželke. Zaradi možnih zapletov je v uvodni fazi potrebna premedikacija z antihistaminiki (3).

Uvodno fazo lahko izvajamo po več različnih protokolih, ki se razlikujejo v času, ki je potreben, da dosežemo vzdrževalni odmerek. Pri običajnem protokolu dosežemo vzdrževalni odmerek v tednih ali mesecih in lahko se izvaja tudi ambulantno. Pri hitrem protokolu dosežemo vzdrževalni odmerek v dnevih, pri zelo hitrem protokolu pa dosežemo vzdrževalni odmerek v enem dnevu (3). Pri hitrejših protokolih se zaščita vzpostavi bistveno hitreje kot pri običajnem protokolu, vendar pa so povezani z večjim deležem zapletov in se zato izvajajo hospitalno.

V vzdrževalnem delu imunoterapije nadaljujemo z aplikacijo 100 µg strupa, kar odgovarja približno pikom dveh čebel ali petih os. V posebnih primerih lahko zvišamo vzdrževalni odmerek na 200 µg, predvsem pri pacientih s pogostimi zapleti med imunoterapijo, pacientih, ki imajo reakcije po piku kljub imunoterapiji, in pacientih, ki imajo več rizičnih faktorjev. Razmak med aplikacijami strupa postopno podaljšujemo, in sicer v prvem letu apliciramo strup na 4 tedne, v drugem letu na 6 tednov, v tretjem letu na 8 tednov, v četrtem letu na 10 tednov in v petem letu na 12 tednov. Vzdrževalno fazo imunoterapije lahko zaključimo po treh letih pri pacientih z blažjo izvorno reakcijo ter po petih letih pri pacientih s težjo izvorno reakcijo. Lahko pa jo izvajamo tudi doživljenjsko, npr. pri pacientih s sistemsko mastocitozo.

Tako med uvodno kot med vzdrževalno fazo lahko pride do stranskih učinkov. Stranski učinki med imunoterapijo so lahko lokalni ali sistemski. Približno 15 % pacientov ima med imunoterapijo veliko lokalno reakcijo, ki vztraja nekaj dni (66). Reakcije blažimo z lokalnim steroidom, kumulativno količino strupa apliciramo na več različnih mest.

Sistemski zapleti se pojavijo pri 8–20 % pacientov, vendar so bistveno pogostejši med zdravljenjem s čebeljim strupom (16–40 %) kot z osjim strupom (4–19 %) (3,6,17,53,67). Bistveno več sistemskih zapletov je med pacienti s potrjeno sistemsko mastocitozo, bolj pa so ogroženi tudi pacienti z višjim nivojem bazalne triptaze, četudi je ta še v normalnem območju (3,6). Več zapletov imajo tudi pacienti z višjo senzitivnostjo bazofilcev (53). Trenutne študije niso potrdile, da bi bilo več zapletov med pacienti, ki prejemajo zdravila iz skupine zaviralcev adrenergičnih receptorjev beta ter zaviralcev encima angiotenzinske konvertaze, tako da teh zdravil med imunoterapijo ne opuščamo (3).

Težo zapletov med imunoterapijo lahko ovrednotimo po Lindi Cox (68) (Tabela 5)

Znaki prizadetosti: Znaki prizadetosti: Smrt

Koža:

Tabela 5: Klasifikacija stranskih učinkov med specifično imunoterapijo (po Lindi Cox [6)].

Zaplete med imunoterapijo zdravimo po smernicah za anafilaksijo v prvi vrsti z adrenalinom ter po potrebi z antihistaminikom, bronhodilatatorjem, kisikom in tekočinami (68).

V primeru lažjih zapletov 1. stopnje med uvodno fazo imunoterapije nadaljujemo po prilagojeni postopni shemi z več vmesnimi koraki. Če se imunoterapija večkrat zaplete ali se pojavijo sistemski zapleti težje stopnje (2–4. stopnje), imunoterapijo začasno prekinemo in ponovno uvedemo po počasnejši shemi, z več premedikacije z antihistaminiki. Ciljni vzdrževalni odmerek je tedaj višji, 200 µg žuželčjega strupa (6,17,69–71).

Obstaja pa skupina pacientov, pri kateri kljub preventivnemu zdravljenju z antihistaminiki ter različnim prilagoditvam protokola in višjim vzdrževalnim odmerkom ne moremo nadaljevati z imunoterapijo zaradi pogostih, ponavljajočih se in težkih sistemskih zapletov. Takrat govorimo o neuspešni imunoterapiji zaradi stranskih učinkov. Pri teh pacientih obstaja večje tveganje za težjo anafilaksijo ob morebitnem naslednjem piku kožekrilca, zato je zdravljenje z imunoterapijo še toliko bolj pomembno.

Klinični učinek zdravljenja z imunoterapijo lahko preverjamo s pikom žive žuželke. Vsaj polovica pacientov doživi med zdravljenjem pik žuželke v naravi in o tem poroča ob naslednjem obisku. V nekaterih centrih opravljajo testiranje z nadzorovanim pikom žive žuželke za dokaz uspešnosti imunoterapije (3). Če pride ob ponovnem piku do reakcije, je treba zvišati vzdrževalni odmerek strupa, praviloma na 200 µg, v nekaterih centrih pa celo na 300 µg (3). Na Kliniki Golnik tega testiranja rutinsko ne izvajamo.

1.4 Omalizumab pri zdravljenju alergijskih bolezni

Omalizumab je rekombinantno monoklonsko protitelo razreda IgG1, ki se z visoko afiniteto veže na prosta protitelesa IgE in jih tako nevtralizira. Ker se veže na Cε3-del, se IgE ne more vezati na receptor FcεRI na bazofilcih, mastocitih in antigen predstavitvenih celicah ter jih zato tudi ne aktivira (72–74).

Znižanje koncentracije prostih IgE povzroči zmanjšanje števila receptorja FcεRI na omenjenih celicah.

Število FcεRI se najprej zmanjša na bazofilcih, lahko že 3. dan po aplikaciji omalizumaba. Število FcεRI na mastocitih pa se zmanjša kasneje, lahko šele po več tednih zdravljenja (73) (75). Omalizumab se od leta 2003 dalje uporablja v klinični praksi pri zdravljenju težke alergijske astme in kronične urtikarije (76),(77). Pri izbranih pacientih s težko, alergijsko eozinofilno astmo pomembno zmanjša število poslabšanj ter porabo sistemskih in inhalacijskih steroidov ter izboljša kakovost življenja. Še boljši uspeh ima zdravljenje z omalizumabom pri kronični spontani urtikariji, kjer učinkuje izredno hitro, v nekaj dnevih do tednih in povsem umiri bolezen do 80 % pacientov (78). Opisani so primeri uspešnega zdravljenja z omalizumabom pri pacientih z idiopatsko anafilaksijo, ki imajo težke reakcije spontano ali pa na neznan alergen(79–81).

Pacienti, ki imajo težje alergijske reakcije po hrani, kot so npr. arašidi ali kravje mleko, imajo višjo občutljivost bazofilcev v primerjavi s pacienti, ki imajo blažje reakcije ali pa so samo senzibilizirani z alergenom (50,82). Zdravljenje alergije na hrano lahko poteka z desenzibilizacijo. Pri pacientih s težjimi reakcijami pa zdravljenje z desenzibilizacijo za alergen pogosto ni uspešno ter je povezano s pogostimi in težkimi stranskimi učinki že ob aplikaciji majhnih količin alergena. Pacienti tako ne dosežejo tarčne vzdrževalne količine alergena ali pa za to potrebujejo zelo veliko časa. Sočasno zdravljenje z omalizumabom se je v študijah izkazalo za uspešno. Omogoča hitro in varno zviševanje alergena med desenzibilizacijo ter zmanjša pojav nevarnih stranskih učinkov (74,83–85). Žal pa uspešnost zdravljenja alergije na hrano z desenzibilizacijo ni vedno dolgotrajna in pri nekaterih pacientih se simptomi alergije vrnejo po ukinitvi zdravljenja z omalizumabom (85–87). Zaenkrat ni znano, pri katerih pacientih bo sočasno zdravljenje z omalizumabom med desenzibilizacijo imelo dolgotrajen uspeh.

Podobno imajo višjo občutljivost bazofilcev tudi pacienti, pri katerih med imunoterapijo s strupom žuželke pride do zapletov (53). Tudi v tej skupini pacientov so opisani uspešni (88–95) in tudi neuspešni (96) primeri sočasnega zdravljenja z omalizumabom pred in med imunoterapijo. Zdravljenje z omalizumabom se je izkazalo za uspešno tudi v skupini pacientov z mastocitozo in alergijo na strupe žuželk, kjer se mastociti in bazofilci lahko aktivirajo tudi po ne-imunološkem mehanizmu (37,88,94,97–

99). Protokoli zdravljenja z omalizumabom pa so se med seboj precej razlikovali glede na odmerek in interval med aplikacijami. V nekaterih primerih se je omalizumab odmerjal po protokolu za zdravljenje težke astme, glede na telesno težo in vrednost celokupnih IgE, v drugih pa po protokolu za zdravljenje

kronične urtikarije, v odmerku 150 ali 300 mg na 4 tedne. Razlikovalo se je tudi trajanje zdravljenja.

Tako zaenkrat ni znano, pri katerih pacientih bo sočasno zdravljenje z omalizumabom uspešno, po kakšnem protokolu naj se aplicira omalizumab in koliko časa naj traja zdravljenje.

2. NAMEN DELA IN HIPOTEZE

Osnovni namen dela je oceniti delež težkih sistemskih zapletov med imunoterapijo s strupi kožekrilcev, določiti neposredne dejavnike, ki napovedujejo težke zaplete med imunoterapijo, in ugotoviti, ali dodatno zdravljenje z omalizumabom omogoča varno uvedbo imunoterapije pri pacientih s ponavljajočimi se težkimi zapleti med imunoterapijo.

Delovne hipoteze:

 Obstajajo napovedni dejavniki za težke sistemske zaplete med imunoterapijo – teža izvorne reakcije, imunoterapija s strupom čebele, občutljivost bazofilcev in bazalni nivo serumske triptaze.

 Zdravljenje z omalizumabom omogoča varno uvedbo imunoterapije pri pacientih, ki so imeli več težkih sistemskih reakcij med imunoterapijo.

 S spremljanjem dinamike imunoloških faktorjev – občutljivosti bazofilcev, merjene z izražanjem CD63 na površini bazofilcev po spodbujanju s strupom žuželke – lahko spremljamo učinek zdravljenja z omalizumabom.

3. METODE

3.1 Zasnova raziskave

Raziskava je bila zasnovana v treh delih.

V prvem delu raziskave smo retrospektivno analizirali pojavnost in težo sistemskih zapletov med imunoterapijo pri vseh pacientih, pri katerih smo na Univerzitetni kliniki Golnik uvajali specifično imunoterapijo s strupom žuželke v letih 2005–2016.

V drugem delu raziskave smo analizirali klinične (spol, starost, teža reakcije ob piku žuželke, prejemanje blokatorjev beta adrenergičnih receptorjev ter zaviralcev angiotenzinove konvertaze) in imunološke dejavnike (bazalni nivo triptaze, specifični IgE za ekstrakt čebeljega in osjega strupa ter za posamezne komponente, test aktivacije bazofilcev), ali napovedujejo težke zaplete med imunoterapijo.

V tretjem delu raziskave smo prospektivno vključili paciente, pri katerih imunoterapije nismo uspeli uvesti zaradi pogostih težkih sistemskih zapletov. Takšnih pacientov je bilo v zadnjih 10 letih 23. Enajst pacientov se je odločilo za ponovno uvedbo imunoterapije. Zdravili smo jih z omalizumabom in ponovno poskušali uvesti imunoterapijo. Spremljali smo stranske učinke med ponovno uvedbo imunoterapije in imunološke parametre – aktivacijo bazofilcev ter število receptorjev FcεRI in IgE na površini bazofilca. Predvidevali smo, da bo zmanjšanje občutljivosti bazofilcev med zdravljenjem povezano z uspehom zdravljenja (51).

3.2 Preiskovanci

V prvem delu raziskave smo retrospektivno vključili 1820 pacientov, ki so se v času od januarja 2005 do junija 2016 zdravili s specifično imunoterapijo s strupom žuželk na Univerzitetni kliniki za pljučne bolezni in alergijo Golnik. Za pridobivanje informacij o vključenih pacientih smo uporabili bolnišnični informacijski sistem BIRPIS. Zbrali smo podatke o spolu, starosti ter poteku imunoterapije.

Imunoterapija s strupom žuželk je bila uvedena v skladu z evropskimi smernicami (3) pri pacientih, ki so imeli po piku žuželke sistemsko alergijsko reakcijo težje stopnje (III in IV stopnje po Muellerju) in pri posameznih pacientih z alergijsko reakcijo lažje stopnje (I in II stopnje po Muellerju) z dodatnimi dejavniki tveganja: večja možnost pika v naravi (čebelarji, vrtnarji, gozdni delavci, delavci na višini …) ali manjša kakovost življenja zaradi strahu pred reakcijo (Tabela 2). Senzibilizacija z alergenom strupa žuželke je bila dokazana s kožnimi vbodnimi ali intradermalnimi testi, serološko ali s testom aktivacije bazofilcev (5,22,70). Vsi diagnostični postopki so opisani spodaj.

Pri naših pacientih smo od januarja 2005 do julija 2008 za uvedbo imunoterapije uporabljali hitri uvodni protokol, od avgusta 2008 dalje pa uporabljamo zelo hitri uvodni protokol (Tabela 6).

Hitri uvodni protokol Zelo hitri uvodni protokol

Dan Čas (min) Odmerek

(µg) Dan Čas (min) Odmerek

(µg)

0 0,02 0 0,1

15 0,03 15 0,3

30 0,05 30 0,7

1 45 0,2 1 45 2

60 0,3 60 3

75 0,5 75 5

90 2 90 10

105 3 105 20

120 5 120 30

135 40

0 10

2 15 20 2 0 50

30 30 15 50

45 40

5 0 100

0 20

4 15 30

30 50

11 0 50

15 50

25 0 100

Tabela 6: Hitri in zelo hitri uvodni protokol imunoterapije s strupom žuželk.

Tako med uvodno kot med vzdrževalno fazo je prišlo do sistemskih zapletov, ki smo jih ovrednotili po Lindi Cox (68) (Tabela 5). Zaplete med imunoterapijo smo zdravili po smernicah za anafilaksijo. V primeru lažjih zapletov 1. stopnje med uvodno fazo smo nadaljevali po prilagojeni postopni shemi z več vmesnimi koraki. Če pa se je imunoterapija večkrat zapletla ali so se pojavili sistemski zapleti težje stopnje (2.–4. stopnje), pa smo imunoterapijo ponovno uvedli po počasnejši shemi, z več premedikacije z antihistaminiki. Ciljni vzdrževalni odmerek je bil v takem primeru višji, 200 µg žuželčjega strupa.

Imunoterapijo smo prekinili zaradi zapletov, če smo jo vsaj trikrat poskušali uvesti, pa so se zapleti kljub temu ponavljali.

3.3 Napovedni dejavniki za težke sistemske zaplete med imunoterapijo

V drugem delu raziskave smo analizirali klinične in laboratorijske podatke pri pacientih, ki so imeli opravljene vse laboratorijske preiskave (bazalna triptaza, specifični IgE za celotni ekstrakt čebeljega in osjega strupa ter za posamezne komponente, test aktivacije bazofilcev). Vsi diagnostični postopki so opisani spodaj. Za pridobivanje informacij o vključenih pacientih smo uporabili bolnišnični informacijski sistem BIRPIS. Zbrali smo podatke o spolu, starosti, teži izvorne reakcije ter poteku imunoterapije, jemanju zdravil iz skupine zaviralcev adrenergičnih receptorjev beta ter zaviralcev encima angiotenzinske konvertaze v času reakcije ob piku. Stopnjo najtežje sistemske alergijske reakcije ob piku kožekrilca smo ocenili po Muellerju (11) (12) (Tabela 2), prav tako smo ocenili, ali je šlo za težko anafilaksijo s presinkopo/kolapsom brez kožne simptomatike ali ne (100). Vključili smo tudi izvide laboratorijskih preiskav: nivo bazalne triptaze, nivo specifičnih IgE za celotni ekstrakt čebeljega in osjega strupa ter za posamezne komponente – rApi m 1 ter rApi m 10 (samo pri pacientih, zdravljenih s strupom čebele), test aktivacije bazofilcev s strupom čebele ali strupom ose, razmerje CD63+ strup čebele ali ose/anti-FcεRI.

3.4 Zdravljenje z omalizumabom

Vse paciente, pri katerih imunoterapije nismo uspeli uvesti zaradi pogostih težkih sistemskih zapletov, smo povabili v odprto, prospektivno študijo dodatnega zdravljenja z omalizumabom ob ponovni imunoterapiji. Upoštevali smo vključitvene in izključitvene kriterije (Tabela 7).

Vključitveni kriteriji:

 starost nad 18 let

 sistemska alergijska reakcija po piku kožekrilca stopnje III in IV po Muellerju

 dokazana senzibilizacija s strupom kožekrilca

 neuspešna imunoterapija zaradi stranskih učinkov:

 imunoterapija je bila prekinjena zaradi pogostih in/ali težkih sistemskih zapletov kljub temu, da smo vsaj trikrat poskušali uvesti imunoterapijo s počasnejšim protokolom, višjim vzdrževalnim odmerkom in intenzivnejšo premedikacijo z antihistaminiki

Izključitveni kriteriji:

 jemanje zdravil iz skupine zaviralcev adrenergičnih receptorjev beta

 nosečnost

Kriteriji za prekinitev študije:

 pogosti in težki stranski učinki med imunoterapijo kljub sočasnem zdravljenju z omalizumabom

 pacientova osebna želja

Tabela 7: Vključitveni in izključitveni kriteriji za prospektivno študijo dodatnega zdravljenja z omalizumabom ob ponovni imunoterapiji

Začetno odmerjanje omalizumaba smo povzeli po doslej objavljenih primerih (88–93,95,101).

Odmerka omalizumaba nismo prilagajali na vrednost celokupnih IgE, saj alergija na strup žuželk ni povezana z atopijo in so celokupni IgE pri teh pacientih praviloma nizki (102). Začeli smo zdravljenje z dvema aplikacija omalizumaba 150 mg v dvotedenskem razmaku in nato ponovno uvedli imunoterapijo po zelo hitri shemi. Ker se to ni izkazalo za klinično učinkovito in so vsi pacienti, zdravljeni po tem protokolu, imeli stranske učinke, smo protokol na podlagi lastnih izkušenj prilagodili ter intenzivirali: aplicirali smo omalizumab 300 mg trikrat v dvotedenskem razmaku pred uvedbo imunoterapije po zelo hitri shemi. V vzdrževalni fazi smo nadaljevali z aplikacijo omalizumaba 300 mg/4 tedne, dokler so pacienti še imeli občasne zaplete. Sam potek zdravljenja z omalizumabom in prilagoditev protokola je natančno opisan v rezultatih. Med zdravljenjem z omalizumabom smo spremljali stranske učinke med ponovno uvedbo imunoterapije in imunološke parametre – aktivacijo bazofilcev ter število receptorjev FcεRI in IgE na površini bazofilca. Študijo je odobrila Komisija za medicinsko etiko Republike Slovenije in je registrirana na ClinicalTrials.gov (NCT02968394).

3.5 Diagnostične metode

3.5.1 Kožni testi

Kožne vbodne teste smo opravljali na volarni strani podlahti.

Pri kožnih vbodnih testih smo nanesli kapljico ekstrakta strupa žuželke v koncentraciji 100 µg/ml in 10 µg/ml (Venomhal, HAL Allergy, Leiden, Nizozemska). Uporabljali smo tudi negativno kontrolo (fiziološko raztopino) in pozitivno kontrolo s histaminom (HAL Allergy, Leiden, Nizozemska). Kapljico smo prebodli z lanceto ter test vrednotili po 15 minutah. Kot pozitiven test smo ocenili velikost urtike vsaj 3 mm.

Pri kožnih intradermalnih testih pa smo tik pod povrhnjico vbrizgali 0,05 ml ekstrakta strupa žuželke in s tem ustvarili 2–3 mm velik podkožni mehurček. Uporabljali smo koncentraciji 0,1 µg/ml in 1 µg/ml

ter negativno kontrolo (fiziološko raztopino) in pozitivno kontrolo s histaminom (HAL Allergy, Leiden, Nizozemska). Kot pozitiven test smo ocenili povečanje urtike za vsaj 3 mm od izhodnega mehurčka.

3.5.2 Določanje specifičnih protiteles razreda IgE

V serumu smo določali specifična protitelesa proti čebeljemu in osjemu strupu ter rekombinatnim alergenom rApi m 1 in rApi m 10 po navodilih proizvajalca s sistemom ImmunoCAP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) ali Immulite (Siemens, Erlangen, Nemčija). Kot pozitivno vrednost smo vrednotili sIgE ≥ 0,35 kU/l.

3.5.3 Določanje serumske triptaze

Triptazo v serumu smo določali po navodilih proizvajalca s sistemom ImmunoCAP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) ali Immulite (Siemens, Erlangen, Nemčija).

3.5.4 Test aktivacije bazofilcev

Test aktivacije bazofilcev smo izvajali po postopku, ki je opisan že v prejšnjih publikacijah (52,54,56,60,103). Heparinizirano polno kri smo predhodno inkubirali v stimulacijskem pufru bazofilcev z dodatkom IL-3 (Buhlmann Laboratories, Basel, Švica), ki je vseboval strup čebele ali ose v koncentraciji 0,001, 0,01, 0,1 in 1 µg/ml (HAL Allergy, Leiden, Nizozemska). Kot negativno kontrolo smo uporabili inkubacijski pufer. Uporabili smo dve pozitivni kontroli: stimulacijo z anti-FcεRI, kjer poteka aktivacija bazofilcev z enakim mehanizmom kot sicer pri stimulaciji z alergenom, ter stimulacijo s fMLP (formil-metionil-leucil fenilalanin), ki ni odvisna od receptorja FcεRI. Koncentracija anti-FcεRI je bila 0,55 µg/ml mAb (Buhlmann Laboratories), koncentracija fMLP pa 2 µM (N-Formil-Met-Leu-Phe, Sigma, St. Louis, MO, ZDA). Inkubacija je potekala 15 minut pri 37 °C. Degranulacijo smo ustavili z ohlajanjem na ledu. Po tem smo dodali FITC-konjugirani anti-CD63 mAb, PE-konjugirani anti-CD123 mAb in PerCP-konjugirani anti-HLA-DR mAb (BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA) in vzorec 20 minut inkubirali na ledu.

Po koncu postopka smo sonde s polno krvjo v roku dveh ur lizirali, sprali, fiksirali in analizirali na pretočnem citometru FACSCalibur (BD Biosciences). Analizirali smo vsaj 400 CD123-pozitivnih celic.

Bazofilce smo identificirali kot celice z nizkim stranskim sipanjem, CD123-pozitivne in HLA-DR-negativne celice, v FL1 (CD63) pa je bila izmerjen odstotek bazofilcev, ki so izražali CD63.

Razmerje CD63+ strup čebele ali ose/anti-FcεRI je bilo izračunano kot odstotek CD63+ bazofilcev pri dani koncentraciji strupa v odstotku CD63+ bazofilcev po stimulaciji z 0,55 µg/ml protiteles FcεRI.

Za izhodiščne vrednosti BAT so bile meritve opravljene pred uvedbo imunoterapije in najmanj 4 tedne po zadnji reakciji. Za spremljanje izražanja CD63 med zdravljenjem z omalizumabom je bil BAT opravljen pred aplikacijo imunoterapije.

3.5.5 Merjenje števila receptorjev FcεRI in IgE na površini bazofilca

Merjenje števila receptorjev FcεRI in IgE na površini bazofilca smo izvajali po postopku, ki je opisan že v prejšnjih publikacijah (54,103). Uporabili smo heparinizirano polno kri. Za označevanje bazofilcev smo uporabili FITC-konjugirana protitelesa proti FcεRI (Thermo Fisher Scientific) ali anti-IgE (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Nemčija). Inkubacija je potekala 15 minut pri 37 °C. Po koncu postopka smo sonde

s polno krvjo v roku dveh ur lizirali, sprali, fiksirali in analizirali na pretočnem citometru FACSCalibur (BD Biosciences). Rezultat smo preračunali s pomočjo standardne kalibracijske krivulje kalibracijskih mikrodelcev, ki so imeli na površini znano število molekul FITC (Agilent, Santa Clara, CA, ZDA) ter tako določili število FcεRI in IgE na površini bazofilca. Uporabili smo podatek, da se na eno protitelo veže ena molekula FcεRI ali IgE. Arbitrarne enote srednje intenzivnosti fluorescence (MFI) FITC smo pretvorili v absolutno število glede na dodeljene molekule ekvivalentnih vrednosti fluorokroma (MEF)

In document Peter Kopač (Strani 15-0)