DIPLOMSKO DELO

(1)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

DIPLOMSKO DELO

Maja Mahorič

Ljubljana, 2021

(2)

(3)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE BIOKEMIJA

Ovrednotenje postopkov kontrastiranja bioloških vzorcev z alternativnimi kontrastnimi snovmi za presevno elektronsko

mikroskopijo

DIPLOMSKO DELO

Maja Mahorič

M

ENTOR

: doc. dr. Nada Žnidaršič

Ljubljana, 2021

(4)

(5)

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisana Maja Mahorič sem avtorica diplomskega dela z naslovom:

Ovrednotenje postopkov kontrastiranja bioloških vzorcev z alternativnimi kontrastnimi snovmi za presevno elektronsko mikroskopijo.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

 je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom doc. dr.

Nade Žnidaršič;

 sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

 se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

 sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

 je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, 2. 9. 2021 Podpis avtorice:

(6)

(7)

Zahvala

Diplomsko delo sem opravljala na Oddelku za biologijo na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani.

Iskreno se zahvaljujem mentorici doc. dr. Nadi Žnidaršič za vso strokovno pomoč, nasvete in vodenje pri opravljanju laboratorijskega dela in pisanju diplomske naloge.

Hvala tudi doc. dr. Poloni Mrak za trud in pomoč pri laboratorijskem delu in vse popravke diplomskega dela.

Članici komisije doc. dr. Veri Župunski se zahvaljujem za končni pregled diplomske naloge.

Nazadnje bi se rada zahvalila družini in prijateljem, ki so me podpirali in mi stali ob strani tekom celotnega študija.

(8)

(9)

Ovrednotenje postopkov kontrastiranja bioloških vzorcev z alternativnimi kontrastnimi snovmi za presevno elektronsko mikroskopijo

Povzetek: Presevni elektronski mikroskop nam omogoča slikanje različnih bioloških vzorcev z visoko ločljivostjo. Ti so v splošnem sestavljeni iz elementov z nizkim atomskim številom, zato so pri slikanju slabo kontrastni. Kontrast vzorcev povečamo z uporabo kontrastnih sredstev, ki večinoma vsebujejo ione težkih kovin. V zadnjem času se na trgu pojavljajo nova kontrastna sredstva, ki poenostavijo postopek priprave vzorcev. Novejši postopki za kontrastiranje so običajno preizkušeni predvsem na različnih humanih in sesalskih vzorcih. V nalogi smo preizkusili dve novejši in redko uporabljani kontrastni sredstvi AU Zero^TM in natrijevo silicij-volframovo kislino v postopkih priprave vzorcev tkiv rib, tkiv žuželk in rastlinskih virusov za elektronsko mikroskopijo. Ovrednotili smo pridobljene mikrografije v primerjavi s klasičnimi postopki. Rezultati mikroskopiranja vzorcev jeter ribe in mišice žuželke so pokazali, da je alternativno kontrastno sredstvo AU Zero^TM v splošnem ustrezno nadomestilo klasični postopek in nam je omogočilo opazovanje značilnih struktur v vzorcu tkiva.

Razlike smo opazili predvsem pri kontrastiranju heterokromatina in lipidnih kapelj v hepatocitih ribe. Rezultati kontrastiranja vzorcev v suspenziji so pokazali, da je natrijeva silicij-volframova kislina v splošnem uporabna za detekcijo in slikanje virusov mozaika tobaka paradižnika, vendar na pridobljenih slikah ultrastrukturne značilnosti virusa niso bile zelo dobro razvidne.

Ključne besede: presevna elektronska mikroskopija, kontrastna sredstva, tkivne rezine, vzorci v suspenziji, priprava vzorcev za presevno elektronsko mikroskopijo

(10)

(11)

Evaluation of the procedures for biological samples contrasting with alternative contrastive agents in transmission electron microscopy

Abstract: Transmission electron microscopy enables analyses of ultrastructural characteristics of biological samples. These samples consist mainly of elements with low atomic numbers, which results in the micrographs that lack contrast. To enhance the contrast, we use contrast agents mostly based on ions of heavy metals. The recent development of new alternative contrast agents enables an easier preparation of biological samples. New protocols are usually tested on different human and mammal samples. In these study, we used two new and rarely used contrast agents AU Zero^TM and sodium silicotungstate for preparation of fish tissue, insect tissue and plant viruses for transmission electron microscopy. We compared and evaluated the acquired micrographs with respect to conventional protocols. The results of imaging the ultrathin sections of fish liver and of insect muscle showed that agent AU Zero^TM generally adequately contrasted these samples and it enabled us to resolve the ultrastructure of our samples. Differences were observed in the case of heterochromatin and lipid droplets imaging in fish hepatocytes. The micrographs of samples in suspension showed that sodium silicotungstate is generally appropriate for detection and observation of tomato mosaic virus but did not enable a more precise observation of the virus’s ultrastructural characteristics.

Keywords: transmission electron microscopy, contrast agents, tissue samples, samples in suspension, sample preparation for transmission electron microscopy

(12)

(13)

Kazalo

1 Uvod ... 1

1.1 Presevni elektronski mikroskop ... 1

1.2 Priprava bioloških vzorcev za presevno elektronsko mikroskopijo ... 2

1.2.1 Priprava vzorcev tkiv ali celic ... 2

1.2.2 Priprava bioloških vzorcev v suspenziji ... 5

1.3 Kontrastiranje ... 6

1.3.1 Kontrastiranje ultratankih rezin bioloških vzorcev ... 6

1.3.2 Negativno kontrastiranje vzorcev v suspenziji ... 8

1.3.3 Alternativna kontrastna sredstva ... 8

2 Namen dela ... 11

3 Eksperimentalni deli ... 13

3.1 Materiali ... 13

3.1.1 Instrumenti in materiali ... 13

3.1.2 Kemikalije ... 13

3.1.3 Vzorci ... 14

3.2 Metode ... 14

3.2.1 Tkivne rezine ... 14

3.2.2 Vzorci v suspenziji ... 15

3.2.3 Mikroskopiranje ... 16

4 Rezultati in razprava ... 17

4. 1 Tkivne rezine ... 17

4.1.1 Jetra ribe ... 17

4.1.2 Mišica žuželke ... 24

4. 2 Vzorci v suspenziji ... 30

4.2.1 Virus mozaika paradižnika ... 30

(14)

(15)

5 Zaključek ... 35 6 Literatura ... 37

(16)

(17)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

DNA deoksiribonukleinska kislina RNA ribonukleinska kislina

ToMV virus mozaika paradižnika

(18)

(19)

Ovrednotenje postopkov kontrastiranja bioloških vzorcev z alternativnimi kontrastnimi snovmi za presevno elektronsko mikroskopijo

1

1 Uvod

1.1 Presevni elektronski mikroskop

Presevni elektronski mikroskop nam omogoča slikanje bioloških vzorcev pri visoki prostorski ločljivosti in velikih povečavah. Glavna prednost v primerjavi z drugimi mikroskopskimi tehnikami je zelo dobra prostorska ločljivost, ki je posledica kratkih valovnih dolžin žarka elektronov v elektronskem mikroskopu. Ločljivost svetlobnih mikroskopov znaša v splošnem 200 nm, medtem ko ločljivost elektronskih mikroskopov v splošnem znaša okrog 0,5 nm, v določenih sistemih pa tudi manj.

Omogoča nam podrobnejšo analizo zgradbe tkiv in celic ter delcev v suspenziji kot so virusi in izolirani proteini. Ločljivost mikrografij bioloških vzorcev je pogojena tudi z njihovimi lastnostmi in predhodno pripravo. Vzorce pripravimo tako, da je njihova struktura ohranjena, da so kontrastni in stabilni v vakumu elektronskega mikroskopa ter zaščiteni pred poškodbami, ki lahko nastanejo zaradi žarka elektronov [1].

V elektronskem mikroskopu žarek elektronov potuje od izvora elektronov proti zaslonu mikroskopa ali kameri in na svoji poti prečka biološki vzorec. Na vrhu je vir elektronov, ki je sestavljen tako, da ustvari oblak elektronov, jih oblikuje v žarek in jih pospeši po koloni navzdol. Eden izmed načinov je, da vir elektronov segrevamo, pri čemer elektronom dovajamo energijo, dokler ne zapustijo trdne površine. V bližini vira je anoda, kar skupaj z dodatnimi deli omogoča, da elektroni potujejo v isto smer v obliki žarka. Viri so različni, največkrat uporabljena sta volframova nitka ali kristal lantanovega heksaborida. Med seboj se razlikujeta po več parametrih kot so število elektronov, koherentnost in širina elektronskega žarka, kar pa vpliva tudi na končno ločljivost slike.

Žarek elektronov potuje po koloni, v kateri je vakum. To prepreči, da bi elektroni na svoji poti do vzorca zadeli druge delce, kar bi vplivalo na njihovo pot in končno sliko.

Na žarek vplivamo s kondenzorskimi lečami, ki zbirajo elektrone in jih usmerijo na področje vzorca, ki ga želimo opazovati. Leče objektiva, vmesne leče in projektorske leče povečajo sliko in jo projicirajo na fosforescenčni zaslon. V splošnem slika v presevnem elektronskem mikroskopu temelji na sipanju elektronov, ki prečkajo vzorec.

Elektroni, ki vzorec nemoteno prehajajo, tvorijo svetle točke v sliki, temne točke pa tvorijo predeli, kjer se elektroni sipajo na atomih težkih elementov v vzorcu. Kot rezultat dobimo sivinsko dvodimenzionalno sliko vzorca [2].

(20)

2

1.2 Priprava bioloških vzorcev za presevno elektronsko mikroskopijo

Vzorce, ki jih opazujemo s presevnim elektronskim mikroskopom predhodno ustrezno pripravimo glede na analize, ki jih želimo izvesti na posameznem vzorcu. Priprava omogoči ohranitev ultrastrukture vzorca, stabilnost vzorca v mikroskopu in snemanje slik z ustrezno kontrastnostjo in ločljivostjo. Z uporabo kontrastnih sredstev povečamo kontrast med posameznimi opazovanimi strukturami v vzorcu [1]. Za lokalizacijo specifičnih celičnih komponent se poslužujemo tehnik imuno-označevanja, ki nam omogočijo podrobnejšo analizo lokacije in razporeditve izbranih makromolekul v vzorcu. Opazovane komponente običajno najprej označimo s primarnimi nato pa s sekundarnimi protitelesi, na katere so pripeti delci koloidnega zlata v velikosti med 5 in 20 nm. Z imunolokalizacijskimi tehnikami lahko celične komponente označujemo pred ali po vklapljanju biološkega vzorca v plastiko [3].

Opazovanje vzorcev s presevno elektronsko mikroskopijo nam omogoča pridobivanje informacij o strukturi vzorcev ter lokaciji makromolekul z visoko ločljivostjo, opazujemo lahko izolirane biološke objekte kot so virusi, izolirani proteini, liposomi in drugi. Z nadaljnjimi analizami posnetkov lahko rekonstruiramo tridimenzionalno zgradbo opazovanih vzorcev [4].

1.2.1 Priprava vzorcev tkiv ali celic

Po odvzemu, je prva stopnja v pripravi bioloških vzorcev fiksacija. Njen namen je ohranitev izvorne strukture vzorca. Fiksacija prepreči morfološke spremembe tkiv, difuzijo topnih komponent celic in razgradne procese. Za ta namen se poslužujemo dveh skupin tehnik; kemijske fiksacije in kriofiksacije [4].

1.2.1.1 Kemijska fiksacija

Za kemijsko fiksacijo vzorcev tkiv ali celic uporabljamo različne kemikalije, najpogosteje glutaraldehid in formaldehid. Uporabljamo jih v različnih kombinacijah in koncentracijah v puferski raztopini. S pufrom zagotovimo izotonično raztopino, v kateri so raztopljeni kemijski fiksativi, ki bodo zaradi razlike v gradientu prehajali v biološki vzorec. Fiksativi na osnovi aldehidov reagirajo z aminskimi skupinami proteinov, kar povzroči nastanek novih vezi, kar vodi do zamreženja.

(21)

3

Kemijski fiksativi se razlikujejo po hitrosti prehajanja v celico in učinkovitosti zamreženja proteinov. Glutaraldehid povzroči hitro zamreženje proteinov, vendar je difuzija v vzorec počasnejša. Ker lahko v tem času pride do razgradnje in poškodb vzorca, pogosto uporabimo mešanico glutaraldehida in formaldehida v ustreznem pufru.

Formaldehid v vzorec difundira hitreje in povzroči začasno zamreženje proteinov, kar upočasni spremembe v vzorcu. Formaldehid nato nadomesti glutaraldehid, ki proteine učinkoviteje zamreži.

Izbira kombinacije fiksativov je odvisna od vrste vzorca, velikosti in nadaljnje priprave.

S kemijsko fiksacijo v biološki vzorec vstopajo nove, tuje molekule, kar lahko povzroči nastanek strukturnih artefaktov in delokalizacijo proteinov in drugih manjših molekul.

Kemijski fiksativi na osnovi aldehidov zamrežijo predvsem proteinske komponente celice, ne pa tudi lipidnih in sladkornih makromolekul.

Po primarni fiksaciji običajno vzorec še postfiksiramo v raztopini osmijevega tetraoksida. Osmijev tetraoksid potuje v celico počasneje kot aldehidi. Je močan oksidant, ki oksidira dvojne vezi nenasičenih maščobnih kislin v membranah celice in jih fiksira. Po reakciji ostane osmij vezan v membrane in, ker je osmij težek element, z njim kontrastiramo celične membrane in ostale strukture na katere se veže. Osmijev tetraoksid ne reagira s sladkorji, zato se tudi s tem postopkom ne ohranijo. Po postfiksaciji z osmijevim tetraoksidom so celice bolj toge in se med pipetiranjem ali centrifugiranjem lažje poškodujejo zato moramo z njimi ravnati previdno.

Učinkovitost kemijske fiksacije je v veliki meri odvisna od hitrosti difuzije fiksativa v celico, proces pa lahko vodi do tvorbe artefaktov in izgub določenih celičnih komponent. Zato so v uporabi specifični protokoli in reagenti, optimizirani za ohranjanje določenih celičnih struktur [3, 4, 5, 6].

1.2.1.2 Kriofiksacija

S postopkom kriofiksacije vzorec hitro zamrznemo pri zelo nizki temperaturi, da se izognemo tvorbi kristalov ledu, ki poškodujejo ultrastrukturo celice in povzročijo artefakte v vzorcu. Cilj postopka je tvorba amorfnega ledu, ki je najbolj podoben tekočemu stanju vode v vzorcu. Praviloma s kriofiksacijo v biološki vzorec ne vnašamo tujih snovi, vendar lahko v določenih primerih vzorec dodatno zaščitimo s krioprotektanti. Nekatere celice imajo naravno prisotne krioprotektante, kot so določeni proteini ali visoka koncentracija sladkorjev.

(22)

4

Vzorec lahko kriofiksiramo na različne načine. Prvi od načinov je, da vzorec potopimo v ohlajen kriogeni medij kot sta etan ali propan. Hladimo ju s tekočim dušikom pri -196 stopinj Celzija. Ko vzorec potopimo v kriogeni medij, pride do nastanka amorfnega ledu do globine od enega do dveh mikrometrov.

Pri tehniki udarnega zamrzovanja vzorec z določeno hitrostjo in določenim pritiskom izstrelimo na kovinsko ploščo, hlajeno s tekočim dušikom na – 196 stopinj Celzija. Pri tem postopku pride do tvorbe amorfnega ledu od 10 do 15 mikrometrov v globino vzorca.

Pri visokotlačnem zamrzovanju vzorec izpostavimo tlaku 2048 barov, ki za 20 stopinj Celzija zniža ledišče vode, zavre nukleacijo in rast kristalov. Vzorec hladimo s tekočim dušikom, vitrifikacija vzorca pa poteče do globine okoli 300 mikrometrov [4, 6, 7].

1.2.1.3 Dehidracija

Po kemijski fiksaciji s fiksativi na vodni osnovi, vodo v celici zamenjamo z organskim topilom, najpogosteje z etanolom ali acetonom. Vzorec postopoma inkubiramo v raztopinah z naraščajočo koncentracijo topila do 100-odstotne koncentracije. Organska topila služijo tudi kot topilo za material v katerega kasneje vklopimo biološki vzorec.

Po kriofiksaciji lahko biološki vzorec dehidriramo s postopkom, ki ga imenujemo kriosubstitucija. Zamrznjeno vodo zamenjamo z organskim topilom, kot je etanol ali aceton, pri temperaturi okrog -90 stopinj Celzija. Raztopini organskega topila dodamo fiksative, ki jih uporabljamo pri klasični kemijski fiksaciji in temperaturo biološkega vzorca postopoma višamo, da pospešimo difuzijo molekul. Po kriosubstituciji lahko vzorec prenesemo na sobno temperaturo [3, 7].

1.2.1.4 Vklopitev v plastiko

Po procesu dehidracije vzorec prepojimo s plastiko, ki v specifičnih pogojih polimerizira. Vzorec prepojimo s tekočo plastiko, ki bo zaradi organskega topila prodrla v celice in jo po določeni dobi inkubacije najpogosteje polimeriziramo s segrevanjem ali z izpostavitvijo UV-svetlobi. Tako dobimo blok strjene plastike, v katero je ujet naš vzorec. To nam omogoča pripravo ultratankih rezin [5].

(23)

5

1.2.1.5 Priprava ultratankih rezin

Po vklopitvi biološkega vzorca v plastiko ali smolo, blok vzorca oblikujemo v trapezoid, da se znebimo odvečne plastike oz. smole in da večji del bloka predstavlja biološki vzorec. Tega vstavimo v ultramikrotom, ki z diamantnim ali steklenim rezilom reže vzorec na nastavljeno debelino. Vzorce narežemo na ultratanke rezine debeline od 40 do 80 nanometrov. Vzorec režemo na površino vode, ki se nahaja ob rezilu, robovi posameznih ultratankih rezin pa se zlepijo skupaj v trak. Trak zaporednih rezin nam omogoča sledenje posameznim strukturam v celici. Rezine prenesemo na kovinsko mrežico [3, 6]. Sledi kontrastiranje rezin in slikanje s presevnim elektronskim mikroskopom.

Pri kriofiksiranih vzorcih, ki jih naknadno nismo vklopili v plastiko, moramo pripraviti ultratanke rezine pri temperaturah nižjih od -140 stopinj Celzija, saj pri višjih temperaturah poteče rekristalizacija vode. Podobno kot pri sobni temperaturi se rezine zlepijo skupaj v trak rezin, ki ga prenesemo na ohlajeno kovinsko mrežico [4].

1.2.2 Priprava bioloških vzorcev v suspenziji

Vzorci v suspenziji so običajno čiste ali delno očiščene neagregirane biološke vzorce v vodni raztopini ali pufru. To so lahko izolirani celični organeli, bakterije, virusi, makromolekulski kompleksi ali izolirane molekule, kot so proteini in nukleinske kisline [1].

1.2.2.1 Negativno kontrastiranje vzorcev v suspenziji

Tehnika negativnega kontrastiranja nam daje informacije o velikosti in obliki delcev v suspenziji. Uporabna je pri opazovanju virusov in drugih makromolekul, saj daje informacije o morfologiji virusa, kot je oblika in simetrija delca ter prisotnost virusne ovojnice.

Vzorce v suspenziji pripravimo z uporabo vodnih raztopin soli težkih kovin za kontrastiranje okolice in vodnih predelov biološkega vzorca. Suspenzijo vzorcev nanesemo na kovinske mrežice, ki so prekrite s tanko plastjo podpornega filma iz folije (npr. Formvar) in ogljika. Odvečno suspenzijo odstranimo. Nato nanesemo kontrastno sredstvo, po določeni dobi inkubacije odstranimo presežek in pustimo, da se vzorec posuši. Dobimo tanek film kontrastnega sredstva, ki obdaja in podpira biološki vzorec.

(24)

6

Prisotnost težkih kovin v okolici vzorca povzroči sipanje elektronov in kot rezultat vidimo svetel biološki vzorec na temni podlagi. Vzorce lahko opazujemo pri sobni temperaturi. [2, 6, 8].

1.2.2.2 Kriofiksacija

Pri kriofiksaciji bioloških vzorcev v suspenziji uporabimo tehniko potopitvenega zamrzovanja. Po kovinski mrežici s tanko plastjo podpornega filma nanesemo biološki vzorec in odvečno suspenzijo odstranimo, da dobimo tanek film vzorca. Kovinsko mrežico potopimo v ohlajen kriogeni medij in vzorec zamrznemo pri nizki temperaturi, da se izognemo tvorbi kristalov ledu. Dobimo objekte, zamrznjene v tankem sloju amorfnega ledu. Z uporabo fazno-kontrastnega slikanja se pri opazovanju takih vzorcev izognemo uporabi kontrastnih sredstev, saj je slika rezultat razlik v elektronski gostoti vzorca [9, 10].

1.3 Kontrastiranje

Kontrastiranje bioloških vzorcev za presevno elektronsko mikroskopijo je ključno za povečanje kontrasta posameznih struktur biološkega vzorca. Za kontrastiranje uporabljamo raztopine kationskih ali anionskih soli težkih kovin. Le-te se vežejo na različno nabite celične komponente. Biološke vzorce lahko kontrastiramo negativno, torej da kontrastiramo okolico struktur v vzorcu ali pa pozitivno, kjer neposredno kontrastiramo celične komponente in goste tkivne strukture. Najpogosteje so v uporabi kontrastna sredstva širokega spektra, ki povečajo kontrast celotnega biološkega vzorca [3, 6].

1.3.1 Kontrastiranje ultratankih rezin bioloških vzorcev

Običajen postopek kontrastiranja poteka tako, da kovinske mrežice z biološkim vzorcem položimo na kapljice raztopine kontrastnega sredstva. Časovni interval med prenosom rezin na mrežico in začetkom kontrastiranja mora biti čim krajši. Kuo in sodelavci v svoji knjigi navajajo, da dosežemo boljši kontrast, če vzorec po prenosu na mrežico direktno kontrastiramo, brez da bi ga izpostavili žarku elektronov za namen preverjanja kakovosti vzorca [8].

(25)

7

Po inkubaciji na kapljici kontrastnega sredstva mrežice odstranimo in jih večkrat speremo z deionizirano vodo. Vzorce lahko zaporedoma kontrastiramo z različnimi sredstvi, pri čemer moramo paziti, da se vzorec med samim postopkom ne posuši. Po končanem kontrastiranju odpivnamo odvečno vodo s filter papirjem in rezine posušimo na zraku [3, 6, 11].

Glavna težava pri procesu kontrastiranja je nastanek oborin soli težkih kovin.

Podaljševanje časa kontrastiranja lahko vodi k obarjanju zaradi sušenja kontrastnih sredstev na površini kapljic. Enako velja za kontrastiranje pri višjih temperaturah kot posledica hitrejšega izhlapevanja raztopin kontrastnih sredstev. Možnost nastanka netopnih agregatov se povečuje tudi s staranjem raztopin. Prav tako se s staranjem zmanjšuje kontrastnost zaradi padca reaktivnosti kontrastnih sredstev. Zato jih moramo primerno shranjevati in redno nadomeščati. [6, 11].

Najbolj razširjena metoda pozitivnega kontrastiranja temelji na kontrastiranju biološkega vzorca z vodno raztopino uranovega acetata, ki mu sledi kontrastiranje s svinčevim citratom. Obe sredstvi sta nespecifični, vendar reagirata z različnimi skupinami. Uranov acetat reagira s fosfatnimi in aminskimi skupinami v fosfolipidih in nukleinskih kislinah, svinčev citrat pa s hidroksilnimi skupinami in komponentami celičnih membran. [6, 12].

Uranov acetat zaradi visokega masnega števila urana tvori največjo elektronsko gostoto in posledično daje največji kontrast biološkemu vzorcu. Z uranovim acetatom povečamo kontrast celičnih membran in molekul DNA ter RNA. Za kontrastiranje uporabljamo vodne ali alkoholne raztopine uranovega acetata. Alkoholne raztopine bodo zaradi svoje polarnosti bolje difundirale v biološke vzorce, ki so vklopljeni v plastiko, vendar lahko pri daljših inkubacijskih dobah povzročajo motnje v plastiki.

Vodne raztopine uranovega acetata imajo nizek pH okrog 4 in jih zato ni priporočeno uporabljati z vzorci, ki so nanj občutljivi. Pri izpostavitvi svetlobi in s staranjem izgublja svojo reaktivnost, posledično se bo na celične komponente vezalo manj uranovih ionov in kontrast bo manjši. S časom se poveča zmožnost tvorbe agregatov, ki jih na mikrografijah vidimo kot elektronsko gosta področja. Z raztopinami uranovega acetata moramo ravnati previdno, saj je radioaktiven in toksičen [6, 11, 12].

Uporaba svinčevega citrata ojača kontrast ribosomov, lipidnih membran in drugih citoplazemskih predelkov. Snovi, ki jih v biološki vzorec vnesemo med postopkom priprave imajo večjo afiniteto do svinčevih ionov kot posamezne celične komponente.

Povečanje kontrasta je tako odvisno od interakcije svinca z osmijevim tetraoksidom, ki

(26)

8

omogoči vezavo svinčevih ionov na polarne skupine molekul ali od interakcije z uranovim acetatom. Svinčev citrat je zelo nepredvidljiv, prav tako je njegova uporaba časovno potratna in zahteva ustrezne pogoje, saj je občutljiv na pH. Raztapljanje ogljikovega dioksida iz zraka povzroči nižanje pH vodne raztopine svinčevega citrata pH vrednost pod 12 pa omogoči tvorbo toksičnega in netopnega svinčevega karbonata.

Na slikah ga vidimo kot elektronsko gosta področja različnih oblik in velikosti. Temu pojavu se izognemo z uporabo raztopin natrijevega hidroksida in prekuhane deionizirane vode, ki vzdržujeta pH okrog 12 in z delom v pogojih brez prisotnosti ogljikovega dioksida [6, 11].

Na kontrast vpliva veliko dejavnikov. Osmijev tetraoksid je hkrati fiksativ in pomaga pri povečanju kontrasta. Fosfatni pufri lahko vodijo do nastanka uranovih oborin in elektronsko gostih struktur v vzorcu. Voda, s katero spiramo vzorec lahko zaradi raztopljenega ogljikovega dioksida vodi do nastanka svinčevih oborin, voda s pH-jem nižjim od 6 pa lahko zmanjša kontrast uranovega acetata [11].

1.3.2 Negativno kontrastiranje vzorcev v suspenziji

Za negativno kontrastiranje vzorcev v suspenziji najpogosteje uporabljamo kislo vodno raztopino uranovega acetata. Razširjena je tudi uporaba nevtralnih vodnih raztopin molibdata, vanadata, fosfor-volframove kisline in natrijeve silicij-volframove kisline.

Zaradi nižjega masnega števila ionov bo elektronska gostota okoli vzorca pri uporabi teh kontrastnih sredstev manjša kot pri uporabi uranovega acetata, vendar pa anionska kontrastna sredstva niso tako zrnata kot uranov acetat in manj reagirajo z biološkim vzorcem [13].

1.3.3 Alternativna kontrastna sredstva

Najbolj pogosto uporabljen postopek za kontrastiranje suspenzij bioloških vzorcev je še vedno kontrastiranje z uranovim acetatom in za kontrastiranje ultratankih rezin dvostopenjski postopek v kombinaciji s svinčevim citratom. Vendar se zaradi določenih pomanjkljivosti, kot je nizek pH raztopine uranovega acetata, nagnjenost k tvorbi precipitatov ter toksičnost in radioaktivnost uporabljajo tudi drugačna kontrastna sredstva. V zadnjem času se na trgu pojavljajo nova alternativna kontrastna sredstva.

Njihove prednosti so predvsem v tem, da tvorijo manj direktnih interakcij z biološkimi

(27)

9

vzorci in imajo večinoma bolj nevtralen pH ter so enostavnejša za uporabo in shranjevanje. Različne kemijske značilnosti kontrastnih sredstev vplivajo na njihovo reakcijo z biološkim materialom in sipanje elektronov, kar vpliva na končni rezultat kontrastiranja [13, 14].

Amonijev molibdat spada med anionska kontrastna sredstva za negativno kontrastiranje suspenzij. Primeren je za kontrastiranje vzorcev občutljivih na spremembe v osmotskem tlaku, vendar ima v primerjavi z ostalimi kontrastnimi sredstvi nižjo elektronsko gostoto, posledično se bodo elektroni manj sipali in dali nižji kontrast. Shranjevanje vzorcev kontrastiranih z raztopino amonijevega molibdata je omejeno na nekaj dni [12, 14].

Fosfor-volframova kislina in natrijeva silicij-volframova kislina v vodnih raztopinah tvorita večje molekularne komplekse imenovane heteropolianioni, ki so stabilni v širokem pH območju. Fosfor-volframova kislina se uporablja kot 1-odstotna do 3- odstotna vodna ali etanolna raztopina. Pri višjih koncentracijah lahko fosfor-volframova kislina v celoti zakrije viruse, pri nizkih koncentracijah pa tvori tanek in enakomeren film, vendar zaradi nizke atomske mase ne daje velikega kontrasta. Zato se lahko uporablja v kombinaciji z uranovim acetatom za ojačitev kontrasta. Ima večjo afiniteto do vezave bazičnih komponent in je uporabna za viruse, za katere je značilno, da pri nižjih pH-jih disociirajo. Natrij silicij-volframova kislina, ki spada med alternativna kontrastna sredstva se uporablja kot 1-odstotna do 5-odstotna raztopina. Še posebej je primerna za opazovanje manjših delcev in posameznih makromolekul [15, 16, 17, 18].

AU Zero^TMje novejše kontrastno sredstvo dostopno na tržišču in je bilo razvito kot nadomestilo za uranov acetat. Za kontrastiranje vzorcev uporabljamo enake postopke in metode kot pri kontrastiranju s klasičnimi kontrastnimi sredstvi. AU Zero^TM lahko dolgoročno shranjujemo pri temperaturi -4 stopinje Celzija v temnem prostoru [19].

(28)

(29)

11

2 Namen dela

Biološki vzorci so sestavljeni pretežno iz elementov z nizkim atomskim številom, kar pomeni, da so vzorci slabo kontrastni pri slikanju s presevnim elektronskim mikroskopom. Za namen povečanja kontrasta tankih rezin in vzorcev v suspenziji uporabljamo kontrastna sredstva, katerih glavna komponenta so v splošnem ioni težkih kovin. Novejši postopki za pripravo bioloških vzorcev za presevno elektronsko mikroskopijo so običajno preizkušeni predvsem na različnih humanih ali drugih sesalskih vzorcih. V nalogi bomo preizkusili dve novejši in zelo redko uporabljani kontrastni sredstvi AU Zero^TM in natrijevo silicij-volframovo kislino v postopkih priprave vzorcev tkiv rib, tkiv žuželk in rastlinskih virusov za presevno elektronsko mikroskopijo. S primerjalno analizo mikrografij bomo ovrednotili primernost uporabe novih postopkov za izbrane vzorce. Postavili smo dve hipotezi:

Hipoteza 1: S kontrastiranjem ultratankih tkivnih rezin jeter rib in mišic žuželk z raztopino AU Zero^TM bomo pridobili mikrografije s približno enakim kontrastom in ločljivostjo kot v primeru klasičnih postopkov.

Hipoteza 2: Z negativnim kontrastiranjem virusov mozaika paradižnika z raztopino natrijeve silicij-volframove kisline bomo uspešno zaznali viruse v suspenziji in pridobili slike z jasno razvidnimi morfološkimi značilnostmi teh virusov.

(30)

(31)

13

3 Eksperimentalni deli

3.1 Materiali

3.1.1 Instrumenti in materiali Instrumenti:

- aparatura za pripravo mrežic za presevno elektronsko mikroskopijo:

napraševalec za ogljik z enoto za modifikacijo površine s plazmo (angl. glow discharge) EM ACE200 (Leica Microsystems, Nemčija)

- presevni elektronski mikroskop CM100 (Philips, Nizozemska) s kamero Orius SC200 (Gatan) in programsko opremo Digital Micrograph

- tehtnica

- magnetno mešalo

Materiali:

- stekleničke za raztopine - čaše

- mešalni magnetki - merilni valj

- mikrocentrifugirke - steklena palčka - brizga

- filter z 0,22 µm porami

- bakrene mrežice (gostota mreže 400 mesh) s plastjo Formvarja in ogljika (4 nm) - kapalke

- petrijevke - Parafilm

- škatla za shranjevanje mrežic - pinceta

- filter papir

3.1.2 Kemikalije

- 2-odstotna in 5-odstotna raztopina natrijeve silicij-volframove kisline (Agar Scientific), molekulska formula H4Na4O40SiW12

(32)

14

- 2-odstotna raztopina fosfor-volframove kisline (SPI Supplies), molekulska formula H3PW12O40nH2O

- 2-odstotna raztopina amonijevega molibdata (SPI Supplies), molekulska formula (NH4)2MoO4

- 0,5-odstotna raztopina svinčevega citrata, molekulska formula C12H10O14Pb3

- kontrastno sredstvo AU Zero^TM EM Stain (Agar Scientific), 5 ml, neredčeno - ekstrakcijski pufer za izolacijo virusov (sestava: 0,1 M fosfatni pufer in 2-

odstoten polivinilpirolidon) - voda Milli-Q

- raztopina 0,1 M NaOH (natrijev hidroksid)

3.1.3 Vzorci

- predhodno pripravljene ultratanke rezine živalskih tkiv: (i) jetra ribe (linj, Tinca tinca), (ii) mišice žuželk – oboje iz arhiva vzorcev Oddelka za biologijo, Biotehniške fakultete, Univerze v Ljubljani

- deli rastlin okuženih z virusom mozaika paradižnika (ToMV) – iz arhiva vzorcev Nacionalnega inštituta za biologijo, donacija dr. Magda Tušek Žnidarič

3.2 Metode

3.2.1 Tkivne rezine

V nalogi smo uporabili predhodno pripravljene vzorce iz zbirke laboratorija za elektronsko mikroskopijo na Oddelku za biologijo, Biotehniške fakultete, UL. Za evalvacijo različnih postopkov kontrastiranja smo uporabili ultratanke rezine vzorca jeter ribe in vzorca mišic žuželk. Oba vzorca tkiv sta bila predhodno fiksirana z aldehidi, postfiksirana z 1-odstotnim osmijevim tetraoksidom in vklopljena v epoksidno smolo Agar 100. Za primerjalno analizo različnih postopkov kontrastiranja smo uporabili zaporedne ultratanke rezine posameznega vzorca.

Rezine obeh vzorcev smo kontrastirali z alternativnim kontrastnim sredstvom AU Zero^TM in 0,5-odstotno raztopino svinčevega citrata. Inkubacija rezin z AU Zero^TM je pri vzorcu jeter ribe trajala 5 minut, pri vzorcu mišice žuželke pa 15 minut. Po inkubaciji smo mrežice z vzorcem spirali v šestih čašah z vodo Milli-Q. Nato smo mrežice inkubirali še v 0,5-odstotni raztopini svinčevega citrata, pri vzorcu jeter ribe 10 minut in pri vzorcu mišice žuželke 12 minut. Po inkubaciji smo rezine spirali v čaši z

(33)

15

0,1 M raztopino NaOH, v dveh čašah 0,05 M raztopine NaOH in še trikrat v vodi Milli- Q. Po končanem spiranju smo jih shranili v škatlici za shranjevanje mrežic.

Pripravljene vzorce smo primerjali s tkivnimi rezinami kontrastiranimi z 1-odstotno raztopino uranovega acetata in 0,5-odstotno raztopino svinčevega citrata, ki so bili pripravljeni po enakem postopku z enakimi inkubacijskimi časi, in s tkivnimi rezinami, ki jih nismo naknadno kontrastirali.

3.2.2 Vzorci v suspenziji

Raztopini 5-odstotne natrijeve silicij-volframove kisline in 2-odstotne fosfor- volframove kisline smo pripravili tako, da smo zatehtali ustrezne količine posameznih kemikalij in jih s pomočjo magnetnega mešala raztopili v 20 ml vode Milli-Q.

Raztopino 2-odstotne natrijeve silicij-volframove kisline smo pripravili z redčenjem 2 ml 5-odstotne raztopine v 3 ml vode Milli-Q. Po pripravi smo raztopine shranili v zaprtih stekleničkah.

Viruse mozaika paradižnika smo izolirali tako, da smo v mikrocentrifugirko prenesli 3- 4 koščke nadrobljenih delov listov okuženih rastlin in dodali približno 0,4 ml ekstrakcijskega pufra. Pufer smo iz založne raztopine odvzeli z brizgalko in ga pred dodajanjem v mikrocentrifugirko prefiltrirali skozi filter z 0,22 µm porami. S stekleno palčko smo zdrobili koščke rastline in sprostili virus iz rastlinskih celic.

Bakrene mrežice (400 mesh) s plastjo Formvarja smo naprašili s 4 nm debelo plastjo ogljika in povečali hidrofilnost površine z metodo modifikacije površine s plazmo (angl.

glow discharge) (Leica EM ACE200). Bakrene mrežice smo položili na kapljico vzorca.

Po 5 minutni inkubaciji smo mrežico dvignili s pinceto in s filter papirjem odpivnali odvečno suspenzijo, jo sprali z vode Milli-Q in odpivnali odvečno vodo. Na mrežico z vzorcem smo kanili kapljico kontrastnega sredstva in inkubirali 30 sekund. Po inkubaciji smo odvečno kontrastno sredstvo odpivnali in vzorec shranili v škatlo za shranjevanje mrežic. Postopek smo izvedli z 2-odstotno in s 5-odstotno raztopino natrijeve silicij-volframove kisline, z 2-odstotno raztopino fosfor-volframove kisline ter z 2-odstotno raztopino amonijevega molibdata. Vzorce smo primerjali z vzorci iz arhiva, ki so bili kontrastirani z 1-odstotno raztopino uranovega acetata.

(34)

16

3.2.3 Mikroskopiranje

Pregledovanje rezin in dokumentiranje rezultatov je potekalo s presevnim elektronskim mikroskopom CM 100 (Philips), opremljenim s kamero Orius SC200 (Gatan) in programsko opremo Digital Micrograph.

(35)

17

4 Rezultati in razprava

4. 1 Tkivne rezine

4.1.1 Jetra ribe

Analizirali smo jetra ribe vrste linj (Tinca tinca), ki sodi v družino pravih krapovcev. Za jetrne celice - hepatocite je značilno veliko okroglo ali ovalno jedro, najpogosteje v sredini celice. V citoplazmi je obsežno omrežje zrnatega endoplazemskega retikuluma.

Hepatociti so med seboj povezani z medceličnimi stiki dezmosomi [20]. Med hepatociti potekajo sinusoidne kapilare, ki omogočajo prenos snovi med krvjo in jetrnimi celicami.

Za evalvacijo postopkov kontrastnih sredstev smo podrobneje primerjali jedro (kromatin, jedrni ovoj in jedrne pore), zrnati endoplazemski retikulum, mitohondrije, lipidne kaplje, dezmosome in celično membrano.

(36)

18

(37)

19

Slika 1: Ultrastruktura jeder hepatocitov v jetrih ribe pri različno kontrastiranih vzorcih. (A, B) nekontrastirana rezina (arhiv laboratorija), (C, D) rezina, kontrastirana z uranovim acetatom in svinčevim

citratom (arhiv laboratorija), (E, F) rezina, kontrastirana s kontrastnim sredstvom AU Zero^TM in svinčevim citratom. Puščice na slikah B, D in F označujejo jedrne pore.

Pri nekontrastirani rezini jedro dobro ločimo od preostalega dela celice (sl. 1A).

Heterokromatin je elektronsko gostejši in daje jedru kontrast v primerjavi s citoplazmo.

Jedrni ovoj in perinuklearni prostor sta vidna, jedrne pore preprosto opazimo (sl. 1B).

Jedrni membrani sta slabše razvidni kot pri rezini kontrastirani z uranovim acetatom in svinčevim citratom (sl. 1C). Zaradi razločnih jedrnih membran pri klasično kontrastirani rezini lažje prepoznamo značilno strukturo jedrne pore, kjer se notranja in zunanja jedrna membrana stikata (sl. 1D). Pri rezini kontrastirani z AU Zero^TM heterokromatin ni tako kontrasten glede na citoplazmo (sl. 1E) kot je to videti na slikah 1A in 1C.

Področja heterokromatina v notranjosti jedra težje razločimo, dobro razvidno pa je jedrce. Jedrni ovoj je razviden, vendar membrani nista tako ostri kot pri klasično kontrastirani rezini. Perinuklearni prostor in jedrne pore lahko razločimo, slabše pa je vidna struktura jedrnih por, ki jo lahko opazimo pri ostalih dveh vzorcih (sl. 1E in 1F).

(38)

20

Slika 2: Ultrastruktura zrnatega endoplazemskega retikuluma v hepatocitih ribe pri različno kontrastiranih vzorcih. (A) nekontrastirana rezina (arhiv laboratorija), (B) rezina, kontrastirana z uranovim acetatom in svinčevim citratom (arhiv laboratorija), (C) rezina, kontrastirana s kontrastnim sredstvom AU Zero^TM in svinčevim citratom. Puščice prikazujejo membrano zrnatega endoplazemskega

retikuluma.

Zrnati endoplazemski retikulum zaradi membrane z ribosomi in elektronsko redkega lumna dobro prepoznamo od ostalih delov celice pri vseh treh različno kontrastiranih vzorcih (sl. 2). Pri nekontrastirani rezini (sl. 2A) posamezne ribosome na membrani težje razločimo kot pri kontrastiranih rezinah (sl. 2B in 2C). Opazovanje ribosomov dodatno oteži še prisotnost precipitatov.

(39)

21

Slika 3: Ultrastruktura mitohondrijev v hepatocitih ribe pri različno kontrastiranih vzorcih. (A) nekontrastirana rezina (arhiv laboratorija), (B) rezina, kontrastirana z uranovim acetatom in svinčevim citratom (arhiv laboratorija), (C) rezina, kontrastirana s kontrastnim sredstvom AU Zero^TM in svinčevim

citratom. MT - mitohondrij, N - jedro.

Pri nekontrastirani rezini je matriks mitohondrijev elektronsko gostejši od citosola in jih preprosto ločimo od ostalega dela celice (sl. 2A in 3A). Nasprotno je pri kontrastiranih rezinah elektronska gostota matriksa mitohondrija podobna kot v citosolu, zato je predvsem kontrast membran tisti, ki nam omogoči prepoznavo mitohondrija (sl. 3B in 3C). Pri vseh treh načinih kontrastiranja rezin vidimo organizacijo krist, vendar so membrane pri kontrastiranih rezinah razločnejše (sl. 2 in 3).

(40)

22

Slika 4: Ultrastruktura lipidnih kapelj v hepatocitih ribe pri različno kontrastiranih vzorcih. (A) nekontrastirana rezina (arhiv laboratorija), (B) rezina, kontrastirana z uranovim acetatom in svinčevim

citratom (arhiv laboratorija), (C, D) rezina, kontrastirana s kontrastnim sredstvom AU Zero^TM in svinčevim citratom.

Lipidne kaplje imajo homogeno vsebino in jih preprosto razločimo od ostalega dela citoplazme (sl. 4). Neenakomerna gostota vsebine nekaterih lipidnih kapelj, ki jo opazimo pri vseh treh metodah priprave rezin, je najbolj očitna pri vzorcih kontrastiranih s sredstvom AU Zero^TM in svinčevim citratom (sl. 4D). Pri rezini kontrastirani z alternativnim sredstvom vidimo, da so lipidne kaplje izrazito elektronsko gostejše v primerjavi z ostalo citoplazmo (sl. 4C). Pri nekontrastirani rezini in rezini kontrastirani z uranovim acetatom in svinčevim citratom so lipidne kaplje manj elektronsko goste (sl. 4A in 4B).

(41)

23

Slika 5: Ultrastruktura dezmosomov v jetrih ribe pri različno kontrastiranih vzorcih. . (A) nekontrastirana rezina (arhiv laboratorija), (B) rezina, kontrastirana z uranovim acetatom in svinčevim citratom (arhiv laboratorija), (C) rezina, kontrastirana s kontrastnim sredstvom AU Zero^TM in svinčevim

citratom.

Pri vseh treh metodah priprave rezin vidimo dezmosome z elektronsko gostima plakoma na citosolni strani plazmaleme ter na plak vezanim citoskeletom, ki se nadaljuje v notranjost celice (sl. 5). Na področju dezmosoma je opazna tudi elektronska gostota v medceličnem prostoru, kar je posledica večje gostote proteinov iz družine kadherinov, ki so značilni za dezmosome in omogočajo vezavo sosednjih celic [21]. Pri nekontrastirani rezini dobro razločimo medcelični prostor, ki je elektronsko redkejši od citoplazme, in plazmalemi sosednjih celic, ki sta dobro kontrastni zaradi vezave osmijevega tetraoksida (sl. 5A). Pri klasično kontrastirani rezini je medcelični prostor

(42)

24

manj vpadljiv, plazmalema pa bolj razločna (sl. 5B). Pri rezini kontrastirani z alternativnim kontrastnim sredstvom so dezmosomi opazni (sl. 5C), vendar manj kontrastni kot pri vzorcih na sliki 5A in 5B, kar pa je lahko delno tudi posledica različnih prerezov dezmosomov in ne samo tehnik kontrastiranja.

4.1.2 Mišica žuželke

Drugi vzorec, ki smo ga analizirali so bile ultratanke rezine prečnoprogastih mišic žuželk. Celice prečnoprogastih mišic so dolge in cilindrične oblike. Zanje je značilno, da imajo veliko število mitohondrijev odgovornih za zagotavljanje velikih količin energije, ki jo mišice potrebujejo za krčenje. Zaradi svoje velikosti imajo več jeder, ki so podolgovate oblike. Krčenje mišičnih celic omogočajo miofilamenti, ki so povezani v miofibrile. Sestavljeni so pretežno iz aktina in miozina, zaradi specifične razporeditev filamentov so vidni izmenjujoči se svetli in temni pasovi vzdolž mišične celice. Pri opazovanju žuželčjega tkiva smo na prerezih dobro razločili tudi traheje in traheole, ki jim omogočajo izmenjavo plinov [22].

(43)

25

Slika 6: Ultrastruktura mišice žuželk pri različno kontrastiranih vzorcih. (A) nekontrastirana rezina (arhiv laboratorija), (B) rezina, kontrastirana z uranovim acetatom in svinčevim citratom (arhiv laboratorija), (C) rezina, kontrastirana s kontrastnim sredstvom AU Zero^TM in svinčevim citratom.

Pri vseh treh rezinah je razvidna osnovna ultrastrukturna organizacija celic, miofibrile z značilnimi strukturami in mitohondriji (sl. 6). Rezina, ki je bila kontrastirana po klasičnem postopku (sl. 6B) ima v primerjavi z ostalima (sl. 6A in 6C) manj elektronsko gost matriks mitohondrijev.

(44)

26

(45)

27

Slika 7: Ultrastrukture miofibril in mitohondrijev mišice žuželke pri različno kontrastiranih vzorcih. (A, B) nekontrastirana rezina (arhiv laboratorija), (C, D) rezina, kontrastirana z uranovim acetatom in svinčevim citratom (arhiv laboratorija), (E, F) rezina, kontrastirana s kontrastnim sredstvom AU Zero^TM in svinčevim citratom. MT – mitohondriji, z belimi puščicami in črko Z so označene Z linije, s črnimi črtkanimi puščicami in črko M so označene M linije in s črnimi puščicami in črko H so označene

H linije.

Pri vseh rezinah lahko vidimo osnovno organizacijo sarkomer, ločimo in prepoznamo Z linije ter M in H linije. Pri nekontrastirani rezini ultrastruktura sarkomere in miofilamenti niso dobro razločni, saj je kontrast odvisen le od gostote proteinov in vezave osmijevega tetraoksida. Zaradi večje gostote proteinov lahko opazujemo Z in M liniji, kar nam omogoči ločitev posameznih delov sarkomere (sl. 7A in 7B). Pri klasično kontrastirani rezini in rezini kontrastirani z alternativnim kontrastnim sredstvom so ultrastrukture sarkomer in miofilamentov dobro razločne in ostre (sl. 7C in 7E), še posebej pri večjih povečavah (sl. 7D in 7F).

Pri vseh treh vzorcih mitohondrije hitro prepoznamo, notranja in zunanja membrana mitohondrijev je dobro vidna pri klasično in alternativno kontrastiranih rezinah. Pri nekontrastirani rezini se elektronska gostota matriksa mitohondrija in lumna krist med sabo ne razlikujeta veliko, vendar položaj krist vseeno lahko razberemo (sl. 7B). Na kontrastiranih rezinah lahko jasno razločimo membrano sarkoplazemskega retikuluma, ki je pri nekontrastirani rezini ne opazimo.

(46)

28

Slika 8: Ultrastruktura jedra mišice žuželke pri različno kontrastiranih vzorcih. (A, B) nekontrastirana rezina (arhiv laboratorija), (C) rezina, kontrastirana z uranovim acetatom in svinčevim citratom (arhiv laboratorija), (D) rezina, kontrastirana s kontrastnim sredstvom AU Zero^TM in svinčevim

citratom.

Jedrni membrani sta razvidni pri rezinah, kontrastiranih s klasičnim in alternativnim postopkom (sl. 8). Večji kontrast med posameznimi regijami v notranjosti jedra je prav tako viden pri obeh postopkih kontrastiranja rezin (sl. 8C in 8D). Pri rezini kontrastirani po klasični metodi ima heterokromatin veliko elektronsko gostoto in je najtemnejši v primerjavi z ostalim delom celice (sl. 8C).

(47)

29

Slika 9: Ultrastruktura traheol žuželke pri različno kontrastiranih vzorcih. (A) nekontrastirana rezina (arhiv laboratorija), (B) rezina, kontrastirana z uranovim acetatom in svinčevim citratom (arhiv

laboratorija), (C) rezina, kontrastirana s kontrastnim sredstvom AU Zero^TM in svinčevim citratom.

Puščice prikazujejo traheole.

Pri opazovanju hitinske stene trahej in traheol ne opazimo večjih razlik med vzorci (sl.

9). Zaradi njihove oblike in svetlega lumna jih hitro opazimo na tkivni rezini. Pri vseh treh uporabljenih postopkih priprave so stene trahej in traheol dobro kontrastne in ostre.

(48)

30

4. 2 Vzorci v suspenziji

4.2.1 Virus mozaika paradižnika

Pri vzorcih v suspenziji smo primerjali slike virusa mozaika paradižnika (ToMV), pridobljene po kontrastiranju virusov z različnimi kontrastnimi sredstvi. Virus mozaika paradižnika je RNA(+) virus, značilne paličaste oblike, v dolžino meri 300 nm, v širino pa 18 nm. Pri teh virusih je na posnetkih načeloma viden tudi centralni kanalček širine 4 nm [23, 24].

Slika 10: Ultrastruktura virusa mozaika paradižnika pri različno kontrastiranih vzorcih 1. del. (A, B) vzorec, kontrastiran z 1-odstotno raztopino uranovega acetata (arhiv laboratorija), (C, D) vzorec,

kontrastiran z 2-odstotno raztopino amonijevega molibdata.

(49)

31

Na posnetkih vzorca izoliranih virusov, ki so bili kontrastirani z 1-odstotno raztopino uranovega acetata, so bili virusi dobro prepoznavni, zaradi značilne paličaste oblike in velikosti (sl. 10A in 10B). Viruse se hitro in dobro razloči od ostalega materiala.

Kontrastno sredstvo je bilo razporejeno povsem ob robu virusov in manj na ostalem materialu ali pa je bilo ostalega materiala na tej mrežici manj. Vidimo oster rob virusa in značilne pravokotne robove na obeh konicah. Značilni kanalček, ki poteka po sredini paličastega virusa je opazen le pri nekaterih virusih. Nekateri virusi so bili poškodovani ali polomljeni, ponekod pa smo videli le manjše fragmente. Večinoma so bili virusi razporejeni posamezno, redkeje smo opazili agregirane viruse.

Pri vzorcu, kontrastiranem z amonijevim molibdatom kljub veliki količini materiala na mrežicah nismo imeli težav z identifikacijo virusov ToMV (sl. 10C in 10D). Opazimo oster rob virusa, prav tako lahko zelo dobro razločimo centralni kanalček. To značilno strukturo smo razločno opazili pri večini virusov kontrastiranih z amonijevim molibdatom. Viruse smo dobro razločili tudi na predelih vzorca z elektronsko gostim ozadjem (sl. 10D).

(50)

32

Slika 11: Ultrastruktura virusa mozaika paradižnika pri različno kontrastiranih vzorcih 2. del. (A) vzorec, kontrastiran z 2-odstotno raztopino fosfor-volframove kisline, (B) vzorec, kontrastiran s 5- odstotno raztopino natrijeve silicij-volframove kisline, (C, D) vzorec, kontrastiran z 2-odstotno raztopino

natrijeve silicij-volframove kisline.

Pri vzorcu, kjer smo za povečanje kontrasta uporabili 2-odstotno raztopino fosfor- volframove kisline je bilo prisotnega veliko drugega elektronsko gostega materiala in virusi so bili manj kontrastni glede na ozadje, kar je dodatno otežilo iskanje virusov (sl.

11A). Možna razlaga je, da se to kontrastno sredstvo bolj veže na druge komponente v vzorcu zato smo težko opazovali značilnosti virusa, kar je primerljivo z rezultati drugih študij [17]. Na sliki 11A je viden značilen centralni kanalček virusa, vendar ga pri uporabi tega kontrastnega sredstva največkrat nismo opazili.

(51)

33

Pri vzorcih, ki smo ju kontrastirali z 2-odstotno raztopino natrij silicij-volframove kisline (sl. 11C in 11D) ali s 5-odstotno raztopino natrijeve silicij-volframove kisline (sl. 11B) je bilo na mrežicah prisotnega veliko drugega materiala. Pri uporabi 2- odstotne raztopine smo viruse hitro prepoznali, saj so bili kljub veliki količini drugega materiala bolj kontrastni glede na okolico. Rob virusnega delca ni tako oster in kontrastno sredstvo se ni enakomerno razporedilo okrog delca kot je razvidno na posnetkih virusov, ki so bili kontrastirani z uranovim acetatom, vendar se kljub temu pri nekaterih opazi centralni kanalček (sl. 11C in 11D). Pri vzorcih, ki smo jih kontrastirali s 5-odstotno raztopino natrijeve silicij-volframove kisline smo opazili podobne rezultate kot pri 2-odstotni raztopini, le da smo opazili še precipitate (sl. 11B). Rezultati uporabe 2-odstotne ter 5-odstotne raztopine natrijeve silicij-volframove kisline in 2-odstotne fosfor-volframove kisline so primerljivi, vendar se kot kaže natrijeva silicij-volframova kislina ni v tolikšni meri vezala na ostali material, zaradi česar smo viruse lažje opazovali. Natrijeva silicij-volframova kislina in fosfor-volframova kislina vsebujeta v primerjavi z uranovim acetatom elemente z nižjim atomskim številom, zato imata manjši vpliv na sipanje elektronov in s tem na končni kontrast in ostrino vzorca.

(52)

(53)

35

5 Zaključek

V nalogi smo ovrednotili rezultate uporabe novejših alternativnih kontrastnih sredstev za presevno elektronsko mikroskopijo izbranih bioloških vzorcev, primerjavi s klasičnimi mikrografijami. Rezultati kontrastiranja rezin tkiv rib in žuželk z raztopino AU Zero^TMkažejo, da je uporabljeni postopek v splošnem primeren za kontrastiranje ultratankih tkivnih rezin analiziranih vzorcev in da z njim pridobimo mikrografije s približno enakim kontrastom kot v primeru klasičnih postopkov. S temi rezultati smo potrdili prvo hipotezo. Postopek je preprostejši za izvedbo in omogoča slikanje organelov in drugih celičnih struktur pri vzorcih živalskih tkiv, vklopljenih v smolo Agar 100. Na alternativno kontrastiranih vzorcih smo lahko opazovali organizacijo sarkomer, mitohondrije, jedra, sarkoplazemski retikulum, traheje in traheole pri vzorcu mišice žuželke in mitohondrije, endoplazemski retikulum, jedra ter dezmosome pri vzorcu jeter ribe. Razlike so bile predvsem pri kontrastiranju heterokromatina in lipidnih kapelj v hepatocitih ribe. Čeprav smo pri obeh vzorcih opazovali zaporedne rezine, smo opazili variabilnost med celicami v okviru iste rezine, kar je otežilo primerjavo rezultatov.

Natrij silicij-volframova kislina je v splošnem uporabna za detekcijo in slikanje rastlinskih virusov ToMV, uporabljeni postopek pa se ni izkazal kot najboljši za natančno opazovanje morfoloških lastnosti virusa. Tako smo potrdili le prvi del druge hipoteze. Pri 5-odstotni raztopini natrijeve silicij-volframove kisline je prišlo do tvorbe precipitatov, razen tega pa ni bilo razlik z 2-odstotno raztopino. Tako natrijeva silicij- volframova kislina kot fosfor-volframova kislina sta se izkazali za manj primerno kontrastno sredstvo za ToMV v primerjavi s klasičnimi postopki. Za boljše rezultate bi morda morali postopek izolacije virusov in kontrastiranja še optimizirati. Na mrežicah je bilo prisotnega veliko drugega rastlinskega materiala, ki je bil neenakomerno razporejen, opazili smo razlike v gostoti materiala med mrežicami, kar je otežilo primerjavo metod kontrastiranja.

V prihodnje bi lahko pri alternativnem kontrastnem sredstvu AU Zero^TM za kontrastiranje rezin uporabili različne inkubacijske čase in tako preverili, kako vplivajo na učinkovitost kontrastiranja. Preverili bi lahko še učinkovitost kontrastiranja drugih živalskih in tudi rastlinskih tkiv, ki so različna po sestavi in vzorce vklopljene v druge smole. Pri našem delu smo uporabljali neredčeno raztopino AU Zero^TM zato bi lahko ovrednotili rezultate pri nižji koncentraciji sredstva. Zanimivo bi bilo ovrednotiti ali in

(54)

36

kako se kvaliteta in učinkovitost kontrastnega sredstva s časom skladiščenja spreminjata. Pri postopku za kontrastiranje vzorcev v suspenziji bi morali v prihodnje optimizirati postopek kontrastiranja z dodatno primerjavo vzorcev, za pripravo katerih bi uporabili raztopine različnih koncentracij in različne inkubacijske čase, preverili bi lahko ali se s filtracijo pripravljenih raztopin znebimo precipitatov in kako to vpliva na končno sliko vzorca. Dodatno bi lahko ovrednotili primernost alternativnih kontrastnih sredstev za slikanje drugih virusov ali drugih vzorcev v suspenziji kot so makromolekule, proteini ter izolirani organeli, katerih lastnosti se razlikujejo od lastnosti virusov.

(55)

37

6 Literatura

[1] B. Böttcher: Transmission Electron Microscopy: Preparation of Specimens. ELS (American Cancer Society, 2012, https://doi.org/10.1002/9780470015902.a0002998.

[2] Transmission Electron Microscopy. Central Microscopy Research Facility.

https://cmrf.research.uiowa.edu/transmission-electron-microscopy (pridobljeno 18. april 2021).

[3] Mark Winey in sod. : Conventional Transmission Electron Microscopy. Molecular Biology of the Cell. 2014, 3, 319–23.

[4] N. Cortadellas, A. Garcia, E. Fernández: Transmission Electron Microscopy in Cell Biology: Sample Preparation Techniques. Unitat de Microscòpia Electrònica, Universitat de Barcelona.

[5] Cryofixation and Chemical Fixation for Electron Microscopy. Bitesize Bio.

https://bitesizebio.com/43315/cryofixation-and-chemical-fixation-for-electron- microscopy/ (pridobljeno 12. april 2021).

[6] Kuo, John. Electron Microscopy: Methods and Protocols. Springer Science &

Business Media, 2007.

[7] S. Hudoklin: Krioelektronska mikroskopija in sorodne metode presevne elektronske

mikroskopije. DLib, Digitalna knjižnica Slovenije.

https://dlib.si/details/URN:NBN:SI:DOC-9F5CHHDC/?query=

%27keywords%3dkriofiksacija%27&pageSize=25 (pridobljeno 12. april 2021).

[8] P. Roingeard in sod. : Virus detection by transmission electron microscopy: Still useful for diagnosis and a plus for biosafety. Reviews in Medical Virology. 2019, 1.

[9] M. J. Dobro in sod. :Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. V: Methods in Enzymology, let. 481, Amsterdam: Elsevier 2010, str. 63–82.

[10] H. Friedrich in sod. : Imaging of Self-Assembled Structures: Interpretation of TEM and Cryo-TEM Images. Angewandte Chemie International Edition. 2010, 43, 7850–58.

(56)

38

[11] R. Pandithage: Brief Introduction to Contrasting for EM Sample Preparation.

Leica-Microsystems. https://www.leica-microsystems.com/science-lab/brief- introduction-to-contrasting-for-em-sample-preparation/ (dostop: 10. maj 2021)

[12] S. De Carlo in sod. : Negative Staining and Cryo-Negative Staining of Macromolecules and Viruses for TEM. Micron. Oxford, England: 1993,42, 117–31.

[13] R. Harris in sod. : Recent Developments in Negative Staining for Transmission Electron Microscopy. Microscopy and Analysis. 2006, 20, 17-21.

[14] Masamichi Nakakoshi in sod. : New versatile staining reagents for biological transmission electron microscopy that substitute for uranyl acetate. Journal of Electron Microscopy. 2011, 60, 401-7.

[15] Negative staining tehniques.

http://web.path.ox.ac.uk/~bioimaging/bitm/instructions_and_information/em/neg_stain.

pdf (pridobljeno 31. julij 2021).

[16] T. Ohoka, in S. Tsuji : Specificity of ionic fixation with silicotungstic acid for cytochemical localization and identification of acetylcholine in synaptic vesicles.

Biomedical Research 9, 1988, 5, 335–41.

[17] A. Moscardini in sod. : Uranium-Free X Solution: A New Generation Contrast Agent for Biological Samples Ultrastructure. Scientific Reports 10, 2020, 1, 11540.

[18] R. W. , Horne in P. Wildy. : Virus structure revealed by negative staining.

Advances in Virus Research, 1963, 10, 101–70.

[19] UA-Zero Trouble Free EM Staining. Agar Scientific.

https://www.agarscientific.com/ua-zero (pridobljeno 16. julij 2021).

[20] Krishna, Murli : Microscopic Anatomy of the Liver. Clinical Liver Disease 2, 2013, S1, S4-S7.

[21] E. Delva in sod. : The Desmosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 1.

2009, 2.

[22] Gartner, L. P., Hiatt, J. L.: Color Atlas and Text of Histology. Lippincott Williams

& Wilkins, 2014.

(57)

39

[23] What Is Tomato Mosaic Virus. Cusabio. https://www.cusabio.com/c-21032.html (pridobljeno 1. avgust 2021).

[24] C. Fauquet, M. A. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger, L. A. Ball.: Virus taxonomy. Elsevier, 2005.