U
NIVERZA VL
JUBLJANIF
AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJODIPLOMSKO DELO
Tine Likovič
2021
U
NIVERZA VL
JUBLJANIF
AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJOUNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE KEMIJE
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
DIPLOMSKO DELO
Tine Likovič
M
ENTOR: izr. prof. dr. Drago Kočar
Ljubljana, 2021
»IZJAVA O AVTORSTVU«
»diplomskega dela«
Spodaj podpisani Tine Likovič sem avtor diplomskega dela z naslovom Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition.
S svojim podpisom zagotavljam, da:
• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom izr. prof. dr. Drago Kočar;
• sem poskrbel, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;
• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);
• sem poskrbel za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;
• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.
V Ljubljani, 27. 08. 2021 Podpis avtorja:
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
Povzetek:
V vzorcu Herbalife Nutrition sem določeval riboflavin (vitamin B2), pantotensko kislino (vitamin B5), biotin (vitamin B7) in vitamin B12 s tehniko tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC). Vsebnost pantotenske kisline sem določil z uporabo standardnega dodatka. Vsebnost riboflavina, biotina in vitamina B12 sem določal s pomočjo umeritvene krivulje. V vzorcu sem poleg vitaminov določil tudi vsebnost dveh mineralov, in sicer mangana in železa s tehniko atomske absorpcijske spektroskopije (AAS). Koncentracijo sem določil preko umeritvene krivulje. Naredil sem dve paralelki in ugotovil, da je metoda zelo ponovljiva. Ugotovil sem, da se dobljene vrednosti dobro ujemajo z deklariranimi.
Največje odstopanje dobim pri vsebnosti železa, kjer je dobljena vrednost 15 % večja od deklarirane vrednosti.
Ključne besede:
Herbalife Nutrition, B vitamini, HPLC, železo, mangan, AASDetrmination of selected vitamins and minerals in Herbalife Nutrition dietary supplement
Abstract:
In the Herbalife Nutrition sample, I determined riboflavin (vitamin B2), pantothenic acid (vitamin B5), biotin (vitamin B7) and vitamin B12 using a high-performance liquid chromatography (HPLC). I evaluated the content of pantothenic acid using a standard additive. Content of riboflavin, biotin and vitamin B12 are determined using an external standard (calibration curve). In addition, I determined the content of two minerals, manganese and iron using atomic absorption spectroscopy (AAS). The concentration was determined using a calibration curve. I made two parallels and found the method to be very reproducible. I have found that the resulting values are in good correspondence with the declared values. The largest deviation is for iron content, where the resulting value is 15%
higher than the declared value.
Keywords:
Herbalife Nutrition, B vitamins, HPLC, iron, manganese, AASKazalo
1 Uvod ... 1
1.1 Herbalife Nutrition ... 1
1.1.1 Izdelki Herbalife Nutrition ... 1
1.1.2 Opis izbranega izdelka ... 2
1.2 Izbrani analiti ... 2
1.2.1 Riboflavin... 2
1.2.2 Pantotenska kislina ... 3
1.2.3 Biotin ... 4
1.2.4 Vitamin B12 ... 4
1.2.5 Mangan ... 6
1.2.6 Železo ... 7
1.2.7 Tekočinska kromatografija ... 8
1.2.8 Atomska absorpcijska spektrometrija ... 8
2 Namen dela ... 11
3 Eksperimentalni del ... 13
3.1 Določevanje vitaminov s HPLC sistemom ... 13
3.1.1 Inštrument ... 13
3.1.2 Priprava standardnih raztopin ... 13
3.1.3 Priprava vzorca ... 14
3.2 Določevanje kovin z atomsko absorpcijsko spektrometrijo ... 14
3.2.1 Inštrument ... 14
3.2.2 Priprava standardnih raztopin ... 14
3.2.3 Priprava vzorca ... 14
4 Rezultati in razprava ... 17
4.1 Določevanje vitaminov s HPLC sistemom ... 17
4.1.1 Določevanje riboflavina ... 17
4.1.2 Določevanje pantotenske kisline ... 19
4.1.3 Določevanje biotina in vitamina B12 ... 21
4.2 Določevanje mineralov z atomsko absorpcijsko spektrometrijo ... 22
4.2.1 Določevanje mangana ... 22
4.2.2 Določevanje železa ... 23
5 Zaključek ... 25
6 Literatura ... 27
Kazalo slik
Slika 1: Riboflavin ... 3Slika 2: Pantotenska kislina ... 3
Slika 3: Biotin ... 4
Slika 4: Kobalamin ... 5
Slika 5: Superoksid dismutaza ... 6
Slika 6: Železo v hemu ... 7
Slika 7: Umeritvena krivulja za riboflavin ... 17
Slika 8: Kromatogram vzorca s ploščino za riboflavin ... 18
Slika 9: Primerjava ploščin pantotenske kisline s standardnim dodatkom ... 19
Slika 10: Primerjava drugih ploščin pantotenske kisline s standardnim dodatkom... 20
Slika 11: Kromatogram vzorca koncentracije 100 g vzorca/L ... 21
Slika 12: Umeritvena krivulja za mangan ... 22
Slika 13: Umeritvena krivulja za železo ... 23
Kazalo tabel
Tabela 1: Količinska vsebnost na 100 g vzorca ... 2Tabela 2: Raztopine standardov ... 13
Tabela 3: Koncentracije standardnih raztopin za umeritveno krivuljo ... 13
Tabela 4: Tabela z zbranimi rezultati... 24
Seznam uporabljenih kratic in simbolov
IADSA mednarodna zveza združenj za dietetiko/prehranska dopolnila HNF Herbalife Nutrition Fundation
USD ameriški dolar RE ekvivalent retinola
α-TE alfa-tokoferol (najbolj aktivna oblika vitamina E)
NE ekvivalent niacina (1 NE = 1 mg niacina oz. 60 mg triptofana) HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti
AAS atomska absorpcijska spektroskopija PDV priporočeni dnevni vnos
LDL lipoprotein majhne gostote HDL lipoprotein visoke gostote CoA koencim A
LD50 srednji smrtni odmerek oz. srednja letalna doza DNK deoksiribonukleinska kislina
UV-VIS ultravijolična-vidna svetloba FLD fluorescenčni detektor MQ mili Q
LOD spodnja meja detekcije
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
1
1 Uvod
V diplomskem delu sem kvantitativno določal izbrane vitamine in minerale prehranskega dodatka »Formula 1 Nadomestni obrok za nadzor telesne teže«, okus vanilijeva krema (ang. vanilla crème), podjetja Herbalife Nutrition.
1.1 Herbalife Nutrition
Herbalife Nutrition je vodilna blagovna znamka na področju nadomestnih obrokov za nadzor telesne teže. Je partner na mnogih športnih dogodkih in sodeluje z različnimi ekipami in zvezami. Je partner vlad in organizacij po vsem svetu, s katerimi sodeluje pri obravnavi težav z debelostjo ali pa samo pri prizadevanju za bolj zdravo skupnost (povezujejo se z mednarodnim inštitutom za biološke znanosti, IADSA) [1].
S fundacijo Herbalife Nutrition (HNF) želijo izboljšati življenja otrokom po celem svetu tako, da jim zagotavljajo zdravo prehrano in izobraževanja o prehrani. HNF vsako leto pomaga več kot 90.000 otrokom. Poleg tega je Herbalife Nutrition partner organizacijam, kot sta na primer ameriški Rdeči križ in ameriško združenje za boj proti raku [1].
1.1.1 Izdelki Herbalife Nutrition
Razvoj njihovih izdelkov vodi znanstveno vodstvo, ki je sestavljeno iz strokovnjakov na področju prehrane in zdravja. Ti aktivno sodelujejo pri razvoju izdelkov in pri programih preizkušanja. Od leta 2010 je podjetje vložilo več kot 300 milijonov USD v program Od semena do hrane. Tako je danes kar 65 % izdelkov narejenih v obratih znotraj podjetja [1].
Herbalife Nutrition ima na trgu izdelke zasnovane za pomoč pri dosegi prehranskih ciljev. Najbolj cenjeni in prodajani so njihovi proteinski napitki v obliki nadomestnih obrokov, saj je bilo v letu 2020 prodanih okoli 1,9 milijard porcij. Imajo tudi veliko izbiro prehranskih dopolnil, zeliščnih napitkov, izdelkov iz aloe in izdelke za energijo ter športno prehrano. [2].
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
2
1.1.2 Opis izbranega izdelka
V prehranskem dodatku Formula 1 Nadomestni obrok za nadzor telesne teže sem določil nekatere vitamine in minerale. Prehranski dodatek se pripravi iz 26 g prahu in 250 mL delno posnetega mleka (1,5 % mlečne maščobe) ali sojinega napitka. Obrok vsebuje 25 vitaminov in mineralov, kot prikazuje tabela 1. Za določitev vsebnosti sem si izbral 4 vitamine in 2 minerala.
1.2 Izbrani analiti
Med vitamini sem si izbral vodotopne vitamine riboflavin (vitamin B2), pantotensko kislino (vitamin B5), biotin (vitamin B7) in vitamin B12, med minerali pa mangan in železo.
1.2.1 Riboflavin
Riboflavin (slika 1) pomaga pri presnovi makrohranil, pomemben je pri zaščiti antioksidantov, prispeva k dobremu delovanju živčevja, vida, kože in sluznic.
Vitamin B2 ima glavno vlogo pri prenosu elektronov v elektronski transportni verigi (dihalni verigi), ki se dogaja v notranji membrani mitohondrija.
Pomanjkanje riboflavina ogrozi obrambni mehanizem pred oksidanti, saj se s tem zmanjša količina reduciranega glutationa, ki je pa glavni antioksidant znotraj celic [3-5].
VITAMINI Na 100 g napitka MINERALI Na 100 g napitka
vitamin A 1060 μg RE Kalij 1420 mg
vitamin D 7,9 μg Kalcij 460 mg
vitamin E 19 mg α-TE Fosfor 890 mg
vitamin K 118 μg Magnezij 431 mg
vitamin C 119 mg Železo 22 mg
Tiamin 1,2 mg Cink 12 mg
Riboflavin 0,35 mg Baker 1,7 mg
Niacin 24 mg NE Mangan 3,3 mg
Vitamin B6 1,7 mg Selen 120 μg
Folna kislina 250 μg Krom 80 μg
Vitamin B12 1,0 μg Molibden 77 μg
Biotin 73 μg Jod 230 μg
Pantotenska kislina 6,8 mg
Tabela 1: Količinska vsebnost na 100 g vzorca
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
3
Povprečni dnevni vnos (PDV) riboflavina pri odrasli osebi je med 1,1 mg in 1,3 mg. Bogati viri riboflavina so meso, mleko in mlečni izdelki, ribe ter zelena zelenjava. Zaenkrat tudi za zelo večje količine zaužitega riboflavina od PDV niso dokazali negativnih učinkov na zdravje. Dlje trajajoči nizki vnosi riboflavina privedejo do razpokanih ustnic, kotičkov ust, temnordečega jezika.
[3-5].
1.2.2 Pantotenska kislina
Pantotenska kislina (slika 2) se absorbira v črevesju in transportira do celic, kjer se je večina pretvori v koencim A (CoA), ki je pomemben pri sintezi maščobnih kislin in njihovi razgradnji ter pri prenosu acetilnih in acilnih skupin.
Vitamin B5 je pomemben pri sintezi holesterola, vitamina D, steroidnih hormonov, žolčne kisline in prostagladinov ter njim podobnim spojinam [6].
PDV pantotenske kisline pri odraslih je 5 mg. Največ ga je v oreščkih, jetrih, siru, polnozrnatih izdelkih in mesu. Raziskave na miših in podganah so pokazale da je LD50 pantotenske kisline 10.000 mg/kg. Do pomanjkanja
Slika 1: Riboflavin
Slika 2: Pantotenska kislina
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
4
pantotenske kisline pride zelo redko prav zaradi njene zastopanosti v večini živil [6].
1.2.3 Biotin
Velike količine biotina (slika 3), ki ga dobimo s hrano v telo, so kovalentno vezane na aminokislino lizin v proteinih. V želodcu proteaze in peptidaze razcepijo proteine na peptide, ki vsebujejo biotin. Za tem pa biotinidaza, ki se nahaja v pankreatični tekočini, iz teh peptidov sprosti prosti biotin [7].
Vitamin B7 je pri sesalcih prostetična skupina za nekatere karboksilaze, mednje sodi tudi acetil-CoA karboksilaza, zato vitamin prispeva k presnovi makrohranil, razgradnji esencialnih aminokislin in nastanku maščobnih kislin.
Zelo pomemben je tudi pri delovanju živčnega sistema [5, 7].
PDV biotina pri odrasli osebi je 30 μg. Največ ga je v tofuju, jetrih, cvetači, jajcih in gobah. Predoziranje biotina, tudi do 600-krat več od PDV, nima toksičnih učinkov. Pomanjkanje vitamina B7 ima lahko neugoden vpliv na imunski sistem in povzroča anoreksijo, slabost, suhe oči [5, 7].
1.2.4 Vitamin B12
Vitamin B12 je največji in najbolj kompleksen vitamin. Znanstvena uporaba izraza ˝vitamin B12˝ se običajno nanaša na cianokobalamin. Vitamin B12 predstavlja družino kemijskih substanc, ki se v organizmu pretvori v aktivno obliko kobalamin. To so cianokobalamin, hidroksokobalamin, metilkobalamin in adenozilkobalamin, kot prikazuje slika 4 [8].
Slika 3: Biotin
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
5
Vitamin B12 se iz hrane sprosti iz proteinov in se najprej v želodcu veže na protein haptokorin (ang. haptocorrin). Za tem se v dvanajstniku s pankreatičnimi proteazami odcepi od haptokorina in se v tankem črevesju veže na notranji faktor (ang. intrinsic factor). Ta kompleks nato lahko vstopa v celice sluznice z receptorji posredovano endocitozo [8].
Vitamin prispeva k zmanjšanju utrujenosti in izčrpanosti, sodeluje pri presnovi hranil, sintezi DNK, tvorbi rdečih krvničk in pretvarjanju rezervnih in transportnih oblik folne kisline v njeno učinkujočo obliko [8].
PDV vitamina B12 pri odraslih je 2,4 μg. Največ ga je v morski hrani, jajcih, mesu, mleku in mlečnih izdelkih. Že z dobrimi 45 g tune zaužijemo PDV. V
Slika 4: Kobalamin
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
6
primeru predoziranja ni dokazov o toksičnosti. Do pomanjkanja vitamina B12 lahko pride z dolgoletno strogo vegetarijansko in vegansko prehrano, kar lahko privede do slabokrvnosti in oslabelega živčnega sistema [5, 8].
1.2.5 Mangan
Mangan ima oksidacijska stanja med -3 in +7, vendar se v bioloških sistemih največ pojavljata Mn(II) in Mn(III) [9].
Absorpcija mangana je odvisna od njegovega vnosa. Če ga je v zaužiti hrani malo, se bo velik delež tega absorbiral. Poleg tega je absorpcija odvisna od spola, saj se pri ženskah absorbira signifikantno več mangana kot pri moških.
V črevesju se Mn(II) absorbira z aktivnim transportnim mehanizmom preko visokoafinitetnih kovinskih transporterjev ali pasivno difuzijo, Mn(III) pa se transportira s proteinom transferinom. V celicah ga je največ v jedru in mitohondriju, v telesu pa v jetrih, trebušni slinavki in ledvicah [9].
Mangan je komponenta metaloencimov, kot so superoksid dismutaza (slika 5, kjer je mangan označen z rumeno barvo), arginaza in piruvat karboksilaza ter je pomemben za normalno presnovo maščob, aminokislin in ogljikovih hidratov. Vključen je tudi v osifikaciji, tj. nastajanju kostnine, saj so encimi za sintezo proteoglikanov odvisni od mangana [9].
PDV mangana se pri odraslih giba med 2 in 5,5 mg. Največ ga dobimo z žiti, oreščki, ajdo, čokolado in kruhom. Že samo 46 g ajde zadosti PDV mangana.
Ob pomanjkanju pride do vnetja kože in vročinskih izpuščajev. Zaradi visokega vnosa mangana se lahko pojavi ti. manganizem (trajna nevrološka motnja zaradi toksičnosti mangana), vendar te zgornje meje še niso določili [9, 10].
Slika 5: Superoksid dismutaza
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
7
1.2.6 Železo
Obstajata dva tipa železa, ki ga dobimo s hrano. Prvi tip je železo, ki ni vezano v hem in je prisotno v rastlinski hrani ter v živalskih tkivih; drugi tip železa je vezan v hem (slika 6), tega dobimo iz hemoglobina ali mioglobina iz živalske hrane in predstavlja več kot 40 % vnosa celotnega železa ter se bolje absorbira kot železo, ki ni vezano v hem. K absorpciji vplivajo tudi drugi faktorji, na primer zaviralci absorpcije (fitati, polifenoli, kalcij in proteini) ali pa spojine, ki pospešujejo absorpcijo, kot so askorbinska kislina in mišična tkiva [11].
Slika 6: Železo v hemu
Železo sodeluje kot kofaktor pri mnogih metabolnih procesih in redoks reakcijah ter pri pomembnih življenjskih procesih, kot so sinteza DNK, prenos elektronov in kisika, dihanje, metabolizem aminokislin, maščob, alkohola, vitamina A in sulfita. PDV železa za odrasle osebe je 14 mg. Največ ga najdemo v jetrih, mesu, stročnicah in zeleni zelenjavi (špinača, grah, brokoli).
Pomanjkanje železa ogroža imunski sistem in lahko negativno vpliva na fizično zmogljivost. Tudi previsoki vnosi železa niso dobri, saj ima prooksidativne lastnosti (lahko tvori škodljive kisikove radikale), poleg tega lahko pride do okvare prebavnega trakta, trebušne slinavke, jeter in kardiovaskularnega sistema [12].
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
8
1.2.7 Tekočinska kromatografija
Tekočinska kromatografija (LC, HPLC) je tehnika, kjer ločimo različne komponente iz mešanice glede na njihovo različno porazdeljevanje med mobilno in stacionarno fazo. Mobilna faza je tekočina, ki se pomika skozi kromatografsko kolono, v kateri se nahaja trdni nosilec, na katerega je nanešena stacionarna faza, ki je trdna snov. Kolone so široke med 1 in 4 mm ter dolge med 5 in 30 cm. Osnova stacionarnih faz je polarni silikagel, ki se ga pa lahko tudi kemijsko modificira v bolj nepolarnega. Pomembnejše lastnosti, ki nam povejo, kako se bo molekulska komponenta v mešanici porazdeljevala med mobilno in stacionarno fazo, so polarnost in prisotnost nekaterih funkcionalnih skupin. Glavni deli aparature za tekočinsko kromatografijo so rezervoar za mobilno fazo, črpalka, injektor za vzorec, kromatografska kolona in detektor [13, 14].
Pri analizni kromatografiji ni pomembno samo to, da ločimo komponente, ampak, da jih na koncu tudi določimo, zato je na koncu kolone detektor.
Najpogostejši detektorji so refraktometrični, spektrofotometrični, fluorescenčni in elektrokemični. Računalnik je povezan z detektorjem, ki preko električne povezave grafično izriše signal, ki ga imenujemo kromatogram. Komponente se v kromatogramu kažejo kot kromatografski vrhovi. Ožji kot je vrh, boljša je bila ločba med njimi. Čas, ki ga komponenta potrebuje za potovanje skozi kolono, imenujemo retencijski čas. Ta podatek je kvalitativni, saj lahko po retencijskem času identificiramo posamezno komponento v mešanici. Ploščina kromatografskega vrha je pa kvantitativni podatek [13, 14].
1.2.8 Atomska absorpcijska spektrometrija
Atomska absorpcijska spektrometrija (AAS) je ena izmed najpogostejših tehnik uporabljenih v analitske namene. Na veliko se uporablja v raziskovalnih laboratorijih na področju hrane, okolja, farmacije. V analizni kemiji se uporablja za določevanje koncentracij večine kovinskih elementov in ima zelo nizko mejo zaznave, tj. pod mg/L [13, 15].
Pri AAS merimo intenziteto svetlobe, ki jo prepuščajo atomi elementov v plinastem stanju. Za vsak element so značilni določeni prehodi med osnovnim in vzbujenimi energijskimi nivoji elektronov, zaradi tega ima vsak element značilen črtast spekter [13].
Določevani elementi morajo biti v plinastem stanju in atomarni obliki.
Največkrat jih v tako stanje spravimo s plamenom, v katerega razpršujemo tekoč vzorec s kovinskimi ioni. Ti ioni pridejo v plamen in se uparijo ter
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
9
reducirajo do atomarne oblike. Pri temu lahko nastanejo tudi oksidi, ki zmanjšujejo občutljivost meritve. Najpogosteje se za plamen uporablja mešanica etin/zrak, ki ima temperaturo med 2400 in 2700 K [13].
Pri AAS atomi elementa absorbirajo svetlobo tiste valovne dolžine, ki ustreza prehodu elektronov na vzbujeno stanje, zato mora vir svetlobe sevati svetlobo ustrezne valovne dolžine. V ta namen se uporablja kot vir svetlobe žarnica z votlo katodo, ki je napolnjena z žlahtnim plinom. Katoda žarnice je prevlečena s plastjo elementa, ki ga določujemo, medtem ko je anoda največkrat iz volframa. Žarnico priklopimo na visoko napetost, kar povzroči ionizacijo žlahtnega plina med katodo in anodo. Nastali kationi priletijo na katodo in izbijejo atome iz njene prevlečene plasti, ti se pa zaradi trkov vzbudijo in sevajo značilen črtast spekter [13].
Aparatura za AAS je sestavljena iz žarnice z votlo katodo, vrtljive zaslonke (ang. chopper), plamena z vzorcem, monokromatorja in detektorja. Naloga vrtljive zaslonke je korekcija ozadja plamena. Med vrtenjem enkrat prepušča svetlobo žarnice z votlo katodo skozi plamen, drugič pa na detektor pade samo svetloba plamena [13].
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
10
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
11
2 Namen dela
Namen diplomskega dela je določiti vsebnost izbranih analitov in dobljene rezultate primerjati s podatki na etiketi izdelka.
Pri tem sem postavil hipotezo, da se bodo deklarirane vrednosti ujemale z rezultati. To hipotezo sem postavil zato, ker me zanima, če ima izdelek res tako vsebnost vitaminov in mineralov kot piše na etiketi.
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
12
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
13
3 Eksperimentalni del
3.1 Določevanje vitaminov s HPLC sistemom
3.1.1 Inštrument
Na HPLC sistemu Hewlett Packard 1100 Series sem določeval vitamine B2, B5, B7 in B12. Uporabljena sta bila UV-VIS (valovna dolžina detekcije pri 210 nm) in FLD detektor (vzbujevalna valovna dolžina pri 450 nm in emitirana svetlobna dolžina pri 530 nm). Injiciran volumen je bil 20 μL. Kolona za analizo je bila XBridge C8 (4,6×150 mm, 3,5 μm). Celotna ločba je trajala 23 min, na koncu se je kolona spirala še tri minute. Mobilna faza je imela prve tri minute in zadnje tri minute ločbe nespremenjeno sestavo (izokratska elucija).
Začetna sestava mobilne faze je bila 10 % acetonitrila in 90 % 0,1 % mravljične kisline (HCOOH). Med tretjo in dvajseto minuto ločbe se je sestava mobilne faze spreminjala tako, da se je delež acetonitrila iz 10 % poviševal na 90 %, delež 0,1 % mravljične kisline pa se je zmanjševal iz 90 % na 10 % (gradientna elucija). Pretok mobilne faze skozi kolono je bil 1 mL/min.
3.1.2 Priprava standardnih raztopin
Standarde vitaminov B2 (riboflavin, čistost je ≥ 98 %, proizvajalca Sigma), B5 (D-pantotenska kislina hemikalcium sol, čistost je ≥ 99 %, proizvajalca Sigma), B7 (biotin, liofiliziran prah, čistost je ≥ 99 %, proizvajalca Sigma) in B12 (vitamin B12, čistost je ≥ 98 %, proizvajalca Sigma) sem zatehtal in raztopil v bučki z deionizirano vodo (tabela 2), bučki z biotinom in riboflavinom sem za 20 min postavil na ultrazvočno kopel.
Za umeritveno krivuljo sem iz pripravljenih standardnih raztopin pripravil 12 raztopin s koncentracijami, kot jih prikazuje tabela 3. Od tega je šest
Tabela 2: Raztopine standardov
Tabela 3: Koncentracije standardnih raztopin za umeritveno krivuljo
ime standarda masa standarda (m) [g] volumen bučke (V) [mL] koncentracija standarda (γ) [mg/mL]
riboflavin 0,0047 100 0,047
pantotenska kislina 0,0244 25 0,976
biotin 0,0245 25 0,980
vitamin B12 0,0264 25 1,056
riboflavin, γ [mg/L] biotin, γ [mg/L] vitamin B12, γ [mg/L]
0,19 39,2 4,2
0,38 78,4 8,4
0,75 117,6 12,7
1,13 156,8 16,9
1,50 196,0 21,1
1,88 235,2 25,3
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
14
standardnih raztopin riboflavina, drugih šest pa mešanica standardnih raztopin biotina in vitamina B12.
Za pantotensko kislino sem v 10 mL bučko dodal 0,4 mL pripravljene standardne raztopine in skupaj s pripravljenim vzorcem (konc. 92,898 g vzorca/L) razredčil do oznake.
3.1.3 Priprava vzorca
Za HPLC analizo sem zatehtal 2,4582 g vzorca in ga v 25 mL bučki raztopil z deionizirano vodo ter razredčil do oznake (γ=98,328 g vzorca/L). Preden sem dal raztopino v vialo za HPLC sistem, sem jo prefiltriral skozi najlonski filter z 0,45 μm porami.
3.2 Določevanje kovin z atomsko absorpcijsko spektrometrijo
3.2.1 Inštrument
Za analizo mangana in železa sem uporabil aparaturo VARIAN Atomic Absorption Spectrometer AA240.
3.2.2 Priprava standardnih raztopin
Za analizo z AAS sem pripravil standardne raztopine železa in mangana.
Najprej sem 5 mL 1 mg/mL standardne raztopine železa (Fe(NO3)3 v 0,5 M HNO3, proizvajalca Merck) in 5 mL 1 mg/mL standardne raztopine mangana (Mn(NO3)2 v 0,5 M HNO3 proizvajalca Merck) dodal v isto 50 mL bučko in razredčil do oznake z deionizirano vodo. Nato sem vzel štiri 50 mL bučke in v prvo dal 0,5 mL prej pripravljene standardne raztopine, v drugo 1 mL, v tretjo 2 mL in v zadnjo 3 mL. V vse bučke sem dodal še 1 mL 65 % dušikove kisline (proizvajalca GPAM-MOL) in razredčil do oznake z deionizirano vodo.
Pripravljene raztopine so imele naslednje koncentracije železa oz. mangana:
0,5 μg/mL, 1,0 μg/mL, 2,0 μg/mL in 3,0 μg/mL. Pripravil sem tudi slepi vzorec tako, da sem v 50 mL bučko dodal 1 mL 65 % dušikove kisline in razredčil do oznake z deionizirano vodo.
3.2.3 Priprava vzorca
Za AAS sem v 50 mL bučko zatehtal 0,9940 g vzorca in dodal malo deionizirane vode. Za tem sem v bučko dodal 4 mL koncentrirane HCl (≥ 37
%, proizvajalec Honeywell) in jo dal na grelnik ter odstavil, ko je raztopina zavrela. Nato sem jo ohladil in prefiltriral skozi bel in črn filter papir.
Prefiltrirano raztopino sem še enkrat prefiltriral skozi najlonski filter z 0,45 μm porami. Za železo sem raztopino petkrat razredčil tako, da sem 2 mL vzorca
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
15
prenesel v 10 mL bučko ter razredčil do oznake z deionizirano vodo. Postopek sem ponovil za drugo paralelko, pri kateri sem zatehtal 1,0772 g vzorca.
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
16
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
17
4 Rezultati in razprava
4.1 Določevanje vitaminov s HPLC sistemom
4.1.1 Določevanje riboflavina
Riboflavin je spojina, ki absorbira svetlobo pri valovni dolžini 450 nm in emitira pri valovni dolžini 530 nm.
Slika 7 prikazuje umeritveno krivuljo riboflavina, po kateri sem izračunal maso riboflavina v 100 g vzorca.
Slika 7: Umeritvena krivulja za riboflavin
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
18
Kromatogram (slika 8) prikazuje dva kromatograma. Rdeč predstavlja signal UV detektorja po injiciranju vzorca, moder pa FLD detektorja prav tako po injiciranju vzorca. Riboflavin se eluira pri sedmih minutah, kjer vidim visok moder vrh. Majhen moder vrh pri petih minutah lahko predstavlja nek vodotopen vitamin, ki podobno fluorescira kot riboflavin. Izmed deklariranih vitaminov bi to lahko bil tiamin.
V enačbo umeritvene krivulje vstavim ploščino riboflavina v vzorcu in dobim:
y = 0,0071*55,63481-0,0026 = 0,3924 γ = 0,39 mg/L
Rezultat na osnovi eksperimentalnih podatkov je 0,39 mg riboflavina v 100 g vzorca. Deklarirana vrednost pa je 0,35 mg.
Slika 8: Kromatogram vzorca s ploščino za riboflavin
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
19 4.1.2 Določevanje pantotenske kisline
Pantotensko kislino sem določal z metodo standardnega dodatka. V eni 10 mL bučki sem imel standard s koncentracijo 39,04 μg/mL in vzorec s koncentracijo 92,898 g vzorca/L. V drugi 10 mL bučki sem imel samo vzorec s koncentracijo 92,898 g vzorca/L.
Na dobljenem izseku kromatograma sem opazoval ploščino vrha pri 3 min, kjer se eluira pantotenska kislina, kot prikazujeta sliki 9 in 10.
Slika 9: Primerjava ploščin pantotenske kisline s standardnim dodatkom
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
20
Rdeč izsek kromatograma predstavlja signal UV detektorja po injiciranju vzorca koncentracije 92,898 g vzorca/L, roza pa predstavlja signal UV detektorja po injiciranju standardnega dodatka in vzorca koncentracije 92,898 g vzorca/L.
Izračun koncentracije pantotenske kisline:
𝑆𝑆𝐷
𝑆𝑉𝑍= γ𝑆𝐷+ 𝛾𝑉𝑍
𝛾𝑉𝑍 𝛾𝑉𝑍 = −𝑆𝑉𝑍 ∗ γ𝑆𝐷
𝑆𝑉𝑍 − 𝑆𝑆𝐷
Iz ploščin iz slike 9 dobim 𝛾𝑉𝑍 = 1,0 mg/L, kar predstavlja 1,1 mg pantotenske kisline v 100 g vzorca.
Iz ploščin na sliki 10 dobim 𝛾𝑉𝑍 = 24,5 mg/L, kar predstavlja 26,4 mg pantotenske kisline v 100 g vzorca.
Ugotovil sem, da je v vzorcu med 1,1 mg in 26,4 mg pantotenske kisline na 100 g vzorca, kar se ujema z deklarirano vrednostjo, ki je 6,8 mg. Prave vrednosti ne dobim, ker vrhova pri treh minutah nista bila dobro ločena, zato
Slika 10: Primerjava drugih ploščin pantotenske kisline s standardnim dodatkom
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
21
točne vrednosti pantotenske kisline nisem mogel določiti. Verjetno dve spojini koeluirata, zato dobim slabo ločbo.
4.1.3 Določevanje biotina in vitamina B12
Ker je vsebnost biotina in vitamina B12 v vzorcu relativno nizka, je njuna identifikacija in kvantitativna določitev otežkočena. Kljub temu da sem pripravil zelo koncentrirano raztopino vzorca, da bi dosegel spodnjo mejo detekcije (LOD), na kromatogramu ne opazimo vrhov pri 7 min (retencijski čas za vitamin B12) in 8 min (retencijski čas za biotin) (slika 11). Rdeč je signal UV detektorja, moder pa signal FLD detektorja po injiciranju vzorca.
Vrednosti LOD biotina in vitamine B12 ocenjujem na nekaj miligramov, kar pomeni, da bi moral imeti tisočkrat večjo koncentracijo vzorca, to je 100 kg vzorca/L.
Slika 11: Kromatogram vzorca koncentracije 100 g vzorca/L
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
22
4.2 Določevanje mineralov z atomsko absorpcijsko spektrometrijo
4.2.1 Določevanje mangana
Za določitev mangana sem iz enačbe umeritvene krivulje, ki jo prikazuje slika 12, izračunal koncentracijo oz. maso mangana v vzorcu.
A = 0,1473 * γ + 0,0164 γ =𝐴−0,0164
0,1473
Meritvi absorbance za vzorec sta bili: A1 = 0,1152 in A2 = 0,1096.
γ1 = 0,671 μg/mL = 0,671 mg/L γ2 = 0,633 μg/mL = 0,633 mg/L
Obe koncentraciji predstavljata koncentraciji v približno 20 g vzorca/L, zato dobljeni koncentraciji množim s približno 5 tako, da lahko primerjam z deklarirano koncentracijo oz. maso.
γ1 = 3,37 mg/L γ2 = 2,94 mg/L
m1 = 3,37 mg na 100 g vzorca m2 = 2,94 mg na 100 g vzorca
Povprečna masa mangana na 100 g vzorca: m = 3,16 mg.
Deklarirana vrednost je 3,3 mg.
Slika 12: Umeritvena krivulja za mangan
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
23 4.2.2 Določevanje železa
Pripravljenim standardnim raztopinam sem izmeril absorbanco in iz rezultatov naredil umeritveno krivuljo, ki jo prikazuje slika 13.
A = 0,0765 * γ + 0,0062 γ =𝐴−0,0062
0,0765
Meritvi absorbance za vzorec sta bile: A1 = 0,0813 in A2 = 0,0920.
γ1 = 0,982 μg/mL γ2 = 1,122 μg/mL
Z upoštevanjem redčenja dobim koncentraciji oz. masi:
γ1 = 24,7 mg/L γ2 = 26,0 mg/L
m1 = 24,7 mg na 100 g vzorca m2 = 26,0 mg na 100 g vzorca
Povprečna masa železa na 100 g vzorca: m = 25,4 mg.
Deklarirana vrednost je 22 mg.
Slika 13: Umeritvena krivulja za železo
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
24
določevani analiti deklarirana vrednost določena vrednost odstopanje od deklarirane vrednsoti [%]
riboflavin 0,35 mg 0,39 mg 11,43
pantotenska kislina 6,8 mg 1,1 mg - 26,4 mg /
biotin 73 μg ni bilo določeno /
vitamin B12 1,0 μg ni bilo določeno /
mangan 3,3 mg 3,16 mg -4,24
železo 22 mg 25,4 mg 15,45
Tabela 4: Tabela z zbranimi rezultati
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
25
5 Zaključek
Dobljeni rezultati za riboflavin se dobro ujemajo z deklarirano vrednostjo. Metoda se mi zdi specifična, saj so spojine, ki absorbirajo in emitirajo svetlobo pri takih valovnih dolžinah kot riboflavin, redke.
Rezultati za pantotensko kislino se ujemajo z deklarirano vrednostjo, vendar pa je interval zelo širok in ni uporaben. Iz kromatogramov se vidi, da ločba spojin ni ustrezna, saj se dela vrhov prekrivata in s tem ne dobim prave ploščine vrhov, kar posledično pomeni, da ne morem ustrezno določiti vsebnosti spojine. Temu problemu bi se lahko izognil z daljšo analizo kromatografije. Mogoče bi lahko dobil boljše rezultate s spreminjanjem mobilne faze in tudi stacionarne faze.
Koncentracije vitaminov biotin in cianokobalamin zaradi njune prenizke vsebnosti v vzorcu nisem mogel določiti. Vzorec bi moral zelo skoncentrirati, da bi vitamina lahko detektiral na HPLC sistemu.
Rezultati za železo in mangan se tudi dobro ujemajo z deklariranima vrednostima.
Hipoteza glede vsebnosti izbranih vitaminov in mineralov drži, saj se dobljeni rezultati dobro ujemajo z deklariranimi vrednostmi.
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
26
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
27
6 Literatura
[1] Več o nas, Herbalife Nutrition.
https://assets.herbalifenutrition.com/content/dam/regional/emea/sl_si/consu mable_content/marketing_materials/brochure/2021/04-Apr/vec-o-nas-si.pdf (pridobljeno 09. jun. 2021).
[2] Who we are, Herbalife Nutrition. https://iamherbalifenutrition.com/who-we- are/ (pridobljeno 06. jun. 2021).
[3] M. Ashoori, A. Saedisomeolia: Riboflavin (vitamin B2) and oxidative stress: A review. British Journal of Nutrition. 2014, 111, 1985-1991.
[4] J. T. Pinto, J. Zempleni: Riboflavin. Advances in Nutrition. 2016, 7, 973-975.
[5] M. Kohlmeier: Nutrient Metabolism : Structures, Functions, and Genetics.
London: Academic Press 2003, str. 561-562, 604, 614, 617.
[6] K. S. Gregory: Pantothenic Acid. Alternative Medicine Review. 2011, 16, 263-274.
[7] J. Zempleni, S. S. K. Wijeratne, Y. I. Hassan: Biotin. Biofactors. 2009, 35, 36-46.
[8] F. Watanabe: Vitamin B12 Sources and Bioavailability. Experimental Biology and Medicine. 2007, 232, 1266-1274.
[9] EFSA NDA Panel: Scientific Opinion on Dietary Reference Values for manganese. EFSA Journal. 2013, 11.
[10] Mangan, Prehrana.si, Nacionalni portal o hrani in prehrani.
https://www.prehrana.si/sestavine-
zivil/minerali/mangan?highlight=WyJtYW5nYW4iXQ== (pridobljeno 13. jul.
2021).
[11] R. Hurrell, I. Egli: Iron bioavailability and dietary reference values. The American Journal of Clinical Nutrition. 2010, 91, 1461-1467.
[12] Železo, Prehrana.si, Nacionalni portal o hrani in prehrani.
https://www.prehrana.si/sestavine-
zivil/minerali/zelezo?highlight=WyJ6ZWxlem8iXQ== (pridobljeno 13. jul.
2021).
[13] H. Prosen, I. Kralj Cigić, M. Strlič: Praktikum iz analizne kemije. Ljubljana:
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 2018, str. 121, 122, 124.
[14] S. Moldoveanu, V. David: Essentials in Modern HPLC Separations.
Waltham, MA: Elsevier 2013, str. 2.
Tine Likovič
Določitev izbranih vitaminov in mineralov prehranskega dodatka Herbalife Nutrition
28
[15] S. L. C. Ferreira, M. A. Bezerra, A. S. Santos, Walter N. L. dos Santos, C.
G. Novaes, O. M. C. de Oliveira, M. L. Oliveira, R. L. Garcia: Atomic absorption spectrometry – A multi element technique. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2018, 100, 1-6.