DIPLOMSKO DELO

(1)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

DIPLOMSKO DELO

Lara Drinovec

Ljubljana, 2021

(2)

(3)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE BIOKEMIJA

Razvoj in uporaba elektrode z ogljikovo pasto in glukoza oksidazo za zaznavanje glukoze

DIPLOMSKO DELO

Lara Drinovec

M

ENTOR

: izr. prof. dr. Mitja Kolar

Ljubljana, 2021

(4)

(5)

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisana Lara Drinovec sem avtorica diplomskega dela z naslovom Razvoj in uporaba elektrode z ogljikovo pasto in glukoza oksidazo za zaznavanje glukoze.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom izr.

prof. dr. Mitja Kolarja;

• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

• sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, 1.9.2021 Lara Drinovec

(6)

(7)

ZAHVALA

Iskreno se zahvaljujem mentorju, izr. prof. dr. Mitji Kolarju, za vso pomoč, usmerjanje in nasvete, ki mi jih je nudil tekom raziskovalnega dela in pisanja diplomskega dela.

Poleg tega se zahvaljujem Emi Gričar, ki mi je s svojimi izkušnjami in odličnimi nasveti nudila pomoč pri eksperimentalnem delu.

Poleg njiju se zahvaljujem še preostalemu osebju Katedre za analizno kemijo.

Zahvaljujem se tudi Mihi Nosanu in doc. dr. Boštjanu Genoriu za pomoč.

Nazadnje se zahvaljujem tudi vsem članom svoje družine, ki so mi omogočili, da je moj študij potekal nemoteno in me pri njem neomajno podpirali.

(8)

(9)

Razvoj in uporaba ogljikovih elektrodnih materialov za meritve v biokemiji

Povzetek: V voltametriji so se po Hg uveljavili novi elektrodni materiali na osnovi C, Bi, Sn itd. Predvsem Bi in modifikacije C kažejo vrsto prednosti in se jih uporablja za določanje biološko pomembnih analitov, kot so na primer kovinski ioni, nitrofenoli in glukoza. Med biosenzorji imajo največji pomen senzorji za zaznavanje glukoze, katerih ključni element je glukoza oksidaza. V sklopu diplomskega dela sem študirala lastnosti elektrodnih materialov na osnovi ogljika, različne tehnike snemanja (CV, SWV, DPV, AdV) in odziv na biološko pomemben analit. Pripravila sem umeritveno krivuljo za dodatke glukoze, izračunala stehiometrijo in določila LOD.

Ključne besede: elektroda iz ogljikove paste, glukoza oksidaza, grafit, voltametrija, glukoza

The development and use of carbon-based electrode materials for measurements in biochemistry

Abstract: New electrode materials based on C, Bi, Sn, etc. have been established in voltammetry, after Hg. In particular, Bi and C modifications show a number of advantages and are used to determine biologically important analytes such as metal ions, nitrophenols and glucose. Glucose sensors with glucose oxidase are the most important among biosensors. I have studied the properties of carbon-based electrode materials, various recording techniques (CV, SWV, DPV, AdV) and the response to a biologically important analyte. I prepared a calibration curve for glucose supplements, calculated stoichiometry, and determined LOD.

Keywords: carbon paste electrode, glucose oxidase, graphite, voltammetry, glucose

(10)

(11)

KAZALO

1 Uvod ... 1

1.1 Elektrokemija... 1

1.1.1 Ciklična voltametrija ... 1

1.1.2 Uporaba elektrod v analizne namene... 3

1.2 Elektrode na osnovi ogljika ... 4

1.2.1 Grafen ... 7

1.2.2 Grafit in ogljikova pasta ... 8

1.3 Zaznavanje glukoze ... 9

1.3.1 Glukoza oksidaza ... 11

2 Namen dela in hipoteza ... 15

3 Materiali in metode ... 17

3.1 Seznam kemikalij ... 17

3.2 Instrumenti ... 18

3.3 Priprava raztopin... 18

3.3.1 Fosfatni pufer ... 18

3.3.2 Heksacianoferat ... 18

3.3.3 Raztopina H2O2 ... 18

3.3.4 Raztopina glukoze ... 19

3.4 Priprava elektrode ... 19

3.4.1 Priprava ogljikove paste ... 19

3.4.2 Disperzija N-htGONR ... 20

3.4.3 Raztopina glukoza oksidaze ... 20

3.4.4 Delovna elektroda ... 21

3.4.5 Priprava elektrokemijske celice ... 21

3.5 Meritve ... 22

3.5.1 Slepi vzorec ... 22

3.5.2 Ciklična voltametrija ... 22

(12)

3.5.3 Priprava umeritvene krivulje s H2O2 ... 23

3.5.4 Elektroda z GOX ... 23

4 Rezultati in razprava ... 25

4.1 Rezultati meritev, opravljenih s slepim vzorcem ... 25

4.2 Rezultati, dobljeni s ciklično voltametrijo ... 25

4.3 Izbira silikonskega olja ... 25

4.4 Določitev ustrezne količine disperzije ... 27

4.5 Umeritvena krivulja za H2O2 ... 29

4.6 Rezultati meritve z glukozo ... 30

4.7 Izračun LOD ... 35

5 Zaključek ... 39

6 Literatura ... 41

(13)

KAZALO SLIK

Slika 1: Preprost cikličen voltamogram reverzibilne redukcije 1 mM Fc⁺ raztopine

do Fc (levo) in spremembe potenciala v odvisnosti od časa (desno) ... 2

Slika 2: Oblike sp² hibridiziranega ogljika: (A) fuleren, (B) enostenske ogljikove nanocevke, (C) grafen, (D) grafit. ... 5

Slika 3: Princip delovanja elektrokemijskega biosenzorja z ogljikovimi nanostrukturami ... 6

Slika 4: Shema reakcije, ki jo katalizira glukoza oksidaza... 12

Slika 5: Struktura encima GOX iz glive; rdeča – FAD, modra - glikozilacije ... 12

Slika 6: Terilnica s pestilom med pripravo ogljikove paste ... 19

Slika 7: Disperzija na ultrazvočni kopeli (levo) in mikrocentrifugirki z disperzijo N-htGONR – črno in glukoza oksidazo – rumeno (levo) ... 20

Slika 8: Elektroda brez dodatnih plasti na površini (levo), elektroda med sušenjem prve plasti disperzije (na sredini) in pripravljena elektroda z dvema plastema disperzije in dvema plastema GOX (desno) ... 21

Slika 9: Pripravljena celica z vsemi elektrodami (črno – protielektroda, rdeče – delovna elektroda, modro – referenčna elektroda) in magnetnim mešalom (levo), ter z rotacijskim mešalom (desno). ... 22

Slika 10: Ciklična voltamograma dveh elektrod brez dodane disperzije. Uporabljeno silikonsko olje AP100 – modra ali AR20 – zelena ... 26

Slika 11: Ciklična voltamograma dveh elektrod z dvema plastema disperzije. Uporabljeno silikonsko olje AP100 – modra ali AR20 – rumena ... 27

Slika 12: Ciklični voltamogrami za elektrode z različnimi plastmi disperzije: brez disperzije – modra, ena plast – zelena, dve plasti – rumena, tri plasti – rdeča. ... 28

Slika 13: Reprezentativna umeritvena krivulja za dodatke H2O2 ... 29

Slika 14: Umeritvena krivulja elektrode z dvema plastema GOX, dodajanje na 100 s, mešanje z rotacijskim mešalom, odmerjanje na 1 s ... 31

Slika 15: Umeritvena krivulja elektrode z dvema plastema GOX, dodajanje na 100 s, prepihovanje s kisikom skozi celotno meritev, odmerjanje na 1 s... 32

(14)

Slika 16: Umeritvena krivulja elektrode z dvema plastema GOX, dodajanje na

200 s, uporaba magnetnega mešala, odmerjanje na 2 s ... 34 Slika 17: Izris krivulje na zaslonu v programu Nova 2.1.5, ki se izriše med merjenjem.

Z rdečimi pikicami so označena mesta, kjer je bil v raztopino dodan nov dodatek. ... 35 Slika 18: Umeritvena krivulja za izračun LOD ... 36 Slika 19: Sprememba toka ob dodajanu posameznih dodatkov ... 37

(15)

KAZALO TABEL

Tabela 1: Naklon premice umeritvene krivulje za elektrode z različnim številom

plasti glukoza oksidaze. ... 30 Tabela 2: Dodatki, ki so bili dodani v celico med meritvijo, in povprečna

izmerjena vrednost toka po vsakem dodatku glede na skupno koncentracijo

glukoze v raztopini. ... 33 Tabela 3: Dodatki pri izvedbi meritve za določitev LOD in povprečne vrednosti

toka po vsakem dodatku. ... 36 Tabela 4: Izračunane vrednosti umeritvene krivulje za izračun LOD ... 38

(16)

(17)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

AVG povprečje

CV ciklična voltametrija

E potencial elektrokemijske celice E⁰ standardni potencial vrste

F Faradayeva konstanta

FAD flavin adenindinukleotid

Fc ferocen

Fc+ ferocenin

GO grafenov oksid

GOX glukoza oksidaza (angl. glucose oxidase)

HCF heksacianoferat

HOMO najvišja zasedena molekulska orbitala LOD meja zaznavnosti (angl. limit of detection) LUMO najnižja prosta molekulska orbitala

MWCNT večstenske ogljikove nanocevke n število elektronov

N-htGONR z dušikom dopirani grafenski nanotrakovi PBS fosfatni pufer z NaCl

R univerzalna plinska konstanta RSD relativni standardni odklon

SD standardni odklon

SWCNT enostenske ogljikove nanocevke

T temperatura

(18)

(19)

Lara Drinovec, Razvoj in uporaba ogljikovih elektrodnih materialov za meritve v biokemiji

1

1 Uvod

1.1 Elektrokemija

Elektrokemija ima vedno večji pomen pri razvoju novih tehnologij. V njenem središču so reakcije, pri katerih pride do prenosa elektronov. V anorganski kemiji se pri reakcijah s prenosom elektronov največkrat navezujemo na oksidacijo ali redukcijo kovinskega kompleksa. Za primer vzemimo ferocen (Fc) in naslednjo reakcijo:

𝐹𝑐⁺+ [𝐶𝑜(𝐶𝑝^∗)₂] ↔ 𝐹𝑐 + [𝐶𝑜(𝐶𝑝^∗)₂]⁺ [1]

Prenos elektrona med dvema molekulama je v tem primeru možen samo, kadar je ta proces termodinamsko ugoden. To se zgodi, ko se energija najnižje proste molekulske orbitale (LUMO) od Fc⁺ razlikuje (je nižja) od energije najvišje zasedene molekulske orbitale (HOMO) od [𝐶𝑜(𝐶𝑝^∗)₂] (𝐶𝑝^∗ = pentametilkloropentadienil). Razlika v energiji teh dveh stanj je vodilna sila reakcije.

Elektrokemijska redukcija pa se od kemijske razlikuje. Zopet pride do prenosa elektrona, le da je tu prisotna elektroda, na kateri poteka reakcija:

𝐹𝑐⁺+ 𝑒⁻ ↔ 𝐹𝑐 [2]

Kaj je torej gonilna sila tega procesa? Elektroda je električni prevodnik, zato lahko z uporabo zunanjega vira energije dodamo napetost, s katero vplivamo na energijo elektronov na elektrodi. Najpogostejši elektrodni materiali so platina, zlato, živo srebro ali stekleni ogljik. Elektroni se iz elektrode prenesejo na Fc⁺, ko je njihova energija višja kot LUMO od Fc⁺. Ker energijo elektronov v elektrodi določa potenciostat, je potek reakcije možno nadzirati.¹

1.1.1 Ciklična voltametrija

V splošnem smislu je voltametrija vsaka tehnika, pri kateri merimo tok ob spreminjanju potenciala med dvema elektrodama. Ciklična voltametrija (CV) je pogosto uporabljena elektrokemijska metoda, s katero lahko preučujemo redukcijske in/ali oksidacijske procese. Pri metodi merimo tokovni odziv redoks aktivne raztopine na linearno ciklično spreminjanje potenciala med dvema ali več vrednostmi E. Med meritvijo analit izgubi elektron (oksidacija) ali pridobi elektron (redukcija), odvisno od smeri spreminjanja potenciala. Je uporabna metoda za hitro pridobivanje informacij o termodinamiki redoks procesov, energijskih nivojih analita in kinetiki reakcij s prenosom elektronov.

(20)

2

Potenciometrija je način merjenja električnega potenciala elektrokemične celice v statičnih pogojih (tj. brez toka). Vrnimo se na ravnotežje med feroceninom (Fc+) in ferocenom (Fc). To ravnovesje je opisano z Nernstovo enačbo, ki povezuje potencial elektrokemijske celice (E) s standardnim potencialom vrste (E⁰) in relativnimi aktivnostmi oksidiranega (Fc⁺) in reduciranega (Fc) analita v sistemu v ravnovesju. V enačbi je F Faradayeva konstanta, R univerzalna plinska konstanta, n število elektronov (v našem primeru: n=1) in T temperatura:

𝐸 = 𝐸^0′+^𝑅𝑇

𝑛𝐹𝑙𝑛^[𝐹𝑐⁺^]

[𝐹𝑐] = 𝐸^0′+ 2,3026^𝑅𝑇

𝐹 𝑙𝑜𝑔^[𝐹𝑐⁺^]

[𝐹𝑐] [3]

Nernstova enačba je učinkovit način za napovedovanje, kako se bo sistem odzval na spremembo koncentracije analita v raztopini ali spremembo elektrodnega potenciala.

Poleg tega nam razumevanje zgornje enačbe pomaga pri razumevanju voltamogramov.

Primer cikličnega voltamograma je prikazan na sliki 1.

Slika 1: Preprost cikličen voltamogram reverzibilne redukcije 1 mM Fc⁺ raztopine do Fc (levo) in spremembe potenciala v odvisnosti od časa (desno)¹

Tako kot druge voltametrične metode tudi ciklična voltametrija uporablja sistem treh elektrod, ki ga sestavljajo delovna elektroda, referenčna elektroda in pomožna elektroda.

Za izvedbo ciklične voltametrije raztopino elektrolita dodamo v elektrokemijsko celico skupaj z referenčno raztopino in tremi elektrodami. S potenciostatom se nato linearno spreminjamo potencial med delovno in referenčno elektrodo, dokler ne doseže nastavljene meje, nato pa ja spreminjamo v nasprotni smeri. Ta postopek med skeniranjem večkrat ponovimo, instrument pa v realnem času meri spreminjajoči se tok

(21)

3

med delovno in števno elektrodo. Pri voltametričnih poskusih je tok, ki nastaja, posledica prenosa elektronov med redoks zvrstjo in elektrodami. Ta se po raztopini prenaša z difuzijo in potovanjem ionov. Tako se na površini elektrode oblikuje kapacitivna električna dvojna plast, imenovana difuzijska dvojna plast. Sestavljajo jo ioni in usmerjeni električni dipoli, ki služijo za nevtralizacijo naboja na elektrodi. Izmerjeni tokovni odziv je odvisen od koncentracije redoks vrste (analita) na površini delovne elektrode. Rezultat je značilen graf v obliki »račke«, znan kot ciklični voltamogram ali ciklovoltamogram.^1,2

CV je vsekakor zelo uporabna metoda na najrazličnejših ravneh. Uporablja se na primer za kvantitativno detekcijo in modifikacijo elektrod. Diazong Ji in ostali pa so v svoji študiji naredili elektrokemijsko napravo, ki je temeljila na pametnem telefonu. S tem so prišli do več prednosti, kot so nizka cena, manjša velikost naprave in pridobivanje podatkov v realnem času. S tako napravo so lahko s CV zaznali različne koncentracije glukoze. Tak sistem bi lahko imel velik potencial za odkrivanje in spreminjanje elektrod na različnih področjih, kot so javno zdravje, spremljanje kakovosti vode in hrane.³

1.1.2 Uporaba elektrod v analizne namene

V voltametriji so se uveljavili novi elektrodni materiali na osnovi C, Bi, Sn itd. Predvsem Bi in modifikacije C kažejo vrsto prednosti in se jih uporablja za določanje biološko pomembnih analitov. Glede na vrsto analita, ki ga želimo določiti, spreminjamo tudi material elektrode in način njene priprave. Z različnimi elektrodnimi materiali lahko pridemo do manj ali bolj natančnih rezultatov, poleg tega pa elektrodni material vpliva tudi na občutljivost elektrode. Spodaj sta omenjena dva primera uporabe elektrod v praksi ter njihove značilnosti.^{4, 5, 6}

Nanostrukturirano bizmutovo filmsko elektrodo je možno uporabiti za detekcijo kovinskih ionov v sledovih. Elektrodo je potrebno prilagoditi več različnim parametrom, kot so sestava raztopine za nanašanje, tok pulznega nanašanja, trajanje impulza itd.

Občutljivost dobro pripravljene elektrode je visoka, signali pa so dobro opredeljeni in ponovljivi. V linearnem koncentracijskem območju od 20 do 100 µg/L lahko določamo koncentracije Cd(II) in Pb(II).⁴

Kot drug primer poglejmo bakreno filmsko elektrodo za občutljivo voltametrično zaznavanje nitrofenolov. Tudi tukaj je potrebno preučiti določene parametre, kot so koncentracija bakrovih ionov, pH, skeniranje potenciala, aktivacijski čas itd. Elektroda je učinkovita za zaznavanje izbranih mono-, di- in trinitrofenolov z dobro občutljivostjo v nizkem koncentracijskem območju μg/L in ugodno ponovljivostjo.⁵

(22)

4

Elektrokemijski biosenzorji imajo vrsto prednosti, kot so: preprostost, občutljivost in hiter odziv elektroanalitičnih naprav v povezavi s selektivnostjo bioloških prepoznavnih molekul. Elektrokemični biosenzorji, ki se uporabljajo v kliničnih analizah, lahko zagotovijo občutljiv in hiter odziv za analizo biomarkerjev. Pogosto uporabljeni materiali na področju biosenzorjev so nanoporozne kovine, grafen, ogljikove nanocevke in urejen mezoporozni ogljik. Nanoporozne kovine so 3D dvokontinuirane strukture s spreminjajočim premerom in dolžino por, ki imajo veliko površino, mehansko odpornost in visoko prevodnost. Elektrode so pripravljene z uporabo različnih kovin, kot so baker, srebro in paladij, večina raziskav pa se osredotoča na nanoporozno zlato. Ker imajo elektrode na osnovi ogljika izredno velik pomen na tem področju, so posebej predstavljene v naslednjem poglavju.⁶

1.2 Elektrode na osnovi ogljika

Ogljik velja za najbolj razširjen material v elektroanalizah. Pogosto navedene prednosti ogljikovih elektrod so nizka cena, široko potencialno okno, relativno inertna elektrokemija in elektrokatalitska aktivnost za različne redoks reakcije. Posebej pomembne so oksidacije in redukcije organskih in bioloških molekul v vodnih in nevodnih medijih, pri katerih so elektrokemijske lastnosti ogljikovih elektrod pogosto boljše od lastnosti žlahtnih kovin. Poleg tega je znana uporaba ogljikovih elektrod za proizvodnjo kovin, shranjevanje energije v baterijah in superkondenzatorjih ter nosilcev katalizatorjev.⁷

Različne nanomateriale na osnovi ogljika razširjeno uporabljamo, medtem ko razlogi za uporabo določenih alotropov pred drugimi niso točno določeni in so pogosto povezani s predhodnimi izkušnjami in dostopnostjo materiala. Najpogosteje uporabljene ogljikove nanostrukture pri elektroanaliznem zaznavanju temeljijo predvsem na ogljikovih atomih s hibridizacijo sp², to so ogljikove nanocevke in grafen.⁸Grafen je najnovejši član družine večdimenzionalnih ogljikovih nanomaterialov, od fulerenov kot 0-D materiala, enostenskih ogljikovih nanocevk (SWCNT) kot 1-D nanomateriala do grafita kot 3-D materiala. Grafen zapolnjuje vrzel za dvodimenzionalne ogljikove nanomateriale. slika 2 prikazuje strukture različnih ogljikovih nanomaterialov.⁹

(23)

5

Slika 2: Oblike sp² hibridiziranega ogljika: (A) fuleren, (B) enostenske ogljikove nanocevke, (C) grafen, (D) grafit.⁹

Med novejše člane skupine ogljikovih nanostruktur uvrščamo ogljikove nanodelce. Ti so veliko pozornosti pritegnili zaradi svojih elektrokemijskih in fizikalno-kemijskih lastnosti, zlasti optičnih lastnosti in elektrokemijske aktivnosti. Zaradi močne fluorescence, močne in nastavljive fotoluminiscence ter netoksičnosti in biokompatibilnosti so ogljikovi nanodelci potencialni kandidati za aplikacije na področju biološkega slikanja, biološkega zaznavanja, dostave zdravil in fotodinamičnega zdravljenja. Poleg tega so zaradi svoje velike specifične površine, visoke električne prevodnosti in izjemne elektrokemične aktivnosti primerne nanostrukture za izdelavo naprav, povezanih z energijo (tj. baterij in superkondenzatorjev), ter senzorjev. Zaradi visoke električne prevodnosti, kemične stabilnosti, velike površine in velike adsorpcijske sposobnosti različnih analitov jih pogosto uporabljamo kot modifikatorje elektrod za različne namene.¹⁰

Med ogljikove nanostrukture uvrščamo tudi kvantne pike na osnovi ogljika, ki se večinoma delijo na dve podskupini: ogljikove kvantne pike in grafonske kvantne pike.

Imajo izjemne lastnosti fotoluminiscence, nizko toksičnost, odlično biokompatibilnost in enostavno funkcionalizacijo, zaradi česar so obetavni kandidati za uporabo v biomedicinski znanosti in inženirstvu. Grafonske kvantne pike običajno pridobivamo iz grafena/grafita ali drugih grafitnih 3D-medialov s sintetičnimi pristopi od zgoraj navzdol.

Običajno so v nekajplastnih strukturah s stranskimi dimenzijami do 100 nm. Ogljikove pa večinoma pripravljamo s sintetičnimi strategijami od spodaj navzgor in imajo kroglasto obliko velikosti do 10 nm.^8,11,12

Naslednja zelo pogosto uporabljena alotropija so ogljikove nanocevke. Gre za edinstvene cevaste strukture z velikim razmerjem med dolžino in premerom. Sestavljene so iz ene

(24)

6

do deset in celo več sto koncentričnih lupin ogljikovih atomov. Neverjetne mehanske in elektrokemijske lastnosti nanocevk so posledica njihove kvazi enodimenzionalne strukture in grafitu podobne razporeditve ogljikovih atomov v lupinah. Razporeditev atomov spominja na satovje. Pri ogljikovih nanocevkah obstajata dve različni strukturni družini, večstenske ogljikove nanocevke (MWCNT) in enostenske ogljikove nanocevke (SWCNT). MWCNT so sestavljene iz koncentričnih in zaprtih grafitnih cevk z zvitimi grafitnimi listi. Vsaka ima različen premer, običajno od 2 do 25 nm, razdalja med listi pa je 0,34 nm, kar je blizu razmaku med plastmi v grafitu. SWCNT pa so izdelane iz ene same brezšivno zvite grafitne plošče, ki je v obliki valja premera 1 do 2 nm. SWCNT so nagnjene k združevanju, običajno tvorijo snope, ki so sestavljeni iz več deset do več sto vzporednih cevk, ki so v medsebojnem stiku. Ogljikove nanocevke imajo edinstvene mehanske in elektrokemijske lastnosti ter kemijsko stabilnost. Električno se obnašajo kot kovina ali polprevodnik, odvisno od strukture. Uporabljajo se na različnih področjih, kot so kemijski senzorji, shranjevanje vodikove energije, materiali za emisijo polja, podpora katalizatorjem, elektronske naprave, itd. Če se osredotočimo na aplikacije za zaznavanje, imajo ogljikove nanocevke nekaj prednosti: majhna velikost z večjo površino, visoka občutljivost, hiter odziv in dobra reverzibilnost pri sobni temperaturi kot senzor za molekule plinov; izboljšan prenos elektronov, kadar se uporabljajo kot elektrode v elektrokemijskih reakcijah, in enostavna imobilizacija proteinov z ohranitvijo aktivnosti kot potencialni biosenzorji.^13,14

Ogljikovi nanodelci in kvantne pike se v znanosti vse bolj uporabljajo, vsekakor pa sta glavni obliki ogljikovih nanostruktur, ki se uporabljata v elektroanalizah, ogljikove nanocevke in grafen, ki je opisan v nadaljevanju. slika 3 prikazuje elektrokemijski biosenzor, v katerem najdemo vse omenjene oblike.¹⁵

Slika 3: Princip delovanja elektrokemijskega biosenzorja z ogljikovimi nanostrukturami¹⁵

(25)

7

1.2.1 Grafen

Nanokompoziti, ki temeljijo na različnih vrstah grafenskih nanomaterialov, vključno z grafenom, grafenovimi oksidi (GO) in dopiranim grafenom, se pogosto uporabljajo kot materiali za različne senzorje, saj kažejo visoko občutljivost, selektivnost in stabilnost.

Grafen je razširjen dvodimenzionalni (2D) ogljikov kristal, v katerem so ogljikovi atomi razporejeni v šesterokotno mrežo, ki spominja na satovje.¹⁶ Po definiciji, ki jo priporoča Mednarodna zveza za čisto in uporabno kemijo (IUPAC), je grafen enojna plast ogljika grafitne strukture, ki opisuje svojo naravo po analogiji s policikličnim aromatskim ogljikovodikom kvazineomejene velikosti. Vendar pa takšne definicije v sedanjih raziskavah ne držijo strogo, koncept grafena je razširjen na vrsto grafitnih materialov, ki so sestavljeni iz ene ali več plasti grafena in velike količine napačno sp³-hibridiziranih ogljikih ali fizikalnih lukenj v strukturi.¹⁷

Grafen lahko sintetiziramo s pristopom od zgoraj navzdol ali od spodaj navzgor. Na splošno pristopi od zgoraj navzdol vključujejo eksfoliacijo grafita kot izhodiščnega materiala z mehanskimi, kemičnimi ali elektrokemičnimi postopki, katerih cilj je oslabiti van der Waalsove sile med plastmi grafena. Pripravo grafena z razpiranjem ogljikovih nanocevk lahko pripišemo posebni kategoriji postopkov v okviru pristopa od zgoraj navzdol. Po drugi strani pa pristopi od spodaj navzgor ustvarjajo grafen s sestavljanjem majhnih molekulskih gradnikov v eno- ali večplastne strukture grafena s pomočjo katalitičnih, termičnih ali kemičnih procesov. Med vsemi temi metodami je kemična eksfoliacija grafita na osnovi raztopine glavna strategija, s katero je mogoče pridobiti velike količine grafena, primernega za nadaljnjo molekulsko funkcionalizacijo.

GO je najpogostejši izdelek, pridobljen z eksfoliacijo grafitnega oksida po kemični poti, ima veliko defektov in kisik vsebujočih skupin, ki lahko delujejo kot katalitični aktivni centri v elektrokemijskem procesu in kot sidrišča za kovalentno ali nekovalentno funkcionalizacijo. Običajno pa je GO zaradi prekinitve sp²-vezavnih mrež izolativen. Za redukcijo GO v reducirani GO je potrebna deoksigenacijska obdelava. S tem lahko povrnemo prvotne lastnosti in dosežemo materiale, ki so do določene mere podobni prvotnemu grafenu.^16,18

Za uporabo določene vrste ogljikovega materiala v elektrokemiji je treba najprej preučiti osnovno elektrokemijsko obnašanje, da se določi več pomembnih parametrov ogljikovih elektrod. Pri grafenu lahko prenos elektronov opazujemo s CV. Pri tem lahko uporabimo redoks par, kot je [Fe(CN)6]^4-/3-, ki ima dobro definirane redoks vrhove in poznane redukcijske lastnosti. Tako anodni kot katodni maksimalni tokovi v CV so linearni s kvadratnim korenom hitrosti skeniranja, kar kaže, da so redoks procesi na elektrodah na

(26)

8

osnovi grafena pretežno nadzorovani z difuzijo. Razdalja med vrhovoma v CV za večino redoks parov s prenosom enega elektrona je precej majhna, zelo blizu idealne vrednosti 59 mV, na primer 61,5 do 73 mV (10 mV/s) za [Fe(CN)6]^4-/3-.¹⁹

Vse bolj v veljavo prihajajo tudi 3D tiskane elektrode na osnovi grafena. Te lahko uporabljamo kot alternativo postopku 3D tiskanja kovin, saj je slednji sorazmerno drag.

Tiskanje elektrod na osnovi grafena je danes mogoče v nekaj minutah s poceni in lahko dostopnimi 3D tiskalniki. Na žalost imajo te grafenske elektrode v svojem prvotnem stanju slabo elektrokemično aktivnost, lahko pa jih aktiviramo z enostavno metodo.

Aktivirane elektrode kažejo dramatično povečanje elektrokemične aktivnosti glede na redoks par [Fe(CN)6]^4-/3-, ki jo lahko opazujemo s CV.²⁰

1.2.2 Grafit in ogljikova pasta

Tudi za ogljikove atome v grafitu je značilna sp2 hibridizacija. Sestavljen je iz ogljikovih plasti s kovalentno in kovinsko vezjo znotraj vsake plasti, ki so zložene v zaporedju AB in povezane s šibko van der Wallsovo interakcijo zaradi delokalizirane orbitale π. Gre torej za več združenih plasti grafena. Grafit je anizotropen: je dober električni in toplotni prevodnik znotraj plasti zaradi kovinske vezave v ravnini, ter slab električni in toplotni prevodnik pravokotno na plasti zaradi šibkih van der Waalsovih sil med plastmi. Zaradi te anizotropije ogljikove plasti zlahka drsijo druga proti drugi, zato je grafit dobro mazivo in odličen material za svinčnike. Anizotropija je tudi razlog, da lahko grafit prehaja skozi kemijske reakcije tako, da se reaktant, ki ga imenujemo interkalat, nahaja med plastmi grafena in tvori spojine imenovane interkalacijske spojine. Grafitna interkalacijska spojina, pri kateri prihaja do prenosa naboja med interkalatom in grafitom, je običajno električno bolj prevodna od grafita. Zaradi svoje električne prevodnosti pa grafit lahko uporabimo kot elektrokemično elektrodo.²¹

V zadnjih šestdesetih letih je ogljikova pasta, postala eden najpogostejših materialov za elektrode, ki se uporablja za laboratorijsko pripravo različnih elektrod, senzorjev in detektorjev. Gre za mešanico ogljikovega (grafitnega) prahu in veziva, ki je običajno v tekoči obliki. Prah ogljika (grafit) kot glavna sestavina ogljikove paste zagotavlja pravilno delovanje elektrode ali senzorja pri elektrokemijskih meritvah. Ustrezni ogljikovi materiali morajo izpolnjevati naslednja merila: velikost delcev v mikrometrih, enakomerna porazdelitev delcev, visoka kemijska čistost in nizke adsorpcijske sposobnosti. Seveda se vrsta in kakovost uporabljenega grafita ter njegova celotna količina v mešanici ogljikove paste odražajo v vseh značilnih lastnostih mešanice.

Tradicionalne ogljikove paste vsebujejo organske tekočine, ki mehansko povezujejo posamezne grafitne delce. Vendar pa poleg te glavne funkcije vezivo kot druga glavna

(27)

9

sestavina ogljikove paste soodloča o njenih lastnostih. Parametri, ki se zahtevajo za tekočine za lepljenje, so: kemijska inertnost in elektroneaktivnost, visoka viskoznost in nizka hlapljivost, minimalna topnost v vodnih raztopinah in nemešanje z organskimi topili.²² Za veziva se uporablja različne sestavine, na primer: parafinska olja, alifatski in aromatski ogljikovodiki, silikonska olja in masti, halogenirani ogljikovodiki in podobni derivati, ter druge tekočine za lepljenje in mešana veziva.²³

Za bolj specifično uporabo je mogoče elektrodo z ogljikovo pasto tudi modificirati.

Nanodelce NiO, sintetizirane s sol-gelom, lahko uporabimo za modifikacijo elektrode iz ogljikove paste pri elektrokatalitskem voltametričnem določanju sulfasalazina.²⁴ Z bizmutovim prahom modificirana ogljikova elektroda pa je uporabna za elektrokemično analizo izbranih težkih kovin.²⁵ Lahko pa elektrodo modificiramo tudi z uporabo encima.

Z GOX modificirana elektroda z ogljikovo pasto je tako uporabna kot biosenzor glukoze.^26,27

1.3 Zaznavanje glukoze

Elektrokemijski biosenzorji imajo mnoge prednosti: preprostost, občutljivost in hiter odziv elektroanalitičnih naprav v povezavi s selektivnostjo bioprepoznavnih molekul.

Vpeljava elektrokemičnih biosenzorjev v klinično analizo lahko zagotovi občutljiv in hiter odziv za analizo biomarkerjev, pri čemer so najuspešnejši senzorji glukoze za bolnike s sladkorno boleznijo.⁶

Zaznavanje glukoze je iz dneva v dan bolj pomembno na najrazličnejših področjih. Velik pomen ima predvsem v medicini, saj je spremljanje glukoze v krvi dragoceno orodje pri obvladovanju sladkorne bolezni. Biosenzor lahko opredelimo kot enoto, ki vključuje biološki ali biološko pridobljen občutljiv element prepoznavanja, integriran ali povezan s pretvornikom. Obstajajo trije glavni deli biosenzorja. Prvi so elementi biološkega prepoznavanja, ki razlikujejo ciljne molekule v prisotnosti različnih kemikalij. Ti vključujejo receptorje, encime, protitelesa, nukleinske kisline, mikroorganizme in lektine.

Drugi del je pretvornik, ki pretvarja dogodek bioprepoznavanja v merljiv signal.

Pretvorniki so lahko elektrokemični, optični, termometrični, piezoelektrični in magnetni.

Zadnji korak pa je obdelava signala, zato potrebujemo sistem, ki pretvori signal v berljivo obliko.

Na splošno meritve glukoze temeljijo na interakcijah z enim od treh encimov:

heksokinazo, glukoza oksidazo (GOX) ali glukoza-1-dehidrogenazo. Do zdaj so bile razvite tri generacije biosenzorjev GOX. Prva generacija temelji na merjenju tvorbe peroksida in potrebuje kisik, druga uporablja dodaten mediator, ki prenaša elektrone z

(28)

10

aktivnega mesta encima na elektrodo, tretja pa temelji na neposrednem prenosu elektronov med GOX in elektrodo. GOX je standardni encim za biosenzorje, saj ima relativno večjo selektivnost za glukozo. GOX je enostavno pridobiti, je poceni in lahko prenese večje skrajnosti pH, ionske jakosti in temperature kot mnogi drugi encimi, kar omogoča manj stroge pogoje med proizvodnim procesom in relativno sproščene norme shranjevanja za uporabo pri laičnih uporabnikih biosenzorjev. Več o tem encimu sem zapisala v posebnem podpoglavju.^28,29 Lahko pa so biosenzorji glukoze tudi neencimatski in temeljijo na različnih materialih, od platine, zlata, kovinskih zlitin, nežlahtnih prehodnih kovin/kovinskih oksidov do organskih materialov, specifičnih za glukozo.³⁰ Življenjska doba elektrod je zelo odvisna od načina priprave in vrste elektrode. Encim GOX pokaže večjo aktivnost po imobilizaciji pri pH 5,5 na vzorcih, in lahko po šestih ciklih ohrani do 50 % začetne encimske aktivnosti.³¹ Če GOX imobiliziramo na površino elektrode s p-benzokinon-ogljikovo pasto tako, da z encimom obremenjeno površino prevlečemo z nitroceluloznim filmom, bo senzor stabilen več kot teden dni.²⁶ Amperometrični senzor glukoze, ki temelji na GOX, imobilizirani na elektrodi iz steklastega ogljika in modificirani z večstenskimi ogljikovimi nanocevkami, pa je lahko stabilen celo dva tedna.³² Imobilizacija pa vsekakor ne sme biti ovira pri delu.

Elektrokemični pristopek za imobilizacijo GOX na reduciranem GO je na primer izredno preprost. Imobilizacija GOX lahko dosežemo v enem samem koraku brez kakršnih koli sredstev za povezovanje ali modifikatorjev.³³ Nov pristop imobilizacije visoko selektivnega in stabilnega biosenzorja glukoze, pa temelji na neposredni elektrokemiji.

Gre za samosestavljanje GOX na reduciranem GO, kovalentno konjugiranem z magnetnimi nanodelci (Fe3O4 NP), modificiranimi na magnetno sitotiskano elektrodo.³⁴ Na občutljivost elektrod za zaznavanje glukoze pa vsekakor vpliva njihova sestava. Na elektrodi iz ogljikove paste, ki je modificirana s koloidnim zlatom lahko pričakujemo zelo nizko mejo zaznavnosti, ki znaša 0,01 mM.²⁷ Amperometrični biosenzor glukoze z uporabo GOX in modificirane grafitne elektrode s kvantnimi pikami (ZnS -CdS) pa nakazuje na še višjo občutljivost z mejo zazavnosti 3,0 µM.³⁵ Nenehen napredek na področju nano materialne znanosti pa je privedel tudi do moduliranja lastnosti nanomaterialov na nadzorovan in zaželen način ter njihovo vse pogostejšo uporabo v elektrokemiji. V tem smislu so nanomateriali, vključno z materiali na osnovi ogljika, kovinami in kovinskimi oksidi ter kompozitnimi materiali, pritegnili veliko zanimanje za konstrukcijo elektrokemičnih biosenzorjev glukoze, ki kažejo dobre rezultate z zelo dobro ponovljivostjo, stabilnostjo in izboljšano občutljivostjo.³⁶

(29)

11

Pri elektrodah za zaznavanje vodikovega peroksida (H2O2) se pogosto srečamo z manganovimi oksidi. Modificirana grafitna elektroda prevlečena z manganovim oksidom, je lahko uporabljena kot senzor H2O2 glede na njeno elektrokatalitično aktivnost za oksidacijo H2O2 v amonijevem pufru (pH 9,0).³⁷ Z manganovim dioksidom (MnO2) pa lahko modificiramo tudi elektrodo z ogljikovo pasto na osnovi parafinskega olja in grafitnega prahu. Poleg tega k boljšim karakteristikam elektrode prispevamo tudi tako, da elektrodo površinsko spremenimo z večstenskimi ogljikovimi nanocevkami (MWCNT).

Skeniranje z elektronsko mikroskopsko karakterizacijo v kombinaciji z energijsko disperzijsko rentgensko spektrometrijo sestavljenih materialov potrjuje, da so mediatorji, delci MnO2, naključno porazdeljeni po površini MWCNT. Elektrode s kompoziti iz MnO2-MWCNT ali Pt-MWCNT so odlični voltametrični senzorji bodisi za določanje H2O2 bodisi za določanje glukoze preko H2O2 v izbranih vzorcih po dodatni modifikaciji ustreznih senzorskih površin z GOX.³⁸

1.3.1 Glukoza oksidaza

Encim glukoza oksidaza (GOX) je oksidoreduktaza, ki katalizira oksidacijo glukoze v H2O2 in D-glukono-δ-lakton. Sistematično ime za GOX je β-D-glukoza:kisik 1- oksidoreduktaza. Encim proizvajajo različne vrste gliv in celo nekatere žuželke. GOX je bil prečiščen iz različnih glivnih virov, predvsem iz rodov Aspergillus in Penicillium, od katerih se za proizvodnjo GOX najpogosteje uporablja A. niger. GOX katalizira oksidacijo β-D-glukoze v glukonsko kislino z uporabo molekularnega kisika kot akceptorja elektronov s hkratno proizvodnjo H2O2. To reakcijo lahko razdelimo na reduktivno in oksidativno fazo, kakor je prikazano na sliki 4. V reduktivni fazi GOX katalizira oksidacijo β-D-glukoze v D-glukono-δ-lakton, ki se neencimsko hidrolizira v glukonsko kislino. Nato se obroč flavin adenin dinukleotida (FAD) v GOX reducira do FADH2. Pri oksidativni fazi pa se reducirana GOX ponovno oksidira s kisikom, pri čemer nastane H2O2.

(30)

12

Slika 4: Shema reakcije, ki jo katalizira glukoza oksidaza³⁹

GOX iz askomicet je dimerni glikoprotein, sestavljen iz dveh identičnih polipeptidnih verig, ki sta kovalentno povezani z disulfidnimi vezmi. Struktura encima je predstavljena na sliki 5. Struktura GOX iz P. amagasakiense kaže, da vsaka njegova podenota vsebuje tesno vezano, vendar ne kovalentno povezano molekulo FAD kot kofaktorja. Ključni ohranjeni aminokislinski ostanki na aktivnem mestu GOX iz P. amagasa-kiense so Tyr73, Phe418, Trp430, Arg516, Asn518, His520 in His563. Arg516 je odločilna aminokislina za učinkovito vezavo β-D-glukoze z GOX.

Slika 5: Struktura encima GOX iz glive A. niger; rdeča – FAD, modra - glikozilacije⁴⁰

(31)

13

GOX je zelo specifičen za β-D-glukozo in je le malo aktiven na druge sladkorje.

Optimalni pH za delovanje encima se giblje med 5,0 in 7,0. Optimalna temperatura je med 25-30 °C in 40-60 °C. Razpolovni čas GOX pri 37 °C je približno 30 minut, zato za delo z encimom pri tej temperaturi pogosto uporabimo imobilizacijo. Glikozilacija lahko znaša od 11 do 30 masnih % skupne molekulske mase, odvisno od vrste GOX in gostitelja, pri katerem prihaja do izražanja encima. Glavni inhibitor je H2O2, ki encim onesposobi z oksidacijo ključnih metioninskih ostankov. Drugi inhibitorji so glukonska kislina in dvovalentni kationi (Cu²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺, Pb²⁺) s koncentracijo nad 50 mM.

Interakcija monovalentnih kationov z GOX bi lahko vodila do bolj kompaktnega encima, kar bi povečalo njegovo stabilnost pred termično denaturacijo. Pod koncentracijo 1 M dvovalentni kationi, kot sta Ca²⁺ ali Mg²⁺, lahko encim stabilizirajo, medtem ko nad 2 M povzročijo disociacijo GOX.

GOX se uporablja na najrazličnejših področjih, in sicer v proizvodnji hrane, nizkoalkoholnih vin in izdelkov za ustno higieno, v tekstilni industriji, za proizvodnjo glukonske kisline in v elektrokemiji za biosenzorje glukoze. ^39,40,41

(32)

(33)

15

2 Namen dela in hipoteza

V biokemiji in biomedicini so vse bolj pomembni senzorji za zaznavanje glukoze. S preizkušanjem različnih parametrov sem želela optimizirati elektrodo, ki bi jo bilo mogoče uporabiti za določanje koncentracije glukoze v raztopini.

Najprej je bilo potrebno izbrati pravo silikonsko olje za pripravo ogljikove paste. Na elektrodno površino sem nato nanesla disperzijo in encim glukoza oksidazo. Določiti je bilo potrebno, koliko plasti določene komponente in v kakšni koncentraciji je potrebno nanesti na elektrodno površino za optimalno delovanje senzorja in čim boljšo občutljivost.

Na koncu je bilo potrebno merjenju prilagoditi še nekaj ostalih komponent, kot so način mešanja, čas odmerjanja in čas med dodajanjem novih dodatkov. Namen je bil optimizirati celoten postopek tako, da sta stehiometrija meritve z H2O2 in glukozo in LOD čim nižja.

Hipoteza: Elektroda, ki je prekrita z GOX, omogoča zaznavanje mikromolarne koncentracije glukoze v vodni raztopini. Za to, da se sprosti in zazna ena molekula H2O2, je potrebnih več molekul glukoze.

(34)

(35)

17

3 Materiali in metode

Eksperimentalno delo sem opravila na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerze v Ljubljani, na katedri za analizno kemijo.

3.1 Seznam kemikalij

Pri eksperimentalnem delu sem uporabila naslednje kemikalije:

• D-(+)-glukoza: Sigma; čistost ≥ 99,5 %

• Dinatrijev hidrogenfosfat, brezvodni: Fluka, BioChemika MicroSelect; čistost

> 99,5 %

• Glicerol: Sigma-Aldrich

• Glukoza oksidaza: Sigma-Aldrich

• Grafit: Sigma-Aldrich; velikost delcev < 20 µm

• H2O2: Sigma-Aldrich 30%

• Kalijev heksacianoferat (II) – trihidrat: Kemika; čistost ≥ 99 %

• Kalijev heksacianoferat (III): Kemika; čistost ≥ 99 %

• Manganov (IV) oksid: Sigma-Aldrich; čistost ≥ 99 %

• Nafion (raztopina perfluorirane smole, ki vsebuje Nafion): Sigma-Aldrich

• Natrijev dihidrogenfosfat monohidrat: Merck; čistost > 99 %

• S sistemom Millipore–MilliQ plus prečiščena voda, upornost večja od 18 MΩ

• Silikonsko olje AP 100: Sigma-Aldrich;

• Silikonsko olje AR 20: Sigma-Aldrich;

• Z dušikom dopirani grafenski nanotrakovi (N-htGONR): sintetizirani v raziskovalni skupini doc. dr. Boštjana Genoria

(36)

18

3.2 Instrumenti

Za merjenje pH fosfatnega pufra sem uporabila pH meter Metrohm (781 pH/ion Meter) z elektrodo Metrohm 6.0259.100 v 3M KCl. Za izvedbo meritev sem uporabljala program Nova 2.1.5. Delovno elektrodo sem pripravila sama, uporabila pa sem tudi referenčno elektrodo Metrohm 6.0750.100, Ag,AgCl/3M KCl in protielektrodo iz platinaste žičke.

Meritve sem izvajala na potenciostatu Autolab PGSTAT302N, pri nekaterih meritvah sem uporabila tudi magnetno mešalo Metrohm 728 Stirer. Pri pripravi disperzije sem uporabila ultrazvočno kopel Sonis 4, Iskra Pio.

3.3 Priprava raztopin

3.3.1 Fosfatni pufer

Fosfatne pufre sem pripravljala iz soli, pridobljenih iz komercialnih virov. Za razredčevanje, izpiranje in pripravo vseh raztopin sem uporabljala dvakrat destilirano vodo, prečiščeno s sistemom Millipore–MilliQ plus. Najprej sem pripravila 100 mM raztopini NaH2PO4 in Na2HPO4, ter jih mešala v ustreznih razmerjih za pridobitev pufra z želeno pH vrednostjo za meritve. Zmešala sem 200 mL raztopine NaH2PO4 in 800 mL raztopine Na2HPO4. Pričakovana pH vrednost končnega pufra je bila 7,4. Vrednost sem potrdila z merjenjem na pH metru proizvajalca Metrohm (781 pH/ion Meter). Založno raztopino pufra PBS sem hranila dobro zaprto, pri temperaturi 23±1 °C in jo kasneje uporabila za pripravo vseh ostalih raztopin.

3.3.2 Heksacianoferat

Za ciklično voltametrijo sem izbrala redoks par [Fe(CN)6]^4-/3-. Heksacianoferat(II) in heksacianoferat(III) sem zmešala v molskem razmerju 1:1. Natehtala sem 633,6 mg heksacianoferata(II) in 493,9 mg heksacianoferata(III), ter ju raztopila v 30 mL pufra PBS. Končna koncentracija raztopine heksacianoferata je 50 mM.

3.3.3 Raztopina H2O2

Raztopino H2O2 sem uporabila za pripravo umeritvene krivulje na elektrodi brez glukoza oksidaze. Uporabila sem 6% založno raztopino H2O2 in jo redčila do končne koncentracije 100 mM. To sem storila tako, da sem 1,56 ml založne raztopine odpipetirala v 25 ml bučko in jo s pufrom PBS dopolnila do oznake. Za dodajanje v celico sem potrebovala raztopini H2O2 v koncentracijah 1 mM in 5 mM. Obeh raztopin sem si pripravila po 10 ml in sicer tako, da sem v prvem primeru odpipetirala 0,1 ml vnaprej

(37)

19

pripravljene 100 mM raztopine, v drugem primeru pa 0,5 ml. Te redčitve sem vsakič pripravila znova, saj H2O2 v nižjih koncentracijah ni tako obstojen in bi bile spremembe toka prenizke, rezultati na netočni.

3.3.4 Raztopina glukoze

Raztopino glukoze sem uporabila za pripravo umeritvene krivulje pri elektrodi, na katero sem nanesla glukoza oksidazo. Pripravila sem si 100 ml 0,2 M založne raztopine glukoze.

Molska masa uporabljene glukoze je bila 180,16 g/mol in sem jo odčitala iz embalaže. V 100 ml sem tako raztopila 3,6 g glukoze. Tudi v tem primeru sem si pripravila različna redčenja in sicer končnih koncentracij 20, 50, 100 in 200 mM. Razredčene raztopine sem hranila zaprte, ker je glukoza zelo stabilna, pa sem iste raztopine uporabljala več dni zaporedoma.

3.4 Priprava elektrode

3.4.1 Priprava ogljikove paste

Za pripravo paste sem potrebovala tehtnico, pipeto in terilnico s pestilom. Natehtala sem 1,3 g grafita, ga prenesla v terilnico in zraven odpipetirala 980 µL silikonskega olja. S pestilom sem obe komponenti združila v pasto in gnetla dolgo časa, da je bila zmes čimbolj homogena. Pri delu sem uporabljala dva različna tipa silikonskega olja, in sicer AR 20 in AP 100. Vsakega sem uporabila za pripravo svoje paste in kasneje primerjala, kako izbira tipa olja vpliva na obnašanje elektrode. Na sliki 6 je prikazana terilnica s pestilom.

Slika 6: Terilnica s pestilom med pripravo ogljikove paste

(38)

20

Po tem, ko sem pripravila pasto, sem jo prenesla v čašo, ki sem jo pokrila s parafilmom.

Čašo s pasto sem hranila v hladilniku.

3.4.2 Disperzija N-htGONR

Za pripravo 250 µl disperzije N-htGONR nanodelcev sem v čisto mikrocentrifugirko odpipetirala:

• 100 µl MnO2 koncentracije 1 mg/ml, raztopljenega v etanol/voda (1:1)

• 100 µl N-htGONR koncentracije 1 mg/ml, raztopljenega v etanol/voda (1:1)

• 25 µl nevrtaliziranega nafiona v 25 % amonijaku

• 25 µl glicerola v vodi s koncentracijo 5 mg/ml

Po dodatku vseh sestavin sem mikrocentrifugirko zaprla in vsebino obdelala z ultrazvokom na ultrazvočni kopeli v času 5 minut, kar je prikazano na sliki 7. Zaprto mikrocentrifugirko sem hranila v temi pri sobni temperaturi.

Slika 7: Disperzija v ultrazvočni kopeli (levo) in mikrocentrifugirki z disperzijo N- htGONR – črno in glukoza oksidazo – rumeno (levo)

3.4.3 Raztopina glukoza oksidaze

Raztopino glukoza oksidaze (GOX) sem pripravila v koncentraciji 20 mg/ml. Na mikrotehtnici sem natehtala 10,6 mg GOX in dodala 25 µl nafiona. Nato sem dodala še

(39)

21

500 µl pufra. Pripravljeno raztopino sem hranila v hladilniku. Če je minilo več kot teden dni časa, sem raztopino ponovno pripravila, saj aktivnost encima s časom upada.

3.4.4 Delovna elektroda

Za pripravo elektrode sem uporabljala teflonsko držalo. Najprej sem odprtino napolnila z ogljikovo pasto in pri tem pazila, da pasta pokriva celotno odprtino in je dobro zbita skupaj in ne vsebuje zraka. Nato sem površino elektrode dobro spolirala. Rob holderja mora biti kar se da čist, zato sem ga obrisala s papirnato brisačko in izopropanolom. Pri tem sem pazila, da se nisem dotikala elektrodne površine. Nato sem elektrodo obrnila s površino navzgor in jo pritrdila s stojalom. S pipeto sem nato na površino elektrode dodala 10 µl disperzije in počakala, da se kapljica posuši. Ta postopek sem ponovila 1x, 2x ali 3x, odvisno od meritve. Za tem pa sem enako dodajala različno število plasti po 10 µl raztopine GOX, kjer je bilo to potrebno. V vseh korakih nanašanja plasti na elektrodno površino sem bila previdna, da se s pipeto ne bi dotaknila elektrodne površine in jo opraskala. Na sliki 8 je prikazana pripravljena elektroda.

Slika 8: Elektroda brez dodatnih plasti na površini (levo), elektroda med sušenjem prve plasti disperzije (na sredini) in pripravljena elektroda z dvema plastema disperzije in dvema plastema GOX (desno)

3.4.5 Priprava elektrokemijske celice

Elektrokemijsko celico in vse elektrode sem pred uporabo vsakič dobro sprala z MQ H2O.

V celico sem odpipetirala 20 ml pufra PBS. Ko sem delala brez GOX, sem pufer pred meritvijo prepihovala z argonom. Pri eni meritvi sem raztopino prepihovala s kisikom.

(40)

22

Slika 9: Pripravljena celica z vsemi elektrodami (črno – protielektroda, rdeče – delovna elektroda, modro – referenčna elektroda) in magnetnim mešalom (levo), ter z rotacijskim mešalom (desno).

V celici so bile tri elektrode: delovna elektroda (elektroda z grafitno pasto), referenčna elektroda (Metrohm 6.0750.100, Ag,AgCl/3M KCl) in protielektroda (platinasta žička), ki naj bi segale vse do enake višine. Zadnja komponenta pa je mešalo. Optimalno mešanje je moč doseči z magnetnim mešalom; uporabila sem magnetno mešalo Metrohm 728 Stirer. Namesto tega sem v nekaterih primerih uporabila tudi rotacijsko mešalo, ali pa sem do mešanja raztopine prišla s prepihovanjem. Na sliki 9, levo je prikazana pripravljena celica z vsemi elektrodami.

3.5 Meritve

Vse meritve sem izvedla na potenciostatu Autolab PGSTAT302N z uporabo programa Nova 2.1.5.

3.5.1 Slepi vzorec

Pred vsako meritvijo sem na vsaki novo pripravljeni elektrodi opravila meritev s slepo probo. Izvedla sem 5 ciklov merjenja s spreminjanjem vrednosti potenciala med -0,2 V in 1,0 V. Če je bilo z elektrodo vse vredu, je bilo dovolj, da sem meritev opravila enkrat.

3.5.2 Ciklična voltametrija

Za CV sem v raztopino pufra PBS v celici, ki sem jo predhodno dobro prepihala z argonom čistosti 5,0, dodala 1 ml pripravljene raztopine 50 mM HCF. Končna

(41)

23

koncentracija v celici je bila 5,0 mM. Na začetku sem meritev izvajala od potenciala - 0,3 V do 1,0 V, nato pa sem potencialno okno zožila glede na dobljene rezultate. Hitrost skeniranja je bila v vseh primerih 100 mV/s. Tudi tukaj sem posnela več ciklov meritev.

Po končani meritvi sem raztopino HCF v celici odlila in dobro sprala celico ter vse elektrode. Za nadaljnje meritve sem celico ponovno napolnila z 20 ml svežega pufra PBS.

3.5.3 Priprava umeritvene krivulje s H2O2

Za pripravo umeritvene krivulje, sem v celico med meritvijo dodajala različne količine raztopin H2O2. Meritev sem izvajala pri 0,65 V z odmerjanjem na 1 s. Na začetku meritve sem počakala, da se krivulja spusti, nato pa sem začela z dodajanjem dodatkov. Prav tako sem čakala določen čas med posameznimi dodatki. Dodatki so se razlikovali glede na meritev, na primer 1 µM, 2,5 µM, 5 µM in 10 µM. Tu sem raztopino lahko prepihovala z argonom, saj v raztopini ne potrebujemo kisika.

3.5.4 Elektroda z GOX

Za pripravo umeritvene krivulje za elektrodo z GOX sem v celico enako kot v prejšnjem primeru med meritvijo dodajala raztopine glukoze različnih koncentracij. Meritev sem izvajala pri 0,65 V z odmerjanjem na 1 s ali 2 s. Na začetku meritve sem tudi tukaj počakala, da se krivulja spusti, nato pa sem začela z dodajanjem dodatkov. Prav tako sem čakala določen čas med posameznimi dodatki, ki sem ga od meritve do meritve nekoliko spreminjala. Koncentracije dodatkov glukoze so se razlikovale glede na meritev. Pri eni meritvi sem ves čas raztopino prepihovala s kisikom čistosti 5,0.

(42)

(43)

25

4 Rezultati in razprava

4.1 Rezultati meritev, opravljenih s slepim vzorcem

S snemanjem meritve slepe probe sem vsakič znova lahko preverila, če vse v celici deluje pravilno. Pri tej meritvi je bil zelo opazen šum, ki se je pojavil zaradi magnetnega mešala in sem ga poskusila kar se da zmanjšati. V nekaterih primerih je bil šum zelo moteč, zato sem za mešanje raje uporabila rotacijsko mešalo ali simulirala mešanje s prepihovanjem.

V nekaterih primerih pa se je kasneje pri pripravi umeritvenih krivulj izkazalo, da to mešanje ne zadošča in sem kljub šumu dobila boljše rezultate, ko sem mešala z magnetnim mešalom. Poleg tega se s cikliziranjem elektrode izboljša tudi njena odzivnost.

4.2 Rezultati, dobljeni s ciklično voltametrijo

Z uporabo ciklične voltametrije sem preverila, kako dobro so elektrode pripravljene.

Predvsem na začetku je meritev včasih pokazala nepričakovane rezultate, čeprav na elektrodni površini ni bilo vidnih nepravilnosti. Razlog za to je bil najverjetneje v tem, da je ob stiku z žico ostalo nekaj zraka, ki je motil delovanje elektrode. Poleg tega sem opazila nepravilno delovanje elektrod, ki so bile nenamerno poškodovane po površini.

Ker je potrebno po elektrodni površini razmazati zelo majhen volumen (10 µL disperzije ali raztopine z GOX), se lahko hitro zgodi, da se površina opraska. To se je zgodilo, če sem se je dotaknila s pipeto, zato sem morala biti pri tem delu zelo pozorna in natančna.

Pri opravljenih meritvah sem opazovala vrhova, in če sta se približevala idealni razdalji v vrednosti 59 mV, sem s tem potrdila, da je elektroda dobro pripravljena. V večini primerov sem dobila krivuljo v obliki »račke«, kot je pričakovano. Če je bilo na krivulji moč opaziti kakšno izboklino, sem lahko sklepala, da je v raztopini še nekaj, kar moti meritev. Največkrat je šlo za kisik, kar je pomenilo, da bi lahko raztopino bolj prepihala z argonom. S prepihovanjem sem namreč zmanjšala vsebnost kisika v raztopini.

4.3 Izbira silikonskega olja

Pri pripravi grafitne paste sem uporabila dve različni silikonski olji. Zanimalo me je, katero olje je boljše za pripravo elektrode, zato sem z obema pastama izmenično opravila meritev CV. Kot prikazuje slika 10, je med obema silikonskima oljema zelo malo razlike.

Za malenkost boljše se je izkazalo olje AR20, saj sta vrhova v tem primeru nekoliko bolj

(44)

26

skupaj. Če primerjamo razliki med vrhovoma pri olju AP100, ki znaša 0,36 V in olju AR20, ki znaša 0,31 V, je razlika še bolj opazna.

Slika 10: Ciklična voltamograma dveh elektrod brez dodane disperzije. Uporabljeno silikonsko olje AP100 – modra ali AR20 – zelena. Os x predstavlja vrednost dodanega potenciala, os y predstavlja izmerjen tok

Zanimalo me je tudi, kako bo izbira olja vplivala na krivuljo, če na elektrodno površino nanesemo dve plasti disperzije. Kot prikazuje slika 11, tudi v tem primeru pridemo do zelo podobnih rezultatov, razlika med vrhovi pa je pri obeh krivuljah približno enaka.

Šum je večji pri elektrodi z oljem AP100. Za nadaljnje delo bi torej lahko uporabila katerokoli olje in prišla do zelo podobnih rezultatov, vseeno pa sem se odločila, da za vse nadaljnje poskuse uporabim pasto iz olja AP100. Razlog za to je bil v pasti, pripravljeni iz olja AR20, saj so v tem primeru kapljice olja pri pripravi elektrode odstopale. Olje AR20 nima prave teksture in je preveč mazavo. Taka elektroda tako ni obstojna dovolj dolgo časa in senzor nima pogoja za stabilen odziv.

(45)

27

Slika 11: Ciklična voltamograma dveh elektrod z dvema plastema disperzije. Uporabljeno silikonsko olje AP100 – modra ali AR20 – rumena. Os x predstavlja vrednost dodanega potenciala, os y predstavlja izmerjen tok

4.4 Določitev ustrezne količine disperzije

Da bi opredelila, koliko plasti po 10 µl disperzije je najbolje uporabiti, sem posnela ciklične voltamograme za elektrode brez, z eno, dvema ali tremi plastmi disperzije, kot je prikazano na sliki 12.

Grafenski material, ki sem ga uporabila za pripravo disperzije, so z dušikom dopirani grafenski nanotrakovi, ki so jih sintetizirali v raziskovalni skupini doc. dr. Boštjana Genoria v dvostopenjskem postopku. V prvem koraku so po izboljšanem Hummerjevem postopku⁴² iz MWCNT z oksidativnim odpiranjem pripravili nanotrakove grafenskega oksida, ki so jih v drugem koraku s pirolizo v amonijakovi atmosferi dopirali z dušikom.

Tak material ima veliko dušikovih funkcionalnih skupin, izmed katerih je največ piridinskih, ki so tudi najbolj elektroaktivne. Sintezni postopek in karakterizacija je podrobno opisana v literaturi ⁴³.

(46)

28

Slika 12: Ciklični voltamogrami za elektrode z različnim številom plasti disperzije: brez disperzije – modra, ena plast – zelena, dve plasti – rumena, tri plasti – rdeča. Os x predstavlja vrednost dodanega potenciala, os y predstavlja izmerjen tok

Pri teh meritvah se vpliv disperzije najbolj opazi, če primerjamo elektrodo brez in elektrodo z eno plastjo disperzije. Vrhova se po dodatku disperzije pomakneta bolj skupaj in postaneta bolj ostra. Ko dodamo naslednjo plast disperzije, razlika med ciklovoltamogramoma ni velika, a kljub temu pripomore k temu, da se vrhova še malenkost približata. Ko so na elektrodi tri plasti disperzije, pa imajo te že slabši učinek.

Vrhova sta sicer malenkost bolj skupaj, a je njuna amplituda manjša, poleg tega pa se krivulja pri višjih potencialih začne zopet vzpenjati, namesto da bi padala. Poleg tega pri dodajanju treh plasti disperzije potrebujemo veliko časa, saj se mora vsaka plast posebej posušiti in pri tretji plasti lahko to traja več kot 20 ali celo 30 minut. Da bi pospešila sušenje, sem v nekaterih primerih površino elektrode prepihala z argonom, kar je pospešilo izhlapevanje. Glede na te rezultate in opažanja sem zato sklepala, da je najbolje na elektrodi uporabiti dve plasti disperzije.

(47)

29

4.5 Umeritvena krivulja za H

2

O

2

Preden sem pričela z delom z glukozo, sem pripravila umeritveno krivuljo za H2O2. Meritev sem opravljala pri 0,65 V, tok pa sem odmerjala na 1 s. Elektroda je za H2O2 zelo občutljiva, zato je do spremembe toka prišlo takoj, ko sem v raztopino odpipetirala raztopino določene koncentracije H2O2. Pred prvim dodatkom sem običajno počakala vsaj 600 s, da se je tok spustil. Če je tok tudi po 600 s še vedno izrazito padal, sem počakala še približno 100-200 s dlje. V primeru da je bil prvi dodatek dodan prehitro, sprememba toka pri tem dodatku ni bila dobro opazna, ali pa je sploh nisem zaznala. Vsak naslednji dodatek sem dodala v intervalu 50 s, kar je zadostovalo, da se je krivulja zaradi dviga toka ustalila. Pri kasnejših dodatkih in posledično višjih koncentracijah H2O2 sem opazila, da se je šum povečal, zato sem za pripravo umeritvene krivulje raje izbirala dodatke čim nižjih koncentracij.

Umeritveno krivuljo sem narisala zato, da sem lahko kasneje rezultate, ki sem jih dobila pri meritvah na elektrodi z GOX, primerjala z rezultati elektrode brez GOX. V ta namen sem med vsemi meritvami izbrala tisto, ki je najbolj reprezentativna. Umeritvena krivulja, ki je prikazana na sliki 13, prikazuje reprezentativne vrednosti.

Slika 13: Reprezentativna umeritvena krivulja za dodatek H2O2

(48)

30

Kot je razvidno iz enačbe premice, je naklon (k) enak 0,0697 µA/µm. To vrednost sem kasneje uporabila za izračun stehiometrije pri meritvah z GOX.

4.6 Rezultati meritve z glukozo

Pri delu z elektrodo, na katero sem nanesla GOX, se je med meritvijo ob uporabi magnetnega mešala pojavil velik šum, zato sem namesto tega za mešanje raje uporabila rotacijsko mešalo. Pri delu z encimom sem pazila, da sem ga hranila v hladilniku, da bi čim dlje ohranil svojo aktivnost. Če sem na elektrodo nanesla pripravljeno raztopino encima, ki je bila starejša od 14 dni, sem opazila, da je bila sprememba toka zelo majhna ali celo neopazna. V takem primeru je bilo potrebno pripraviti svežo raztopino z encimom.

Najprej sem morala določiti, koliko plasti GOX je potrebno nanesti za najboljše rezultate.

Kot sem ugotovila že prej, sem na vsako elektrodo nanesla dve plasti disperzije in tega parametra nisem spreminjala. Ko se je disperzija posušila, pa sem čeznjo nanesla eno, dve ali tri plasti po 10 µl raztopine GOX. Z vsemi elektrodami sem izrisala umeritvene krivulje in primerjala njihove naklone. Rezultati so prikazani v tabeli 1.

Tabela 1: Naklon premice umeritvene krivulje za elektrode z različnim številom plasti glukoza oksidaze.

Št. plasti GOX Naklon (k)

1 0,0074

2 0,0117

3 0,0171

Z večanjem števila plasti se naklon veča, kar pomeni večjo občutljivost senzorja. Pri raztopini GOX pa se pojavi enaka težava kot pri disperziji, in sicer hitrost sušenja posameznih plasti. Ker je raztopina GOX izključno vodna in ni pomešana z etanolom kot disperzija, se suši še dlje časa. Priprava elektrode bi nam tako v primeru dodajanja treh plasti GOX vzela preveč časa, zato sem za nadaljnje poskuse na elektrode dodajala vsakič po dve plasti GOX. Umeritvena krivulja elektrode z dvema plastema GOX je prikazana na sliki 14.

(49)

31

Slika 14: Umeritvena krivulja elektrode z dvema plastema GOX, dodajanje glukoze na 100 s, mešanje z rotacijskim mešalom, odmerjanje na 1 s

Pri dodajanju raztopin H2O2 pri delu z elektrodami brez GOX (slika 13) je tok narasel takoj po dodatku. Pri meritvah z GOX pa je do spremembe toka prišlo kasneje, po nekaj sekundah, in ne takoj po dodatku glukoze. Razlog je v tem, da mora najprej priti do reakcije, pri kateri ob delovanju encima GOX glukoza zreagira do H2O2, ki šele nato povzroči spremembo toka. Dodaten razlog za zakasnitev je lahko tudi mešanje, ki z uporabo rotacijskega mešala ni tako učinkovito, kot če bi za mešanje uporabila magnetno mešalo. Prepihovanja z argonom tu nisem smela uporabiti kot dodatno simulacijo mešanja, saj bi v takšnem primeru iz raztopine izgnala ves kisik, ki pa je za delovanje encima GOX nujno potreben.

Zanimalo me je, če aktivnost encima med meritvijo zaradi pomanjkanja kisika upada. Če bi to držalo, bi se aktivnost encima povečala, če bi med celotno meritvijo raztopino prepihovala s kisikom. To bi se odražalo že med meritvijo, saj bi tok narasel hitreje, naklon umeritvene krivulje pa bi se povečal. Poleg tega bi prepihovanje s kisikom izboljšalo mešanje raztopine.

Pri meritvi s kisikom sem imela nekaj težav, saj je bilo zelo težko uravnavati pretok O2. Ta je moral biti ravno pravšnji, da je raztopina lepo krožila po celici. Če je bil pretok kisika prevelik, so mehurčki zraka poškodovali elektrodno površino in potrebno je bilo