MAGISTRSKO DELO

U

L

F

MAGISTRSKO DELO

Elvira Boršić

Ljubljana, 2021

U

L

F

MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE BIOKEMIJA

Vpliv kalijevih ionov in vrste oligomera NLRP3 na aktivacijo inflamasoma

MAGISTRSKO DELO

Elvira Boršić

M

: viš. znan. sod. dr. Iva Hafner Bratkovič S

: doc. dr. Gregor Gunčar

Ljubljana, 2021

IZJAVA O AVTORSTVU

magistrskega dela

Spodaj podpisani/-a Elvira Boršić sem avtor/-ica magistrskega dela z naslovom: Vpliv kalijevih ionov in vrste oligomera NLRP3 na aktivacijo inflamasoma.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

• je magistrsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom viš.

znan. sod. dr. Ive Hafner Bratkovič in somentorstvom doc. dr. Gregorja Gunčarja;

• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. List RS, št. 16/2007);

• sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;

• je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.

V Ljubljani, 29. 6. 2021 Podpis avtorice:

Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Biokemija.

Delo je bilo opravljeno na Kemijskem inštitutu, na Odseku za sintezno biologijo in imunologijo pod skrbništvom viš. znan. sod. dr. Ive Hafner Bratkovič.

Senat UL FKKT je za mentorico imenoval viš. znan. sod. dr. Ivo Hafner Bratkovič in za somentorja doc. dr. Gregorja Gunčarja.

Recenzenti: prof. dr. Roman Jerala (član), doc. dr. Vera Župunski (predsednica komisije).

Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela

Predsednica komisije: doc. dr. Vera Župunski, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Članica: viš. znan. sod. dr. Iva Hafner Bratkovič, Kemijski inštitut

Član: doc. dr. Gregor Gunčar, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Član: prof. dr. Roman Jerala, Kemijski inštitut

Zahvala

Hvala viš. znan. sod. dr. Ivi Hafner Bratkovič za mentorstvo, spodbudo in vso predano znanje. Hvala za temeljit pregled magistrskega dela.

Hvala izr. prof. dr. Mojci Benčina za pomoč pri izvedbi eksperimentov. Za nasvete in pomoč v laboratoriju se zahvaljujem dr. Petri Sušjan, Sari Orehek in ostalim sodelavcem z Odseka za sintezno biologijo in imunologijo na Kemijskem inštitutu.

Doc. dr. Gregorju Gunčarju se zahvaljujem za somentorstvo in pregled magistrskega dela. Hvala prof. dr. Romanu Jerali in doc. dr. Veri Župunski za pregled magistrskega dela.

Posebna zahvala gre mami, sestri, babici in dediju za vso podporo in spodbudo med študijem. Hvala sošolkam, cimram in vsem prijateljem za spodbudo in čudovito preživeta študentska leta. Najlepše se zahvaljujem Janiju za vso podporo pri študiju in na moji poklicni poti. Hvala za potrpljenje in razumevanje. Hvala moji Abby, ki je v najtežjih trenutkih vedno stiskala tačke zame in me spravljala v dobro voljo.

Vpliv kalijevih ionov in vrste oligomera NLRP3 na aktivacijo inflamasoma

Inflamasom NLRP3 je del naravne imunosti, ki omogoča zaznavo številnih patogenih in endogenih molekulskih vzorcev, ki aktivirajo senzorski protein NLRP3. Njegova oligomerizacija omogoči pripenjanje ASC in pro-kaspaze-1, ki postane aktivna in sproži zorenje vnetnih citokinov IL-1β in IL-18 ter cepitev gasdermina D. N-končni del proteina tvori pore v membrani, skozi katere se v izvencelični prostor sprosti citokin IL1β, ki izzove lokalno vnetje ter celično smrt imenovano piroptoza. Neregulirano delovanje inflamasoma NLRP3 je povezano s številnimi boleznimi, kot sta ateroskleroza in nevrodegenerativne bolezni. Zaenkrat začetne stopnje aktivacije NLRP3 še niso pojasnjene, saj je malo verjetno, da strukturno tako različni aktivatorji neposredno aktivirajo NLRP3. Namen našega dela je bil ovrednotiti začetni del poti aktivacije z osredotočenostjo na oligomerizacijo in pripravo sistemov za preučevanje vpliva K⁺, kot skupnega dejavnika različnih aktivatorjev, na NLRP3.

Ker je nejasno, kakšno strukturo tvori NLRP3 ob aktivaciji, nas je zanimalo, ali lahko inflamasom aktiviramo iz struktur, ki tvorijo brez-membranske organele (LLPS). Na NLRP3^PYD smo pripeli proteine, ki fazno separirajo, saj lahko z LLPS lokalno povečamo koncentracijo komponent. Pripravljene variante NLRP3^PYD smo stabilno izrazili v makrofagih. Ugotovili smo, da je fuzija s TDP-43 najboljša za aktivacijo inflamasoma, kar smo zaznali kot močno izločanje IL-1β in piroptozo. Opazili smo, da je aktivnost inflamasoma odvisna od kompaktnosti nastalega kondenzata. Z metodo vračanja fluorescence po fotobeljenju smo pokazali, da NLRP3^PYD in tudi ASC zamrežita strukturo LLPS, tako da ni več dinamična. Za nadaljnje delo smo pripravili dobra kandidata, ki aktivirata inflamasom, in omogočata preučevanje mehanizma zgornjih poti.

V drugem delu smo želeli vzpostaviti sistem za preučevanje oligomerizacije in vitro, saj v celičnem okolju ne moremo enoznačno analizirati neposrednih vplivov na NLRP3.

Analizirali smo izražanje NLRP3 z dvema različnima evkariontskima kompletoma za transkripcijo in translacijo in vitro, pri čemer smo zgolj z enim uspešno pripravili proteine, ki so nam omogočili izvedbo fluorescenčne korelacijske spektroskopije.

Ugotovili smo, da je slabost takšnih reagentov nizek izplen reakcije. Za preučevanje vpliva K⁺ na aktivacijo inflamasoma v celicah, smo pripravili funkcionalen NLRP3 s pripetim senzorjem za K⁺, GINKO1, ki bi lahko omogočal vizualno in kvantitativno spremljanje koncentracij K⁺.

V okviru magistrskega dela smo vzpostavili sisteme, ki nam bodo omogočili nadaljnje raziskovanje vpliva iztoka K⁺ na oligomerizacijo NLRP3, ter pokazali, da brez- membranski organeli omogočajo robustno aktivacijo inflamasoma.

Ključne besede: NLRP3, PYD, LLPS, kalijevi ioni, transkripcija/translacija in vitro

The effect of potassium ions and type of NLRP3 oligomer on inflammasome activation

NLRP3 inflammasome is a part of innate immunity that allows the identification of a plethora of pathogen and endogenous molecular patterns that trigger the activation of NLRP3. Its oligomerization enables the binding of ASC and pro-caspase-1, which becomes active and leads to the maturation of IL-1β and IL-18 and the cleavage of gasdermin D. N-terminal part of the protein forms pores, through which mature cytokines are released into the extracellular space where they cause local inflammation and pyroptotic cell death. It is still unknown how the initial stages of NLRP3 activation proceed, as it is unlikely for structurally different activators to directly activate NLRP3.

The purpose of our work was to evaluate the early steps of this pathway with the focus on oligomerization and the preparation of systems to study the influence of K⁺ as a common factor downstream of different NLRP3 activators.

Since it is unclear what structure NLRP3 forms upon activation, we were interested in whether inflammation can be activated from structures that form membrane-less organelles (LLPS). We fused proteins that phase separate with NLRP3^PYD as LLPS can locally increase the concentration of components. Prepared variants of NLRP3^PYD were stably expressed in macrophages. Fusion with TDP-43 was found to trigger inflammasome activation, which was determined as strong IL-1β secretion as well as pyroptotic cell death. With fluorescence recovery after photobleaching we showed that NLRP3^PYD as well as ASC tether the LLPS structure to a less dynamic structure. The compactness of the condensate formed influences the kinetics of inflammasome activation. We prepared good candidates that activate inflammasome and allow further studies of early steps in NLRP3 activation.

In the second part, we wanted to establish a system for studying oligomerization in vitro since we cannot analyze the direct effects of K⁺ efflux on NLRP3 in the complex cellular environment. We analyzed the expression of NLRP3 with two different eukaryotic kits for in vitro translation and transcription, but only one enabled us to prepare proteins for examination with fluorescence correlation spectroscopy. We found that the disadvantage of such reagents is the low yield of the reaction. To study the effect of K⁺ on inflammasome activation in cells, we developed a functional NLRP3 with an attached K⁺ sensor, GINKO1, that could allow visual and quantitative monitoring of fluctuations in K⁺ concentrations.

In the master thesis, we established systems that will allow us to further investigate the influence of K⁺ efflux on the oligomerization of NLRP3 and show that membrane-less organelles allow robust activation of the inflammasome.

Keywords: NLRP3, PYD, LLPS, potassium ions, in vitro transcription/translation

Kazalo

1 Uvod ... 1

1.1 Inflamasomi ... 1

1.2 Inflamasom NLRP3 ... 2

1.2.1 Različne poti aktivacije inflamasoma NLRP3... 3

1.2.2 Celični mehanizmi aktivacije inflamasoma NLRP3 ... 4

1.2.3 Konstitutivna aktivacija inflamasoma NLRP3 ... 6

1.3 Fazna separacija tekoče-tekoče ... 7

1.4 Fluorescenčna korelacijska spektroskopija ... 8

2 Namen dela in hipoteze ... 11

2.1 Vpliv domen, ki omogočajo fazno separacijo tekoče-tekoče, na povezovanje domen PYD in s tem aktivacijo inflamasoma NLRP3 ... 11

2.2 Vzpostavitev sistemov za neposredno in posredno spremljanje vpliva kalijevih ionov na aktivacijo NLRP3 ... 12

3 Materiali in metode ... 13

3.1 Materiali ... 13

3.1.1 Laboratorijska oprema ... 13

3.1.2 Kemikalije ... 14

3.1.3 Kompleti reagentov ... 14

3.1.4 Raztopine in pufri ... 15

3.1.5 Protitelesa ... 15

3.1.6 Sesalske celične linije ... 16

3.1.7 Bakterijske kulture ... 16

3.1.8 Gojišča ... 16

3.1.9 Vektorji ... 16

3.2 Metode ... 19

3.2.2 Molekulsko kloniranje ... 20

3.2.3 Priprava stabilnih celičnih linij ... 24

3.2.4 Delo s celičnimi kulturami ... 25

3.2.5 Transfekcija HEK293 s kontrolami TDP-43(ΔNLS)-YFP, označenima variantama NLRP3^PYD ter ASC-mCerulean ... 26

3.2.6 Sprožitev prvega signala aktivacije inflamasoma ... 27

3.2.7 Sprožitev drugega signala aktivacije inflamasoma ... 27

3.2.8 Konfokalna mikroskopija ... 28

3.2.9 Detekcija izločenih citokinov s testom ELISA ... 29

3.2.10 Spremljanje vpliva različnih variant NLRP3^PYD na piroptotično celično smrt 29 3.2.11 Prenos western ... 30

3.2.12 Izražanje proteinov s transkripcijo in translacijo in vitro ... 33

3.2.13 Analiza izražanja proteinov s transkripcijo/translacijo in vitro ... 34

3.2.14 Analiza oligomerizacije NLRP3 ... 34

4 Rezultati ... 37

4.1 Priprava linij iBMDM, ki izražajo fuzijske različice NLRP3^PYD, ki tvorijo LLPS 37 4.1.1 Načrtovanje in priprava fuzijskih različic NLRP3^PYD ... 37

4.1.2 Priprava celičnih linij... 38

4.1.3 Indukcija sinteze različic NLRP3^PYD z doksiciklinom ... 38

4.1.4 Preverjanje učinka različic NLRP3^PYD na aktivacijo inflamasoma ... 40

4.2 Preverjanje vpliva K⁺ na oligomerizacijo NLRP3 ... 51

4.2.1 Načrtovanje fluorescenčno označenega NLRP3 za izražanje v sistemu in vitro 51 4.2.2 Analiza izražanja označenega NLRP3 v različnih sistemih transkripcije/translacije in vitro ... 52

4.2.3 Preverjanje oligomerizacije NLRP3 z uporabo različnih metod ... 54

4.2.4 Priprava fuzijskega proteina NLRP3 s senzorjem za K⁺ ... 59

4.2.5 Priprava celične linije NLRP3-GINKO1 ... 60

4.2.6 Prisotnost kalijevega senzorja z NLRP3 v makrofagih ... 60

4.2.7 Preverjanje vpliva NLRP3-GINKO1 na celično smrt in sproščanje IL-1β v

makrofagih ... 62

5 Razprava ... 65

5.1 Aktivacija inflamasoma s kondenzati LLPS ... 65

5.2 Kalij in aktivacija inflamasoma NLRP3 ... 69

5.2.1 Vzpostavitev sistema transkripcije in translacije in vitro za opredelitev vloge K⁺ pri oligomerizaciji NLRP3 ... 69

5.2.2 Pripenjanje senzorja za K⁺ na NLRP3 in preučitev aktivacije inflamasoma 71 6 Zaključek ... 73

7 Literatura ... 75

8 Priloge ... 83

Kazalo slik

Slika 1: Komponentne inflamasoma NLRP3. ... 2

Slika 2: Mehanizem kanonične aktivacije inflamasoma NLRP3 ... 4

Slika 3: Možni mehanizmi, ki privedejo do iztoka K+ ... 6

Slika 4: Princip fazne separacije v bioloških sistemih ... 7

Slika 5: Shema vektorja pRetroX-TRE3G. ... 17

Slika 6: Shema vektorja pLEXSY_invitro-2. ... 18

Slika 7: Prikaz izražanja različic NLRP3^PYD v odvisnosti od koncentracije doksiciklina (DOX) s prenosom western. ... 39

Slika 8: Detekcija časovnega izražanja različic NLRP3^PYD s prenosom western. ... 40

Slika 9: Koncentracijska odvisnost sproščanja IL-1β glede na naraščajoče koncentracije doksiciklina. ... 41

Slika 10: Učinek sprožitve izražanja variant NLRP3^PYD z izbranimi koncentracijami doksiciklina na sproščanje IL-1β. ... 42

Slika 11: Vpliv variant NLRP3^PYD na celično smrt v odvisnosti od koncentracije doksiciklina. ... 43

Slika 12: Učinek izražanja različic NLRP3^PYD na celično smrt. ... 44

Slika 13: Merjenje kinetike prehajanja PI v celice. ... 45

Slika 14: Detekcija konstitutivno aktivnih variant NLRP3^PYD-TDP-43 s konfokalnim mikroskopom. ... 47

Slika 15: (Ne)vračanje fluorescence po fotobeljenju (FRAP) pri različicah NLRP3^PYD. ... 48

Slika 16: Izražanje pripravljenih konstruktov v celicah HEK293. ... 49

Slika 17: Detekcija različnih kondenzatov TDP-43 v prisotnosti ASC v HEK293. ... 50

Slika 18: Krivulje FRAP različic TDP-43 v prisotnosti ASC. ... 51

Slika 19: Izražanje fluorescenčno označenega NLRP3 s kompletom reagentov LEXSY je slabše v prisotnosti KCl. ... 53

Slika 20: Detekcija izražanja NLRP3 s kompletom reagentov TnT v in brez prisotnosti KCl. ... 54

Slika 21: Rezultat modre nativne elektroforeze kot kontrole za oligomerno stanje proteina NLRP3. ... 55

Slika 22: Vizualizacija oligomerizacije proteina NLRP3(1-686) z nativno elektroforezo. ... 56

Slika 23: Krivulje analize časovnega pojemanja fluorescence pri različnih vzorcih GFP in mCherry s programsko opremo SymPhoTime 64. ... 57

Slika 24: Izražanje NLRP3-GINKO1 v mišjih makrofagih. ... 60

Slika 25: Prikaz izražanja NLRP3-GINKO1 v makrofagih z izbitim genom za NLRP3.

... 61 Slika 26: Izločanje IL-1β in LDH v supernatant celic NLRP3-GINKO1. ... 62

Kazalo preglednic

Preglednica 1: Seznam uporabljene laboratorijske opreme. ... 13

Preglednica 2: Seznam uporabljenih kemikalij. ... 14

Preglednica 3: Seznam uporabljenih kompletov reagentov. ... 14

Preglednica 4: Seznam uporabljenih raztopin in pufrov. ... 15

Preglednica 5: Seznam uporabljenih protiteles in redčitev pri prenosu western. ... 15

Preglednica 6: Seznam uporabljenih sesalskih celičnih linij. ... 16

Preglednica 7: Seznam uporabljenih bakterijskih kultur. ... 16

Preglednica 8: Seznam uporabljenih gojišč za gojenje sesalskih celičnih linij. ... 16

Preglednica 9: Seznam uporabljenih gojišč za gojenje bakterijskih kultur. ... 16

Preglednica 10: Seznam uporabljenih vektorjev ali vključkov. ... 16

Preglednica 11: Seznam uporabljenih začetnih oligonukleotidov s pripadajočimi nukleotidnimi zaporedji. ... 19

Preglednica 12: Reakcijska mešanica za PCR. ... 21

Preglednica 13: Program reakcije PCR. ... 21

Preglednica 14: Reakcijska mešanica za rezanje očiščenih produktov PCR in vektorja pRetroX-TRE3G. ... 22

Preglednica 15: Reakcijska mešanica za rezanje očiščenih produktov PCR in vektorja pLEXSY. ... 22

Preglednica 16: Reakcijska mešanica za ligacijo. ... 23

Preglednica 17: Reakcijska mešanica za kontrolno rezanje plazmidov. ... 23

Preglednica 18: Seznam uporabljenih sekvenčnih začetnih oligonukleotidov s pripadajočimi nukleotidnimi zaporedji. ... 24

Preglednica 19: Volumen gojišča in koncentracija celic v različnih formatih plošč... 26

Preglednica 20: Koncentracije sprožilcev prvega signala aktivacije... 27

Preglednica 21: Količine uporabljenih reagentov za pripravo 10 % in 15 % ločevalnega gela za NaDS PAGE. ... 32

Preglednica 22: Sestava reakcijskih mešanic za translacijo/transkripcijo in vitro z LEXSY. ... 33

Preglednica 23: Sestava reakcijskih mešanic za translacijo/transkripcijo in vitro s kompletom reagentov TnT. ... 33

Preglednica 24: Seznam uporabljenih celičnih linij iBMDM. ... 38

Preglednica 25: Rezultati merjenja življenjske dobe fluoroforjev in FCS na vzorcih pripravljenih z LEXSY. ... 58

Preglednica 26: Rezultati merjenja življenjske dobe fluorescence na vzorcih pripravljenih s TnT. ... 59

Preglednica 27: Seznam uporabljenih celičnih linij pri eksperimentih z NLRP3-GINKO1.

... 60

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

AGE agarozna gelska elektroforeza

APS amonijev persulfat

ASC z apoptozo povezan klobčiču podoben protein, ki vsebuje CARD BCA bikinhonska kislina

BMDM makrofagi iz kostnega mozga

BN-PAGE modra nativna poliakrilamidna gelska elektroforeza

bp bazni par

BRET bioluminiscenčni resonančni prenos energije CARD domena, ki rekrutira kaspaze

CPI inhibitor proteaz

Da Dalton

DAMP s poškodbami povezani molekulski vzorci DMSO dimetilsulfoksid

DNA deoksiribonukleinska kislina dNTP deoksinukleotid trifosfat

DOX doksiciklin

E. coli Escherichia coli

EDTA etilendiaminotetraocetna kislina ELISA encimsko-imunski test

FBS serum ploda goveda

FCCS navzkrižno korelacijska fluorescenčna spektroskopija FCS fluorescenčna korelacijska spektroskopija

FRAP obnavljanje fluorescence po fotobeljenju FUS protein združen v sarkomu

GFP zelen fluorescenčni protein

GINKO1 zelen indikator za K⁺ za optično slikanje 1

GSDMD gasdermin D

HEPES 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonska kislina

HRP hrenova peroksidaza

iBMDM imortalizirani makrofagi iz kostnega mozga IDR intrinzično neurejene regije

IL interlevkin

LB lizogeno gojišče LDH laktat dehidrogenaza

LEXSY komplet reagentov za transkripcijo in translacijo in vitro iz lizata protozoja Leishmania tarentolae

LLPS fazna separacija tekoče-tekoče

LPS lipopolisaharidi

LRR domena, bogata z levcini

MQ voda Milli-Q

NACHT domena, prisotna pri proteinih NAIP, CIITA, HET-E in TP1 NaDS natrijev dodecilsulfat

NEK7 z nikoli v mitozi gen a povezana kinaza 7 NF-κB jedrni dejavnik κB

NLR NOD-u podobni receptorji

NLRP3 protein 3, ki vsebuje NOD, LRR in PYD NLRP3^PYD domena PYD v proteinu NLRP3

NOD oligomerizacijska domena, ki veže nukleotid Nt-GSDMD N-končni del gasdermina D

P3KO celice z izbitim endogenim genom za NLRP3 PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza

PAMP s patogeni povezani molekulski vzorci PBS fosfatni pufer z NaCl

PBST fosfatni pufer z NaCl in Tween-20 PCR verižna reakcija s polimerazo

PI propidijev jodid

PRR receptorji za prepoznavanje vzorcev PTM posttranslacijske modifikacije

PYD pirinska domena

RNA ribonukleinska kislina

ROI območje interesa

ROS reaktivne kisikove spojine rpm vrtljaji na minuto

TAE pufer Tris-acetat-EDTA

TDP-43 protein TAR (transaktiven odziv), ki veže DNA, velik 43 kDa TEMED N,N,N',N'-tetrametiletilendiamin

TLR Toll-u podoben receptor

Tm talilna temperatura

TnT komplet reagentov za hitro transkripcijo in translacijo in vitro iz lizata zajčjih retikulocitov

Tris 2-amino-2-(hidroksimetil)propan-1,3-diol

wt divji tip

YFP rumen fluorescenčni protein

1

1 Uvod

1.1 Inflamasomi

Inflamasomi so večproteinski kompleksi, ki so prisotni v citosolu različnih tipov celic [1], in so znani predvsem po aktivaciji vnetnih kaspaz [2, 3]. Med slednje uvrščamo kaspazo- 1, -4, -5 in -11 [4, 5]. Za aktivacijo kaspaz je potrebna oligomerizacija senzorskega proteina, ki neposredno ali posredno privede do združitve več pro-kaspaznih enot in avtokatalitično aktivacijo v aktivno kaspazo [5]. Vsi inflamasomi aktivirajo kaspazo-1, ki omogoča zorenje vnetnih citokinov pro-interlevkina-1β (pro-IL-1β) in pro-IL-18 ter proteina gasdermina D (GSDMD) [4].

Piroptoza je posebna oblika programirane litične celične smrti. Po aktivaciji inflamasoma vnetna kaspaza cepi protein GSDMD na N- (Nt-GSDMD) in C- končno domeno, pri čemer se Nt-GSDMD translocira na membrano, kjer tvori pore [6] s premerom približno 20 nm, ki so bolj prepustne za majhne bazične in nevtralne proteine [7]. Pore so dovolj velike, da nastane sprememba v ionskem gradientu, kar povzroči vnos molekul vode, zaradi česar se celica napihne in sčasoma poči [4]. V zunajcelično okolje se tako sprosti vsebina celice vključno s provnetnimi citokini, ki vplivajo na nadaljnji vnetni odziv [6].

Sestavljanje inflamasoma je odziv na zaznane zunanje, s patogeni povezane molekulske vzorce (PAMP), ali notranje signale, s poškodbami povezane molekulske vzorce (DAMP) [2]. Skupina receptorjev za prepoznavanje vzorcev (PRR) je zelo raznovrstna. Do sedaj odkriti PRR, ki tvorijo komplekse inflamasoma, so NLRP1, NLRP3, NLRC4, Pyrin in AIM2. Obstajajo dokazi, da so lahko v tvorbo vključeni tudi drugi člani družine NOD-u podobnih receptorjev (NLR) in receptorjev z domenama pirin in HIN (PYHIN) [8].

Večina NLR-jev ima podobno arhitekturo, in sicer vsebujejo N-končno pirinsko domeno (PYD) ali domeno, ki rekrutira kaspaze (CARD), osrednjo nukleotid-vezavno in oligomerizacijsko domeno (NACHT) ter C-končne domene, bogate z levcini (LRR) [9, 10]. Določeni inflamasomi potrebujejo za vršenje svoje funkcije adapterske proteine, kot je z apoptozo povezan skupku podoben protein, ki vsebuje CARD (ASC) [1].

Neregulirana aktivnost inflamasomov je povezana s patogenezo različnih avtoinflamatornih, avtoimunskih in kroničnih vnetnih ter metabolnih motenj, kot so putika, ateroskleroza, diabetes tipa 2 [11], prekomerno aktivacijo pa povezujejo tudi z nevrodegenerativnimi boleznimi in rakom [3, 9].

2

1.2 Inflamasom NLRP3

Med vsemi inflamasomi je inflamasom NLRP3 najbolj raziskan. Od ostalih receptorjev se razlikuje po tem, da ga aktivira širok nabor strukturno zelo različnih PAMP-ov in DAMP-ov [12]. To so številni mikrobni in virusni produkti (toksini, ki tvorijo pore, npr.

nigericin; LPS, bakterijska in virusna DNA oz. RNA itd.), delci (alum, silicijev dioksid, imikvimod itd.) ali endogene molekule (ATP, kristali holesterola, amiloid β itd.) [13].

Inflamasom NLRP3 ima tridelno sestavo: senzor NLRP3, adaptor ASC in pro-kaspaza- 1. Senzorski protein je sestavljen iz domen PYD, NACHT in LRR (slika 1) [10]. Osrednja domena NACHT je ključna za oligomerizacijo inflamasoma po aktivaciji [14].

Sestavljena je iz nukleotid vezavne domene (NBD), vijačne domene 1 (HD1), večkrilne vijačne domene (WHD) in vijačne domene 2 (HD2) [14, 15]. Funkcija domene LRR je pri različnih PRR prepoznavanje PAMP-ov in DAMP-ov, vendar so ugotovili, da v primeru NLRP3 ni esencialna za aktivacijo inflamasoma [14].

Dokazali so, da ima pomembno vlogo tudi z NIMA povezana kinaza 7 (NEK7) [16], ki se preko katalitične domene veže na domeno LRR proteina NLRP3 [2, 8] (slika 1), glede na strukturne študije pa tudi na NBD in HD2, ki sta del domene NACHT [17]. Sharif in sod. predpostavljajo, da NEK7 ni zadostna za aktivacijo NLRP3, saj ne vpliva na pretvorbo domene NACHT v aktivno, preko katere poteče oligomerizacija [17]. Kinazna aktivnost NEK7 ni nujna za tvorbo inflamasoma. Zanimivo je, da aktivacija NLRC4 in AIM2 ni odvisna od NEK7 [8].

Slika 1: Komponentne inflamasoma NLRP3.

3

1.2.1 Različne poti aktivacije inflamasoma NLRP3

Ker je aktivacija inflamasoma vnetni proces, mora biti zelo reguliran. Inflamasom NLRP3 se lahko aktivira preko treh signalnih poti, ki jih imenujemo kanonična, nekanonična in alternativna aktivacijska pot. Vsem trem je skupna prva stopnja aktivacije, razlike nastanejo pri drugem koraku. Kanonična aktivacija je najbolj splošna in je opisana v nadaljevanju ter na sliki 2.

Za aktivacijo in sestavljanje inflamasoma sta potrebna dva koraka. Prvi signal (angl.

priming) sprožijo različne molekule PAMP (npr. LPS), ki preko PRR aktivirajo signalno pot NF-κB, s čimer poteče prepisovanje komponent NLRP3, pro-kaspaze-1 in pro-IL-1β [13]. Vedno več je dokazov, da prvi korak vpliva tudi na posttranslacijsko raven regulacije, npr. na podaljšanje življenjske dobe proteina NLRP3 preko deubikvitinacije [18]. Aktivatorji drugega signala povzročijo homooligomerizacijo NLRP3 in s tem vezavo ASC preko homotipičnih interakcij med domenama PYD. ASC nadalje rekrutira pro-kaspazo-1, kar vodi v procesiranje in aktivacijo kaspaze-1 (slika 1) [19]. Slednja cepi tarčne molekule, med katerimi je tudi GSDMD. Skozi delno selektivne pore GSDMD se sprosti celična vsebina, ki nato v okolici sproži buren vnetni odziv (slika 2) [8].

Pri nekanonični poti je za aktivacijo inflamasoma potrebna kaspaza-11 v mišjih celicah [3, 8] oziroma kaspaza-4 in -5 v človeških celicah [3]. Značilna je za okužbe s po Gramu negativnimi bakterijami. LPS iz zunajcelične stene bakterij deluje na dva načina, preko receptorja TLR4, ki se aktivira v prvi stopnji aktivacije inflamasoma, in pa tudi kot citosolni aktivator [13]. Internalizacija LPS lahko poteče na različne načine, npr. preko privzema bakterij v celice z zunaj membranskimi vezikli, iz vakuol, v katerih se nahajajo bakterije idr. [20]. Aktivacija s prvim signalom poveča ekspresijo pro-kaspaze-11, medtem ko je pri človeku kaspaza-4 konstitutivno izražana, zato prvi korak aktivacije ni potreben [21]. Neaktivne vnetne kaspaze lahko preko domene CARD direktno zaznajo citosolni LPS, čemur sledi oligomerizacija in aktivacija. Aktivna kaspaza-11 nato cepi GSDMD [13, 21], ne pa tudi citokinov pro-IL-1β in pro-IL-18 [3]. Pore GSDMD povzročijo iztok K⁺, kjer se vključi kanonična aktivacija inflamasoma NLRP3 in s tem tudi cepitev provnetnih citokinov [22].

Alternativna pot je značilna za humane monocite. Glavna razlika s kanonično potjo je ta, da je alternativna neodvisna od iztoka kalija in celice ne vstopijo v piroptozo [21]. Ta pot prav tako ni dvostopenjska. Signalizacija preko TLR4 privede tudi do aktivacije kaspaze- 8, ni pa še znano, kako ta aktivira NLRP3 in izločanje IL-1β [23].

4

Slika 2: Mehanizem kanonične aktivacije inflamasoma NLRP3.

1.2.2 Celični mehanizmi aktivacije inflamasoma NLRP3

Kot že omenjeno, obstajajo številni različni aktivatorji inflamasoma NLRP3. Ker je malo verjetno, da bi vsi neposredno aktivirali njegovo sestavljanje, predvidevajo, da lahko NLRP3 zazna spremembe v določenih celičnih procesih, kot so spremembe v homeostazi ionov (iztok kalijevih in kloridnih ionov, vtok kalcijevih in natrijevih ionov), nastanek reaktivnih kisikovih spojin (ROS), okvarjeni mitohondriji in razlitje lizosomov [8].

Zaradi obsežnosti področja se bomo podrobneje dotaknili zgolj iztoka kalijevih ionov.

1.2.2.1 Vloga iztoka K⁺ pri aktivaciji inflamasoma NLRP3

Veliko je dokazov, da je K⁺ nujen in zadosten za aktivacijo inflamasoma NLRP3 [24–

28], vendar mehanizem poteka še vedno ni pojasnjen. Iztok K⁺ je ena izmed najpogostejših in najverjetnejših hipotez, saj veliko aktivatorjev NLRP3 povzroči spremembe v permeabilnosti celične membrane za K⁺, hkrati pa visoka zunajcelična koncentracija K⁺ inhibira ta efekt za številne testirane aktivatorje [25, 26]. Z merjenjem izločanja IL-1β in aktivnosti kaspaze-1 so pokazali, da je medij brez K⁺ zadosten za

5

aktivacijo makrofagov divjega tipa (wt) v odsotnosti aktivatorjev NLRP3. IL-1β so zaznali že 30 min po začetku inkubacije v mediju brez K⁺. Ta efekt so opazili tudi, če je bilo v mediju prisotnega manj kot 0,5 mM K⁺, znotrajcelična raven K⁺ pa nad 77 % [25].

Pri avtoaktivnih variantah je za aktivacijo nujen samo prvi signal. Visoka koncentracija zunajceličnega K⁺ ni zadostna za inhibicijo z LPS tretirane avtoaktivne variante NLRP3 R258W, povezane s sindromom Muckle-Wells. Glede na te podatke bi lahko K⁺ deloval neposredno na NLRP3 z indukcijo sprememb v wt NLRP3, ki so že prisotne pri NLRP3 R258W, ali pa vpliva na signalizacijo, predhodno od aktivacije NLRP3 [25]. Trenutno ni dokazov, da je prvi mehanizem možen. Je pa iztok K⁺ pomemben za interakcije s partnerji NLRP3, ki vodijo njegovo aktivacijo. He in sod. so stimulirali BMDM z ATP [29]. V celicah tretiranih s 50 mM KCl, ki prepreči iztok K⁺ [25], je bila onemogočena interakcija med NLRP3 in NEK7, ki bi naj bila pomembna za aktivacijo NLRP3 [17, 29].

Da K⁺ ni neposredni aktivator NLRP3, potrjuje študija Tang in sod. [30]. Preučevali so kloridne znotrajcelične kanalčke (CLIC), ki se nahajajo v citosolu in organelih, kot so mitohondriji, endosomi in jedro, v topni obliki ali vezani na membrane. Pokazali so, da je iztok K⁺ celični dogodek, ki se zgodi pred iztokom Cl^-, ki sicer aktivira NLRP3.

Predpostavili so tudi, da aktivacija inflamasoma poteka preko iztoka K⁺, ki vpliva na poškodbe mitohondrijev in nastanka ROS [30].

Vpliv K⁺ lahko preučujemo z bioluminiscenčnim resonančnim prenosom energije (BRET). Pri BRET dobimo signal, če sta donor (luciferaza) in akceptor (npr. rumen fluorescenčni protein) v razdalji manj kot 10 nm [14]. Stimulacija HEK293, ki izražajo NLRP3 s sondo BRET, z nigericinom ima za posledico znižanje signala BRET. Ob tretiranju celic z ionoforom tako nastanejo strukturne preureditve ali spremembe okolja NLRP3, ki so lahko posledica iztoka K⁺ [31].

Kljub vsemu obstajajo študije, da določeni aktivatorji delujejo neodvisno od iztoka K⁺. To so majhne molekule, ki delujejo na mitohondrij. Tretma celic z imikvimodom v prisotnosti visoke koncentracije KCl ni inhibiral aktivacije NLRP3 [32]. Imikvimod deluje na mitohondrije, kjer zavira delovanje oksidoreduktaze NQO2 in mitohondrijskega kompleksa I. Posledica sta nastanek ROS-ov in oksidacija cisteinov citosolnih proteinov, za katera so pokazali, da pripeljeta do aktivacije NLRP3, ki je odvisna od NEK7 [32].

1.2.2.2 Do iztoka K⁺ privedejo različni mehanizmi

V iztok K⁺ je vpletenih več ionskih kanalov oziroma (ne)selektivnih por na celični membrani (slika 3).

6

Receptor P2X7 je od ATP odvisen, za katione specifičen ionski kanalček, ki se odpre ob vezavi ATP. V zunajceličnem okolju je dokaj malo ATP v normalnih pogojih, njegova koncentracija pa se drastično poveča ob stresu in umirajočih se celicah. V takšnih primerih vezava ATP na P2X7 povzroči iztok K⁺ (in vdor Ca²⁺) [24, 33]. Iztok lahko poteče tudi preko pannexina-1, ki je neselektivni kanalček in omogoča prehod ionov ter molekul, velikih do 1,5 kDa [34]. Pannexin-1 vsebuje inhibitorni citoplazemski C-končni del, ki ga ob različnih stimulih odcepijo kaspaze ter s tem povzročijo njegovo odprtje [34, 35]. Pred kratkim so pokazali, da bi naj v povezavi s P2X7 deloval tudi dvodomenski K⁺ kanalček TWIK2. Inhibicija ali delecija TWIK2 je preprečila aktivacijo NLRP3 z ATP, ne pa tudi z nigericinom in imikvimodom [27].

Na integriteto celične membrane in aktivacijo inflamasoma NLRP3 vplivajo številni mikrobni toksini, ki tvorijo pore (nigericin, gramicidin, valinomicin, streptolizin O idr.) [24, 36]. Pri iztoku K⁺ sodeluje tudi GSDMD. N-terminalni konec proteina tvori delno selektivne pore na membrani, skozi katere lahko uhajajo K⁺. Pri nekanonični aktivaciji ga cepi kaspaza-11, kar nato vodi v aktivacijo NLRP3 [37, 38].

Slika 3: Možni mehanizmi, ki privedejo do iztoka K+.

1.2.3 Konstitutivna aktivacija inflamasoma NLRP3

Več kot 90 različnih mutacij v NLRP3 povzroča s kriopirinom povezane periodične sindrome (CAPS, angl. cryopyrin-associated periodic syndromes), vendar jih le nekaj povzroča resne zaplete [39]. Za to redko avtosomno dominantno avtoimunsko bolezen je značilen širok spekter simptomov, kot so vročina, sistemsko vnetje, bolečine v sklepih,

7

konjunktivitis in vnetje centralnega živčnega sistema [21, 40]. Večina drugačno- smiselnih mutacij (predvsem mutacije s pridobitvijo funkcije) je v domeni NBD, nekaj pa v LRR [41]. Mutacije povzročijo konstitutivno aktivacijo NLRP3, ki ne potrebuje drugega signala aktivacije, kar omogoča zorenje ter sproščanje IL-1β. Povečana aktivnost je verjetno posledica onemogočene zaprte konformacije [39], kar olajša tvorbo oligomera.

Konstitutivno aktivacijo inflamasoma NLRP3 lahko dosežemo z zamenjavo domen. Tako so Hafner-Bratkovič in sod. pripravili konstitutivno aktiven NLRP3, pri čemer so nadomestili domeno PYD z domeno CARD proteinov NLRC4 ali ASC, kar nakazuje, da ima PYD v NLRP3 inhibitorno vlogo. Varianta brez PYD ni bila aktivna. Konstitutivno aktivni varianti v manjši meri aktivirata kaspazo-1 v odsotnosti ASC [14]. Sušjan in sod.

pa so pokazali, da lahko PYD (NLRP3^PYD) z dodano trimerizacijsko domeno foldon učinkovito sproži zorenje IL-1β v odsotnosti aktivatorjev [42].

1.3 Fazna separacija tekoče-tekoče

Kot že samo ime pove, gre pri fazni separaciji za soobstoj dveh faz. Proteini in nukleinske kisline so biološki polimeri, pri katerih so pod ustreznimi pogoji možni fazni prehodi. V bioloških sistemih je najpogostejša fazna separacija tekoče-tekoče (LLPS), v določenih primerih je možen prehod v gele in trdne faze [43]. Gonilna sila LLPS je prekinitev interakcij makromolekula-voda in tvorba interakcij makromolekula-makromolekula ter voda-voda pod energijsko ugodnimi pogoji. Fazna separacija je odvisna od pogojev, in sicer koncentracije makromolekul, raztopine, temperature, soli, pH ter izključenega volumna drugih makromolekul [44].

Slika 4: Princip fazne separacije v bioloških sistemih.

8

Evkariontske celice vsebujejo številne brez-membranske kondenzate proteinov in nukleinskih kislin. To so npr. jedrce, stresna zrnca, P-telesca, parapege, centrioli itd. [43, 45, 46]. Takšne razdelke opredeljujejo tri značilnosti: hitra prerazporeditev komponent, sferičnost kondenzatov zaradi površinske napetosti in njihova fuzija ter fisija [47].

Stehiometrija znotraj takih razdelkov zelo variira, zato so običajno v različnih velikostih.

Določeni preidejo iz tekoče v gelu podobno fazo (zorenje), kar lahko detektiramo z metodo obnavljanja fluorescence po fotobeljenju (FRAP) (slika 4) [48]. Zorenje lahko traja kratek čas ali več ur, pri čemer velja, da je prehod v gelu podobno fazo hitrejši pri proteinih, ki so nagnjeni k agregaciji [49]. Obnovitev fluorescence je odvisna od dinamike v nastalem kondenzatu. Če so kapljice podobne tekočini, je vračanje fluorescence zelo hitro in lahko doseže 100 %. Pri kondenzatih, podobnih gelu, je vračanje bistveno počasnejše in doseže približno 15 %. Kondenzati so nepravilnih oblik. Pri agregatih se fluorescenca po FRAP ne povrne [49, 50]. Za določanje LLPS se pogosto uporablja tudi tretiranje celic z alkoholom 1,6-heksandiolom, pri čemer je kriterij hitra razpustitev kondenzatov [44].

Proteini, pri katerih poteče LLPS, imajo določene strukturne lastnosti. Gre predvsem za vsebnost domen, ki so podobne prionom, domen z nizko kompleksnostjo (LCD) in intrinzično neurejenih regij (IDR) [49, 51]. Interakcije med temi regijami, ki bi naj doprinesle k fazni separaciji, so šibke in prehodne. Zelo pogoste so elektrostatske interakcije. Med LCD spadajo domene RGG, ki so pogoste v RNA-vezavnih motivih, ki jih vsebujejo številni znani proteini z LLPS (npr. TDP-43, FUS, TIA-1). Arginin (in ostale pozitivno nabite aminokisline) v teh motivih tvori interakcije kation-π in π-π [49]. Pri teh sodelujejo tudi hidrofobni aminokislinski ostanki [46], ki so redki v IDR, delujejo pa kot adhezivni elementi [44]. Visoka valenca in afiniteta interakcijskih partnerjev sta pomembni za tvorbo velikih konstruktov pri nizkih koncentracijah [46]. Na osnovi znanih regij in interakcij je oblikovanih kar nekaj baz podatkov za LLPS (LLPSDB, PhaSePro, DrLLPS itd.). Anomalni fazni prehodi številnih proteinov so povezani z nastopom nevrodegenerativnih bolezni [52].

1.4 Fluorescenčna korelacijska spektroskopija

Fluorescenčna korelacijska spektroskopija (FCS) je zelo zmogljiva metoda, ki omogoča merjenje koncentracij in spremljanje dinamike ter interakcij fluorescenčnih biomolekul in vitro kot tudi in vivo [53]. V osnovi pri FCS merimo nihanja v fluorescenci pri eni ali več označenih fluorescenčnih molekulah v zelo majhnem volumnu, ki ga opazujemo, običajno je to femtolitrsko območje [54, 55]. Meritve izvajamo z invertnim konfokalnim mikroskopom od nekaj nanosekund do nekaj minut. Mikroskop mora vsebovati visoko

9

občutljivo plazovno fotodiodo (APD) za detekcijo fluorescence [53, 56]. Z merjenjem intenzitete v odvisnosti od časa se detektiran signal zveča ali zmanjša zaradi fizikalnih, kemijskih in bioloških učinkov molekul [54, 56]. To so lahko premikanje molekul v opazovanem volumnu, konformacijske spremembe, tvorba kompleksov in agregatov idr.

Surovi podatki FCS so časi prihoda posameznih fotonov, ki jih preračunamo v intenziteto nihanj F(t), s pomočjo katerih določimo avtokorelacijsko funkcijo intenzitete nihanj (enačba 1). Funkcija primerja signal samemu sebi ob različnih časih in s tem odraža verjetnost, da signal pripada istemu molekularnemu dogodku [53, 55].

𝐺(𝜏) = 〈𝛿𝐹(𝑡)𝛿𝐹(𝑡 + 𝜏)〉

〈𝐹(𝑡)〉²

Enačba 1: Avtokorelacijska funkcija G(τ). V ravnotežju so nihanja definirana kot razlika od povprečnega izmerjenega signala nihanj: 𝛿𝐹(𝑡) = 𝐹(𝑡) − 〈𝐹(𝑡)〉. S primerjavo izmerjenih vrednosti intenzitete fluorescence F ob času t in vrednosti ob kasnejšem času t + τ dobimo navzkrižno korelacijo signala s samim sabo, normalizirano s kvadratom povprečne fluorescence [53].

Določeno avtokorelacijsko krivuljo prilegamo matematičnemu modelu, s katerim dobimo kvantitativne informacije o spremljanem sistemu. Modelna funkcija je odvisna od parametrov, ki jih prilegamo [53]. Podatki, ki jih dobimo, so npr. čas difuzije (τ_D), število molekul v volumnu, ki smo ga opazovali, in koeficient difuzije (D) [56]. τ_D je povezan s časom, ki ga molekula preživi v detekcijskem volumnu. Amplituda je obratno sorazmerna s številom molekul v detektiranem volumnu, s pomočjo teh parametrov lahko določimo tudi koncentracijo fluorescenčnih molekul v raztopini [53].

Prednost FCS je visoka občutljivost zaznavanja posamezne molekule, zato se reakcije tipično izvajajo v nanomolarnem koncentracijskem območju. To je še posebej pomembno za sisteme, kjer so preučevane molekule v nizkih koncentracijah (npr. celice). Zaradi majhnega detekcijskega volumna omogoča npr. preučevanje zgolj dela celic [54] in pa dinamične procese v fizioloških razmerah. Za kompleksne sisteme, kot so npr. večcelični organizmi) so razvili več tehničnih nadgradenj [53]. Ker je tehnika neinvazivna in dodajanje reagentov načeloma ni potrebno za samo meritev, lahko celoten material uporabimo za nadaljnje analize [54]. FCS ni primeren za preučevanje počasne dinamike molekul [55], saj so v tem primeru potrebne daljše meritve z nižjo močjo laserja, da se izognemo bledenju fluorofora, kar vpliva tako na amplitudo kot tudi na obliko korelacijske krivulje [53].

Obstaja več variacij FCS. Ena od njih je navzkrižno korelacijska fluorescenčna spektroskopija (FCCS), imenovana tudi dvobarvni FCS, ki omogoča določanje dinamike in analizo specifičnih bimolekularnih interakcij [56]. FCCS je praktična metoda za kvantifikacijo interakcij encim-substrat in protein-protein. Delež vezanih molekul

10

določimo preko amplitude navzkrižne korelacijske funkcije (enačba 2) in iz avtokorelacijskih krivulj [53, 55].

𝐺_𝑐𝑐(𝜏) = 〈𝛿𝐹_𝑎(𝑡)𝛿𝐹_𝑏(𝑡 + 𝜏)〉

〈𝐹_𝑎(𝑡)𝐹_𝑏(𝑡)〉

Enačba 2: Navzkrižno korelacijska funkcija Gcc(τ). Fa in Fb predstavljata intenziteti kanala a in b, ki pripadata dvema različno označenima molekulama. Amplituda navzkrižne korelacije se poveča v primeru, ko molekuli a in b interagirata in se po opazovanem volumnu premikata skupaj [53].

11

2 Namen dela in hipoteze

Mehanizem aktivacije inflamasoma NLRP3 je zelo aktualna tema, predvsem ker njegova aktivacija spremlja številne bolezni sodobnega časa, kot so kardiovaskularne in nevrodegenerativne bolezni. V aktivacijo inflamasoma NLRP3 z zelo raznolikimi aktivatorji so lahko vpleteni številni celični procesi, in sicer tvorba reaktivnih kisikovih spojin, poškodbe mitohondrijev in lizosomov ter znižanje citosolne koncentracije K⁺. Aktivatorji inflamasoma povzročijo oligomerizacijo NLRP3, kar omogoči vezavo in posledično polimerizacijo adaptorja ASC, na slednjega pa se vežejo molekule pro- kaspaze-1. To privede do samoaktivacije kaspaze-1.

Namen magistrske naloge je bil preučiti zgodnje poti aktivacije inflamasoma NLRP3, natančneje oligomerizacijo NLRP3. To smo preučevali iz dveh vidikov. V prvem delu nas je zanimalo, ali je oblika oligomera sploh pomembna oziroma ali lahko aktivacijo zagotovimo s kondenzati LLPS. V drugem delu smo želeli vzpostaviti metodo za preučevanje vpliva kalijevih ionov na oligomerizacijo NLRP3, in sicer neposredno v sistemu in vitro ter preko biološkega senzorja za kalij v celicah.

2.1 Vpliv domen, ki omogočajo fazno separacijo tekoče-tekoče, na povezovanje domen PYD in s tem aktivacijo inflamasoma NLRP3

Aktivatorji inflamasoma povzročijo oligomerizacijo NLRP3 in nastanek inflamasoma NLRP3. Zaenkrat še ni pojasnjeno, kakšno je končno oligomerno stanje, ki omogoči vezavo ASC. Pirinska domena NLRP3 (NLRP3^PYD) sama ni zadostna za nukleacijo polimerizacije ASC, pokazali pa so, da je trimerizacija NLRP3^PYD minimalno oligomerno stanje za sprožitev izločanja IL-1β [42]. Zanimalo nas je, ali lahko z dodatkom proteinov, za katere je dokazano, da se fazno ločijo, na domeno NLRP3^PYD dosežemo zadostno aktivacijo inflamasoma. Takšne domene imajo visoko valenco, s čimer se poveča verjetnost interakcij (ali fazne separacije) pri nizkih koncentracijah komponent [57], kar bi lahko omogočilo približanje NLRP3^PYD in tvorbo ogrodja za vezavo ASC ter prokaspaze-1. Najprej smo izbrali ustrezna proteina, to sta bila FUS in TDP-43. Za preverjanje vpliva kompaktnosti kondenzatov smo izbrali dve različici TDP-43. S tehnikami molekulskega kloniranja smo želeli pripraviti NLRP3^PYD v fuziji s proteinom, ki omogoča fazno separacijo tekoče-tekoče. Pripravljene konstrukte smo želeli vnesti v celice imortaliziranih mišjih makrofagov in jih inducibilno izražati. Njihovo funkcionalnost smo nameravali testirati z različnimi tehnikami, kot so test celične smrti

12

LDH, izločanje citokina IL-1β, prenos western in s konfokalno mikroskopijo. Zastavili smo si naslednji hipotezi:

• Pripravljene celične linije bodo inducibilno izražale načrtovane proteine NLRP3^PYD-FUS(1-422), NLRP3^PYD-TDP-43(ΔNLS)-YFP in NLRP3^PYD-TDP-43 (ΔNLS/5F→L)-YFP.

• Zaradi bližine in večvalentnosti NLRP3^PYD v kondenzatih bo prišlo do konstitutivne aktivacije inflamasoma.

2.2 Vzpostavitev sistemov za neposredno in posredno spremljanje vpliva kalijevih ionov na aktivacijo NLRP3

Določitev celičnega dogodka, ki neposredno povzroči aktivacijo NLRP3, je problematična s stališča, da aktivatorji inflamasoma NLRP3 sprožijo več celičnih odgovorov. Z analizo predpostavljenih mehanizmov so prišli do ugotovitve, da je sprostitev K⁺ iz celice skupna skoraj vsem kanoničnim aktivatorjem in da je medij z nizko koncentracijo K⁺ zadosten za aktivacijo NLRP3 [25]. Ni pa še dokaza, ali lahko NLRP3 neposredno zazna znižanje K⁺. V ta namen smo najprej želeli z uporabo dveh različnih sistemov transkripcije in translacije in vitro pripraviti fluorescenčno označen NLRP3 in njegovo krajšo, še funkcionalno varianto NLRP3(1-686) [14], s katerima bi vzpostavili sistem za preučevanje oligomerizacije NLRP3 z uporabo različnih metod v odsotnosti celic. Primernost posamezne metode za pripravo proteinov smo želeli analizirati s tehnikama nativne poliakrilamidne elektroforeze in s fluorescenčno korelacijsko spektroskopijo. Postavili smo naslednjo hipotezo:

• Z uporabo transkripcije in translacije in vitro lahko pripravimo sistem, ki bi nam omogočal preučevanje oligomerizacije NLRP3.

Ker je obnašanje proteina v celici drugačno kot v izoliranih pogojih, nas je zanimalo, ali bi lahko na posreden način analizirali, kako mikrookolje K⁺ deluje na protein NLRP3. V ta namen smo želeli s tehnikami molekulskega kloniranja pripraviti NLRP3 z dodanim senzorjem za kalij GINKO1. Zapis za protein smo nameravali vstaviti v celice imortaliziranih mišjih makrofagov pod inducibilnim promotorjem. Zanimalo nas je, ali dodan senzor vpliva na delovanje NLRP3, kar smo želeli preveriti s testom celične smrti LDH in izločanjem IL-1β. S konfokalno mikroskopijo smo nameravali preveriti njegovo izražanje in sprožitev aktivacije inflamasoma NLRP3.

• Fuzijski protein NLRP3-GINKO1 bo omogočal aktivacijo inflamasoma NLRP3 v celicah z izbitim genom za NLRP3.

13

3 Materiali in metode

3.1 Materiali

3.1.1 Laboratorijska oprema

Preglednica 1: Seznam uporabljene laboratorijske opreme.

proizvajalec laboratorijska oprema

Applied Biosystems ciklični termostat Veriti 96-Well Thermal Cycler Assistant Reamix vibracijsko mešalo

BD Plastipak brizge

Bemis parafilm M

Binder CO2 inkubator za celične kulture Biometra transiluminator TI 3

Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra (sistem za PAGE), Mini Trans-Blot Cell (sistem za mokri prenos), PowerPac HV (električni napajalnik), kadička za AGE

BioTek čitalnik mikrotitrskih plošč Synergy Mx

CBS komora s tekočim dušikom

Corning banjice za multikanalno pipeto, črna mikrotitrska plošča s prosojnim dnom s 96 vdolbinicami

Eppendorf namizna centrifuga MiniSpin, termoblok Thermomixer Compact, avtomatske pipete (1 mL, 200 μL, 100 μL, 20 μL, 10 μL, 2,5 μL), multikanalne avtomatske pipete (300 μL, 100 μL, 10 μL), nastavki za avtomatske pipete, sterilne centrifugirke (5 mL) Essen Bioscience Incucyte

Falcon sterilne serološke pipete (5 mL, 10 mL)

GE Healthcare nitrocelulozna membrana Amersham Hybond ECL

Gorenje hladilnik, mikrovalovna pečica, naprava za vakuumsko pakiranje Greiner 2 mL pipete za sesanje, mikrotitrske plošče s 96 vdolbinicami s

polovično površino za test ELISA Hettich hlajena centrifuga Universal 320 R Hygonorm mrežice za lase

Hygostar copatki za celični laboratorij

Ibidi ploščica za mikroskopiranje z 8 vdolbinicami s plastičnim ali steklenim dnom

IKA vibracijski stresalnik MS3 basic, magnetno mešalo RCT basic Invitrogen naprava za avtomatsko štetje celic Countess, ploščica za štetje

celic

Iskra PIO brezprašna komora M18

Kambič inkubator RT-1000

KERN laboratorijska tehtnica Kimberly-Clark rokavice KIMTECH

Leica invertni svetlobni mikroskop DM IL LED, konfokalni mikroskop TSC SP5 in TSC SP8

New Brunswick Scientific inkubator s stresalnikom Innova 42

Sanyo zamrzovalnik

14 proizvajalec laboratorijska oprema

Sarstedt mikrocentrifugirke (2 mL, 1,5 mL, 0,5 mL), sterilne in nesterilne centrifugirke (15 mL, 50 mL), nastavki za avtomatske pipete, 11 mL centrifugirke z okroglim dnom

Sartorius 0,45 μm filter Minisart, analitska tehtnica

Syngene naprava G:BOX za slikanje membran, program GeneSnap Tecan naprava za spiranje mikrotitrskih plošč HydroSpeed Thermo Fischer Scientific

spektrofotometer Nanodrop 1000, program ND-1000, nesterilne mikrotitrske plošče s 96 vdolbinicami Nunc 96F, zamrzovalnik - 80 °C

TPP

sterilne mikrotitrske plošče s 6, 12, 24 in 96 vdolbinicami, sterilne centrifugirke (15 mL in 50 mL), krioviale, serološke pipete, stojala za centrifugirke, flaške za gojenje celičnih kultur 75 cm² VWR sterilne serološke pipete (25 mL, 50 mL)

3.1.2 Kemikalije

Preglednica 2: Seznam uporabljenih kemikalij.

proizvajalec kemikalija

Ecolab dezinfekcijsko sredstvo Skinman Soft N Fermentas 6x DNA nanašalni pufer

GE Healthcare Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent Gibco FBS, gojišči DMEM in Opti-MEM

Gold Biotechnology agaroza

IDT začetni oligonukleotidi

Invitrogen deoksinukleotidi dATP, dTTP, dGTP, dCTP, barvilo tripan modro, reagent Lipofectamine 2000, ELISA/ELISPOT Diluent, RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor, UltraPure EDTA (0,5 M), propidijev jodid (1 mg/mL)

Invivogen ultračisti LPS iz E. coli 0111:B4, poly(I:C), puromicin New England Biolabs pufer NEBuffer 3.1

Sigma-Aldrich etidijev bromid, ampicilin, DMSO, akrilamid, bisakrilamid, APS, TEMED, EDTA, Tween-20, BCA, β-merkaptoetanol, doksiciklin, antibiotik G41, doksiciklin, Tris, raztopina bikinonske kisline, CuSO4, CPI-His tag, kalijev D-glukonat, nigericin

Šampionka varikina

Thermo Fischer Scientific DNA-polimeraza Phusion HS II, restrikcijski encimi BamHI, NotI, XhoI, DNA-ligaza T4, 5x pufer RAPID, označevalec velikosti za AGE (GeneRuler Mix), označevalec velikosti za PAGE (PageRuler Plus Prestained), SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate, TMB, avidin-HRP, i-Block, Gibco HEPES (1 M)

VWR NaDS

3.1.3 Kompleti reagentov

Preglednica 3: Seznam uporabljenih kompletov reagentov.

proizvajalec ime

Invitrogen Mouse IL-1 beta Uncoated ELISA

15

proizvajalec ime

Jena Bioscience LEXSY in vitro Translation Kit for plasmid based cell-free protein synthesis

Promega TnT Quick Coupled Transcription/Translation System

Thermo Fisher Scientific CyQUANT™ LDH Cytotoxicity Assay, GeneJET Plasmid MiniPrep Kit

VWR peqGOLD Gel Extraction Kit

3.1.4 Raztopine in pufri

Preglednica 4: Seznam uporabljenih raztopin in pufrov.

proizvajalec sestava

10 x PBS 1,7 M NaCl, 34 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4, pH=7,4

50 x TAE 40 mM Tris, 20 mM ocetna kislina, 1 mM EDTA 10 x pufer za NaDS-PAGE 0,250 M Tris (pH 8,3), 1,92 M glicin, 1 % NaDS 10 x pufer za nativno PAGE 0,250 M Tris (pH 8,3), 1,92 M glicin

Pufer za prenos western 25 mM Tris, 192 mM glicin, 20 % metanol, pH 8,3 Blokirni pufer za nitrocelulozno

membrano PBST z i-Block 1 x PBS, 0,01 % Tween-20, 0,2 (w/v) i-Block Pufer za spiranje nitrocelulozne

membrane PBST 1 x PBS, 0,01 % Tween-20 Pufer za spiranje plošč pri testu ELISA 1 x PBS, 0,05 % Tween-20 Raztopina za zaustavitev reakcije pri

testu ELISA 1 M H3PO4

Pufer za lizo sesalskih celic 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5 % Triton X-100, 0,5 % Na⁺ deoksiholat 4 x NaDS nanašalni pufer z reducentom 250 mM Tris/HCl pH 6,8, 8 % NaDS, 40 % glicerol,

20 % β-merkaptoetanol, 0,04 % bromfenol modro 4 x nanašalni pufer za nativno PAGE 250 mM Tris/HCl pH 6,8, 40 % glicerol, 20 % β-

merkaptoetanol, 0,04 % bromfenol modro

6 x nanašalni pufer za AGE 0,25 % bromfenol modro, 0,25 % ksilencianol, 40 % glukoza

5 x pufer za hitro ligacijo 250 mM Tris-HCl (pH 7.6), 50 mM MgCl2, 5 mM ATP, 5 mM DTT, 25 % (w/v) polietilenglikol-8000

3.1.5 Protitelesa

Preglednica 5: Seznam uporabljenih protiteles in redčitev pri prenosu western.

proizvajalec ime redčitev

Abcam kozja poliklonska protitelesa proti zajčjim IgG, konjugirana s HRP (sekundarno)

1:3000 Adipogen mišje protitelo proti NLRP3 (primarno) 1:1000 Cell Signaling

Technology mišje protitelo proti β-aktinu (primarno) 1:5000 Invitrogen zajčja protitelesa proti GFP (primarna) 1:1000 Jackson Immuno

research

kozja poliklonska protitelesa proti mišjim IgG, konjugirana s HRP (sekundarno)

1:3000

16

3.1.6 Sesalske celične linije

Preglednica 6: Seznam uporabljenih sesalskih celičnih linij.

celična linija opis

iBMDM P3KO/D2 trajna celična kultura imortaliziranih mišjih makrofagov, izoliranih iz kostnega mozga NLRP3^-/- miši, klon D2

Gryphon Ampho pakirna linija za proizvodnjo virusov za transdukcijo

HEK293 trajna celična kultura človeških embrionalnih ledvičnih celic

3.1.7 Bakterijske kulture

Preglednica 7: Seznam uporabljenih bakterijskih kultur.

bakterijska kultura genotip

Escherichia coli TOP10 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

3.1.8 Gojišča

3.1.8.1 Gojišča za gojenje sesalskih celičnih linij

Preglednica 8: Seznam uporabljenih gojišč za gojenje sesalskih celičnih linij.

gojišče uporaba

DMEM z 10 % FBS gojenje iBMDM P3KO in HEK293 DMEM nacepljanje celic za eksperimente Opti-MEM priprava transfekcijskih mešanic 3.1.8.2 Gojišča za gojenje bakterijskih kultur

Preglednica 9: Seznam uporabljenih gojišč za gojenje bakterijskih kultur.

gojišče sestava

LB (tekoče) 10 g/L tripton, 10 g/L NaCL, 5 g/L kvasni ekstrakt

LBA (tekoče) 10 g/L tripton, 10 g/L NaCL, 5 g/L kvasni ekstrakt, 50 μg/mL ampicilin LBA (trdno) 10 g/L tripton, 10 g/L NaCL, 5 g/L kvasni ekstrakt, 15 g/L agar, 50 μg/mL

ampicilin

3.1.9 Vektorji

Preglednica 10: Seznam uporabljenih vektorjev ali vključkov.

proizvajalec (številka) izvorni raziskovalec vektor/vključek

Addgene (26866) Chandra Tucker [58] pCRY2PHR-mCherryN1 Addgene (29609) Aaron Gitler [59] pcDNA 3.2-FUS-1-526aa-V5 Addgene (84912) Aaron Gitler [60] pcDNA3.2 TDP-43 NLS1 YFP Addgene (84913) Aaron Gitler [60] pcDNA3.2 TDP-43 NLS1, 5F-L YFP Addgene (113112) Robert Campbell [61] pcDNA3.1-GINKO1

Clontech pRetroX-TRE3G

JenaBioscience (EGE-262) pLEXSY_invitro-2

Kemijski inštitut sfGFP [62]

Kemijski inštitut pRetroX-TRE3G mNLRP3 [14]

Sigma Aldrich pcDNA3

Addgene (41840) Eicke Latz [63] pRP-hASC-mCerulean

17

Pri delu smo uporabili vektorje iz zbirke plazmidov Addgene, ki so nam služili kot vir genov za vključke FUS(1-422), TDP-43(ΔNLS)-YFP in TDP-43(ΔNLS/5F→L)-YFP. Z vektorjem pRetroX-TRE3G smo jih vnesli v sesalske celične linije iBMDM P3KO.

S pomočjo vektorja pRetroX-TRE3G lahko pripravimo rekombinantne retroviruse, s katerimi v genom tarčne celice naključno integriramo transgeno DNA med regijama dolgih končnih ponovitev (LTR) na vektorju (slika 5). Vektor vsebuje sistem Tet-On za inducibilno izražanje željenih konstruktov z doksiciklinom, analogom tetraciklina.

Tarčne celice izražajo transaktivator Tet-On 3G, na katerega se veže doksiciklin, kar povzroči strukturne spremembe v Tet-On 3G. To omogoči vezavo na operator tet (tetO), s čimer se aktivira transkripcija genov pod promotorjem TRE3GV (PTRE3GV). V odsotnosti doksiciklina je ekspresija zelo nizka, saj se transaktivator ne more vezati na tetO [64]. Vektor vsebuje zapis za rezistenco na ampicilin in puromicin, s katerimi selekcioniramo celice, ki so sprejele transgeno DNA.

Slika 5: Shema vektorja pRetroX-TRE3G.

Za eksperimente v sesalski celični kulturi HEK293 smo uporabili konstrukte vnesene v ekspresijski vektor pcDNA3.

Za pripravo proteinov s transkripcijo in translacijo in vitro smo uporabili vektor pLEXSY_invitro-2, v katerega smo vstavili vključke mNLRP3 v kombinaciji s sfGFP in mCherry. pLEXSY_invitro-2 (slika 6) vsebuje zapis za EGFP, ki ga lahko uporabimo za pozitivno kontrolo reakcije. Ker vsebuje dve multipli klonirni mesti (MCS), omogoča tri

18

klonirne strategije. Lahko zamenjamo gen za EGFP s tarčnim genom, česar smo se poslužili tudi sami, ali pa pripravimo N- ali C-terminalne fuzije z EGFP. Vektor vsebuje zapis za rezistenco na ampicilin, geni pa se izražajo pod promotorjem T7.

Slika 6: Shema vektorja pLEXSY_invitro-2.

19

3.2 Metode

3.2.1.1 Načrtovanje začetnih oligonukleotidov

Začetne oligonukleotide smo načrtovali tako, da smo s podaljški vključili start in stop kodon, Kozakino zaporedje in restrikcijska mesta, ki so nam omogočila vnos vključkov v vektor. Dolžina prilegajočega se zaporedja je bila običajno približno 20 bp. Od dolžine je odvisna tudi talilna temperatura (Tm), zato je bilo končno število bp takšno, da je ustrezalo Tm okoli 56 °C, ki smo jo določili s pomočjo orodja OligoAnalyzer (IDT). Med zaporedji posameznih genov smo dodali tudi povezovalno zaporedje GGAGGATCAGGGGGG (aminokislinsko zaporedje: GGSGG). Zaporedja so prikazana v preglednici 11.

Preglednica 11: Seznam uporabljenih začetnih oligonukleotidov s pripadajočimi nukleotidnimi zaporedji.

ime nukleotidno zaporedje

F- BamHI-NLRP3 CGGGATCCGCCACCATGAC

R-FUS1-link-PYD TATAATCGTTTGAGGCCCCCCCTGATCCTCCG

F-PYD-link-FUS1 GCGGAGGATCAGGGGGGGCCTCAAACGATTATACCCAACAA G

R-NotI-FUS1 ATTTGCGGCCGCTCATCGCTGCTGTCCTCCA R-TDP43-PYD CCCGAATATATTCAGACCCCCCTGATCCTCCG

F-PYD-TDP43 GCGGAGGATCAGGGGGGTCTGAATATATTCGGGTAACCGAAG ATG

R-NotI-YFP ATTTGCGGCCGCTCACTTGTACAGCTCGTCCATGC F-XhoI-NLRP3 CCGCTCGAGGCCACCATGACCTCCGTGCGGTG R-sfGFP-link-

NLRP3

CTCATCCCCCCTGATCCTCCCCAGCTGATCTCGAACACGATG F-NLRP3-link-

sfGFP

CTGGGGAGGATCAGGGGGGATGAGCAAAGGTGAAGAACTTT TTACCG

R-sfGFP ATTTGCGGCCGCTCATTTATACAGTTCATCCATACCATGGGTA ATACC

R-sfGFP-link- NLRP3(1-686)

CTCATCCCCCCTGATCCTCCGGGGCTGTTGTGGAAGAAG F- NLRP3(1-686)-

link-sfGFP

CCCGGAGGATCAGGGGGGATGAGCAAAGGTGAAGAACTTTTT ACCG

R-mCherry-link- NLRP3

CACCATCCCCCCTGATCCTCCCCAGCTGATCTCGAACACGATG F-NLRP3-link-

mCherry

CTGGGGAGGATCAGGGGGGATGGTGAGCAAGGGCGAG R-NotI-mCherry ATTTGCGGCCGCCTACTTGTACAGCTCGTCCATGC R-mCherry-link-

NLRP3(1-686)

CACCATCCCCCCTGATCCTCCGGGGCTGTTGTGGAAGAAG F- NLRP3(1-686)-

link-mCherry

CCCCGGAGGATCAGGGGGGATGGTGAGCAAGGGCGAG F-XhoI-sfGFP CCGCTCGAGGCCACCATGAGCAAAGGTGAAGAACTTTTTACC

G

F-XhoI-mCherry CCGCTCGAGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG