Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
MAGISTRSKO DELO
Mia ŽGANJAR
Ljubljana, 2021
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE
BIOKEMIJE
Potrditev novih interaktorjev variant proteina Pig1 kvasovke Saccharomyces cerevisiae
MAGISTRSKO DELO
Mia ŽGANJAR
Mentor: prof. dr. Uroš Petrovič
Ljubljana, 2021
magistrskega dela
Spodaj podpisana Mia Žganjar sem avtorica magistrskega dela z naslovom: Potrditev novih interaktorjev variant proteina Pig1 kvasovke Saccharomyces cerevisiae.
S svojim podpisom zagotavljam, da:
• je magistrsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof.
dr. Uroša Petroviča;
• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;
• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje
predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);
• sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;
• je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.
V Ljubljani, datum Podpis:
Delo je bilo opravljeno na Institutu »Jožef Stefan«, Odseku za molekularne in biomedicinske znanosti.
Senat UL FKKT je za mentorja imenoval prof. dr. Uroša Petroviča.
Recenzenta: doc. dr. Marina Klemenčič in izr. prof. dr. Marko Dolinar.
Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela
Predsednica komisije: doc. dr. Marina Klemenčič, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Član: izr. prof. dr. Marko Dolinar, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Član: prof. dr. Uroš Petrovič, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta in Institut
»Jožef Stefan«
Tole magistrsko delo ne bi bilo opravljeno brez strokovnega vodenja in usmerjanja mentorja prof. dr. Uroša Petroviča, ki moje raziskovalno delo spremlja že iz časa dodiplomskega študija. Zahvaljujem se ti za vse dane priložnosti učenja, zaupanje, delovno ter intelektualno svobodo v mojem strokovnem razvoju in seveda za vse opravljene projekte.
Tako se tudi iz srca zahvaljujem celotni kvasni skupini za družbo, ure smeha, timsko delo, vse nasvete in nore ideje ob kavi. Skupaj preživet čas mi bo za zmeraj ostal v spominu.
Hvala tudi družini, prijateljem ter partnerju Gregorju. Vedno ste mi stali ob strani in mi bili v oporo pri doseganju ciljev. Dajali motivacijo, ko sem jo najbolj rabila in mi vlivali samozavest, ko je sama nisem našla.
cerevisiae
Povzetek:
Za naravne populacije so značilne kompleksne ravni uravnavanja celičnih procesov, ki so običajno pod posrednim ali neposrednim vplivom okolja. Raznolikost med osebki populacije je zato moč pripisati raznolikemu medsebojnemu povezovanju teh ravni, izražanje lastnosti pa pripisujemo pripadajočim razlikam genetskih ozadij.
Za odkrivanje genske arhitekture in molekulskih mehanizmov kompleksnih lastnosti uporabljamo številne pristope povezovanja fenotipa z genotipom. Vzročno povezovanje genotipa in fenotipa med drugim omogoča analiza določanja lokusov kvantitativnih lastnosti (ang. Quantitative Trait Locus analysis; QTL) ter njene izpeljanke.
Z analizo QTL je bila prepoznana tudi kompleksna lastnost sposobnosti kopičenja založnih lipidov v kvasovki S. cerevisiae [1]. Predlagani so bili kandidatni vzročni geni, od katerih PIG1 predstavlja gen z najvišjo napovedno močjo fenotipa na osnovi variante lokusa kvantitativne lastnosti. Alelni varianti PIG1 preučevanih sevov BY4741 in AWRI1631 se razlikujeta v številnih polimorfizmih, ki predstavljajo več kot 2 % zaporedja gena. Raznolikost variant zato dopušča spremenjen interaktom in divergentno funkcionalnost.
Ob preiskovanju vloge PIG1 v lipidnem metabolizmu smo uporabili dopolnjevanje proteinskih in genetskih interakcijskih profilov z določanjem novih genetskih in proteinskih interakcijskih partnerjev variant PIG1. Tako smo želeli preučiti pomen perturbacije interaktoma, odvisnega od genetskega ozadja seva. V sklopu magistrskega dela smo, za določevanje genetskih interakcij, izvedli test celične rasti ob prisotnosti rapamicina. Določili smo dve novi genetski interakciji gena PIG1 in sicer negativno genetsko interakcijo z RML2 ter pozitivno genetsko interakcijo s PHO23. Ugotovili smo, da kombinacija alelov seva AWRI1631v genetskem ozadju seva BY4741 povzroča hibridno nekompatibilnost s še neznanim genetskim dejavnikom.
Razlike v interaktomih med sevoma smo podkrepili z visokozmogljivo različico metode dvohibridnega sistema kvasovke. Ta pristop nam je omogočal določiti nove kandidatne proteinske interaktorje variant proteina Pig1. V nadaljevanju smo s klasičnimi pristopi potrdili zgolj že znano interakcijo s proteinom Gsy2.
Ključne besede: genetske interakcije, proteinske interakcije, lokus kvantitativne lastnosti, PIG1
Confirmation of novel yeast Saccharomyces cerevisiae Pig1 protein variant interactors
Abstract:
Natural populations harbour complex levels of cellular regulation, which are usually directly or indirectly influenced by environmental factors. The variance of a trait in a population can therefore be explained by its underlying diverse interconnection of those regulation levels, which are based on the corresponding genetic background.
In an aim of discovering the genetic architecture and molecular mechanisms of complex traits, we use several approaches to associate phenotype with genotype. One way of casual linking the genotype to phenotype is in using the quantitative trait locus (QTL) analysis and its extensions.
Using such an analysis, accumulation of lipid storage in the common yeast S. cerevisiae has been determined as a quantitative, complex trait. Among proposed causative candidate genes, PIG1 had the highest QTL prediction power of the phenotype based on different loci of quantitative traits [1]. Its allelic polymorphic variance between the commonly used laboratory BY4741 strain and the AWRI1631 wine strain is higher than 2% and allows for altered interactome and its consequential divergent functionality.
In the scope of investigating the role of PIG1 in lipid metabolism, we aimed to complement its interaction profiles by determining new genetic and protein interaction partners, based on the allelic variant of the PIG1 gene. Thus, we wanted to analyse the importance of perturbation of the interactome, which depends on the underlying genetic background.
To determine genetic interactions, we performed a cell growth test in the presence of rapamycin. Two new interactions of the PIG1 were identified, namely a negative interaction with RML2 and a positive interaction with PHO23. We found that the combination of the AWRI1631 strain alleles in the BY4741 genetic background causes hybrid incompatibility with a yet unknown genetic factor.
The interactome divergence between studied stains was supported by a high-throughput variant of the yeast two-hybrid method. With this so-called barcode-fused yeast two- hybrid method we were able to identify new candidate protein interactors of Pig1 variants.
With the follow-up classical approaches, we were only able to confirm the previously known protein interaction with Gsy2.
Keywords: Genetic interactions, protein interactions, quantitative trait locus, PIG1
1 Uvod ... 1
1.1 Kvasovka S. cerevisiae kot modelni organizem ... 1
1.1.1 Genetska zasnova kvasovke ... 1
1.2 Kompleksne ali poligenske lastnosti ... 2
1.2.1 Analiza poligenskih lastnosti in lokusi kvantitativne lastnosti (QTL) ... 3
1.2.2 Ekstremna analiza lokusov kvantitativne lastnosti (X-QTL) ... 4
1.3 Lipidni metabolizem kvasovke ... 6
1.3.1 Kopičenje založnih lipidov ... 6
1.4 Določitev novih vzročnih genov kopičenja nevtralnih lipidov ... 7
1.4.1 Genotipska in fenotipska razlika med starševskima sevovoma kvasovke S. cerevisiae ... 7
1.4.2 Analiza X-QTL ... 7
1.4.3 Kandidatni vzročni geni: PIG1, RML2 in PHO23 ... 8
1.5 Funkcijska genomika in interaktomika ... 10
1.5.1 Genetske interakcije ... 11
1.5.2 Dobzhansky-Mullerjev model nekompatibilnosti ... 12
1.5.3 Proteinske interakcije ... 13
1.5.4 Dvohibridni sistem kvasovke ... 13
1.5.5 S črtnimi kodami združen dvohibridni sistem kvasovke ... 14
1.5.6 Bimolekulska fluorescenčna komplementacija ... 15
2 Namen dela in hipoteze ... 17
3 Materiali in metode ... 19
3.1 Materiali ... 19
3.1.1 Organizmi in sevi ... 19
3.1.2 Plazmidni vektorji ... 21
3.1.3 Kemikalije, pufri, komercialni kompleti in laboratorijski materiali ... 22
3.1.4 Gojišča ... 27
3.1.6 Druga delovna oprema ... 29
3.2 Metode ... 30
3.2.1 Verižna reakcija s polimerazo (PCR) ... 30
3.2.2 Izolacija plazmidne DNA ... 36
3.2.3 Izolacija genomske DNA (gDNA) ... 36
3.2.4 Priprava kompetentnih bakterijskih celic ... 36
3.2.5 Transformacija bakterij ... 36
3.2.6 Transformacija kvasovk ... 37
3.2.7 Ekstrakcija DNA iz agaroznega gela ... 38
3.2.8 Ekstrakcija PCR produkta ... 38
3.2.9 Merjenje optične gostote celic ... 38
3.2.10 Agarozna elektroforeza ... 38
3.2.11 Priprava trajnih kultur ... 39
3.2.12 Sestavljanje po Gibsonu ... 39
3.2.13 Rezanje z restrikcijskimi encimi ... 39
3.2.14 Redčitveni kapljični test ... 40
3.2.15 Izvedba metode BFG ... 41
3.2.16 Izvedba metode dvohibridnega sistema kvasovke ... 41
3.2.17 Bimolekulska fluorescenčna komplementacija ... 42
4 Rezultati ... 43
4.1 Genetski interaktorji gena PIG1 ... 43
4.1.1 Določitev novih genetskih interakcij alelnih variant gena PIG1 ... 43
4.1.2 Znane genetske interakcije gena PIG1 ... 49
4.2 Določevanje novih proteinskih interakcij variant proteina Pig1 ... 51
4.2.1 Analiza BFG-YTH ... 52
4.2.2 Rezultati določanja proteinskih interakcij z metodo dvohibridnega sistema kvasovke ... 57
4.2.3 Rezultati določanja proteinskih interakcij z metodo bimolekulske fluorescenčne komplementacije ... 59
6 Seznam uporabljenih virov ... 67 7 Priloge ... 77
bp bazni par
AD DNA aktivacijska domena
AR I/II aktivacijska regija
BC črtna koda
BD DNA vezavna domena
BFG-YTH s črtnimi kodami združen dvohibridni sistem kvasovke BiFC bimolekulska fluorescenčna komplementacija
BSA goveji serumski albumin CNV različica števila kopij
CSM mešanica esencialnih hranil za kvasovke
DBB aditiv DMSO-Betain-BSA
dH2O deionizirana voda
DMSO dimetilsulfoksid
DNA deoksiribonukleinska kislina dNTP deoksinukleozid trifosfat
ER endoplazemski retikulum
gDNA genomska DNA
GFP zeleni fluorescenčni protein HDAC histon-deacetilacijski kompleks
HR homologna rekombinacija
indeli insercije in delecije
kb kilobazni par
kDa kilodalton
LD lipidne kapljice
LiAC litijev acetat
Mbp megabazni par
MOPPS 3-(N-Morpholino) propansulfonska kislina MQ ultra čista voda Milli-Q
MYTH membranski dvohibridni sistem NGS sekvenciranje naslednje generacije
nt nukleotid
OD600 protein optična gostota pri valovni dolžini svetlobe 600 nm ORF odprti bralni okvir
PCA komplementacijski test s proteinskimi fragmenti PCR poliverižna reakcija s polimerazo
PEG polietilenglikol
PP1 protein fosfataza tipa1 QTL lokus kvantitativne lastnosti
QTL analiza metoda kartiranja lokusov kvantitativne lastnosti
RHA obojestranska analiza hemizigotov
SD minimalno gojišče za kvasovke iz peptona, glukoze in CSM SDS natrijev dodecilsulfat
SE sterilni estri
SGA metoda sintetičnega genetskega nabora SGD podatkovne zbirke kvasovke Saccharomyces SNP polimorfizem posameznega nukleotida SNV variacija posameznega nukleotida TAG triacilgliceroli
TAP tandemsko afinitetno čiščenje UAS zgornje aktivacijsko zaporedje
VC C-konec fluorescenčnega proteina Venus VN N-konec fluorescenčnega proteina Venus
WT divji tip
X-QTL analiza metoda ekstremnega kartiranja lokusov kvantitativne lastnosti YNB osnovno dušikovo gojišče za kvasovke
YPD kompleksno gojišče za kvasovke iz kvasnega ekstrakta YTH dvohibridni sistem kvasovke
1
1 Uvod
1.1 Kvasovka S. cerevisiae kot modelni organizem
Kvasovka Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) je kot enocelični evkariontski mikroorganizem poznana predvsem po svoji vlogi v živilski industriji. Ker so jo sprva povezovali s pridelavo vina, piva ter pripravo pekovskih izdelkov, ni presenetljivo, da njeno znanstveno ime »cerevisiae« izhaja iz stare terminologije za pivo. Čeprav kvasovko S. cerevisiae poznamo že stoletja, pa jo znanstveno proučujejo šele od sredine tridesetih let prejšnjega stoletja, ko so pričeli s prvimi križanji za izboljšavo fenotipskih lastnosti pivskih in vinskih sevov [2], [3]. Do danes je S. cerevisiae, kot evkariontski modelni organizem, omogočila odkritja nekaterih ključnih mehanizmov celične biologije.
Ti vključujejo mehanizme celičnega cikla, potek prepisovanja ali transkripcije, zaščito kromosomov s telomerami, in avtofagijo [4].
Zaradi enostavnosti gojenja v fizikalno in kemijsko kontroliranem okolju ter rasti na definiranih gojiščih, nam kvasovka omogoča eksperimentalno dovršeno raziskovanje.
Hkrati ima relativno kratek generacijski čas (90 min v optimalnih, laboratorijskih pogojih), kar omogoča izvajanje selektivnega pritiska kot gonila laboratorijsko induciranega evolucijskega razvoja ter preučevanje sprememb na populacijski ravni, v relativno kratkem časovnem okvirju [3]–[5]. Kvasovka kot modelni organizem je v preteklosti prednjačila predvsem zaradi enostavne manipulacije genetskega material ter visoke ohranjenosti nukleotidnih in aminokislinskih zaporedij z višjimi evkarionti. Tako je bilo moč ustvariti številne knjižnice mutant, na primer knjižnico vseh delecijskih mutant (ang. Yeast Knockout Collection), ki so omogočale preučevanje temeljnih biokemijskih procesov in ta spoznanja večinsko prenesti na višje evkarionte, predvsem na človeka [3]–[5]. Analiza fenotipov knjižnic mutant je predstavljala bazo za preučevanje metabolnih, morfogenih ter signalnih poti. Tako so med drugim nastala nova področja raziskovanja, kot sta funkcijska genomika in sistemska biologija. Kvasovke pa so tako postale modelni organizmi za preučevanje na celični, molekulski in genomski ravni [5].
1.1.1 Genetska zasnova kvasovke
Kvasovka S. cerevisiae je prvi evkariontski organizem, katerega genom je bil leta 1996 sekvenciran [6]. Ocenjujejo, da več kot 85 % genoma referenčnega seva S288c izvira iz seva EM93. Slednji je vinski sev, ki ga je leta 1983 izoliral Emil Mark iz gnilih fig v Kaliforniji ter je služil za razvoj številnih laboratorijskih sevov, ki so mu prav tako sorodni [2], [7]. V celici kvasovke s haploidnim setom DNA je približno 12 megabaznih parov (Mbp), razporejenih v 16 kromosomov [6]. Do februarja 2021 je bilo, po podatkih iz genomske podatkovne zbirke kvasovke Saccharomyces (ang. Saccharomyces Genome
2
Database, SGD) v genomu referenčnega seva S288c kvasovke S. cerevisiae določenih 7.930 genov. Odprte bralne okvirje (ang. Open Reading Frames, ORF) predstavlja 6572 (83 %) genov, od tega je potrjenih in okarakteriziranih 5176 (79 %), preostanek pa so nepotrjeni ali dvomljivi (21 %). Tako gre za kompakten genom, kjer ORF nastopa na vsaki 2 kb, kar predstavlja okrog 50-krat višjo gostoto genov v primerjavi z genomom človeka [3], [6]. Le 1358 (17 %) je genov, ki ne kodirajo proteine [8]. Ocenili so tudi, da ima referenčni sev okrog 1114 esencialnih genov, ostali predstavljajo neesencialne gene [7]. Za kvasovko je značilno tudi, da ima relativno majhen delež intronov (le okrog 5 % genov ima introne [9]), ti pa so značilni predvsem za gene, ki zapisujejo ribosomske proteine, pri čemer gre za majhen intron na začetku zapisa [6].
Pri preučevanju 1011 sevov kvasovke S. cerevisiae so ugotovili okrog 1,63 milijonov polimorfizmov posameznih nukleotidov (ang. Single-Nucleotide Polymorphisms, SNP, ang. Single-Nucleotide Variants, SNV), katerih večina (93 %) je na alelih z nizko alelno frekvenco [10]. Prav tako so odkrili 125.701 insercij ali delecij (indelov; ang. insertion or deletion, indels), dolgih do 50 baznih parov (bp), pri čemer je 42,6 % indelov dolgih po le 1 bp [10]. Največ variacij v obliki SNP in različic števila kopij (ang. Copy-Number Variation, CNV) je v predelu subtelomernih regij, kjer prihaja do največ rekombinacij. V teh regijah so zaznali tudi največ indelov [7], [10]. Najmanj variacij so opazili v centromerah kromosomov. V kodirajočem delu genoma so zaznali 17 % manj SNP-jev, kakor v predelu, ki ne zapisuje proteinov, od tega so esencialni geni najmanj podvrženi variaciji in le pri 4 esencialnih genih referenčnega seva so zaznali manjše indele, ki pa naj ne bi vplivali na funkcionalnost genov. To gre predvsem na račun manjšega vpliva na fenotip in manj pogostih rekombinacij v funkcionalnih območjih kromosomov [7]. Ob preučevanju genomov 1011 naravnih izolatov je bilo moč določiti tudi pangenom S.
cerevisiae. Izmed do takrat odkritih 7796 ORF-ov (v 1011 sevih) je 4940 ORF-ov prisotnih pri vseh sevih (središčni genom kvasovke; ang. core genome), medtem ko je pojavnost 2856 ORF-ov v sevih variabilna. Večina genov središčnega genoma kvasovke je prisotnih v eni sami kopiji na haploidni set, pri čemer pa so variabilni geni lahko zastopani tako v hemizigotih (ena kopija v diploidnem setu), kot tudi v več kopijah haploidnega ali diploidnega seta. Kar 123 esencialnih genov referenčnega genoma ni del središčnega genoma kvasovke, pri čemer pa je 71 takih, ki imajo ortologe [10].
1.2 Kompleksne ali poligenske lastnosti
Večina opažene raznolikosti, v dovzetnosti za bolezni, odzivu na zdravilne učinkovine ter v morfoloških, fizioloških in vedenjskih lastnostih med posamezniki naravnih populacij je običajno posledica kompleksnih spletov genetskih ter okoljskih dejavnikov.
Z namenom odkrivanja genetske arhitekture ter poznavanja molekulskega mehanizma izražanja lastnosti so izvedli precej študij, in čeprav so odkrile številne povezave med genetskimi dejavniki ter omenjenimi lastnostmi, so večinsko ti dejavniki imeli le delne
3
doprinose k celokupnemu fenotipu. V naravi torej prevladujejo lastnosti s kontinuirno variacijo nad diskretnimi lastnostmi [11]–[14].
Populacijska genetika posledično jasno loči monogenske od kompleksnih lastnosti. Pod monogenske ali mendelske lastnosti spadajo tiste, ki imajo le nekaj zaznavnih in razločnih stanj fenotipa, ki se izražajo kot posledica delovanja enega samega do le nekaj genov. Gre torej za diskretne lastnosti, ki so lahko močno izražene ter slonijo na predvidljivih enostavnih zakonitostih dedovanja t.i. mendelskih lastnosti [11], [12], [15], [16].
Kompleksne, tudi poligenske ali kvantitativne lastnosti so na drugi strani lastnosti z merljivo fenotipsko variacijo, ki jo je moč pripisati delovanju več genov oziroma lokusov, pri čemer vsak od njih praviloma prispeva le majhen delež k končnemu fenotipu [11]–
[13], [16]–[19]. Za poligenske lastnosti je značilno, da so geni lahko v medsebojnih genetskih interakcijah, hkrati pa so lahko v posredni ali neposredni interakciji s spremenljivim okoljem, kar vodi v fenotipsko plastičnost. Nanje vpliva tudi spol osebkov, genetsko ozadje in pleiotropnost genov [12], [16], [17], [20]. Značilno je tudi, da se kvantitativna variacija lastnosti običajno približa normalni porazdelitvi, kar je v nasprotju s pričakovanimi kvalitativnimi, diskretnimi kategorijami vrednosti monogenskih lastnosti. To ne pomeni, da vrednosti poligenske lastnosti ne morejo biti diskretne (npr.
število tumorjev), le da je fenotip kontinuiren znotraj populacije. Kompleksno gensko arhitekturo poligenskih lastnosti predstavlja, med drugim, tudi dejstvo, da se določen lokus lahko obnaša tako kot lokus poligenske lastnosti, kakor tudi kot lokus monogenske lastnosti [12], [16], [17], [20]. Interpretacija lastnosti ter njena razčlenitev med poligensko in monogensko lastnostjo je posledično odvisna od preiskovanih genov ali lokusov. Dober primer predstavlja telesna višina. Tri neodvisne študije so odkrile 54 označevalcev, povezanih s telesno višino ljudi, vendar so ti označevalci pojasnili le okrog 10 % variacije v populaciji, pri čemer je dednost telesne višine ocenjena na 88 % [14].
Gre torej za očitno kvantitativno lastnost, ki je v populaciji normalno porazdeljena. Kadar pa se s preučevanjem osredotočimo le na gene, ki povzročajo pritlikavost, pa se vzročni lokusi obnašajo diskretno, kot je to značilno za monogenske lastnosti [16].
Kompleksne lastnosti so značilne za vse naravne populacije, tako tudi za običajno kvasovko S. cerevisiae. Nekaj potrjenih poligenskih lastnosti kvasovk so na primer acidotolerantnost, sposobnost prevzema dušika, termotolerantnost ter odpornost proti številnim kemikalijam [17], [20]–[22]. Med drugim pa so za kompleksno lastnost potrdili tudi akumulacijo založnih lipidov [1].
1.2.1 Analiza poligenskih lastnosti in lokusi kvantitativne lastnosti (QTL)
Ker kompleksne lastnosti nimajo diskretnih fenotipov in so lahko pod vplivom druge kompleksne lastnosti, ostaja njihovo preučevanje izziv. Običajni pristopi genetske manipulacije namreč praviloma ne rezultirajo v bistveno spremenjenem fenotipu in nam tako otežujejo jasno vzročno povezovanje fenotipa z genotipom. Za preučevanje kompleksnih lastnosti zato uporabljamo metode določanja lokusov kvantitativnih
4
lastnosti (ang. Quantitative Trait Locus; QTL), oziroma analize QTL. Te metode omogočajo statistično povezovanje fenotipa z genotipom, za določanje predelov genoma, odgovornih za preučevano kompleksno lastnost. QTL območja lahko obsegajo več genov, en sam gen (ang. Quantitative Trait Gene, QTG), ali pa zgolj posamezen nukleotid. Kadar variacijo fenotipa kompleksne lastnosti povzroča SNV, govorimo o nukleotidih kvantitativne lastnosti (ang. Quantitative Trait Nucleotide, QTN). Več QTL kot jih ima neka lastnost, težja je njihova identifikacija, saj ima vsak le delni doprinos. Težavno pa je tudi določanje QTL, ki so v neposredni bližini in se z mejozno rekombinacijo redkeje ločijo. V takšnih primerih namesto več QTN ali QTG identificiramo en sam QTL. Za klasično metodo določanja QTL pri kvasovki potrebujemo dva haploidna starševska seva, ki se razlikujeta v preiskovani lastnosti ter imata polimorfne molekulske označevalce, ki jih spremljamo pri potomcih po križanju starševskih sevov. Polimorfni molekulski označevalci, ki jih lahko spremljamo, so lahko celotni geni, SNP, CNV, indeli ali mesta reorganizacije kromosomov [11]–[13], [16], [22], [23].
Analizo izvedemo tako, da po križanju starševskih sevov in generiranju populacije segregant izvedemo statistično asociacijsko analizo povezave med merljivo vrednostjo poligenske lastnosti in pripadajočimi molekulskimi označevalci (genotipom) v čim večjem naboru potomcev. Kandidatne lokuse je moč določiti, saj imajo slednji bistveno drugačno frekvenco zastopanja od preostalih lokusov oziroma od naključne rekombinacije. Frekvenca rekombinacije omogoča določitev razdalje med posameznimi polimorfnimi označevalci, kar v koraku kartiranja omogoča določitev frekvence označevalca na kandidatnem lokusu. Frekvenca polimorfnega označevalca je v teh lokusih značilno višja, opazovani polimorfni označevalec pa je bodisi inferioren, bodisi superioren. Zadnji korak QTL analize je potrjevanje kandidatnih vzročnih QTL-ov. To se običajno izvaja z različnimi pristopi zamenjave lokusov v starševskih sevih ali potomcih, s povratnim križanjem, kombinatornim preučevanjem delecijskih mutant haploidov, prekomernim izražanjem kandidatnih genov ali z obojestransko analizo hemizigotov (ang. Reciprocal Hemizygosity Analysis, RHA). Pripravljene mutante in/ali potomce povratnega križanja ponovno genotipiziramo ter fenotipiziramo ter tako potrdimo ali ovržemo asociacijsko razmerje med kandidatnim molekulskim označevalcem in kompleksno lastnostjo. V primeru povratnega križanja se ob hkratni potrditvi QTL lahko poveča tudi ločljivost določitve oziroma velikost QTL. Po številnih ciklih povratnega križanja segregant z enim ali obema starševskima sevoma pride do povečanja deleža genoma izbranega starševskega seva in zmanjšanja deleža genoma drugega starševskega seva, tako pa v segregantah ostanejo le molekulski označevalci, ki imajo vpliv na poligensko lastnost [1], [11], [20]–[26], [12]–[19].
1.2.2 Ekstremna analiza lokusov kvantitativne lastnosti (X-QTL)
Ekstremna analiza lokusov kvantitativne lastnosti (ang. Extreme QTL analysis, X-QTL) predstavlja razširjeno obliko analize QTL, ki temelji na visokozmogljivem pristopu
5
pregleda čim večjega nabora segregant. Zaradi povečane populacije segregant po križanju genotipsko različnih starševskih sevov se statistična moč analize poveča, posledično pa je možna boljša ločljivost ter detekcija QTL, ki imajo lahko bistveno manjši doprinos k izražanju kompleksne lastnosti [20].
Za pridobitev večjega nabora segregant se za X-QTL uporablja metoda sintetičnega genetskega nabora (angl. Synthetic Genetic Array, SGA) [20]. Gre za metodo določanja sintetične genetske letalnosti, ki predstavlja skrajno obliko negativne genetske interakcije, pri kateri le kombinacija dveh lokusov povzroči letalnost organizma [27]–
[29]. V primeru X-QTL analize SGA uporabimo kot visokozmogljiv pristop ločevanja askospor in tako pridobivanja velikega nabora haploidnih segregant paritvenega tipa a [20]. Selekcija temelji na genetskem označevalcu SGA (can1Δ::STE2pr-Sphis5 lyp1Δ his3Δ1) v enem izmed starševskih sevov, ki je paritvenega tipa α. Drugi starševski sev mora biti paritvenega tipa a. Za dodatno selekcijo pa potrebuje še delecijo gena HIS3 (his3Δ) [10–12] . Promotor STE2 je aktiven zgolj v haploidih paritvenega tipa a, tako v teh celicah lahko poteka biosinteza histidina na osnovi gena HIS5 iz kvasovke Schizosaccharomyces pombe. Ker je znano, da promotor STE2 lahko izrazi nekaj gena SpHIS5 tudi v diploidih (MATa/MATα) in tako omogoča preživetje majhnega deleža diploidov, za selekcijo uporabimo še dva dodatna genetska označevalca [28]. Lyp1 in Can1 sta permeazi, ki omogočata prenos lizina (Lyp1) oziroma arginina (Can1) ter njunih analogov. Na selekcijskem gojišču HS, brez histidina ter z dodanimi toksičnimi analogi arginina (kanavanin) in lizina (S-(2-aminoetil)-L-cistein oz. tializin), je tako omogočena selekcija izključno haploidnih segregant paritvenega tipa a [27]–[29].
Zaradi zmožnosti visokozmogljivega pristopa pridobitve segregant se v okviru analize X- QTL uporabljajo metode genotipizacije na ravni celotnega genoma, ki temeljijo na uporabi mikromrež ali paralelnega masovnega sekvenciranja nove generacije. Potrebo po visoki zmogljivosti pa zahtevajo tudi metode fenotipizacije. Te morajo podajati lahko zaznaven in kvantitativen signal preučevanega analita. Uporabljajo se predvsem metode selektivne rasti (selektivna gojišča, vpliv temperature), posrednih ali neposrednih barvanj (kromogeno, fluorescenčno) ali označevanj (npr. fluorescenčne označbe proteinov) [1], [17], [20], [24].
Preučevanje bolj zahtevnih fenotipov, kot je na primer kvantifikacija ter sestava celičnih lipidov, kjer imamo opravka z raznoliko kemijsko strukturo ter s tem pogojenimi kemijskimi lastnostmi, še vedno predstavlja analitske izzive. Zato je uspešnost povezovanja poligenskih lastnosti z njihovimi polimorfnimi molekulskimi označevalci med drugim odvisna tudi od sposobnosti izbrane metode fenotipizacije [30], [31].
6
1.3 Lipidni metabolizem kvasovke
Preučevanje lipidov in lipidnega metabolizma zadnja leta pridobiva vedno več pomena tako v medicini kot tudi v biotehnologiji. Porast z lipidi povezanih bolezni, kot so debelost, ateroskleroza in diabetes tipa 2 [32]–[34], proizvodnja biogoriv (npr. biodizla) ter drugih industrijsko pomembnih komponent (površinsko aktivne snovi, detergenti, maziva, hranila, topila, polimeri) [31], [33], [35], [36], kot tudi vidik bioremediacije [35], zahteva poznavanje temeljnih načel lipidnega metabolizma tako v človeku, kot tudi v industrijsko pomembnih mikroorganizmih [31], [33].
Zaradi evolucijske ohranjenosti metabolnih poti, med katere spada tudi lipidni metabolizem [31]–[33], zaradi manj kompleksne lipidne sestave ter enostavnega genetskega manipuliranja kvasovka S. cerevisiae prednjači pred ostalimi modelnimi organizmi pri preučevanju lipidnega metabolizma. Z uporabo kvasovke je tako bilo mogoče odkriti številne mehanizme lipidnega metabolizma, kot tudi preučevanje soodvisnosti z drugimi procesi, ki zajemajo celično signaliziranje, celično rast, sintezo bioloških membran, celično smrt ter ohranjanje homeostaze [31], [34]. Iz soodvisnosti omenjenih procesov je razvidno, da ima lipidni metabolizem kompleksno genetsko arhitekturo z dinamično povezavo številnih genov in/ali proteinov, ki so v bodisi posredni, bodisi neposredni medsebojni interakciji [1], [31]–[33], [35]. Kljub poznavanju osnovnih encimov metabolnih poti sinteze, razgradnje in imobilizacije lipidov, številne ravni uravnavanja slednjih še niso povsem pojasnjene [1].
1.3.1 Kopičenje založnih lipidov
V kvasovki so identificirali že okrog 150 različnih tipov lipidov, od tega večinski delež lipidne sestave predstavljajo založni ali nevtralni lipidi. Mednje sodijo triacilgliceroli (TAG) in sterolni estri (SE), ki so pri referenčnem sevu S. cerevisiae načeloma v razmerju 1:1 [31], [34]. Založni lipidi se pospešeno sintetizirajo v endoplazemskem retikulumu (ER) ob presežku glukoze ali maščobnih kislin in pomanjkanju dušika. Kopičijo se v posebnih organelih, lipidnih kapljicah (ang. lipid droplets, LD). LD so sestavljene iz več osnovnih komponent: hidrofobne sredice, ki jo sestavljajo TAG ter sloji SE, lipidnega monosloja ter številnih vanj integriranih proteinov [32], [33]. Nakopičeni TAG in SE v LD so kot energijska in snovna zaloga za sintezo kompleksnih lipidov [1], [31]–[34], [37], hkrati pa preprečujejo lipotoksičnost ter tako vzdržujejo celično homeostazo [31], [32].
Nekateri mikroorganizmi so sposobni nakopičiti založne lipide v obsegu od 70 % [38] do 80 % [35] lastne suhe teže. Gre za t.i. oleogene ali oljne mikroorganizme, med katere spadajo tudi nekatere kvasovke, med njimi Lipomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis in Yarrowia lipolytica. S. cerevisiae po drugi strani lahko, ob enakih rastnih pogojih in brez genetskih sprememb, doseže le 5-10 % suhe teže založnih lipidov [35], [38] in tako ne spada med oleogene kvasovke. Razlike v
7
akumulaciji založnih lipidov pa niso samo medvrstne, temveč opažajo tudi veliko raznolikost med sevi znotraj vrste. Laboratorijski sevi S. cerevisiae imajo praviloma majhne zaloge TAG v primerjavi z naravnimi oziroma industrijskimi izolati, pri katerih je ta lastnost bolj izražena in lahko akumulirajo do 20 % TAG ob optimiziranih rastnih pogojih [1], [39].
Omenjena kompleksnost lipidnega metabolizma in nediskretna porazdelitev vsebnosti založnih lipidov znotraj vrste S. cerevisiae jasno nakazujeta, da gre za poligensko ali kompleksno lastnost [1], katere mehanizmi uravnavanja in povezava z drugimi celičnimi procesi še niso povsem raziskani.
1.4 Določitev novih vzročnih genov kopičenja nevtralnih lipidov
Z določitev novih vzročnih genov kopičenja nevtralnih lipidov v kvasovki je naša skupina uporabila že omenjeno metodo X-QTL, pri čemer so križali dva starševska seva, ki se razlikujeta tako po genetskih molekulskih označevalcih, kakor tudi po kapaciteti kopičenja založnih lipidov [1], [40].
1.4.1 Genotipska in fenotipska razlika med starševskima sevovoma kvasovke S.
cerevisiae
Križanje je bilo izvedeno med pogosto uporabljenim laboratorijskim sevom BY4741, ki izvira iz referenčnega seva S288c [41], in avstralskim vinskim sevom AWRI1631. Ta je bil pridobljen iz komercialnega vinskega seva N96 in se na ravni SNP relativno precej razlikuje od referenčnega (S288c). Med njima so namreč odkrili kar 57.463 SNV, ki so v povprečju prisotni na vsakih 162 nt, odkrili pa so tudi 10.827 indelov [42].
Ker se sev BY4741 od referenčnega seva S288c ne razlikuje, razen v delecijah pogosto uporabljenih selekcijskih označevalcev [41], pričakujemo, da je genetska razlika med izbranima sevoma v preostalih regijah enaka razliki med referenčnim in vinskim sevom ter zadostna, da lahko služi vzročnemu povezovanju polimorfizmov s kopičenjem založnih lipidov. Po zmožnosti kopičenja založnih lipidov se BY4741 in AWRI1631 znatno razlikujeta. V stacionarni fazi rasti, na minimalnem gojišču, sev BY4741 nakopiči le 1,5 % založnih lipidov glede na suho težo, medtem ko je sev AWRI1631 zmožen kopičiti več kot enkrat več založnih lipidov, in sicer 4,1 % suhe teže [1], [40].
1.4.2 Analiza X-QTL
Po križanju so v subpopulaciji haploidnih segregant prve filialne generacije (F1) z visokim deležem založnih lipidov določili 8 QTG, katerih nesinonimni polimorfizmi izvirajo pretežno iz enega izmed staršev in katerih funkcija še ni bila povezana s kopičenjem lipidov. Od 8 QTG, je sedem takih (PIG1, PHO23, AQR1, PML39, SWH1, AFI1 in ZDS2) imajo obogaten alel seva AWRI1631 in tako je alelna varianta tega seva
8
superiorna. En gen, in sicer RML2, pa pretežno izvira iz seva BY4741. Tako je varianta gena RML2AWRI1631 inferiorna napram RML2BY4741. Izmed naštetih genov smo za nadaljnjo študijo izbrali tri - PIG1, PHO23 in RML2. Prva dva smo izbrali, saj sta, glede na polimorfizme, imela najvišjo napovedno moč določitve QTL. RML2 pa smo izbrali, ker je bil edini izmed določenih QTG, ki je pretežno izviral iz starševskega seva z nizko vsebnostjo lipidov. Njihov kvantitativni doprinos k kopičenju lipidov je bil potrjen s pripravo delecijskih mutant, zamenjavo alelov in sledečo kvantifikacijo založnih lipidov.
Še dodatna potrditev genov pa izhaja iz povratnega križanja segregante z najvišjo vsebnostjo založnih lipidov posamezne filialne generacije v izbrani starševski liniji, z izbranim starševskim sevom [1].
1.4.3 Kandidatni vzročni geni: PIG1, RML2 in PHO23
Funkcionalnost kandidatnih vzročnih genov še ni bila direktno povezana z akumulacijo založnih lipidov, čeprav gena RML2 in PHO23 lahko, posredno, povežemo z drugimi mehanizmi, vpletenimi v metabolizem lipidov. Zapis za protein Rml2 se nahaja na 5.
kromosomu in zapisuje veliko podenoto mitohondrijskega ribosomskega proteina. Poleg translacije v mitohondrijih njegovo funkcijo povezujejo z regulacijo transkripcijskega faktorja Adr1. Ta, med drugim uravnava izražanje genov, vpletenih v β-oksidacijo maščobnih kislin [8], [43]. Mutanta RML2, označena s fat21 (Pro-65-His), ni sposobna inducirati β-oksidacije oleinske kisline v peroksisomih, pri čemer pa prevzem same oleinske kisline in njena vključitev v glicerolipide nista spremnjena. Mutanta fat21 prav tako kaže letalno, negativno interakcijo z ničelno mutacijo v genu OLE1. Ta nosi zapis za Δ9-desaturazo, potrebno za sintezo maščobnih kislin ter pravilno ločevanje mitohondrijev [8], [44].
Produkt gena PHO23, ki je zapisan na kromosomu 14, je protein Pho23. Gre za komponento regulatornega histon deacetilacijskega kompleksa (ang. Histone deacetylase, HDAC) Rpd3L, vključenega v organizacijo kromatina, avtofagijo, preoblikovanje ter utišanje telomer in uravnavanje transkripcije kot odgovor na celični stres v primeru pomanjkanja glukoze ali visoke temperature [8], [45]. V kompleksu Rpd3L je Pho23 ključen, saj izguba njegove funkcije povzroči nefunkcionalnost kompleksa [45]. Tarča kompleksa Rpd3L je poleg globalne regulacije številnih procesov tudi promotor gena INO1. Ta kodira inozitol-3-fosfat sintazo, ki je vključena v sintezo inozitol fosfatov ter fosfolipidov, ki vsebujejo inozitol [8].
Pig1 je zapisan na 12. kromosomu in povezuje katalitično podenoto protein fosfataze tipa 1 (ang. Protein Phosphatase type 1, PP1) Glc7 z glikogen sintazo Gsy2 [8], [46]–[48].
Njegova poznana in opisana vloga je v uravnavanju biosinteze in kopičenja glikogena.
Glede na gensko ontologijo (ang. Gene Ontology, GO) spada Pig1 med regulatorje protein fosfataze, ima pa tudi paralog - Gac1, ki naj bi nastal ob podvojitvi celotnega genoma [8]. Identičnost zaporedij (april 2021) je ocenjena na 32 % [49], čeprav v
9
literaturi najdemo podatek o 38-odstotni identičnosti več kot 230 aminokislin dolgega segmenta [47].
Kot že omenjeno, izbrani kandidatni geni analize QTL med sevoma BY4741 in AWRI1631 nosijo nesinonimne polimorfizme. Ti so predstavljeni v tabeli 1. RML2 in PHO23 imata zgolj po en nesinonimen polimorfizem, pri čemer se alela gena PHO23 razlikujeta samo po dveh polimorfizmih (en sinonimen, drug nesinonimen), alela gena RML2 pa štirih polimorfizmih (trije sinonimi, en nesinonimen). Alela gena PIG1 po drugi strani ne kažeta tako visoke identičnosti. PIG1AWRI1631 nosi v primerjavi z referenčnim alelom kar 23 polimorfizmov, od katerih je 14 nesinonimnih. Na aminokislinski ravni gre za odstopanje v 2,16 % (14 od 649 aminokislin), na nukleotidni ravni pa to predstavlja razliko v 1,18 % celotnega zaporedja (23 od 1947 nt). Sledi, da imata alela 97,84-odsotno identičnost na proteinski ravni ter 98,82-odstotno identičnost na nukleotidni ravni [1], [50].
Tabela 1. Nesinonimni polimorfizmi izbranih kandidatnih genov med aleloma referenčnega seva (S288c) in vinskega seva AWRI1631.
Gen SNP Sprememba
aminokisline
PIG1
A533G Y178C
G551A G184E
A868G T290A
G1075A G359R
T1114C E372K
C1237T S412P
C1520T S507 L
C1528G Q510E
G1673A R558K
A1675C K559Q
G1735C A579P
C1814A T605N
C1883T T628I
C 1908A H636Q
PHO23 G572A S191N
RML2 C74T P25L
10
1.5 Funkcijska genomika in interaktomika
Pig1 so, z najvišjo napovedno močjo določitve QTL-a, določili kot glavni kandidatni vzročni gen kopičenja založnih lipidov v kvasovki [1]. Znatno število nesinonimnih polimorfizmov med izbranima sevoma dopušča spremenjeno funkcionalnost ter spremenjen interakcijski profil gena oziroma proteina. Interakcijski profil je nabor interakcijskih partnerjev oziroma interaktorjev neke celične komponente (proteina, gena, male molekule, nukleinske kisline) in predstavlja le del celokupnega interaktoma.
Interakcijski profil gena/proteina izbranega seva zato lahko kaže na vpliv genetskega ozadja na izražanje izbrane fenotipske lastnosti. Preučevanje interaktoma, tj. celostnega nabora medsebojnih posrednih ali neposrednih interakcij med celičnimi komponentami (proteini, geni, malimi molekulami, nukleinskimi kislinami) [51], spada pod okrilje funkcijske genomike. Z njo želimo, bodisi na genomski, bodisi sistemski ravni, pojasniti funkcijo celičnih komponent in jih tako umestiti v kompleksno celično arhitekturo, da bi lahko pojasnili povezavo med genotipom in fenotipom, dinamiko znotraj celice ter morebitno povezavo z zunanjimi vplivi [52]. Pojasnjevanje funkcije na podlagi interakcijskih profilov je mogoče, saj komponente, ki so v interakciji, običajno sodelujejo v biokemijski poti ali si delijo »globalno« funkcionalnost v celici [51].
Interaktom s posameznimi interakcijskimi profili prikazujemo z biološkimi omrežji, ki slonijo na teoriji grafov. Vsak graf ponazarja razmerje med členi; v tem smislu točke ali vozlišča predstavljajo celične komponente (proteini, geni, metaboliti, nukleinske kisline), povezave med njimi pa njihove interakcije. Dolžina povezave načeloma ponazarja moč interakcije, v nekaterih omrežjih pa lahko z njimi ponazarjamo tudi usmerjenost interakcije. Za večino bioloških omrežij velja, da so od merila neodvisna in neuniformna.
To pomeni, da ima večina komponent le nekaj povezav oziroma interakcij, manjši del komponent pa ima relativno veliko povezav in predstavljajo t.i. zvezdišča. Več
»podmrežij« s strukturo zvezdišč se hierarhično združuje v večja omrežja, ki imajo prav tako strukturo zvezdišč. Vzpostavi se prepletena, večplastna genetska arhitektura, ki predstavlja genetsko ozadje osebka. Strukturo hierarhične organiziranosti interakcijskih profilov prikazuje slika 1, ki hkrati predstavlja nekaj glavnih bioloških omrežij: omrežje genetskih interakcij, proteinskih interakcij, regulatorno omrežje, s kinazami pogojeno regulatorno mrežo ter metabolno mrežo [51], [53].
11
Slika 1. Glavni tipi bioloških omrežij. A: Regulatorno omrežje, B: Omrežje genetskih interakcij, C: S kinazami pogojena regulatorna mreža, D: Metabolna mreža, E: Omrežje proteinskih interakcij (prirejeno po [53]).
1.5.1 Genetske interakcije
Omrežja genetskih interakcij lahko napovejo povezavo med geni ter pripadajočimi biološkimi potmi, s tem pa omogočajo razumevanja razmerja med genotipom in fenotipom. Hkrati nam lahko podajajo odgovore na dedljivost ali celo dajejo informacije o pomanjkljivo določenih genetskih determinantah preiskovanih fenotipskih lastnosti [54], [55].
Ločimo dva osnovna tipa genetskih interakcij. Pozitivne genetske interakcije ter negativne genetske interakcije. Prve so definirane kot tiste, pri katerih kombinacija delecijskih mutant dveh genov rezultira v večji kvantitativni vrednosti preučevane lastnosti od pričakovane glede na vrednost iste lastnosti pri posameznih enojnih delecijskih mutantih. Negativne genetske interakcije pa so tiste, pri katerih kombinacija delecijskih mutant rezultira v manjši vrednosti lastnosti od pričakovane [54]–[57].
Običajno, ne pa nujno, se pri preučevanju genetskih interakcij navezujemo na fitnes, ki ga tako pri kvasovkah kot tudi ostalih mikroorganizmih merimo s hitrostjo celične rasti oziroma frekvenco delitve celic. Zato za določanje genetskih interakcij uporabljamo kvantitativne ter semikvantitativne metode, ki slonijo na določanju sposobnosti celične rasti in/ali hitrosti celične rasti [58].
12
Vsak gen ima v dani celici svoj genetski interakcijski profil, ki je sestavljen tako iz negativnih, kot tudi pozitivnih genetskih interakcij ter predstavlja kvantitativno mero funkcijske podobnosti z drugimi geni. Več genov s funkcijskimi podobnostmi se v interakcijsko mrežo vključuje v skupkih (ang. clusters), več slednjih nato v skupke višje hierarhije, vse do celokupnega genetskega interaktoma vseh genetskih interakcij dane celice. Funkcijska podobnost se neposredno navezuje na vlogo v podobnih biokemijskih procesih. Geni v podobnih bioloških procesih imajo lahko skupne interaktorje, njihovi produkti - torej proteini, pa običajno sodelujejo v isti biokemijski poti ali sodelujejo v kompleksu. Iz tega sledi, da imajo proteini podobne interakcijske profile kakor geni in se proteinska ter genetska interakcijska omrežja prekrivajo [54]–[57], [59].
Za omrežje gentskih interakcij esencialnih genov kvasovke so tudi ugotovili, da je 5-krat gostejše kakor omrežje neesencialnih genov [54], [55], [59]. Hkrati pa ima večina genov kvasovke v svojem interakcijskem profilu vsaj en esencialen gen. Delno funkcionalni aleli esencialnih genov (hipomorfni) velikokrat rezultirajo v sintetični letalnosti, če so v kombinaciji z delecijskimi aleli neesencialnih genov ali enim od preostalih hipomorfnih alelov [59].
1.5.2 Dobzhansky-Mullerjev model nekompatibilnosti
Negativne genetske interakcije med geni, ki so bili podvrženi funkcionalni, genetski divergenci znotraj dveh sorodnih taksonomskih entitet, lahko povzročajo hibridno nekompatibilnost potomcev filialne generacije F1, kadar se ti sorodni entiteti križata.
Fenotipsko se inkompatibilnost lahko kaže v obliki ekološke maladaptacije (zmanjšanega fitnesa), neviabilnosti ali sterilnosti. Nastane kot posledica reprodukcijske izolacije ter podvrženosti selekcijskemu pritisku v vsaj eni od ločenih populacij. Tako namreč pride do genetsko različnih in neodvisnih taksonomsko sorodnih entitet, ki so rezultat evolucijskega procesa speciacije [60]–[63].
Genetsko osnovo hibridne nekompatibilnosti sta preučevala Theodosius Dobzhansky in Hermann Joseph Muller, ki sta, neodvisno eden od drugega, vzpostavila t.i. Dobzhansky- Mullerjev model, ki razlaga, kako se hibridna nekompatibilnost lahko razvije.
Predpostavila sta, da sta za nekompatibilnost potrebna vsaj dva divergentna alela. V primeru, kadar v eni od populacij pride do negativne dominance, tj. kadar se razvijejo heterozigoti z inferiornim genotipom ter vodijo v neviabilnost ali sterilnost, na-pram bodisi dominantnim, bodisi recesivnim homozigotom, bi se namreč tak alel iz genetskega sklada izločil, saj ne bi omogočil reprodukcije heterozigotov. Močno inferiorni aleli sami po sebi zato ne morejo povzročati nekompatibilnosti, lahko pa povzročajo neskladje v kombinaciji z drugim alelom, kadar pride do križanja. Selekcijski pritisk v reprodukcijsko ločeni populaciji torej lahko vodi do divergentnega alela, ki dani populaciji lahko tudi daje prednost v določeni ekološki niši in celo poveča fitnes. Ob srečanju in križanju z drugo, genetsko različno populacijo, pa lahko tak alel tvori nekompatibilne genetske interakcije, ki rezultirajo v zmanjšanem fitnesu, neviabilnosti ali sterilnosti [60]–[63].
13
1.5.3 Proteinske interakcije
Upoštevajoč osrednjo biološko dogmo in dejstvo, da se interakcijski profili genetskih in proteinskih interakcij v veliki meri prekrivajo, ni presenetljivo, da se ob preučevanju funkcionalnosti genov hkrati navezujemo na funkcionalnost njihovih produktov - proteinov. Proteinske interakcije oziroma interakcije protein-protein (ang. Protein- Protein Interactions, PPI) definiramo kot neposredne ali fizične interakcije med dvema ali več proteini. Predstavljajo največji ter najbolj raznolik nabor celičnih interakcij in so nepogrešljive tako za pravilno strukturo celic, kakor tudi za dinamiko in organizacijo večine celičnih procesov [51], [53], [64]–[66].
Ločevanje in razvrščanje PPI je lahko odvisno od številnih kriterijev; tako jih lahko ločimo glede na identičnost proteinskih enot v oligomerih (homooligomeri napram heterooligomerom), trajnost interakcije (prehodne ali trajne) ali moč interakcije (šibke, srednje močne, močne). Ker pa nekatere podenote same zase niso stabilne in/ali same zase nimajo biološke funkcije, je lahko kriterij razvrstitve tudi obveznost povezovanja v komplekse (obvezne ter neobvezne interakcije) [67].
Precej raziskav na proteomski ravni temelji na predpostavki, da lahko identifikacija interakcijskih partnerjev proteinov z neznanimi funkcijami omogoči vpogled v njihovo biološko vlogo [65]. Številne genetske, biokemijske, biofizikalne ter računalniške pristope so uporabili za določevanje proteinskih interakcij. Od teh so le genetski in biokemijski omogočali visoko zmogljivost za določanje ter hkratno potrditev celostnih interaktomov organizmov [64], [65]. Prva in najširše uporabljena metoda za preučevanje PPI je dvohibridni sistem kvasovke (ang. Yeast Two-Hybrid system, YTH). Spada med in vivo genetske metode določanja PPI, med katere uvrščamo tudi druge komplementacijske teste s proteinskimi fragmenti (ang. Protein fragment Complementation Assays, PCA). V obeh primerih gre za metode, ki so v glavnem namenjene za določanje binarnih interakcij. Za določanje interakcij proteinskih kompleksov pa so bolj primerne biokemijske metode tandemskega afinitetnega čiščenja (ang. Tandem Affinity Purification, TAP), sklopljene z masno spektrometrijo [64]–[66].
1.5.4 Dvohibridni sistem kvasovke
Dvohibridni sistem kvasovke sta razvila in leta 1989 prvič predstavila Stanley Fields in Ok-kyu Song. Uporabila sta obstoječa znanja o modularni zgradbi transkripcijskega aktivatorja Gal4 kvasovke za pripravo genetskega sistema, ki posredno, z izražanjem poročevalskega proteina, omogoča določanje proteinskih interakcij in vivo [68].
Gal4 je eden izmed regulatornih proteinov, ki v kvasovki uravnavajo rast na sekundarnem viru ogljika - galaktozi. Tranksripcijski regulator inducira izražanje genov GAL tako, da se veže na zgornja aktivacijska zaporedja (ang. Galactose Upstream Activation Sequence, UASGAL) njihovih regulatornih regij. Število elementov UASGAL ter njihova afiniteta za
14
vezavo Gal4 med regulatornimi regijami genov GAL variirata. V genomu kvasovke so določili približno 300 potencialnih vezavnih mest, nekatera od teh se nahajajo tudi znotraj ORF-ov. Gal4 je 881 aminokislinskih ostankov dolg protein (~92 kDa), sestavljen iz številnih domen; na N-končnem delu je DNA-vezavna domena (ang. DNA Binding Domain, BD) s strukturo cinkovih prstov, sledita povezovalna in dimerizacijska domena.
Ima še regulatorno domeno na C-končnem delu, kamor se veže njegov represor Gal80, ter aktivacijsko domeno (ang. DNA Activation Domain, AD), ki jo sestavljata dve kisli regiji - ARI in ARII (ang. Activation Region I/II). Gal4 se kot homodimer veže na prepoznavno 17-merno zaporedje 5'-CGG-N11-CCG-3', pri čemer se cinka znotraj BD direktno povežeta s CGG elementi na vsaki strani tega prepoznavnega zaporedja, povezovalna in dimerizacijska domena pa sta v interakciji s fosfatnimi skupinami vmesnega 11-mernega zaporedja. AD aktivira izražanje posredno, s pomočjo kofaktorjev in povezave z osnovnim transkripcijskim kompleksom [64], [68], [69].
Pri dvohibridnem sistemu kvasovke imata preučevana proteina, imenovana vaba (ang.
bait, npr. protein »X«) in plen (ang. pray, npr. protein »Y«), fuzijo z eno od dveh glavnih (BD in AD) domen transkripcijskega aktivatorja Gal4. V osnovni različici metode je vaba imela fuzijo z DB, plen pa fuzijo z AD. Ob obstoječi interakciji med vabo in plenom (»X«
in »Y«), se AD in DB zbližata in združita v funkcionalen transkripcijski aktivator, ki se lahko veže na funkcionalne elemente UASGAL promotorja PGAL1. Pod kontrolo PGAL1 so običajno zapisi za selekcijske in poročevalske proteine, kot je na primer zapis za β- galaktozidazo. Ti nam nato omogočajo odbiranje le tistih parov, ki so sposobni interagirati [64], [68], [70], [71].
Iz prvotne različice metode so do danes razvili številne izpeljanke, ki ne omogočajo zgolj detekcije binarnih proteinskih interakcij, ampak tudi interakcije med tremi proteini (trihibridni sistem), med membranskimi proteini (ang. Membrane Yeast Two Hybrid, MYTH), ter interakcije med proteini in nukleinskimi kislinami. Princip metode so uporabili tudi v drugih organizmih, tako danes poznamo vsaj še bakterijske in sesalske dvohibridne sisteme. S pomočjo razvite metode so z obsežnimi študijami sistematično določili večinski del interaktoma ne samo kvasovke S. cerevisiae, temveč tudi številnih drugih organizmov, kot so na primer Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans ter človeka [53], [64], [68], [70], [72]–[74].
1.5.5 S črtnimi kodami združen dvohibridni sistem kvasovke
Visokozmogljiva različica YTH, ki izkorišča prednosti sekvenciranja naslednje generacije (ang. Next Generation Sequencing, NGS) ter uporabe črtnih kod, imenujemo s črtnimi kodami združen dvohibridni sistem kvasovke (ang. Barcode Fusion Genetics- Yeast Two-Hybrid; BFG-YTH). Metodo so razvili za določitev ter dopolnitev človeškega interaktoma proteinskih interakcij ter je omogočala določiti približno 53.000 proteinskih interakcij v človeku [75], [76]. Od klasične različice se razlikuje predvsem po tem, da matriko interakcij vseh proteinskih parov pridobimo iz enega samega množičnega zbirka
15
(ang. pool) sevov. Visoka zmogljivost, v smislu praktičnosti, ekonomičnosti ter sposobnosti razširitve na višjo skalo, omogočimo z uporabo črtnih kod, ki se, če proteina interagirata, izmenjajo med plazmidnimi vektorji s pomočjo rekombinaze Cre ter omogočajo semikvantifikacijo interakcij [75].
Haploidni sevi za izvedbo BFG-YTH so pripravljeni tako, da vsak nosi bodisi plazmid plena, bodisi plazmid vabe. Pri tem vsak znan protein nastopa enkrat kot plen, enkrat kot vaba. Vsak plazmid hkrati nosi lokus dveh črtnih kod (ang. Barcode 1/ 2; BC1 in BC2), pri čemer je ena od njih med prepoznavnimi zaporedji lox rekombinaze Cre. Vaba ima znotraj mest lox črtno kodo 1 (BC1), plen ima med mesti lox črtno kodo 2 (BC2).
Haploidna seva, imenovana komplet orodja-a (ang. toolkit-a, sev RY1010) in komplet orodja-α (ang. toolkit-α, sev RY1030), se ne razlikujeta zgolj po paritvenem tipu, ampak tudi po tem, da orodje-a izraža rtTa, orodje-α pa nosi zapis za rekombinazo Cre, ki je pod kontrolo promotorja PtetO2. Komplet orodja-a transformiramo s plazmidom plena, komplet orodja-α pa s plazmidom vabe. Knjižnice vab in plenov križamo en masse, da nastanejo vse kombinacije diploidnih celic. Množičen zbirek diploidnih celic nato podvržemo selekciji, kot je to značilno za klasični YTH. Če sta torej proteina v interakciji, se transkripcijski aktivator Gal4 sestavi ter sproži izražanje selekcijskega gena (v tem primeru gena HIS3) in celica je kos selekciji. Preživijo torej samo celice, v katerih je prišlo do interakcije med proteinskim parom ter pravilne sestave ter delovanja transkripcijskega faktorja Gal4. Zbirek celic, ki ga odberemo po selekciji, nadalje podvržemo delovanju doksiciklina, ki inducira izražanje rekombinaze Cre v smislu sistema Tet-On. Rekombinaza Cre se veže na svoja prepoznavna mesta lox in v diploidnih celicah izmenja črtne kode med plazmidi vab in plenov. V vsaki celici tako nastaneta dve himerni kombinaciji črtnih kod (BC1-BC1 ter BC2-BC2), ki predstavljata interakcijo proteinskega para. Lizi celic ter pomnoževanju črtnih kod sledi masovno paralelno sekvenciranje, analiza odčitkov NGS in semikvantifikacija vseh zaznanih črtnih kod proteinskih parov [75].
1.5.6 Bimolekulska fluorescenčna komplementacija
Dvohibridni sistemi so po svoji osnovi arhetipska oblika komplementacijskega testa s proteinskimi fragmenti (ang. Protein fragment Complementation Assays, PCA). Osnova vseh teh metod je namreč v tem, da ob interakciji preučevanih proteinov pride do zbližanja proteinskih fragmentov, ki so bili razcepljeni in preko distančnika povezani nanje. Fragmenti sami zase niso funkcionalni, zaradi s proteinsko interakcijo pogojene neposredne bližine pa se ti lahko povežejo v funkcionalen protein in opravlja svojo biološko funkcijo [66], [77]–[82].
Za razliko od YTH, kjer pravilno sestavljen razcepljen protein Gal4 omogoča izražanje poročevalskih proteinov, so pri komplementacijskih testih poročevalski proteini tisti, ki so razcepljeni. Primer takih poročevalskih proteinov so β-galaktozidaza, β-laktamaza, ubikvitin ali fluorescenčni proteini. Najširše uporabljena metoda komplementacijskega
16
testa z razcepljenimi proteini je bimolekulska fluorescenčna komplementacija (Bimolecular Fluorescent Complementation, BiFC). Gre za metodo, pri kateri imata preučevana proteina fuzijo z bodisi N-končnim, bodisi C-končnim fragmentom razcepljenega fluorescenčnega proteina. V prvi, osnovni različici je reporterski protein predstavljal zeleni fluorescenčni protein (ang. Green Fluorescent Protein, GFP). Kasneje pa so za ta namen razvili številne izboljšane različice, kot so na primer mVenus, rdeči fluorescenčni protein (ang. Red Fluorescent Protein, RFP) ali mCherry. Ob interakciji med preučevanima proteinoma se fragmenta reporterja sestavita v delujoč protein, ki ob presvetlitvi celic s svetlobo ustrezne valovne dolžine začne emitirati fluorescenčni signal.
Proučevane proteine izražamo endogeno, pod nativnimi promotorji. To daje tej metodi prednost pri preučevanju interakcij v odvisnosti od vzorca izražanja. Ker pa je vzorec izražanja v veliki meri pogojen z vplivi iz okolja, BiFC omogoča umeščanje PPI v celični kontekst preučevanja dinamike interakcij pod različnimi vplivi ter ob različnih časovnih točkah. Omogoča tudi lokalizacijo interakcij znotraj celičnih predelkov ter (semi)kvantifikacijo preko linearne zveze med močjo interakcije in močjo fluorescence [66], [77]–[82].
17
2 Namen dela in hipoteze
V magistrskem delu smo želeli, preko dopolnitve interakcijskega profila, preveriti, ali je gen PIG1 vključen v procese kopičenja nevtralnih lipidov v kvasovki S. cerevisiae.
Osrednji namen dela je bil torej določiti nove genetske in proteinske interaktorje PIG1 oziroma Pig1 ter poiskati posredne ali neposredne povezave z geni, vpletenimi v lipidni metabolizem.
Izhodišče za to delo je bila predhodna študija, osnovana na analizi X-QTL povezovanja izbrane kompleksne lastnosti z genotipom dveh divergentnih sevov kvasovke, v kateri je bil PIG1 določen kot gen z največjim doprinosom k izbranemu kvantitativnemu fenotipu med izbranima sevoma.
Domnevamo, da je skrajna fenotipska variabilnost sposobnosti kopičenja lipidov med izbranima sevoma, laboratorijskim sevom BY4741 ter vinskim sevom AWRI1631, pogojena s pripadajočimi polimorfizmi ter posredno spremenjeno funkcionalnostjo kandidatnih genov. Alelni varianti PIG1 sevov BY4741 in AWRI1631 imata namreč znatno število nesinonimnih polimorfizmov, kar potencialno rezultira v odstopanju njunih interakcijskih profilov in posledični divergentni funkcionalnosti, odvisni od genetskega ozadja. Stranski namen magistrskega dela zato vključuje primerjavo genetskih in proteinskih interakcij obeh variant zapisov PIG1, z domnevo, da se vrste in moči interakcij med njima razlikujejo.
Prizadevali smo si določiti genetske interakcije med variantami glavnih kandidatnih genov omenjene QTL študije, in sicer PIG1, RML2 in PHO23. V nadaljevanju smo si želeli določiti še nove proteinske interaktorje proteinskih variant Pig1, zato smo na podlagi rezultatov BFG-YTH študije, ki so jo izvedli v sodelujoči raziskovalni skupini prof. Fredericka P. Rotha (Univerza v Torontu, Kanada), izbrali nekaj potencialnih interaktorjev ter jih s klasičnimi pristopi poskušali potrditi.
V okviru magistrskega dela smo želeli preveriti veljavnost naslednjih hipotez:
1. Gen PIG1 je v genetski interakciji z geni lipidnega metabolizma kvasovke S.
cerevisiae.
2. V genetskem interaktomu kvasovke S. cerevisiae obstajajo razlike, odvisne od prisotnosti specifične alelne variante PIG1 iz sevov BY4741 oziroma AWRI1631.
3. Med proteinskima interaktomoma sevov BY4741 in AWRI1631 kvasovke S.
cerevisiae obstajajo razlike.
19
3 Materiali in metode
3.1 Materiali
3.1.1 Organizmi in sevi
V tem delu smo v glavnem uporabili dva organizma; kvasovko S. cerevisiae ter bakterijo E. coli (tabela 2).
Bakterija E. coli seva DH5α smo uporabili predvsem za pripravo plazmidnih vektorjev in za trajno shranjevanje le-teh. Uporabljena starševska seva kvasovke S. cerevisiae sta že omenjena vinski sev AWRI1631 ter laboratorijski sev S288C (BY4741). Preostale seve teh dveh linij smo pripravili z genetskimi spremembami, bodisi za namen te magistrske naloge s spodaj opisanimi metodami, bodisi so bile že uporabljene za ostale študije. Sev PJ69-4a smo uporabili za namen potrjevanja proteinskih interakcij z metodo dvohibridnega sistema kvasovk.
Tabela 2. Pregled uporabljenih organizmov.
Organizem/sev Genotip Vir
E.coli DH5α
F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA- argF)U169 hsdR17(rK- mK+) λ–
Institut "Jožef Stefan"
S. cerevisiae PJ69- 4a
MATa trp1-901 leu2-3,112 ura3-52 his3- 200 gal4Δ gal80Δ LYS2::GAL1pr-HIS3 GAL2pr-ADE2 met2::GAL7pr-lacZ
Institut "Jožef Stefan"
Sevi S. cerevisiae linije S288c
BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
Institut "Jožef Stefan"
BY4741 PHO23AWRI1631
Institut "Jožef Stefan"
BY4741 PIG1 AWRI1631
Institut "Jožef Stefan"
BY4741 RML2 AWRI1631
Institut "Jožef Stefan"
BY4741 PHO23 AWRI1631 PIG1 AWRI1631
Institut "Jožef Stefan"
BY4741 PIG1 AWRI1631 RML2AWRI1631
Institut "Jožef Stefan"
20
BY4741 RML2AWRI1631 PHO23 AWRI1631
Institut "Jožef Stefan"
BY4741 PIG1 AWRI1631 RML2AWRI1631 PHO23 AWRI1631
Institut "Jožef Stefan"
BY4741 PIG1-VC To delo
BY4741 PIG1 AWRI1631-VC To delo
BY4741 PIG1-VC GSY2-VN To delo
BY4741 PIG1-VC GSY1-VN To delo
BY4741 PIG1-VC MGA2-VN To delo
BY4741 PIG1-VC OLE1-VN To delo
BY4741 PIG1 AWRI1631-VC GSY2-VN To delo
BY4741 PIG1 AWRI1631-VC GSY1-VN To delo
BY4741 PIG1 AWRI1631-VC MGA2-VN To delo
BY4741 PIG1 AWRI1631-VC OLE1-VN To delo
Sevi S. cerevisiae linije AWRI1631
AWRI1631 MATa hoΔ Institut "Jožef
Stefan"
AWRI1631 RML2BY4741 Institut "Jožef
Stefan"
AWRI1631 PIG1BY4741 Institut "Jožef
Stefan"
AWRI1631 PHO23BY4741 Institut "Jožef
Stefan"
AWRI1631 PHO23BY4741 PIG1BY4741 Institut "Jožef Stefan"
AWRI1631 PIG1 BY4741 RML2 BY4741 Institut "Jožef Stefan"
AWRI1631 RML2 BY4741 PHO23 BY4741 Institut "Jožef Stefan"
AWRI1631 PIG1 BY4741 RML2 BY4741 PHO23 BY4741 Institut "Jožef Stefan"
AWRI1631 PIG1-VC To delo
AWRI1631 PIG1 AWRI1631-VC To delo
AWRI1631 PIG1-VC GSY2-VN To delo
AWRI1631 PIG1-VC GSY1-VN To delo
AWRI1631 PIG1-VC MGA2-VN To delo
AWRI1631 PIG1-VC OLE1-VN To delo
AWRI1631 PIG1 BY4741-VC GSY2-VN To delo
AWRI1631 PIG1 BY4741-VC GSY1-VN To delo
AWRI1631 PIG1 BY4741-VC MGA2-VN To delo
AWRI1631 PIG1 BY4741-VC OLE1-VN To delo
21
3.1.2 Plazmidni vektorji
V tem delu so bili uporabljeni plazmidni vektorji, zapisani v tabeli 3.
Tabela 3. Pregled uporabljenih plazmidov.
Plazmid Vir
pGBKT7 Institut "Jožef Stefan"
pGADT7 Institut "Jožef Stefan"
pGBKT7-hMLH1 Institut "Jožef Stefan"
pGADT7-hPMS2 Institut "Jožef Stefan"
pGBKT7-PIG1 BY To delo
pGBKT7-PIG1 AW To delo
pGADT7-GSY2 BY To delo
pGADT7-GSY2 AW To delo
pFA6a-KanMX6-Prpl7b-VN Institut "Jožef Stefan"
pFA6a-His3MX6-Prpl7b-VC Institut "Jožef Stefan"
22
3.1.3 Kemikalije, pufri, komercialni kompleti in laboratorijski materiali
V tem poglavju so nanizane tabele, kjer so v tabeli 4 zapisane uporabljene kemikalije, v tabeli 5 je pregled uporabljenih materialov, v tabeli 6 uporabljenih komercialnih kompletov ter v tabeli 7 pregled uporabljenih pufrov.
Tabela 4. Pregled kemikalij.
Kemikalija Proizvajalec
1,4-ditiotreitol (DTT) Thermo Scientific
10× FastDigest Green Buffer; pufer za rezanje z
restrikcijskimi encimi Thermo Scientific
3-(N-morfolino)propansulfonska kislina (MOPS) Sigma
adenin 99 % Alfa Aesar
agar Formedium
agaroza Sigma
ampicilin Sigma
bacto Tripton Becton-Dickinson
bacto-Pepton Sigma
betain Merck
CaCl2 × 2H2O Sigma
CSM (-his) Formedium
CSM (-leu -trp) Formedium
CSM (-leu-trp-ade-his) Formedium
deionizirana voda (dH2O)
dimetilsufoksid (DMSO) Sigma
EDTA Serva
enoverižna DNA iz lososovih spermijev Sigma
etanojska kislina J.T. Baker
etanol (EtOH) 96 %, 75 %, 70 % Carlo Erba
geneticin Sigma
glicerol VWR BDH
Chemicals
glicerol 99,5 % VWR BDH
Chemicals
glukoza Sigma
glukoza (dekstroza) Sigma
goveji serumski albumin (BSA) Sigma
imerzijsko olje 518 F ZEIZZS
izopropanol Carlo Erba
kanamicin Sigma
kvasni ekstrakt Sigma
lestvica DNA GeneRuler (1 kb) Thermo Scientific
23
lestvica DNA GeneRuler (100 bp) Thermo Scientific
litijev acetat dihidrat Sigma
mešanica dNTP Thermo Fischer
MgCl2 Merck
MgCl2 25 mM Thermo Scientific
Midori Green barvilo za barvanje DNA Nippon Genetics
MQ voda Merck Millipore
N,N-dimetilformamid Carlo Erba
Na2HPO4 Serva
NaCl Merck
NaH2PO4 Serva
nanašalni pufer (6×) Thermo Fischer
natrijev dodecilsulfat (SDS) Fischer Bioreagents
nikotinamid adenindinukleotid (NAD) Roth
polietilenglikol 3350 Sigma
pufer za DNA-polimerazo Phusion Hot Start High- Fidelity
New England biolabs (NEB)
pufer za DNA-polimerazo Q5 Hot Start High-Fidelity New England biolabs (NEB)
pufer za DNA-polimerazo Taq Thermo Scientific
rapamicin Thermo Scientific
RbCl2 Sigma
sredstvo proti bledenju (Antifade soluton) Sigma
tris Serva
tris - ocetna kislina - EDTA (TAE) pufer Sigma
varikina (natrijev hipoklorid) Kemika
X-Gal Fermentas
YNB z amonijevim sulfatom Formedium
YPD Formedium
