Ljubljana, 2021 Eva Gartner DELO DIPLOMSKO ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

DIPLOMSKO DELO

Eva Gartner

Ljubljana, 2021

(2)

(3)

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE

BIOKEMIJA

Priprava celičnih modelov s stabilnim izražanjem proteinov z dipeptidnimi ponovitvami in ovrednotenje njihove vloge

DIPLOMSKO DELO

Eva Gartner

Mentor: prof. dr. Boris Rogelj

Ljubljana, 2021

(4)

(5)

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisana Eva Gartner sem avtorica diplomskega dela z naslovom: Priprava celičnih modelov s stabilnim izražanjem proteinov z dipeptidnimi ponovitvami in ovrednotenje njihove vloge.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof. dr.

Borisa Roglja

• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

• sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, 30. 8. 2021 Podpis avtorice:

(6)

(7)

Zahvala

Eksperimentalni del diplomskega dela sem opravljala na Inštitutu Jožef Štefan na Odseku za biotehnologijo.

Zahvaljujem se delovni mentorici dr. Janji Božič za pomoč in usmeritev pri izvajanju eksperimentalnega dela diplomske naloge, pomoč pri razumevanju teorije v ozadju eksperimenta ter za temeljit pregled zaključnega dela.

Zahvaljujem se mentorju prof. dr. Borisu Roglju za teoretske osnove ter hiter in temeljit pregled zaključnega dela. Zahvaljujem se tudi za hitro odzivnost

Zahvaljujem se članu komisije doc. dr. Gregorju Gunčarju za pregled diplomske naloge in podane komentarje.

Zahvaljujem se tudi vsem zaposlenim na Inštitutu Jožef Štefan, ki so mi kakorkoli pomagali in mi olajšali izvedbo eksperimentalnega dela.

Na koncu pa se zahvaljujem tudi vsem, ki so mi bili v oporo in pomoč pri samem pisanju in oblikovanju končnega diplomskega dela.

(8)

(9)

Priprava celičnih modelov s stabilnim izražanjem proteinov z dipeptidnimi ponovitvami in ovrednotenje njihove vloge

Povzetek:

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) in frontotemporalna demenca (FTD) sta nevrodegenerativni bolezni, za kateri je značilno postopno slabšanje simptomov, ki neizogibno vodijo v smrt. Razlog za razvoj so lahko mutacije v več potencialnih genih. Kot enega izmed ključnih genov za razvoj ALS/FTD se smatra C9orf72. Mutacija se pojavi znotraj prvega introna, v katerem se nahajajo heksanukleotidne ponovitve GGGGCC. V normalnih pogojih jih je manj kot 30, ob mutaciji pa se število lahko poveča tudi na več tisoč. Ena glavnih hipotez, ki ponuja razlago za patološke vplive podaljšanih ponovitev v genu C9orf72, je akumulacija toksičnih agregatov proteinov z dipeptidnimi ponovitvami (DPR). Poznamo pet različnih proteinov DPR: poli(GA), poli(GR), poli(PA), poli(PR) in poli(GP). Nastanejo pri posebni obliki translacije, ki poteka neodvisno od začetnega kodona AUG.

Pripravili smo pet celičnih linij, ki stabilno izražajo proteine DPR s 125 ponovitvami. Iz vnaprej pripravljenih plazmidnih vektorjev smo z restrikcijo izrezali zapise za proteine DPR in jih preklonirali v ekspresijski plazmidni vektor pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop. Želeli smo, da se proteini DPR izražajo skupaj s fluorescenčnim markerjem mScarlet. Ker vsi proteini DPR niso bili v enakem bralnem okvirju kot marker, smo bralni okvir osnovnega ekspresijskega vektorja premaknili za enega oz. dva nukleotida. Z dobljenimi konstrukti smo transficirali Flp- in celično linijo HEK293T. Flp-in sistem nam omogoča integracijo zapisov za proteine DPR v genom celic preko FRT mest, ki se nahajata na osnovnem plazmidu in v genomu celic. Po transfekciji in selekciji celic smo posamezne kolonije pripravili za mikroskopiranje in s fluorescenčno mikroskopijo preverili uspešnost izražanja proteinov DPR. S pomočjo fluorescenčnega markerja mScarlet smo dokazali izražanje proteinov DPR v celici. Ker smo pred mikroskopiranjem dodali tudi barvilo DAPI, smo lahko opazovali tudi lokalizacijo proteinov v celici.

Ključne besede: proteini z dipeptidnimi ponovitvami, ALS, FTD, C9orf72, HEK293T, sistem Flp-in

(10)

(11)

Preparation of cell models with stable expression of dipeptide repeat proteins (DPR) and evaluation of their role

Abstract:

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD) are both neurodegenerative diseases, characterized by gradual progressing symptoms, that inevitably lead to death. Both are connected to mutations in several potential genes. C9orf72 is thought to be one of the key genes involved in development of ALS/FTD. Mutation occurs in the hexanucleotide (GGGGCC) repeats region inside the first intron. Normally there are about 30 repeats, but mutation can raise that number to more than thousand. One of the main hypotheses explaining the pathological effect of extended hexanucleotide repeats is accumulation of toxic proteins with dipeptide repeats (DPR). There are five proteins DPR: poly(GA), poly(GR), poly(PA), poly(PR), poly(GP), which are produced by translation that is independent of the start codon AUG.

We prepared five cell lines that would stably express proteins DPR with 125 repeats. We used restriction to cut fragments of DNA that code for proteins DPR from previously prepared plasmid vectors and cloned them in expression plasmid vector pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop. We wanted proteins DPR to cotranslate with fluorescent marker mScarlet, but not all proteins were in the same reading frame as the marker. For that reason we moved the reading frame of the expression vector for one and for two nucleotides. We transfected Flp-in HEK293T cell line with these constructs. Flp-in system allows us integration of DNA in the genome via Flp recombinase-mediated DNA recombination at the FRT sites, located on expression vector and cell genome. After transfection and cell selection we prepared selected colonies for microscopy and confirmed successful expression of proteins DPR with fluorescent microscopy.

We also added DAPI so we could observe DPR localization in cells.

Keywords: dipeptide repeat proteins, ALS, FTD, C9orf72, HEK293T, Flp-in system

(12)

(13)

Kazalo

1. UVOD ... 1

1.1 ALS IN FTD ... 1

1.2 C9orf72 ... 1

1.2.1 VLOGA MUTACIJE C9orf72 PRI RAZVOJU ALS/FTD ... 2

1.3 MOŽNI MEHANIZMI C9orf72 ALS/FTD ... 4

1.3.1 VPLIV IZGUBE FUNKCIJE GENA NA RAZVOJ C9orf72 ALS/FTD ... 4

1.3.2 VPLIV RNA NA RAZVOJ C9orf72 ALS/FTD ... 5

1.3.3 VPLIV STRESNIH GRANUL NA RAZVOJ C9orf72 ALS/FTD ... 6

1.3.4 VPLIV PROTEINOV DPR NA RAZVOJ C9orf72 ALS/FTD ... 7

1.4 RAN TRANSLACIJA ... 7

1.5 FLP-IN SISTEM ... 9

2. NAMEN DELA ... 10

3. MATERIALI IN METODE ... 11

3.1 MATERIALI ... 11

3.1.1 Laboratorijska oprema ... 11

3.1.2 Kemikalije in pufri ... 12

3.1.2.1 Kemikalije ... 12

3.1.2.2 Pufri ... 12

3.1.3 Kompleti reagentov ... 13

3.1.4 Standardi ... 13

3.1.5 Encimi in ustrezni pufri ... 13

3.1.6 Plazmidni vektorji ... 13

3.1.7 Sintetični oligonukleotidi za premik bralnega okvirja ... 15

3.1.8 Bakterijski sevi in gojišča ... 15

3.1.9 Sesalska celična linija in rastno gojišče ... 15

3.1.9.1 Celična linija HEK293T ... 15

3.1.9.2 Rastno gojišče ... 16

3.2 METODE ... 16

3.2.1 DELO Z NUKLEINSKIMI KISLINAMI ... 16

3.2.1.1 Transformacija bakterijskih celic ... 16

3.2.1.2 Priprava prekonočne kulture bakterijskih celic ... 16

3.2.1.3 Izolacija plazmidne DNA iz kulture bakterijskih celic... 16

3.2.1.4 Agarozna gelska elektroforeza (AGE) ... 18

3.2.1.5 Izolacija plazmidne DNA iz agaroznega gela ... 19

3.2.1.6 Premik bralnega okvirja ... 19

(14)

(15)

3.2.1.6 Kloniranje zapisov za proteine DPR v plazmidni vektor pcDNA5 ... 21

3.2.2 DELO S SESALSKIMI CELICAMI ... 23

3.2.2.1 Priprava celične kulture za transfekcijo ... 23

3.2.2.2 Transfekcija sesalskih celic ... 24

3.2.2.3 Selekcija sesalskih celic ... 25

3.2.2.4 Indukcija izražanja DPR in priprava celic za mikroskopiranje ... 25

3.2.2.5 Mikroskopiranje ... 25

4.REZULTATI ... 26

4.1 ANALIZA KONSTRUKTOV Z VSTAVLJENIMI ZAPISI ZA PROTEINE Z DIPEPTIDNIMI PONOVITVAMI ... 26

4.2 ANALIZA IZRAŽANJA PROTEINOV Z DIPEPTIDNIMI PONOVITVAMI V INDUCIRANIH SESALSKIH CELICAH ... 28

5. RAZPRAVA ... 31

6. ZAKLJUČEK ... 34

7. LITERATURA ... 36

8. PRILOGE ... 39

(16)

(17)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

AGE agarozna gelska elektroforeza

ALS amiotrofična lateralna skleroza (fALS – dedna oblika bolezni) bp bazni par

C9orf72 gen (angl. chromosome 9 open reading frame 72) CMV citomegalovirus

DAPI 4′,6-diamidino-2-fenilindol

DENN proteini (angl. differentially expressed in normal and neoplastic cells) dH2O deionizirana voda

DMEM gojišče za sesalske celice (angl. Dulbecco's Modified Eagle Medium) DPR dipeptidne ponovitve (angl. dipeptide repeat)

EDTA etilendiamintetraocetna kislina FTD frontotemporalna demenca

G4C2 RNA RNA, ki vsebuje heksanukleotidne ponovitve GGGGCC GEF izmenjevalni faktor (angl. guanine nucleotide exchange factor) hnRNPH heterogeni jedrni ribonukleoprotein H

ISR integriran stresni odziv

LBA gojišče Laurija-Bertani z ampicilinom

LCD domena proteina z enostavno sestavo (angl. low complexity domain) Met-tRNA prenašalna RNA, ki nosi aminokislino metionin

p62 nukleoporin p62

PCR verižna reakcija s polimerazo (angl. polymerase chain reaction) RAN translacija neodvisna od začetnega kodona (angl. repeat associated non-AUG) RBP RNA vezavni protein (angl. RNA-binding protein)

SG stresne granule

SOD1 superoksid dismutaza 1 TDP-43 Tar DNA-binding protein 43 tet teraciklin

Tris 2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiol

(18)

(19)

Eva Gartner: Priprava celičnih modelov s stabilnim izražanjem proteinov z dipeptidnimi ponovitvami in ovrednotenje njihove vloge

1

1 UVOD

1.1 ALS IN FTD

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je hitro napredujoča nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna postopna izguba motoričnih nevronov, ki nadzorujejo delovanje skeletnih mišic. Posledično prihaja do mišičnih krčev, togosti in postopnega slabljenja mišic, kar sčasoma vodi v popolno paralizo in smrt. Znaki se pojavljajo zaradi odmiranja zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov, ki izvirajo iz motoričnega predela možganske skorje, možganskega debla in hrbtenjače [1, 2, 3]. Zaradi vedno daljše življenjske dobe se pogostost pojava ALS v bolj razvitih družbah v zadnjih letih povečuje, kljub temu pa je to še vedno redka bolezen. Povprečno se v enem letu ALS razvije pri 2,1 posameznikih na 100 000 ljudi . Pričakovana življenjska doba od pričetka bolezni je 2 do 5 let. V večini primerov se ALS pojavi po petdesetem letu, povprečna starost ob začetku je približno 58 let [3, 4].

Vzroki za ALS so lahko okoljski, genetski ali preplet obojih. V 90 % do 95 % primerov gre za ti. sporadično ALS, pri kateri gre za naključen pojav bolezni brez dedne nagnjenosti ali očitnih faktorjev tveganja. Pri 5 % do 10 % primerov pa gre za dedno obliko bolezni (fALS) [5, 6].

FTD je nevrodegenerativna bolezen, ki prizadene predvsem čelni in senčni reženj možganov [7]. Povzroča spremembe osebnosti, nezmožnost prepoznave pomena besed, težave z jeziki in splošno poslabšanje kognitivnih sposobnosti [4, 8]. Je bolj pogosta kot ALS, a vseeno jo smatramo kot redko bolezen. Povprečno se v enem letu razvije pri 4 posameznikih na 100 000 ljudi. Razvije se lahko pri različnih starostih, najbolj pogosto med 45. in 60. letom [4].

Pričakovana življenjska doba po začetku bolezni je daljša kot pri bolnikih z ALS, povprečno se giblje od 6 do 8 let [8]. Več raziskav se osredotoča na preučevanje povezave med nastankom fALS in FTD. Nanjo namiguje dejstvo, da 5 % do 10 % bolnikov z fALS diagnosticirajo s FTD, kar 50 % pa jih kaže tudi znake. Enako velja v obratni smeri, saj kar tretjina bolnikov s FTD kaže znake motorične nefunkcionalnosti, značilne za fALS [4, 9].

Tudi FTD se lahko pojavi naključno, brez očitnih faktorjev tveganja, ali pa pride do pojava zaradi dedne nagnjenosti. Slednje je pri FTD bolj pogosto kot pri ALS, kar v 30 % do 50 % primerov gre za dedno obliko bolezni [8].

Tako dedna kot sporadična ALS/FTD sta lahko posledica mutacije v več potencialnih genih.

Pri ALS so najpogostejše mutacije v genih SOD1, TARDBP, FUS in C9orf72, pri FTD pa v genih MAPT, GRN in C9orf72 [3, 10]. V obeh primerih je najpogostejša mutacija gena C9orf72, ki je prisotna pri 5 % do 10 % sporadične ALS/FTD in pri 25 % do 60 % dedne ALS/FTD [11].

1.2 C9orf72

Človeški gen C9orf72 leži na p kraku kromosoma 9. Njegova citogenetska lokacija je 9p21.2.

[3, 12]. Zapisuje za istoimenski protein, ki ga najdemo v mnogih tkivih. V največji meri je prisoten v živčnih celicah, možganski skorji in v motoričnih nevronih, ki se nahajajo v možganih in hrbtenjači [13].

(20)

2

Več raziskav in bioinformatskih analiz je potrdilo, da je protein C9orf72 strukturni homolog DENN proteinov [11, 14, 15]. Posledično mu pripisujejo tudi podobno molekularno vlogo.

Sodeluje pri vezikularnem transportu kot Rab-GTPazni izmenjevalni faktor (Rab-GEF).

Delovanje Rab-GTPaz aktivira s tem, da stimulira sprostitev GDP (gvanozin-difosfat) in omogoča vezavo GTP (gvanozin-trifosfat) [12, 16, 17]. Poleg tega ima regulatorno vlogo pri procesih avtofagije in sprostitve ekstracelularnih veziklov. Nujen naj bi bil tudi za formacijo stresnih granul, posledično bi njegovo pomanjkanje lahko vplivalo na okrnjen stresni odziv [3, 13].

1.2.1 VLOGA MUTACIJE C9orf72 PRI RAZVOJU ALS/FTD

Gen C9orf72 je sestavljen iz 11 eksonov. Med nekodirajočima eksonoma 1a in 1b se nahaja intron 1, znotraj katerega najdemo ponavljajoče zaporedje šestih nukleotidov – GGGGCC (G4C2) [11, 16]. V normalnem stanju je ponovitev <30, pri bolnikih z ALS/FTD pa je lahko teh ponovitev tudi več tisoč [12].

V nebolezenskem stanju se zaradi alternativnega izrezovanja gen prepiše v tri najbolj pogoste transkripte: V1 (NM_145005), V2 (NM_018325) in V3 (NM_001256054). Ti zapisujejo za kratko in dolgo obliko proteina C9orf72 (Slika 1). Prepisovanje variant V1 in V3 se začne v promotorski regiji na 5’ koncu eksona 1a, prepisovanje V2 pa v promotorski regiji znotraj introna 1. Posledično se V2 začne z alternativnim eksonom 1b, ki se nahaja za ponavljajočim zaporedjem G4C2. Intron 1 se skupaj s ponovitvami G4C2 med procesiranjem RNA izreže in razgradi [11, 12, 16, 18].

Slika 1: Najpogostejši transkripti, ki nastanejo pri prepisovanju gena C9orf72.

Na sliki je prikazana enostavna shema eksonov gena C9orf72 in tri najpogostejše variante prepisovanja. Z zeleno je označen nekodirajoči del, z rjavo pa kodirajoči del, ki zapisuje za protein. Varianta 1 zapisuje za kratko obliko, varianti 2 in 3 pa za dolgo obliko proteina. Intron 1 se nahaja med nekodirajočima eksonoma 1a in 1b.

(21)

3

V bolezenskem stanju prisotnost več kot tridesetih ponovitev moti normalno procesiranje RNA.

Posledično nastajajo različni RNA produkti, ki še vedno vsebujejo intron 1 in heksanukleotidne ponovitve[19]. Nastanejo lahko običajni transkripti z ohranjenim intronom 1, transkripti, ki se nehajo prepisovati v regiji ponovitev G4C2 in posamezni izrezani introni 1 z ohranjenim heksanukleotidnim ponavljajočim zaporedjem (Slika 2). Ti produkti so razlog za razvoj C9orf72 ALS/FTD [11]. Ponavljajoče heksanukleotidno zaporedje se pri varianti V1 in V3 nahaja v intronski regiji in se prepiše v pre-mRNA, pri varianti V2 pa se nahaja v promotorski regiji in se ne prepiše v pre-mRNA (slika 1). Vseeno lahko vpliva na nivo izražanja. Običajno v največji meri nastaja varianta V2, v primeru mutacije pa se nivo V2 zmanjša in se hkrati poveča število transkriptov, v katere je vključen intron 1. Za začetek prepisovanja se pri mutiranem genu preferenčno uporablja promotor na 5’ koncu nekodirajočega eksona 1a [9, 16, 20].

Prepisovanje heksanukleotidnega zaporedja poteka v smereh 5’ → 3’ in 3’ → 5’. Nastaneta smerna in protismerna RNA, ki sta obe vpleteni v razvoj bolezni [16].

Slika 2: Transkripti, ki nastajajo zaradi mutacije v genu C9orf72.

Shema predstavlja najpogostejše oblike transkriptov, ki nastanejo zaradi povečanega števila ponovitev G4C2

znotraj introna 1. Rdeča barva označuje intron 1, zelena nekodirajoči del, rjava pa kodirajoči del.

(22)

4

1.3 MOŽNI MEHANIZMI C9orf72 ALS/FTD

Vpliv povečanega števila ponovitev G4C2 na razvoj C9orf72 ALS/FTD še ni popolnoma pojasnjen. Raziskave se gibljejo okoli treh najbolj pogostih hipotez, ki razlagajo vpliv mutacije C9orf72 na razvoj ALS/FTD: izguba oziroma zmanjšanje ekspresije endogenega proteina C9orf72, kopičenje smerne in protismerne RNA, ki vključujeta ponovitve G4C2/C4G2 ter nalaganje proteinov z dipeptidnimi ponovitvami (DPR), ki nastanejo z RAN translacijo heksanukleotidnih ponovitev G4C2 in C4G2 (Slika 3) [6, 9]. V splošnem ima pridobljena toksičnost smerne in protismerne RNA ter proteinov DPR večji učinek na razvoj bolezni kot izguba funkcije proteina C9orf72. Poleg teh mehanizmov je za razvoj bolezenskega stanja velikega pomena tudi okvarjena dinamika stresnih granul (SG) [21].

1.3.1 VPLIV IZGUBE FUNKCIJE GENA NA RAZVOJ C9orf72 ALS/FTD

V raziskavah posmrtnih možganov bolnikov s C9orf72 ALS/FTD so odkrili 50 % manjšo koncentracijo C9orf72 [21]. Zmanjšanje količine endogenega C9orf72 negativno vpliva na vezikularni transport in endocitozo, inhibira endosomalni transport in prispeva k celičnem stresu [17]. Zavira indukcijo avtofagije in povzroča akumulacijo p62 ter agregacijo TDP-43.

Slika 3: Možni mehanizmi, po katerih pride do razvoja C9orf72 ALS/FTD.

Mutacija v genu C9orf72 vpliva na patološke spremembe na ravni DNA, RNA in proteinov. Na ravni DNA te vodijo v izgubo funkcije proteina C9orf72, mutiran gen pa se dalje prepiše v toksično smerno in protismerno RNA. Ta se s posebno obliko translacije (RAN) v treh bralnih okvirjih prepiše v šest zgoraj prikazanih produktov. Poli(GP) nastane iz smerne in protismerne RNA, zato večinoma govorimo o petih različnih produktih. Shema je ustvarjena s spletnim orodjem Biorender.com (prirejeno po ref. 16).

(23)

5

Protein C9orf72 je vpleten v mnoge transportne procese, zato njegovo pomanjkanje celico naredi bolj ranljivo in tako prispeva k nevrodegeneraciji [3, 20, 21, 22]. Mutacija povzroča tudi akumulacijo glutamatskih receptorjev, kar vodi v eksitotoksičnost. Pojav bolezni zaradi izgube funkcije C9orf72 imenujemo »loss of function mechanism« [3, 7].

1.3.2 VPLIV RNA NA RAZVOJ C9orf72 ALS/FTD

Kot enega pomembnih mehanizmov nastanka C9orf72 ALS/FTD se omenja toksičnost sekvenc RNA, ki vključujejo ponavljajoča zaporedja G4C2/C4G2 [16]. Te oblikujejo ti. RNA skupke (angl. »RNA foci«) sestavljene iz smerne ali protismerne RNA in RNA-vezavnih proteinov (RBP). Najdemo jih predvsem v nevronih, pa tudi v astrocitah, mikroglii in oligodendrocitah.

Večinoma se nahajajo v celičnem jedru, vedno bolj pa se poudarja tudi pomembnost RNA skupkov v citoplazmi. Ti naj bi bili po nekaterih raziskavah celo bolj toksični od tistih v jedru [11, 21]. Prisotnost RNA skupkov v frontalnem korteksu in hrbtenjači nakazujejo na ti. »gain of function« mehanizem C9orf72 ALS/FTD [3].

Ponavljajoča zaporedja G4C2 v DNA in RNA tvorijo G-kvadruplekse, stabilne sekundarne strukture, značilne za sekvence bogate z gvaninom. Protismerne sekvence, bogate s citozinom, tvorijo drugačne motive [16, 22]. Tvorba G-kvadrupleksov v DNA povzroča akumulacijo nepopolnih transkriptov gena C9orf72, ki se končajo v regiji heksanukleotidnih ponovitev. Ti so eden glavnih krivcev za razvoj C9orf72 ALS/FTD [23].

RNA skupki iz smerne oziroma protismerne RNA zajamejo RBP-je in različne faktorje ter jim onemogočijo opravljanje njihove funkcije. To vodi v motnjo mnogih procesov kot so procesiranje RNA, prepisovanje, eksport mRNA iz jedra in transport po citoplazmi ter avtofagija. Povzročali naj bi tudi jedrni stres [16, 21]. Vpletenost metabolizma RNA v nastanek in razvoj C9orf72 ALS/FTD so potrdili z mutacijami v nekaterih ključnih genih, povezanih z različnimi procesi [22]. Težko je identificirati vse faktorje, ki jih zajamejo RNA skupki, med najpomembnejšimi so: hnRNP-H, Pur-α, ALYREF, SRSF1, nukleolin, ZFP106, FMRP, PABPC, ADARBP. Ti faktorji oz. RBP-ji vplivajo na metabolizem RNA, njihova nefunkcionalnost pa moti zgoraj naštete procese in tako pripomore k nevrodegeneraciji (Slika 4) [16, 21].

Zaradi podobnega vpliva na razvoj bolezni vse več dokazov kaže na podobnost med RNA skupki in stresnimi granulami, ki se vedno bolj pogosto omenjajo kot eden pomembnih faktorjev za razvoj C9orf72 ALS/FTD in drugih nevrodegenerativnih bolezni [24].

(24)

6

Slika 4: Procesi, v katere so vpleteni RNA-vezavni proteini

Na sliki so našteti glavni procesi na katere negativno vpliva RNA s ponavljajočim heksanukleotidnim zaporedjem. Pod vsakim procesom so navedeni RNA-vezavni proteini, ki pri njem sodelujejo, vendar zaradi zajetja v RNA skupke ne morejo opravljati svoje funkcije. Shema je ustvarjena s spletnim orodjem Biorender.com (prirejeno po ref. 16).

1.3.3 VPLIV STRESNIH GRANUL NA RAZVOJ C9orf72 ALS/FTD

Stresne granule so citosolne nukleoproteinske inkluzije brez membrane, ki se tvorijo kot odgovor na celični stres. Sestavljene so iz molekul RNA in RNA-vezavnih proteinov.

Predstavljajo zelo prilagodljiv mehanizem za ohranitev energije in preživetje v stresnih pogojih, saj omejijo translacijo na le tiste proteine, ki so nujni za preživetje celice. Translacijo ustavijo tako, da zajamejo še neprevedeno mRNA, RNA-vezavne proteine in druge faktorje, ki sodelujejo pri translaciji. So zelo dinamične in močno regulirane strukture, ki po koncu stresa hitro razpadejo in sprostijo vsebino granul nazaj v citosol. V zmernih količinah so stresne granule koristne, celo nevroprotektivne, okvarjena dinamika in kopičenje SG pa sta ena izmed pomembnih razlogov za razvoj C9orf72 ALS/FTD [22, 24, 25].

Porušena dinamika stresnih granul je v glavnem posledica mutacij RNA-vezavnih proteinov v domeni LCD. Interakcije z LCD so običajno šibke, z argininom bogate domene proteinov DPR pa z LCD tvorijo močne interakcije, kar ima patološke posledice. Tvorijo se toksični agregati, ki povzročajo celični stres in stimulirajo stresni odziv ter formacijo stresnih granul. Spremenijo se biofizikalne lastnosti stresnih granul, ki postanejo netopne in ujamejo RBP-je v ireverzibilne toksične agregate. Izgubijo zmožnost razgradnje po koncu stimulacije stresnega odziva. RNA- vezavni proteini tako ostanejo ujeti in ne morejo opravljati običajnih funkcij, s čimer se poruši homeostaza RNA in proteinov. Vse skupaj vodi v nevrodegeneracijo [11, 24].

Dinamiko SG se vedno bolj omenja kot osrednji mehanizem razvoja bolezni, na katerega vplivajo G4C2/C4G2 RNA in proteini s ponavljajočimi dipeptidnimi ponovitvami [22].

(25)

7

1.3.4 VPLIV PROTEINOV DPR NA RAZVOJ C9orf72 ALS/FTD

Tretja hipoteza, ki razlaga razvoj bolezenskega stanja, je akumulacija toksičnih agregatov proteinov z dipeptidnimi ponovitvami. Ti nastanejo s posebno obliko translacije, ki poteka neodvisno od začetnega kodona AUG (RAN translacija). S translacijo iz smerne in protismerne G4C2 RNA v šestih bralnih okvirjih nastane pet različnih proteinov DPR: poli(GR) s ponavljajočim zaporedjem glicina in arginina, poli(GA) iz glicina in alanina, poli(PR) iz prolina in arginina, poli(GP) iz glicina in prolina ter poli(PA) iz prolina in alanina. GA in GR se prepišeta iz smerne RNA, PA in PR pa iz protismerne. GP se iz obeh smeri prepiše v enak produkt (Slika 3). Smerni produkti so v splošnem bolj pogosti kot protismerni [16, 20, 21]. GA je nagnjen k agregaciji in je najpogosteje prisoten v obliki citoplazemskih inkluzij, PA in GP sta topna in se nahajata po vsej celici, PR se pojavlja v jedru, GR pa tako v citoplazmi kot tudi v celičnem jedru [20, 26]. Najdemo jih v nevronih hipokampusa, frontalnem in motoričnem korteksu, redkeje tudi v hrbtenjači ali v celicah glia [14, 19, 20, 26].

Vpliv proteinov DPR na razvoj C9orf72 ALS/FTD je v zadnjih letih osrednja tema mnogih raziskav, kljub temu pa povsem natančni mehanizmi še niso znani. Najbolj toksična sta z argininom bogata poli(PR) in poli(GR). Sledi jima najbolj pogost DPR - poli(GA), za poli(GP) in poli(PA) pa obstaja manjša verjetnost, da sta toksična [20].

Najbolje raziskan je poli(GA), za katerega so ugotovili že kar nekaj mehanizmov toksičnosti:

inhibicija proteosomskega sistema zaradi sekvestracije nekaterih ključnih komponent kot sta Unc119 in proteini HR23, indukcija ER stresa, kar vodi v stresni odziv in formacijo SG, okvara nukleoplazmatskega transporta in indukcija apoptoze [20, 22, 24]. Večinoma temeljijo na zajetju molekul, ki so pomembne za določen proces. Od vseh DPR-jev je poli(GA) najbolj pogost in močno nagnjen k agregaciji [26]. Nekatere raziskave so pokazale, da se poli(GA) agregira v obliki amiloidnih fibril, ki tvorijo paralelno β-ploskev. Zaradi biofizikalnih podobnosti med temi agregati in amiloidom β, polipeptidom, ki sodeluje pri nastanku Alzheimerjeve bolezni, sklepajo, da ima njuna agregacija podoben učinek na razvoj bolezni [27].

Kot najbolj toksična sta se v večini raziskav pokazala z argininom bogata poli(PR) in poli(GR).

Dokazano interagirata z LCD domeno RNA-vezavnih proteinov in motita prehod molekul med fazami. Slednje temelji na šibkih interakcijah. Posledično motita dinamiko SG in vplivata na translacijo mRNA [20, 24]. Ostali do sedaj znani mehanizmi toksičnosti so: zmanjšanje sinteze ribosomov, okvarjen nukleoplazmatski transport, motenje delovanja spliceosoma in UPS. Prek teh mehanizmov ovirata sintezo ribosomov in translacijo ter prispevata k nevrodegeneraciji [21, [22, 28].

1.4 RAN TRANSLACIJA

RAN translacija je neobičajna oblika translacije mRNA, ki lahko poteka v evkariontskih celicah in omogoča translacijo sicer nekodirajočega dela genoma, največkrat so to ponavljajoča zaporedja nukleotidov. Pogosta je pri boleznih, ki se razvijejo zaradi velikega števila ponavljajočih se zaporedij nukleotidov.

(26)

8

Poteka neodvisno od AUG start kodona in naj bi za začetek prepisovanja potrebovala sposobnost RNA, da tvori sekundarne strukture. Pri C9orf72 ALS/FTD translacija poteka v več bralnih okvirjih, možnost za premike bralnega okvirja naj bi povečevala struktura G- kvadrupleksa, ki ga tvori G4C2/C4G2 RNA [16, 22].

Običajna evkariontska translacija poteka v treh korakih: začetek (iniciacija), podaljševanje in terminacija. Začetek translacije je najbolj reguliran, potrebnih je namreč veliko iniciacijskih faktorjev (eIF). Najpomembnejša koraka sta nastanek terciarnega in prediniciacijskega kompleksa. Terciarni kompleks nastane med GTP-aznim iniciacijskim faktorjem eIF2, ki je sestavljen iz podenot eIF2α, eIF2β in eIF2µ ter iniciatorsko Met-tRNA. Ta se s še nekaterimi dodatnimi iniciacijskimi faktorji veže na 40S podenoto ribosoma ter tvori 43S prediniciacijski kompleks (PIC). Pomemben je tudi kompleks eIF4F, sestavljen iz podenot eIF4E, eIF4G in eIF4A. Prepozna 5’ m⁷G kapo na RNA in razreši sekundarne strukture ter omogoči translacijo.

Prediniciacijski kompleks se potem prek interakcije z eIF4F veže na mRNA v 48S »scanning«

kompleks, ki potuje po mRNA v smeri 5’ → 3’, dokler ne najde začetnega kodona AUG in Kozakovega zaporedja. Sprostijo se nekateri iniciacijski faktorji in nastane 80S elongacijski kompleks [11, 23].

Kljub intenzivnim raziskavam na področju RAN translacije, natančen mehanizem še vedno ni poznan. Predpostavljajo, da pri različnih oblikah G4C2/C4G2 RNA poteka translacija prek različnih mehanizmov. RNA z ohranjenim intronom 1 naj bi se prevajala po mehanizmu, ki je odvisen od 5’ m⁷G kape, za izrezane introne in skrajšane produkte pa predvidevajo od kape neodvisen mehanizem. Več samostojnih raziskav je potrdilo odvisnost RAN translacije od eIF4A in eIF4E, ki sestavljata kompleks za prepoznavo 5’ m⁷G kape. Njuna inhibicija močno zmanjša stopnjo translacije. Odkrili so tudi, da se ta začne s kodonom CUG (»near-cognate AUG«), ki se nahaja 24 nukleotidov navzgor od heksanukleotidnih ponovitev v GA bralnem okvirju in hkrati v optimalnem Kozakovem zaporedju [27]. GA se torej prevaja predvsem po ti. »scanning« mehanizmu, pri translaciji DPR-jev v ostalih bralnih okvirjih pa pride do premika bralnih okvirjev na ribosomu To omogoča nastanek več različnih produktov iz ene same mRNA [27]. Po drugi strani bi lahko šlo tudi za mehanizem, ki ni odvisen od 5’ m⁷G kape. Celični stres namreč aktivira integrirani stresni odziv, ki vključuje formacijo stresnih granul ter zajetje molekul potrebnih za translacijo odvisno od 5’ m⁷G kape. RAN translacija pa v stresnem okolju postane še bolj intenzivna, kar nakazuje na mehanizem, ki ni odvisen od 5’ m⁷G kape [11, 20, 22, 29]. Neodgovorjeno ostaja tudi vprašanje, kako se nekodirajoča G4C2/C4G2 RNA prenese iz jedra v citoplazmo, ne da bi se razgradila [26].

Kljub nasprotovanjem raziskav na področju RAN translacije, je velika večina identificirala nekaj faktorjev, ki vplivajo na sam potek translacije. To so npr. kompleks eIF4F, mnoge raziskave so izpostavile vlogo eIF2α, ki se pod vplivom ISR fosforilira in vpliva na povečano produkcijo DPR, pa tudi RpS25, komponento 40S podenote ribosoma [11]. Majhno število odkritih faktorjev, ki vplivajo na RAN translacijo namiguje na to, da ta poteka po dokaj enostavnem mehanizmu, ki zgolj preskoči določene korake običajne translacije [11, 29].

(27)

9

1.5 FLP-IN SISTEM

Flp-in sistem omogoča integracijo in izražanje tarčnega gena v sesalskih celicah. Za njegovo delovanje so pomembni trije plazmidni vektorji. Prvi je pFRT/lacZeo, s katerim transficiramo sesalske celice, da dobimo Flp-in celično linijo. V celice z njim vnesemo mesto FRT, ki se nahaja takoj za začetnim kodonom fuzijskega gena lacZ-Zeocin. Celice, ki so rezistentne na Zeocin in imajo eno integrirano mesto FRT so primerne za nadaljnjo uporabo. Druga komponenta Flp-In sistema je ekspresijski vektor pcDNA5/FRT (v našem primeru je to osnovni vektor pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop) z vgrajenim tarčnim genom. Izražanje gena je pod nadzorom CMV promotorja. Na 5’ koncu kodirajoče regije se nahaja mesto FRT in gen za rezistenco na antibiotik higromicin. Slednji nima ne promotorja ne začetnega kodona, zato se samostojno na plazmidu ne more izražati. Skupaj s pcDNA5/FRT sesalske celice transficiramo še s tretjim pomembnim plazmidnim vektorjem - pOG44, ki nosi zapis za Flp rekombinazo. Ta se veže na mesto FRT in omogoči rekombinacijo med obema mestoma FRT. Posledično se celoten plazmidni vektor pcDNA5/FRT s tarčnim genom integrira v genom sesalske celice.

Začetni kodon ATG in SV40 promotor iz vektorja pFRT/lacZeo sedaj omogočata prepisovanje gena za rezistenco na higromicin, kar omogoča selekcijo uspešno transficiranih Flp-In celičnih linij [30, 31]. Enostavna shema Flp-in sistema je predstavljen na Slika 5 .

Slika 5: Shema integracije tarčne DNA v genom sesalskih celic po sistemu Flp-In.

Slika prikazuje poenostavljeno shemo integracije plazmidnega vektorja s tarčno DNA v genom sesalskih celic oz. v plazmidni vektor pFRT/lacZeo, s katerim smo predhodno transficirali sesalske celice. Gen za higromicin se pred integracijo ne more prepisovati, ker nima promotorja, po integraciji pa njegovo prepisovanje omogočata promotor in začetni kodon na vektorju pFRT/lacZeo. Nasprotno se gen za zeocin zaradi pomanjkanja promotorja ne more več prepisovati. Uspešno transficirane sesalske celice pridobijo odpornost na higromicin in izgubijo odpornost na zeocin.

(28)

10

2. NAMEN DELA

Kljub mnogim raziskavam na področju amiotrofične lateralne skleroze in frontotemporalne demence, natančni mehanizmi za razvoj teh bolezni še niso poznani. Znanstveniki se vse bolj osredotočajo na pomen mutacije v genu C9orf72. ki je lahko potencialni vzrok za razvoj ALS/FTD. Eden od mehanizmov nastanka bolezni, ki je povezan z mutacijo v omenjenem genu, je kopičenje toksičnih proteinov z dipeptidnimi ponovitvami. Poznanih je pet različnih DPR-jev: poli(GA), poli(GR), poli(GP), poli(PA) in poli(PR).

Namen diplomskega dela je bil priprava deset Flp-in celičnih linij, ki bi po indukciji z doksorubicinom izražale proteine DPR. Pripraviti smo želeli pet celičnih linij HEK293T in pet celičnih linij SH-SY5Y. Vsaka od petih bi izražala eno vrsto proteina z dipeptidnimi ponovitvami. Flp-in celične linije bi transficirali s pripravljenimi konstrukti, ki nosijo DNA zapis za DPR-je, jih selekcionirali in preverili njihovo izražanje s fluorescenčno mikroskopijo.

Poleg same prisotnosti bi opazovali tudi njihovo lokalizacijo v celici.

Zaradi izrednih razmer smo uspeli pripraviti le pet celičnih linij HEK293T, vendar sklepamo, da bi po enakem postopku uspeli pripraviti tudi celice SH-SY5Y.

Na podlagi literature smo pred začetkom eksperimenta postavili hipoteze:

- GA se nahaja v obliki citoplazemskih inkluzij.

- PR tvori inkluzije, ki se nahajajo v celičnem jedru.

- PA, GR in GP so topni in se nahajajo tako v citoplazmi kot v celičnem jedru.

(29)

11

3. MATERIALI IN METODE

3.1 MATERIALI

3.1.1 Laboratorijska oprema

- 50-/25-mililitrske centrifugirke (Falcon) - aparatura za slikanje gelov (UVITEC) - avtomatske pipete (Eppendorf)

- brezprašna komora Labcaire (Wolflabs) - centrifuga (Eppendorf)

- digestorij (Wasermann)

- fluorescenčni konfokalni mikroskop LSM10 Carl Zeiss (Carl Zeiss) - gojitvene petrijevke (TPP)

- hemocitometer (BRAND) - hladilnik (Semlab)

- inkubator 37°C (Binder)

- inkubator – stresalnik Certomat HK (B. Braun Biotech International) - invertni svetlobni mikroskop OLYMPUS CKX41 (OLYMPUS) - kadička za AGE (Thermo Fisher Scientific)

- laboratorijska steklovina - laboratorijski gorilnik

- mikrocentrifugirke (Eppendorf)

- mikrovalovna pečica ZM21MS (Zanussi) - napajalnik za AGE (Thermo Fisher Scientific) - PCR naprava Nexus X2 (Eppendorf)

- plošče s 6, 12 in 24 vdolbinicami (TPP)

- spektrofotometer Nanodrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific) - stresalnik Vibromix (Tehtnica)

- tehtnica (Genius, Sartorius 200A) - termoblok ThermoShaker (Biometra) - termoblok s hlajenjem (Eppendorf) - zamrzovalnik (-80°C) (Sanyo)

(30)

12

3.1.2 Kemikalije in pufri 3.1.2.1 Kemikalije

V Tabela 1 so navedene kemikalije s posameznimi proizvajalci.

Tabela 1: Seznam uporabljenih kemikalij

Kemikalija Proizvajalec

1 x PBS Gibco Thermo Scientific

4 % paraformaldehid Sigma-Aldrich

70 % etanol Macherey-Nagel

100 % etanol Promega

Agaroza Sigma-Aldrich

Ampicilin Sigma-Aldrich

BSA (goveji serumski albumin) Invitrogen

doksiciklin Sigma-Aldrich

EDTA Serva

FBS (fetusni serum goveda) Eurosone

Higromicin Invitrogen

Izopropanol Merck

NaCl Sigma-Aldrich

Optimem Gibco Thermo Scientific

poli-L-lizin Sigma-Aldrich

ProLong™ Diamond Antifade reagent z barvilom DAPI

Invitrogen

SYBR Safe Invitrogen

tripan modro (Trypan Blue) Sigma-Aldrich

Tris Serva

TrypLE Select Enzyme Gibco Thermo Scientific

3.1.2.2 Pufri

V Tabela 2 so navedeni uporabljeni pufri in njihova sestava. Zraven pufrov, ki jih nismo pripravili sami, so navedeni tudi proizvajalci.

Tabela 2: Seznam uporabljenih pufrov

Pufer Sestava Proizvajalec

6 x nanašalni pufer za AGE

0,25 % bromfenol modro, 0,25 % ksilencianol, 15 % fikol tip 4000, 150 mM EDTA

Thermo Fisher Scientific

1 x pufer TAE 40 mM Tris, 20 mM ocetna kislina, 1 mM EDTA

pripravljen v laboratoriju Pufer za prileganje

oligonukleotidov

10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA pufer

pripravljen v laboratoriju

(31)

13

3.1.3 Kompleti reagentov

V Tabela 3 so našteti kompleti reagentov, ki smo jih uporabljali pri delu v laboratoriju.

Tabela 3: Seznam uporabljenih kompletov reagentov

Komplet reagentov Uporaba Proizvajalec

NucleoBond Xtra Midi Kit izolacija plazmidne DNA iz večjega volumna prekonočne bakterijske kulture

Macherey-Nagel

Wizard® Plus SV

Minipreps DNA Purification System

izolacija plazmidne DNA iz manjšega volumna prekonočne bakterijske kulture

Promega

Lipofectamin 3000 Transfection Reagent

transfekcija sesalskih celičnih linij Invitrogen Nucleospin Gel and PCR

Clean-Up Kit

izolacija plazmidne DNA iz agaroznega gela Macherey-Nagel

3.1.4 Standardi

Za določanje ustrezne velikosti fragmentov in s tem preverjanje uspešnosti reakcij smo pri agarozni gelski elektroforezi uporabili standard GeneRuler 1kbp Ladder (Thermo Fisher Scientific).

3.1.5 Encimi in ustrezni pufri

V Tabela 4 so našteti uporabljeni encimi in ustrezni pufri, v katerih smo izvedli reakcije.

Tabela 4: Seznam uporabljenih encimov in pufrov

Encim Razred encima Pufer Proizvajalec

FastDigest Hind III restriktaza FD pufer Thermo Fisher Scientific FastDigest Kpn I restriktaza FD pufer Thermo Fisher Scientific FastDigest EcoRV restriktaza FD pufer Thermo Fisher Scientific T4 DNA ligaza ligaza T4 DNA ligazni pufer Thermo Fisher Scientific

3.1.6 Plazmidni vektorji

Izhodiščni plazmidi z zapisom za proteine z dipeptidnimi ponovitvami so predstavljeni v Tabela 5. Uporabljene plazmide so pripravili na Inštitutu Jožef Štefan. Uspelo jim je klonirati konstrukte s 125 heksanukleotidnimi ponovitvami.

Tabela 5: Izhodiščni plazmidi

Plazmid Vstavljen zapis za DPR Plazmidna karta

pEGFP-C3 poli(GA) in poli(GP) Priloga 1

pEGFP-C1 poli(PA) in poli(PR) Priloga 2

pcDNA3 Myc poli(GR) Priloga 3

(32)

14

Zapise za proteine z dipeptidnimi ponovitvami smo preklonirali v plazmidni vektor pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop (Slika 6). Gre za inducibilni ekspresijski vektor, ki je namenjen prenosu željenega gena v celice po sistemu Flp-In. Pomembna mesta na plazmidu so predstavljena v Tabela 6.

Tabela 6: Pomembna mesta na plazmidu pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop

Mesto na plazmidu Pomen

CMV promotor Močan promotor, ki omogoča izražanje željenega

gena v širokem naboru sesalskih celičnih linij

Tet operator Omogoča vezavo tet represorja in regulacijo

izražanja gena s tetraciklinom

Multiplo klonirno mesto (MCS) Omogoča nam vstavitev tarčnega gena

Mesto FRT Omogoča vezavo Flp rekombinaze in integracijo

plazmida v genom Flp-In celic

Selekcijski marker za higromicin Selekcija transficiranih sesalskih celic Selekcijski marker za ampicilin Selekcija transformiranih celic E. coli

bla promotor Omogoča ekspresijo gena za rezistenco na Amp

mScarlet Fluorescenčni marker

Ori Omogoča hitro replikacijo plazmida v E. coli

SV40 poliadenilacijski signal Omogoča učinkovito terminacijo transkripcije in poliadenilacijo mRNA

Slika 6: Shema ekspresijskega plazmidnega vektorja pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop.

Na sliki je prikazana shema vektorja, v katerega smo klonirali zapise za proteine z dipeptidnimi ponovitvami. Označena so najpomembnejša mesta na plazmidu in restrikcijska mesta za encime. Slika je narejena v programu Snap Gene Viewer.

(33)

15

3.1.7 Sintetični oligonukleotidi za premik bralnega okvirja

Za premik bralnega okvirja smo načrtovali 4 oligonukleotide (Slika 7) s katerimi smo uničili obstoječe restrikcijsko mesto Hind III in enako restrikcijsko mesto vstavili v drugem bralnem okvirju.

3.1.8 Bakterijski sevi in gojišča

Za pomnoževanje plazmidne DNA smo uporabljali kompetentne celice E. coli sev DH5α. Za gojenje celic smo uporabili standardno tekoče in trdno osnovno gojišče Luria Bertani (LB).

Sestava je navedena v Tabela 7. Za selekcijo transformiranih celic smo gojišču aseptično dodali antibiotik ampicilin v končni koncentraciji 100 µg/ml.

Tabela 7: Sestava gojišč LB

Gojišče Sestava (za 1 L gojišča)

tekoče gojišče LB 10 g triptona + 5 g kvasnega ekstrakta + 10 g NaCl + 1 L dH2O

trdno gojišče LB 10 g triptona + 5 g kvasnega ekstrakta + 10 g NaCl + 15 g agarja + 1 L dH2O

3.1.9 Sesalska celična linija in rastno gojišče 3.1.9.1 Celična linija HEK293T

HEK293 celice (angl. »human embryonic kidney 293 cells«) so sesalske celice, prvotno vzgojene iz človeških ledvičnih embrionalnih celic v celični kulturi. Zaradi enostavnega gojenja in relativne nagnjenosti k transfekciji se pogosto uporabljajo v celični biologiji, predvsem za vnos in izražanje tarčnega gena. Iz celic HEK293 izhaja celična linija HEK293T, ki dodatno izraža mutiran SV40 antigen T, kar omogoča replikacijo transficiranih plazmidov s SV40 ori.

Uporabili smo Flp-in 293T celice, ki imajo stabilno mesto FRT na transkripcijsko aktivnem genomskem lokusu. Dobimo jih s transfekcijo celic z vektorjem pFRT/lacZeo. Največkrat se uporabljajo skupaj z vektorji, ki nosijo zapis za gene, katerih transkripcija je nadzorovana s CMV promotorjem [32]. Celice so že predhodno pripravili na inštitutu Jožef Štefan.

Slika 7: Oligonukleotidi za premik bralnega okvirja.

Na sliki levo (A) je prikazan oligonukleotid, s katerim bomo bralni okvir premaknili za dva nukleotida, desno (B) pa oligonukleotid, s katerim bomo bralni okvir premaknili za en nukleotid. Z rdečo je prikazano na novo uvedeno restrikcijsko mesto za HindIII.

(34)

16

3.1.9.2 Rastno gojišče

Celice HEK293T smo gojili v tekočem gojišču DMEM (angl. Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture, Gibco), ki je v končnih koncentracijah vseboval 10 % fetusnega seruma goveda (FBS) in 1 % mešanico antibiotikov penicilin in streptomicin (oboje SIGMA- ALDRICH).

3.2 METODE

3.2.1 DELO Z NUKLEINSKIMI KISLINAMI 3.2.1.1 Transformacija bakterijskih celic

Transformacija je proces, pri katerem kompetentne bakterijske celice iz okolja sprejmejo manjše proste molekule DNA (npr. plazmide). Kompetentnost celic lahko dosežemo s kemikalijami, izpostavitvijo toplotnemu šoku ali z elektroporacijo.

S transformacijo in izolacijo plazmidne DNA iz prekonočne kulture bakterijskih celic smo namnožili izhodiščni plazmid, plazmida s premaknjenim bralnim okvirjem in končne ligirane produkte.

Uporabili smo kompetentne celice E. coli, sev DH5α. Vnaprej pripravljene alikvote (100µl), hranjene na - 80°C, smo počasi odtajali na ledu in jim dodali 5 µl ligacijske mešanice ali 1 µl plazmidne DNA. Po 20-minutni inkubaciji na ledu smo izvedli 1-minutni toplotni šok na 42°C.

Ponovno smo inkubirali na ledu 2 minuti, celicam dodali 300 µl gojišča LB in pol ure stresali na 37°C. Na hitro smo jih centrifugirali, da so se nekoliko posedle, odstranili 150 µl gojišča in ostalo razmazali na agarne plošče LBA. Plošče smo preko noči inkubirali na 37°C. Plazmidi, ki smo jih želeli namnožiti, imajo rezistenco na ampicilin, zato so na plošči zrasle le kolonije uspešno transformiranih celic.

3.2.1.2 Priprava prekonočne kulture bakterijskih celic

Prekonočno kulturo smo pripravili tako, da smo aseptično prenesli zrasle kolonije iz trdnega gojišča v 5 ml tekočega gojišča LBA (10 µl ampicilina na 1 ml gojišča) in celice čez noč stresali na 37°C. Za izolacijo začetnega osnovnega plazmida pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop in plazmidov, katerih zaporedje smo preverili s sekvenciranjem, je zadostovalo, če smo v tekočo kulturo prenesli po eno kolonijo iz katere smo izolirali DNA. Pri izolaciji ligiranih produktov smo v tekoče gojišče prenesli po pet kolonij iz agarne plošče, saj nismo bili prepričani, če je ligacija v vseh primerih uspela. Kolonije bi namreč zrasle tudi, če bi se plazmidni vektor zlepil skupaj sam s sabo.

3.2.1.3 Izolacija plazmidne DNA iz kulture bakterijskih celic

Plazmidno DNA smo izolirali iz prekonočne kulture bakterijskih celic DH5α, namnoženih v selektivnem gojišču LBA. Izhodiščni plazmid in plazmida s premaknjenim bralnim okvirjem smo izolirali iz 200 ml oz. 250 ml prekonočne kulture (MIDI prep), saj smo potrebovali večje koncentracije za rezanje in kloniranje. Ostale ligirane produkte smo izolirali iz 5 ml prekonočne kulture (Mini prep).

(35)

17 Izolacija iz 5 ml prekonočne kulture

Uporabili smo komplet reagentov Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, USA) in sledili standardnem protokolu. Plazmidna DNA se po alkalni lizi sprosti iz celice in se veže na silikatni nosilec, sledi čiščenje in elucija izolirane DNA.

Prekonočno kulturo smo prenesli v mikrocentifugirko in 5 minut centrifugirali na maksimalni hitrosti (16000 x g). Odstranili smo gojišče in celice resuspendirali v 250 µl raztopine za resuspenzijo ter jih lizirali z dodatkom 250 µl raztopine za celično lizo. Rahlo smo premešali in dodali 10 µl raztopine alkalne proteaze. Slednja razgrajuje proteine v celičnem lizatu v bazičnih pogojih. Po 5 minutah inkubacije na sobni temperaturi smo bazično raztopino nevtralizirali s 350 µl raztopine za nevtralizacijo, rahlo premešali in 10 minut centrifugirali (13000 x g) pri sobni temperaturi. Nelizirane celice, oborjeni proteini in kromosomska DNA so se posedli na dno mikrocentrifugirke. Supernatant, v katerem je ostala plazmidna DNA, smo prenesli na kolono Miniprep in centrifugirali 1 minuto pri 13000 x g. Pri tem se nam je plazmidna DNA zaradi interakcij vezala na silikatne nosilce na koloni. Kolono smo dvakrat spirali z raztopino za spiranje (750 µl in 250 µl, 1 minuta pri 13000 x g), nato pa jo osušili z 2- minutnim centrifugiranjem pri 13000 x g. Kolono smo postavili v 1,5 ml mikrocentrifugirko in plazmidno DNA z 1-minutnim centrifugiranjem eluirali v 50 µl MQ (voda brez nukleaz).

Koncentracije izolirane plazmidne DNA smo spektrofotometrično pomerili z napravo Nanodrop. Na podlagi razmerij 260 nm/280 nm in 260 nm/230 nm smo ocenili njeno čistost.

Izolacija iz 200 ml oz. 250 ml prekonočne kulture

Za izolacijo večje količine plazmida smo uporabili komplet reagentov Nucleobond Xtra EF plasmid purification (Midi EF). Metoda prav tako temelji na selektivni vezavi plazmidne DNA na silikatni nosilec, čemur sledi čiščenje in elucija. Na silikatne nosilce je pripeta anion- izmenjevalna skupina MAE (metil amino alkohol), ki je v kislih pH pogojih pozitivno nabita in omogoča vezavo negativno nabite plazmidne DNA.

Prekonočno kulturo smo prenesli v 250 ml centrifugirko in 10 minut centrifugirali pri 6000 x g na 4°C. Supernatant (gojišče) smo odlili, celice pa resuspendirali v 8 ml pufra za resuspendiranje. Lizirali smo jih z dodatkom 8 ml liznega pufra (vsebuje NaDS), rahlo premešali in bazično raztopino po 5-minutni inkubaciji nevtralizirali z 8 ml pufra za nevtralizacijo. Proteini in kromosomska DNA so ostali oborjeni, plazmidna DNA pa se je vrnila v topno stanje. Mešali smo do popolnega razbarvanja modre barve, 10 minut centrifugirali in naprej uporabljali le supernatant, v katerem je bila plazmidna DNA. Supernatant smo po kapljicah nanesli na filter NucleoBond Midi kolone, ki smo jo predhodno ekvilibrirali s 15 ml ekvilibracijskega pufra. Plazmidna DNA se je vezala na silikatne nosilce na koloni. Kljub temu da visoka ionska jakost lizata preprečuje vezavo RNA in proteinov na kolono, moramo s kolone in filtra sprati vse kontaminante. Pri prvem koraku čiščenja smo na filter po kapljicah dodali 5 ml pufra za spiranje filtra, nato pa smo ga odstranili in ga v nadaljnjih korakih nismo več uporabljali. Sledila sta še dva koraka spiranja, najprej smo spirali s 35 ml ENDO-EF, nato pa še s 15 ml WASH-EF pufra. Tako smo odstranili vse sledove endotoksinov.

(36)

18

Plazmidno DNA smo eluirali v 5 ml pufra za elucijo in prenesli po 1 ml v 5 mikrocentrifugirk.

Tako smo v nadaljevanju lahko centrifugirali pri večjih obratih. Elucija je potekala v bazičnih pogojih, da se je nevtraliziral pozitiven naboj anionskega izmenjevalca in se je plazmidna DNA sprostila s kolone.

Za nadaljnjo uporabo smo plazmidno DNA najprej oborili, nato paiz eluata odstranili soli in sledove alkohola. V vsako izmed petih mikrocentrifugirk smo dodali 700 µl izopropanola, hranjenega na sobni temperaturi. Temeljito smo premešali in 15 minut centrifugirali pri 4500 x g na sobni temperaturi. Supernatant smo odstranili, plazmidno DNA pa spirali s 400 µl etanola.

Po centrifugiranju (4500 x g, 5 min) smo etanol previdno odstranili s pipeto. Oborino smo posušili na zraku in raztopili v H2O-EF. Raztopino s plazmidno DNA smo iz vseh petih mikrocentrifugirk prenesli v eno in izmerili koncentracijo na Nanodropu.

3.2.1.4 Agarozna gelska elektroforeza (AGE)

Tekom dela smo uspešnost restrikcije oz. ligacije večkrat preverili z uporabo gelske agarozne elektroforeze. To tehniko uporabljamo za ločevanje nukleinskih kislin v vzorcu na podlagi razlik v njihovi obliki in velikosti. Molekula DNA je zaradi fosfatnih skupin negativno nabita, zato se v električnem polju premika proti pozitivni elektrodi – anodi. Na hitrost potovanja DNA skozi gel vplivata predvsem njena dolžina in zvitost. Daljše in bolj linearne molekule DNA bodo v primerjavi s krajšimi in bolj zvitimi molekulami potovale počasneje. Na hitrost potovanja molekul vpliva tudi stopnja zamreženosti gela, ki je odvisna od koncentracije agaroze. Večja stopnja zamreženosti omogoča ločevanje manjših molekul, saj te potujejo po gelu počasneje. Za vizualizacijo se gelu običajno doda fluorescenčno barvilo (npr. etidijev bromid, SYBR Safe), ki omogoča opazovanje DNA pod UV svetlobo.

Pred izvedbo elektroforeze smo najprej pripravili gel. Ustrezno maso agaroze (vedno smo pripravili 0,8 % gel) smo ob segrevanju raztopili v pufru TAE. Raztopino smo nekoliko ohladili in glede na njen volumen dodali ustrezno količino barvila SYBR Safe (10 000 x redčenje).

Primer je predstavljen v Tabela 8.

Tabela 8: Sestava 0,8 % agaroznega gela za veliko kadičko z 20 žepki

Komponenta Količina

agaroza 0,672 g

pufer TAE 84 ml

barvilo SYBR Safe 8,4 µl

Gel smo glede na število vzorcev vlili v malo ali veliko kadičko in ga nekaj časa pustili, da se strdi. Nato smo ga oblili s pufrom TAE do označene višine, nanesli vzorce in priklopili na vir konstantne napetosti, 90 V za malo kadičko in 130 V za veliko kadičko.

Vedno smo poleg vzorcev nanesli tudi velikostni standard 1 kbp in kontrolni vzorec. Pred nanosom smo vzorcem dodali 6 x nanašalni pufer, da smo lažje spremljali njihovo potovanje po gelu.

(37)

19

3.2.1.5 Izolacija plazmidne DNA iz agaroznega gela

Plazmidno DNA smo iz gela izolirali z uporabo kompleta reagentov NucleoSpin Gel and PCR Clean-up. Metoda temelji na selektivni vezavi plazmidne DNA na silikatno membrano in eluciji očiščene DNA.

Najprej smo pod UV svetlobo s skalpelom iz gela izrezali liso, ki predstavlja rezano plazmidno DNA in na podlagi teže izračunali volumen pufra NTI, ki ga moramo dodati. Za vsakih 100 mg gela, smo dodali 200 µl pufra. Inkubirali smo na 50°C z občasnim vorteksiranjem, dokler se ni gel popolnoma raztopil. Po 700 µl homogene raztopine smo prenesli v NucleoSpin kolono in 30 s centrifugirali pri 11000 x g. Tekočino, ki se je preko membrane prenesla v zbiralno tubo, smo zavrgli in postopek ponavljali, dokler nismo porabili celotne raztopine. S tem smo plazmidno DNA vezali na membrano NucleoSpin kolone. Dodali smo 700 µl pufra NT3 za spiranje membrane in 30 s centrifugirali pri 13000 x g. Ta korak smo ponovili dvakrat, da smo DNA res očistili vseh soli in omogočili lažjo uporabo v nadaljnjih reakcijah. Membrano smo posušili z dodatnim 1-minutnim centrifugiranjem pri 11000 x g. NucleoSpin kolono smo prestavili v 1,5 ml mikrocentrifugirko in plazmidno DNA eluirali v 50 µl segrete vode. Nekaj minut smo inkubirali na zraku in centrifugirali 1 minuto pri 11 000 x g. Koncentracije smo pomerili na Nanodropu.

3.2.1.6 Premik bralnega okvirja

DNA zapise za proteine DPR smo rezali iz vnaprej pripravljenih vektorjev z ustreznimi restriktazami. V osnovni plazmidni vektor pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop smo jih vstavili za zapis za mScarlet, pri čemer smo pazili, da so bili v enakem bralnem okvirju kot fluorescenčni marker. GA in GR smo klonirali v osnovni vektor brez premaknjenega bralnega okvirja, PR in PA v vektor s prestavljenim bralnim okvirjem za en nukleotid, GP pa v vektor s premaknjenim bralnim okvirjem za dva nukleotida. Z metodami kloniranja smo prek restrikcijskih mest za HindIII in KpnI v osnovni vektor vstavili novo restrikcijsko mesto v ustreznem bralnem okvirju.

Načrtovanje in priprava oligonukleotidov za prileganje

Novo restrikcijsko mesto za premik bralnega okvirja smo vstavili tako, da smo preko restrikcijskih mest za HindIII in KpnI v osnovni vektor ligirali sintetične oligonukleotide.

Slednje smo jih načrtovali sami. Na 5’ koncu smernega oligonukleotida je prepoznavno mesto za HindIII, na 3’ koncu pa prepoznavno mesto za KpnI. Z zamenjavo nukleotida T z G smo uničili staro restrikcijsko mesto za HindIII in preko oligonukleotida vstavili novo. Pred novo restrikcijsko mesto smo dodali enega oziroma dva nukleotida, da je bilo restrikcijsko mesto v pravem bralnem okvirju (Slika 8).

(38)

20

Pred kloniranjem v osnovni plazmidni vektor smo morali izvesti poravnavo smernih in protismernih oligonukleotidov. Prejete oligonukleotide smo z vodo razredčili do koncentracije 100 µM in izračunali kakšen volumen moramo dodati v reakcijo, če zanjo potrebujemo 2 µg vsakega oligonukleotida. Pripravili smo dve reakcijski mešanici. V vsako smo dali izračunan volumen smernega in protismernega oligonukleotida za oba primera premika bralnega okvirja ter dopolnili do 50 µl s pufrom za prileganje. Reakcijski mešanici smo za eno uro postavili v PCR aparaturo, v kateri je potekalo prileganje s temperaturnim programom postopnega ohlajanja iz 98°C na 25°C.

Kloniranje poravnanih vektorjev v pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop

Izvedli smo po dve ligacijski reakciji z različnim razmerjem oligonukleotidov in plazmidnega vektorja (6:1 in 4:3) za posamezen bralni okvir. Reakcije so potekale 2 uri na sobni temperaturi.

Sestava reakcijske mešanice je predstavljena v Tabela 9.

Z ligacijsko mešanico smo transformirali celice DH5α in iz prekonočne kulture izolirali po pet plazmidnih vektorjev za vsako razmerje (postopek opisan na str. 17). Koncentracije smo izmerili na Nanodropu.

Tabela 9: Sestava reakcijske mešanice za ligacijo oligonukleotidov v osnovni vektor

Razmerje 6:1 Razmerje 4:3

Reagent Volumen Reagent Volumen

10 x redčeni oligi 6 µl 10 x redčeni oligi 4 µl

pcDNA5 FRT TO

mScarlet-I Myc stop (rezan s HindIII in KpnI)

1 µl pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop (rezan s HindIII in KpnI)

3 µl

ligazni pufer 2 µl ligazni pufer 2 µl

ligaza T4 1 µl ligaza T4 1 µl

voda 10 µl Voda 10 µl

Skupaj 20 µl Skupaj 20 µl

Slika 8: Oligonukleotidi za premik bralnega okvirja z označenimi pomembnimi mesti.

Desno je prikazan oligonukleotid za premik bralnega okvirja za en nukleotid, levo pa oligonukleotid za premik bralnega okvirja za dva nukleotida. Zeleno obarvani nukleotidi na 5’ koncu predstavljajo prepoznavno mesto za restriktazo HindIII, na 3’ koncu pa prepoznavno mesto za KpnI. Preko teh dveh mest se bosta oligonukleotida ligirala v osnovni plazmidni vektor. S sivo je označeno prepoznavno mesto za restriktazo Xhol, rdeče obarvani nukleotidi pa predstavljajo novo restrikcijsko mesto za HindIII. Staro mesto smo uničili z zamenjavo nukleotida T z G. Zamenjan nukleotid je na sliki označen fluorescenčno zeleno.

(39)

21 Preverjanje uspešnosti premika bralnega okvirja

Pred nadaljevanjem dela smo preverili, če smo izolirali plazmide s premaknjenim bralnim okvirjem, torej uspešnost ligacije oligonukleotidov v vektor. To smo naredili z restrikcijo z XhoI. Eno restrikcijsko mesto za XhoI se je že predhodno nahajalo na plazmidu, drugo pa smo načrtno vnesli z oligonukleotidoma (slika 3.4). Po restrikciji pričakujemo v restrikcijski mešanici dva fragmenta, manjšega (okoli 100 bp), ki predstavlja izrezano zaporedje med restrikcijskima mestoma za XhoI in večjega, ki predstavlja ostali plazmid.

Kot kontrolo restrikcije smo rezali še nerezan osnovni vektor pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop. S tem smo preverili, če restrikcijsko mesto za XhoI na osnovnem plazmidnem vektorju normalno deluje. Sestava restrikcijske mešanice je predstavljena v Tabela 10. Po 1-urni inkubaciji na 37°C smo reakcijsko mešanico nanesli na agarozni gel, da bi preverili prisotnost dveh fragmentov (postopek opisan na str. 18-19). Opazili smo le eno liso pri velikosti ustrezni plazmidnemu vektorju, vendar smo sklepali, da drugega fragmenta ne vidimo, ker je premajhen.

Tabela 10: Sestava reakcijske mešanice za restrikcijo z XhoI Restrikcija vektorjev s premaknjenim

bralnim okvirjem

Kontrola

Reagent Volumen Reagent Volumen

ligacijski produkt 5 µl osnovni nerezan vektor 0,75 µl

pufer FD 2 µl pufer FD 2 µl

XhoI 1 µl Xhol 1 µl

voda 12 µl Voda 16,25 µl

Plazmida s potrjeno pravilno sekvenco smo izolirali iz 250 ml prekonočne kulture in rezali s KpnI in Hindlll. Restrikcijsko mešanico smo nanesli na agarozni gel, iz katerega smo plazmidno DNA izolirali (opisano na str. 19).

3.2.1.6 Kloniranje zapisov za proteine DPR v plazmidni vektor pcDNA5

Zapise za vseh 5 proteinov DPR smo že imeli vstavljene v predhodno pripravljene plazmidne vektorje (tabela 5). Vsak zapis ima optimizirane kodone za proteinsko izražanje le enega DPR- ja in dodan start in stop kodon. DNA zapise smo klonirali v osnovni plazmidni vektor pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop. Pri poli(GA) in poli(GR) se je bralni okvir po ligaciji v osnovni vektor ujemal z bralnim okvirjem mScarlet, poli(PA) in poli(PR) smo klonirali v vektor s premaknjenim bralnim okvirjem za en nukleotid (pcDNA5 FRT TO mScarlet-I HindIII_2), poli(GP) pa v vektor s premaknjenim bralnim okvirjem za dva nukleotida (pcDNA5 FRT TO mScarlet-I HindIII_3).

(40)

22 Restrikcija plazmidnih vektorjev

Zapise za proteine z dipeptidnimi ponovitvami smo klonirali v osnovni vektor prek restrikcijskih mest za HindIII in KpnI. Izjema je poli(GR), ki smo ga klonirali prek KpnI in EcoRV. Izhodiščni vektor, vektorje s premaknjenim bralnim okvirjem in vektorje z zapisi za proteine DPR smo rezali z restriktazama KpnI in HindIII. V reakcijsko mešanico za restrikcijo plazmidov smo dali 5 µg plazmidne DNA, 10 x FD pufer, BSA v končni koncentraciji 100 µg/µl, HindIII in KpnI. Z dH2O smo dopolnili do ustreznega volumna (Tabela 11). Za kloniranje poli(GR) smo nastavili povsem enako restrikcijo, le da smo namesto restriktaze HindIII uporabili EcoRV.

Restrikcija je potekala 1h pri 37°C.

Tabela 11: Primer sestave restrikcijske mešanice za rezanje pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop in poli(PR)

pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop poli(PR)

Reagent Volumen Reagent Volumen

plazmidna DNA 2,64 µl plazmidna DNA 3,6 µl

10 x FD pufer 10 µl 10 x FD pufer 7,5 µl

BSA (1000 µg/µl) 10 µl BSA (1000 µg/µl) 7,5 µl

HindIII 2 µl HindIII 2 µl

KpnI 2 µl KpnI 2 µl

dH2O 73,3 µl 6 dH2O 53,5 µl

Po 1-urni inkubaciji smo restrikcijske mešanice nanesli na agarozni gel, da smo preverili uspešnost rezanja. Ustrezne fragmente smo izrezali in jih izolirali iz gela po postopku opisanem na strani 19. Dobili smo rezane plazmidne vektorje in izrezane zapise za proteine z dipeptidnimi ponovitvami.

Ligacija zapisov za proteine DPR v plazmidne vektorje

Pri ligaciji smo pazili, da smo zapise za proteine DPR ligirali v vektor z ustrezno premaknjenim bralnim okvirjem. Le tako se bodo DPR-ji prepisovali v enakem bralnem okvirju kot fluorescenčni marker mScarlet. Pravilne kombinacije so navedene v Tabela 12.

Tabela 12: Ustrezne kombinacije zapisov za DPR in plazmidnih vektorjev

DPR Plazmidni vektor

poli(GA) pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop

poli(GR) pcDNA5 FRT TO mScarlet-I Myc stop

poli(PA) pcDNA5 FRT TO mScarlet-I HindIII_2

poli(PR) pcDNA5 FRT TO mScarlet-I HindIII_2

poli(GP) pcDNA5 FRT TO mScarlet-I HindIII_3