UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
JULIJA BUCHMEISTER
MAGISTRSKA NALOGA
UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM INDUSTRIJSKA FARMACIJA
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
JULIJA BUCHMEISTER
ANALIZNI PRISTOP ZA VREDNOTENJE STABILNOSTI HIDROFILNIH VITAMINOV
ANALYTICAL APPROACH FOR STABILITY EVALUATION OF HYDROPHILIC VITAMINS
UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM INDUSTRIJSKA FARMACIJA
Ljubljana, 2021
Magistrsko nalogo sem opravljala na Katedri za biofarmacijo in farmakokinetiko na Fakulteti za farmacijo, Univerza v Ljubljani, pod mentorstvom prof. dr. Roberta Roškarja, mag. farm. in somentorstvom dr. Žane Temove Rakuša, mag. farm.
Mentorju prof. dr. Robertu Roškarju se iskreno zahvaljujem za vso strokovno znanje, nasvete, prijaznost, sproščenost in potrpežljivost. Velika zahvala gre tudi somentorici dr.
Žane Temovi Rakuša za ves trud, čas, prijetnost in pomoč pri nastajanju magistrskega dela.
Posebna zahvala gre tudi vsem najbližjim za podporo, potrpežljivost in spodbudo v času izdelave magistrske naloge.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod vodstvom mentorja prof. dr.
Roberta Roškarja, mag. farm in somentorice dr. Žane Temove Rakuša, mag. farm.
Julija Buchmeister
III
VSEBINA
1 UVOD ... 1
1.1 VITAMINI ... 1
1.1.1 VODOTOPNI VITAMINI – B KOMPLEKS IN C VITAMIN ... 2
1.1.1.1 Tiamin (B1) ... 3
1.1.1.2 Riboflavin (B2) ... 3
1.1.1.3 Niacin (B3) ... 3
1.1.1.4 Pantotenska kislina (B5) ... 4
1.1.1.5 Piridoksin (B6) ... 4
1.1.1.6 Biotin (B7) ... 5
1.1.1.7 Folati ... 5
1.1.1.8 Cianokobalamin (B12) ... 6
1.1.1.9 Askorbinska kislina (vitamin C) ... 7
1.2 STABILNOST ... 7
1.2.1 STABILNOST NA SPLOŠNO ... 7
1.2.2 STABILNOST VITAMINOV ... 8
1.2.2.1 Vpliv farmacevtske oblike, agregatnega stanja in ovojnine ... 9
1.2.2.2 Vpliv zunanjih dejavnikov ... 9
1.2.2.3 Stabilnost vitaminov v raztopinah ... 10
1.2.2.4 Stabilnost vitaminov v trdnem stanju ... 12
1.2.3 TESTIRANJE STABILNOSTI ... 13
1.2.3.1 Dolgoročno testiranje (angl. long term testing) ... 13
1.2.3.2 Pospešeno testiranje (angl. accelerated testing) ... 13
1.2.3.3 Stresno testiranje (angl. stress testing) ... 14
1.2.4 ANALITIKA VITAMINOV ... 14
2 NAMEN DELA ... 16
3 MATERIALI IN METODE ... 17
3.1 MATERIALI ... 17
3.1.1 REAGENTI IN TOPILA ... 17
3.1.2 STANDARDI ... 17
IV
3.1.3 NAPRAVE IN PRIBOR ... 18
3.2 INSTRUMENTALNE ANALIZNE METODE ... 19
3.2.1 ANALIZNA METODA ZA SOČASNO VREDNOTENJE VODOTOPNIH VITAMINOV ... 19
3.2.2 IZOKRATSKE METODE ZA ANALIZO POSAMEZNIH VODOTOPNIH VITAMINOV ... 20
3.3 PRIPRAVA VZORCEV ... 20
3.3.1 PRIPRAVA MOBILNE FAZE (MF) IN TOPIL... 20
3.3.2 VALIDACIJA ANALIZNE METODE ZA SOČASNO VREDNOTENJE VODOTOPNIH VITAMINOV ... 21
3.3.3 RAZVOJ IN VALIDACIJA ANALIZNIH METOD ZA POSAMEZNE VITAMINE ... 23
3.3.4 STRESNO TESTIRANJE STABILNOSTI VITAMINOV V TRDNEM STANJU ... 25
3.3.4.1 Priprava vzorcev za preverjanje topnosti vit. B7 in stabilnosti THFK... 25
3.3.4.2 Priprava vzorcev za spremljanje stabilnosti posameznih vitaminov pri povišani T in RV .... 26
3.3.4.3 Priprava vzorcev za spremljanje stabilnosti posameznih vitaminov v fotostabilnostni stresni študiji ... 26
3.3.4.4 Priprava vzorcev za spremljanje stabilnosti vitaminov v zmesi vseh vitaminov pri povišani T in RV ... 27
3.4 VALIDACIJA INSTRUMENTALNE METODE ... 28
3.4.1 SPECIFIČNOST ... 28
3.4.2 LINEARNOST ... 29
3.4.3 TOČNOST ... 29
3.4.4 NATANČNOST ... 29
3.4.5 STABILNOST VZORCEV ... 30
3.5 OBDELAVA PODATKOV ... 30
4 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 31
4.1 RAZVOJ ANALIZNEGA PRISTOPA ... 31
4.1.1 NADGRADNJA GRADIENTNE ANALIZNE METODE ... 31
4.1.2 RAZVOJ IZOKRATSKIH ANALIZNIH METOD ... 32
4.2 VREDNOTENJE UHPLC METODE ... 34
4.2.1 VALIDACIJA ANALIZNE METODE ZA SOČASNO VREDNOTENJE VODOTOPNIH VITAMINOV ... 34
4.2.1.1 Specifičnost ... 34
4.2.1.2 Linearnost ... 35
V
4.2.1.3 Točnost in ponovljivost ... 37
4.2.1.4 Stabilnost vzorcev ... 37
4.2.2 VALIDACIJA ANALIZNIH METOD ZA POSAMEZNE VITAMINE ... 39
4.2.2.1 Specifičnost ... 39
4.2.2.2 Linearnost ... 39
4.2.2.3 Točnost, ponovljivost in stabilnost standardov ... 40
4.2.3 PRIMERJAVA GRADIENTNE IN IZOKRATSKE ANALIZNE METODE ... 40
4.3 VREDNOTENJE STABILNOSTI VITAMINOV V TRDNEM STANJU – STRESNA ŠTUDIJA ... 41
4.3.1 RAZVOJ IN OPTIMIZACIJA PRIPRAVE VZORCEV ZA VREDNOTENJE STABILNOSTI V TRDNEM ... 41
4.3.2 VREDNOTENJE STABILNOSTI POSAMEZNIH VITAMINOV PRI POVIŠANI T IN RV ... 43
4.3.3 VREDNOTENJE STABILNOSTI POSAMEZNIH VITAMINOV OB IZPOSTAVITVI SVETLOBI ... 45
4.3.4 VREDNOTENJE STABILNOSTI ZMESI VITAMINOV PRI POVIŠANI T IN RV ... 47
5 SKLEP ... 53
6 LITERATURA ... 54
7 PRILOGE ... 60
PRILOGA 1 ... 60
PRILOGA 2 ... 61
PRILOGA 3 ... 62
PRILOGA 4 ... 68
VI
KAZALO SLIK
Slika 1: Kromatogram vseh devetih osnovnih vodotopnih vitaminov in treh vitamerov v standardni raztopini pri 210 nm.
Vrstni red elucije: C (2,1 min), B1 (3,1 min), B3-k (3,6 min), B6 (4,4 min), B3 (6,9 min), B5 (9,4 min), THFK (12,1 min),
B9 (14,2 min), B7 (17,6 min), B2-f (20,8 min), B12 (21,6 min) in B2 (24,7 min). ... 31
Slika 2: Kromatogram vit. B2-f z retencijskim časom 20,8 min, posnet pri 445 nm. ... 32
Slika 3: Kromatograma izokratskih programov za analizo vit. B7 (7,7 min) in B12 (7,0 min) pri 20 % (3a) oz. vit. B7 (5,1 min) in B12 (3,4 min) pri 25 % MeOH (3b), posneta pri 210 nm. ... 33
Slika 4: Kromatogram uporabljenih topil (MQ, 1 mM EDTA, 1 mM NaOH, 1 mM EDTA z dodanim 1 mM NaOH) pri 210 nm. ... 35
Slika 5: Umeritvena premica za vit. B6 s podano enačbo linearne regresije in R2. ... 36
Slika 6: Vidna barvna razlika pri vit. C v odprtem (levi vsebnik) in zaprtem vsebniku (srednji vsebnik) po prvem tednu izpostavljenosti 60 °C in 75 % RV. Barvna sprememba vit. C v zaprtem vsebniku po treh mesecih v izrazitejšo rjavo in pojav majhnih »zažganih kep« (desni vsebnik). ... 44
Slika 7: Na vseh treh slikah so prikazani vzorci po zaključku enotedenske stresne študije. Stresna vzorca zmesi vitaminov (RDA razmerje in enako razmerje vitaminov – 1:1) pri 60 °C in nekontrolirani nizki RV sta ohranila prvotne organoleptične lastnosti ves čas študije (a). Stresna vzorca zmesi vitaminov (RDA razmerje in enako razmerje vitaminov – 1:1) pri 60 °C in 75 % RV sta bila že po dveh dneh povsem ožgana, po tednu dni pa smoljnata z zlepljenimi delci (b). Stresni vzorec enakega razmerja zmesi vitaminov pri 40 °C in 75 % RV je bil povsem ožgan že po treh dneh, stresni vzorec RDA razmerja zmesi vitaminov pri 40 °C in 75 % RV pa rahlo ožgan po tednu dni izpostavljenosti stresnim pogojem (c). ... 49
Slika 8: Spremljanje vsebnosti vit. B2-f v zmesi vitaminov, v stresnih vzorcih in obeh kontrolah z označenimi SD odstopanji. Vzorci: 1:1 60O (enakomerno razmerje, 60 °C, odprt vsebnik), 1:1 60Z (enakomerno razmerje, 60 °C, zaprt vsebnik), 1:1 80Z (enakomerno razmerje, 60 °C, zaprt vsebnik), 1:1 kontrola (enakomerno razmerje, sobna T, zaprt vsebnik), RDA 60O (RDA razmerje, 60 °C, odprt vsebnik), RDA 60Z (RDA razmerje, 60 °C, zaprt vsebnik), RDA 80Z (RDA razmerje, 80 °C, zaprt vsebnik), RDA kontrola (RDA razmerje, sobna T, zaprt vsebnik)... 50
Slika 9: Vsebnost in SD odstopanja posameznih vitaminov v zmesi vseh vitaminov po enem tednu študije. Rezultati so podani v % glede na vsebnost vitamina ob času 0. Vzorci: 1:1 60O (enakomerno razmerje, 60 °C, odprt vsebnik), 1:1 60Z (enakomerno razmerje, 60 °C, zaprt vsebnik), 1:1 80Z (enakomerno razmerje, 60 °C, zaprt vsebnik), RDA 60O (RDA razmerje, 60 °C, odprt vsebnik), RDA 60Z (RDA razmerje, 60 °C, zaprt vsebnik), RDA 80Z (RDA razmerje, 80 °C, zaprt vsebnik). ... 51
Slika 10: Kromatogram izokratske metode za vit. C pri 290 nm in 1 % MeOH z retencijskim časom 2,1 min. ... 62
Slika 11: Kromatogram izokratske metode za vit. B1 pri 245 nm in 1 % MeOH z retencijskim časom 3,1 min. ... 63
Slika 12: Kromatogram izokratske metode za vit. B6 pri 290 nm in 1 % MeOH z retencijskim časom 4,4 min. ... 63
Slika 13: Kromatogram izokratske metode za vit. B3 pri 260 nm in 10 % MeOH z retencijskim časom 3,3 min. ... 64
Slika 14: Kromatogram izokratske metode za vit. B5 pri 210 nm in 10 % MeOH z retencijskim časom 5,1 min. ... 64
Slika 15: Kromatogram izokratske metode za THFK pri 287 nm in 20 % MeOH z retencijskim časom 3,7 min. ... 65
Slika 16: Kromatogram izokratske metode za vit. B9 pri 287 nm in 20 % MeOH z retencijskim časom 4,4 min. ... 65
Slika 17: Kromatogram izokratske metode za vit. B7 pri 210 nm in 25 % MeOH z retencijskim časom 5,3 min. ... 66
Slika 18: Kromatogram izokratske metode za vit. B12 pri 362 nm in 25 % MeOH z retencijskim časom 3,5 min. ... 66
Slika 19: Kromatogram izokratske metode za vit. B2 pri 445 nm in 30 % MeOH z retencijskim časom 4,6 min. ... 67 Slika 20: Kromatogram izokratske metode za vit. B9 (4,4 min) in THFK (3,7 min) pri 20 % MeOH, posnet pri 287 nm. 67
VII
SEZNAM PREGLEDNIC
Preglednica I: Zbrani kvalitativni podatki (+ skoraj neobčutljiv/stabilen, ++ delno občutljiv, +++ zelo občutljiv/nestabilen) o stabilnosti vodotopnih vitaminov v raztopinah pod vplivom različnih dejavnikov (56,62), stresna študija posameznih vit.
(posam.) in vit. v zmesi vseh vodotopnih vit., kjer zapisani % predstavljajo preostal % vit. po določenem času – urah (h)
(63) in dodatni podatki o stabilnosti vit. v raztopinah. ... 10
Preglednica II: Zbrani podatki o stabilnosti vodotopnih vitaminov v trdnem stanju. ... 12
Preglednica III: Deleža mobilne faze A in B v določenem časovnem intervalu. ... 19
Preglednica IV: Izbrane valovne dolžine detekcije in retencijski časi (tr) posameznih vitaminov. ... 19
Preglednica V: Pregled izokratskih metod z uporabljenimi deleži MeOH v mobilni fazi, pripadajočimi retencijskimi časi posameznih vitaminov (tR), časom analize in valovno dolžino detekcije (λ). ... 20
Preglednica VI: Priprava OR standardov vitaminov za vrednotenje analizne metode. ... 22
Preglednica VII: Postopek redčitev 400 % standardne raztopine za pripravo kalibracijskih (vzorci umeritvene premice (UP)) in kontrolnih vzorcev (QC). ... 22
Preglednica VIII: Koncentracije standardov vodotopnih vitaminov za vrednotenje metode. ... 23
Preglednica IX: Priprava stresnih vzorcev. ... 24
Preglednica X: Pripravo kalibracijskih vzorcev posameznega vitamina (B1, B3, B5, B6, B7, B9, B12 in C) z navedenimi volumni [μL]. ... 25
Preglednica XI: Pripravo kalibracijskih vzorcev posameznega vitamina (THFK, B2 in B2-f) z navedenimi volumni [μL]. ... 25
Preglednica XII: Rezultati vrednotenja linearnosti za vodotopne vitamine s podanim linearnim koncentracijskim območjem, s pripadajočimi umeritvenimi premicami in izračunanimi R2. ... 36
Preglednica XIII: Znotraj-dnevna točnost, ponovljivost in ponovljivost injiciranja (RSD, n = 3) analizne metode za vodotopne vitamine. ... 37
Preglednica XIV: Stabilnost vzorcev pri vseh treh koncentracijskih nivojih po 12 in 24 urah, izražena v odstotkih glede na začetno vrednost (n = 3). ... 38
Preglednica XV: Vitamini, analizirani po kratkih izokratskih metodah, s pripadajočimi umeritvenimi premicami in korelacijskimi koeficienti (R2). ... 39
Preglednica XVI: Rezultati točnosti, ponovljivosti in stabilnosti vzorcev na enem koncentracijskem nivoju – QCM po 24 urah, izraženi v odstotkih glede na začetno vrednost (n =3) za kratke izokratske metodo. ... 40
Preglednica XVII: Rezultati preverjanja homogenosti znotraj vzorcev posameznih vitaminov, podani s povprečno vrednostjo točnosti in RSD (n = 3). ... 42
Preglednica XVIII: Rezultati študije posameznih vitaminov v trdnem stanju pri 60 °C in 75 % RV. Prikazani so podatki o stabilnosti vitaminov v odprtih in zaprtih vsebnikih v testiranih časovnih intervalih glede na začetno časovno točko. ... 44
Preglednica XIX: Vpliv svetlobe na stabilnost posameznih vitaminov v trdnem stanju. Podatki o stabilnosti vitaminov v testiranih časovnih intervalih glede na začetno časovno točko so izraženi v %.. ... 46
Preglednica XX: Podatki o priporočenem dnevnem vnosu posameznih vodotopnih vitaminov, v katerih živilih so najpogosteje prisotna ter bolezni, ki lahko nastanejo zaradi dolgotrajnega pomanjkanja posameznega vitamina (Poglavje 1.1) (7,10–12,102). ... 60
Preglednica XXI: Rezultati testiranih stresnih vzorcev: podatki o vsebnosti posameznega vitamina v kontrolnem in stresnem vzorcu pri določenem pogoju. ... 68
VIII
POVZETEK
Vitamini so zelo aktualno raziskovalno področje zaradi številnih pozitivnih učinkov pri ohranjanju zdravja. V splošnem so vodotopni vitamini nestabilni, a je podatkov malo, še posebej o njihovi stabilnosti v trdnem stanju. Naš namen je bil pridobiti podatke o stabilnosti vodotopnih vitaminov v trdnem stanju, posamezno in v zmeseh.
Glavni cilj magistrske naloge je bil razvoj enostavnega analiznega pristopa za spremljanje stabilnosti najpogostejših oblik vodotopnih vitaminov v trdnem stanju. V ta namen smo predhodno razvito stabilnostno indikativno metodo UHPLC-DAD za sočasno vrednotenje glavnih vodotopnih vitaminov (tiaminijev klorid (B1), riboflavin (B2), riboflavin natrijev fosfat (B2-f), nikotinamid (B3), kalcijev D-pantotenat (B5), piridoksinijev klorid (B6), D- biotin (B7), folna kislina (B9), cianokobalamin (B12), L-askorbinska kislina (C)) razširili za vrednotenje dveh dodatnih vitamerov B3 in B9 (nikotinska kislina in 5-metil tetrahidrofolna kislina). Z namenom skrajšanja časa in poenostavitve analiznega postopka smo razvili in optimizirali kratke stabilnostno indikativne metode za analizo posameznih vodotopnih vitaminov. Vse metode smo ovrednotili v skladu s smernicami ICH in jih uporabili pri vrednotenju stabilnosti vodotopnih vitaminov v trdnem stanju, posamezno in v zmeseh.
Stabilnostne študije smo izvedli v klimatskih komorah pri različnih stresnih pogojih – povišani temperaturi, relativni vlažnosti, svetlobi. Optimizirali smo pripravo vzorcev in prilagajali eksperimentalne pogoje. Na osnovi rezultatov trimesečne študije stabilnosti posameznih vitaminov pri 60 °C in 75 % relativne vlažnosti smo potrdili ustrezno stabilnost (> 90 % začetne vsebnosti) za večino vitaminov in manjšo stabilnost (45 – 89 %) za vitamine B5, B12 in obe obliki B2. V enotedenski študiji izpostavitve posameznih vodotopnih vitaminov svetlobi smo ugotovili, da vsi vitamini razen vitaminov C in B12 ohranjajo svojo stabilnost (> 90 % začetne vsebnosti). Vrednotenje stabilnosti vodotopnih vitaminov v zmesi je bilo težavno zaradi nehomogenosti vzorcev. Smo pa ugotovili, da so vitamini v zmesi manj stabilni kot posamezno, kar so potrdile tudi organoleptične spremembe vzorcev (ožganost in smoljnatost). Na stabilnost vitaminov v zmesi je pomembno vplivala zlasti višja relativna vlažnost in njen sinergistično destabilizirajoči učinek s povišano temperaturo.
Zaključimo lahko, da smo uspešno razvili analizni pristop za vrednotenje stabilnosti posameznih vodotopnih vitaminov v trdnem stanju. Za ustrezno ovrednotenje stabilnosti vitaminov v zmeseh pa bo potrebna še nadaljnja optimizacija pred-analiznih aktivnosti.
Ključne besede: vodotopni vitamini, UHPLC, stabilnostno indikativna metoda, stabilnost v trdnem, stresno testiranje
IX
ABSTRACT
Vitamins are a very topical field of research due to their many positive effects in maintaining health. In general, water-soluble vitamins are unstable, but little data is available, especially about the stability of water-soluble vitamins in the solid state. Our purpose was to obtain data on their stability in the solid state, individually and in mixtures.
Themaingoalofthemaster's thesis was to develop a simple analytical approach to monitor the stability of the most common forms of water-soluble vitamins in the solid state. For this purpose we expanded previously developed stability indicative UHPLC-DAD method for the simultaneous evaluation of the main water-soluble vitamins (thiamine chloride (B1), riboflavin (B2), riboflavin sodium phosphate (B2-f), nicotinamide (B3), calcium D- pantothenate (B5), pyridoxine hydrochloride (B6), D-biotin (B7), folic acid (B9), cyanocobalamin (B12), L-ascorbic acid (C)) for evaluation of two additional vitamers B3 and B9 (nicotinic acid and 5-methyl tetrahydrofolic acid). In order to shorten the time and simplifytheanalyticalprocedure,wehavedeveloped and optimized fast stability-indicative methods for the analysis of individual water-soluble vitamins. All methods were evaluated according to ICH guidelines and used for stability studies of water-soluble vitamins in the solid state, individually and in mixtures. Stability studies were performed in climatic chambers under various stress conditions - elevated temperature, relative humidity, light.
We optimized sample preparation and adjusted the experimental conditions. Based on the results of a three-month stability study of individual vitamins at 60 °C and 75 % relative humidity, we confirmed adequate stability (> 90% of initial content) for most vitamins and lowerstability(45–89%)forvitaminsB5,B12andboth forms of B2. In a one-week study of the exposure of individual water-soluble vitamins to light, we found out that all vitamins exceptvitaminsCandB12maintaintheirstability(>90%oftheinitial content). Evaluation of the stability of water-soluble vitamin mixtures was difficult due to the inhomogeneity of the samples. However, we found out that the vitamins in the mixture are less stable than individually, which was also confirmed by organoleptic changes of samples (burned and resinous). The stability of the vitamins in the mixture was significantly affected by the higher relative humidity and its synergistic destabilizing effect with elevated temperature.
We have successfully developed an analytical approach to evaluate the stability of individual water-soluble vitamins in the solid state. Further optimization of pre-analytical activities will be required to properly evaluate the stability of vitamins in mixtures.
Keywords: water-soluble vitamins, UHPLC, stability indicative method, stability in solid state, stress testing
X
SEZNAM OKRAJŠAV
Simboli
m masa [g]
M molska masa [g/mol]
tr retencijski čas [min]
t čas [min]
T temperatura [°C]
λ valovna dolžina [nm]
V volumen [L]
Kratice
AUC površina pod kromatografskim vrhom (angl.: Area Under the Curve) AK askorbinska kislina
B1 tiaminijev klorid
B2 riboflavin
B2-f riboflavin natrijev fosfat
B3 nikotinamid
B3-k nikotinska kislina B5 kalcijev D-pantotenat B6 piridoksinijev klorid
B7 D-biotin
B9 folna kislina B12 cianokobalamin C L-askorbinska kislina
DAD detektor z nizom diod (angl.: Diode-Array Detector) EDTA etilendiamintetraocetna kislina
FO farmacevtska oblika
XI
HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (angl.: High Performance Liquid Chromatography)
MeOH metanol
MF mobilna faza
MQ voda milliQ voda OR osnovna raztopina QC kontrolna raztopina R2 korelacijski koeficient razt. raztopina
RDA priporočen dnevni odmerek (angl.: Recommended Daily Allowance) RSD relativni standardni odklon (angl.: Relative Standard Deviation) RV relativna vlažnost
SIM stabilnostno indikativna metoda SR raztopina standarda
ST standard
THFK 5-metil tetrahidrofolna kislina
UHPLC-DAD tekočinska kromatografija ultra visoke ločljivosti sklopljena z detektorjem z nizom diod (angl.: Ultra-High Performance Liquid Chromatography coupled with Dode-Array Detection)
UP umeritvena premica
UZ ultrazvok
vit. vitamin
VZ vzorec
ZU zdravilna učinkovina
1
1 UVOD
1.1 VITAMINI
Izraz vitamin (vit.) izvira iz dveh latinskih izrazov; »vita« pomeni življenje, »amin« pa se navezuje na dušik vsebujočo spojino. Prve vitamine so odkrili v začetku 20. stoletja, poimenovali pa so jih s črkami abecede po vrstnem redu odkritij. Kasneje so ugotovili, da vsi vitamini ne vsebujejo dušika, vendar se je ime ohranilo vse do danes (1–3).
Vitamini so kemijsko heterogena skupina biološko aktivnih organskih spojin z nizko molekulsko maso, ki so nujno potrebna za normalno delovanje organizma. V telesu imajo pomembno vlogo pri uravnavanju fizioloških procesov, kot so dihanje, rast in razvoj, presnova, delovanje možganov in živčevja. Pri telesnih reakcijah sodelujejo kot hormoni, antioksidanti in kofaktorji (4).
Poznamo 13 predstavnikov vitaminov: v maščobah so topni A, D, E in K, v vodi pa osem vitaminov skupine B in vit. C. Vodotopni vitamini imajo v svoji strukturi eno ali več polarnih ali ionizirajočih skupin (npr. hidroksilna, karboksilna, ketonska, amino ali fosfatna), medtem ko imajo maščobotopni vitamini hidrofobne strukture (dolge lipofilne verige, aromatski in nearomatski obroči). Razlika med obema skupinama je pomembna, saj lahko telo vitamine, topne v maščobah, skladišči dlje, medtem ko se lahko vodotopni vitamini (z izjemo B12) v telesu zadržijo le krajši čas in jih je zato treba pogosteje uživati. Vodotopni vitamini, ki so v presežku, se namreč ne skladiščijo v organizmu, ampak se skoraj v celoti izločijo iz telesa z urinom preko ledvic. Iz prebavil pa se absorbirajo hitro in neposredno, bodisi s pasivno difuzijo bodisi s specifičnimi transportnimi proteini (4–6).
Telo vitaminov ni zmožno samo sintetizirati iz osnovnih gradnikov, razen izjem (D, K, B3), v manjših količinah (7). Zato jih moramo za varovanje zdravja vsakodnevno vnašati v telo s hrano, v ustreznih količinah, določenih s priporočenim dnevnim vnosom – RDA (angl.
Recommended Daily Allowance). Ta je prilagojen za nosečnice, doječe matere, otroke in mladostnike, starejše, vegetarijance in vegane ter telesno aktivnejše ljudi, ki imajo večinoma povečane potrebe po vitaminih (5,8–10).
V sodobnem svetu masovne proizvodnje živil, industrijske obdelave in hitrega pridobivanja hrane je naša prehrana vedno bolj osiromašena in enolična (11). Na ta način je prejemanje dnevnega priporočenega vnosa hranil vprašljivo, kar lahko privede do (dolgotrajnega) pomanjkanja vitaminov, to pa lahko vodi v hipovitaminoze ali celo avitaminoze oz. z njimi
2
povezane bolezni, ki so zbrane v Preglednici XX v Prilogi 1 (8). V primeru nezadostnega vnosa je vitamine smiselno dodajati v vsakodnevno uravnoteženo prehrano v obliki prehranskimi dopolnil (7,12). Prekomeren vnos vitaminov, še posebej maščobotopnih, lahko vodi v drugo skrajnost, tako imenovane hipervitaminoze, pri katerih se posameznega vitamina v telesu nakopiči preveč. Maščobotopni vitamini se namreč ob prekomernem zaužitju ne izločijo z urinom kot vodotopni vitamini, ampak se kopičijo in ostajajo v telesu dlje časa (recimo A in D) (8).
1.1.1 VODOTOPNI VITAMINI – B KOMPLEKS IN C VITAMIN
Med vodotopne vitamine prištevamo vitamine B kompleksa – tiamin (B1), riboflavin (B2), niacin (B3), pantotenska kislina (B5), piridoksin (B6), biotin (B7), folna kislina (B9) in cianokobalamin (B12) ter vit. C (askorbinska kislina). Skupina zajema strukturno in funkcionalno zelo različne spojine. Vsem predstavnikom pa je skupno, da so bistveni za normalno celično delovanje, rast in razvoj, presnovo makrohranil (ogljikovih hidratov, maščob in beljakovin), obnovo dednega materiala, zdravo kožo, lase in nohte, normalno delovanje mišic, živčnega sistema ter možganov, tvorbo rdečih krvničk, celjenje ran in drugo (5). Pri odkritju so bili znanstveniki najprej prepričani, da gre za eno snov; poimenovali so jo vit. B, vendar izkazalo se je, da gre za skupino različnih vitaminov, ki so jih nato označili s številčnim indeksom: B1, B2 in tako dalje. Vsem je bilo skupno, da so jih izolirali iz kvasa in jeter (8). Za nekatere spojine so kasneje ugotovili, da ne izkazujejo vseh lastnosti vitaminov, zato nekateri vitamini B manjkajo (npr. B4) (13).
Vitamine B kompleksa najdemo zlasti v mesu, ribah, mleku in mlečnih izdelkih, sveži zelenjavi, sadju, žitih, sladkorni melasi, tako da jih v večini lahko zaužijemo dovolj že z običajno uravnoteženo prehrano. V živilih vitamini niso prisotni posamezno, temveč se vedno pojavljajo v celotni skupini (7,11). V Prilogi 1 (Preglednici XX) so povzete informacije o priporočenem dnevnem vnosu posameznih vodotopnih vitaminov ter v katerih živilih so najpogosteje prisotni.
Kljub uravnoteženi in splošno zdravi prehrani se lahko pojavi pomanjkanje kakšnega vitamina, ki ga spremljajo znaki, kot so npr. utrujenost, splošna slabost, zmanjšana zbranost, potrtost, slabša kakovost spanja, zgodnejše sivenje in izpadanje las, zaprtost, povečana vsebnost holesterola v krvi (11). Vpliv na zdravje posameznika je odvisen od trajanja in resnosti primajkljaja vitamina. Ima pa vsak posameznik različne potrebe po vitaminih, na katere vpliva zdravje (kronične in akutne bolezni), življenjski stil (npr. kajenje), določena (fiziološka) stanja in drugi dejavniki (14). Običajno se pojavi istočasno pomanjkanje večjega
3
števila B vitaminov, zato je ob znakih pomanjkanja kateregakoli B vitamina priporočljivo jemati celoten B-kompleks, saj se med seboj dopolnjujejo (13).
1.1.1.1 Tiamin (B1)
Tiamin označujemo z B1, saj so ga odkrili prvega (7). Poznamo ga v več oblikah, najpogostejši sta tiaminijev klorid in tiaminijev mononitrat (15). Sodeluje pri presnovi ogljikovih hidratov, zato so v primeru večje količine zaužitih enostavnih ogljikovih hidratov tudi potrebe telesa po tiaminu večje. Sicer je tiamin potreben za normalno delovanje živčevja, spominske sposobnosti, delovanje mišic in srca, izboljša razpoloženje in zmanjša celični oksidativni stres (7).
Če ga primanjkuje, smo utrujeni in razdražljivi, pogosto nas spremlja tudi nespečnost.
Največkrat pride do pomanjkanja pri starejših in alkoholikih zaradi zmanjšane absorpcije tiamina. Hudo pomanjkanje vit. B1 pa povzroča bolezen beriberi, ki se kaže z mišično šibkostjo, čustveno nestabilnostjo, glavoboli, utrujenostjo, motnjami zaznavanja, kar lahko vodi do težav z živčnim in krvno-žilnim sistemom (16).
1.1.1.2 Riboflavin (B2)
Ima značilno živo rumeno do oranžno barvo, najdemo pa ga v prosti ali fosfatni obliki, katera je v vodi tudi bistveno bolj topna (17–19). Sodeluje v elektronski transportni verigi pri celičnem dihanju, kot kofaktor v encimskih reakcijah presnove ogljikovih hidratov, lipidov in aminokislin, pri pretvorbi vit. B6 in B3, proizvodnji ščitničnega hormona, sintezi DNK, obnavljanju in popravljanju tkiv. Koristen je za zdravo kožo, nohte in lase, zmanjša pogostost napadov migrene in njihovo moč ter skupaj z vit. A vpliva na vid (7,11,20).
Pomanjkanje vpliva na sposobnost absorpcije železa iz hrane, najpogosteje se pojavi pri bolnikih z vnetim črevesjem ali pri kroničnih alkoholikih. Priporočljivo je dodajati večje odmerke riboflavina nosečnicam, športnikom in ljudem, ki so pod hujšim stresom. Pri pomanjkanju prihaja do razpok na vogalih ust, vnetega rdečega jezika, vnetega grla, na svetlobo občutljivih oči, sprememb na koži, izpadanja las, glavobola, raztresenosti, nespečnosti in anemije (7,11).
1.1.1.3 Niacin (B3)
Poznamo dve obliki niacina – nikotinamid in nikotinsko kislino (21). Njegova posebnost v skupini vodotopnih vitaminov je, da nastaja tudi endogeno, saj ga organizem lahko sintetizira iz esencialne aminokisline triptofan, ki se v telesu ne porabi za izgradnjo beljakovin (11). V telesu se niacin pretvarja iz ene oblike v drugo, ki sodelujeta pri celičnih
4
redoks reakcijah kot prekurzorja koencimov NAD+ in NADP in tako opravljata pomembno vlogo pri celični presnovi in dihanju. Sodelujeta pri signalizaciji celic, popravljanju DNK, katabolizmu maščob, ogljikovih hidratov, beljakovin in alkohola, sintezi maščobnih kislin in holesterola. Niacin je potreben tudi za nastanek spolnih hormonov, za normalno delovanje živčnega sistema in možganov (11). V raziskavah so pokazali, da večji odmerki niacina znižujejo vsebnost holesterola in trigliceridov v krvi in lahko s tem pripomore k preprečevanju ateroskleroze in pri zdravljenju hiperholesterolemije (22,23). Naj bi tudi izboljšal cirkulacijo, lajšal simptome artritisa, lajšal depresijo, nespečnost in preprečeval razvoj sladkorne bolezni tipa I (11).
Pomanjkanje niacina vodi do pelagre, bolezni, za katero je značilen sočasni pojav dermatitisa, diareje in demence. Prihaja do vnetja sluznice, luščenja kože, razpokane in pigmentirane kože, zmedenosti in nevroloških motenj (24).
1.1.1.4 Pantotenska kislina (B5)
Pantotenska kislina je kemijsko amid med pantojsko kislino in aminokislino beta-alanin. V naravi je večinoma vezana v koencimu A, v prosti obliki jo najdemo zelo redko, v farmacevtskih izdelkih pa je večinoma v obliki soli (npr. kalcijev pantotenat), ki imajo boljšo stabilnost (24). Ključna je pri sintezi živčnih prenašalcev, steroidnih hormonov, aminokislin, maščobnih kislin, fosfolipidov in hemoglobina. Pomembna je za rast, ohranja zdravje živčnega sistema, pravilno delovanje nadledvične žleze, regeneraciji tkiv, kože in las ter preprečuje vnetja. Sodeluje pri pretvorbi maščob in sladkorjev v energijo ter pri presnovi aminokislin in etanola. Lahko izboljša počutje pri sindromu kronične utrujenosti, pomaga pri migreni, artritisu, slabi prebavi in simptomih alergij (7).
Izraz »pantotenska« izvira iz grške besedice »pantos«, kar pomeni od vsepovsod. Najdemo ga namreč v številnih živilih, zato do pomanjkanja vit. B5 običajno ne prihaja. V primeru pomanjkanja pa se pojavijo raztresenost, pomanjkanje zbranosti, težave pri pomnjenju, nespečnost,slabšiimunskisistem,slabost(11).Ljudje,kisopogostopodstresomalifizično zelo aktivni ter nosečnice morajo dnevno dobiti večje količine pantotenske kisline (24).
1.1.1.5 Piridoksin (B6)
Nahaja se v več oblikah kot piridoksin, piridoksal in piridoksamin, ki se ob vstopu v jetra ali telesno celico fosforilirajo (24). Piridoksin sodeluje pri presnovi makrohranil, maščobnih kislin in aminokislin (triptofan in cistein), sintezi hemoglobina, histamina in živčnih prenašalcev (prenašajo živčne dražljaje in s tem določajo razpoloženje, ravnanje in spanje),
5
tvorbi protiteles in rdečih krvničk, izražanju genov, uravnava delovanje hormonov, skrbi za izravnavo natrija in kalija v telesnih tekočinah ter pomaga pri absorpciji vit. B12. Skupaj s folno kislino in vit. B12 pomaga telesu razgrajevati homocistein, ki sicer poveča tveganje za srčno-žilna obolenja. Sodeluje kot kofaktor v več kot 140 biokemijskih reakcijah v celicah (7,11,25,26).
Povečane potrebe po vnosu vit. B6 opazimo večkrat pri ženskah (pred menstruacijo, med jemanjem kontracepcijskih tablet, med nosečnostjo) in starostnikih, pri povišanem krvnem sladkorju in pri ljudeh, ki so veliko pod stresom. Pomanjkanje piridoksina se kaže v obliki dermatitisa, vnetja jezika in oči, izgube teka, anemije, živčnih motenj (nespečnost, nervoznost, depresija) (25,27,28).
1.1.1.6 Biotin (B7)
Ime biotin izvira iz besede »bios«, ki v grščini pomeni življenje. Izdelujejo ga črevesne bakterije, čeprav ga telo v takšni obliki težje uporabi. V naravi se nahaja samo v eni aktivni obliki, kot D-biotin (7). Nekateri ga imenujejo tudi vit. H (29). Sodeluje pri številnih metabolnih reakcijah, pri biosintezi maščobnih kislin, presnovi ogljikovih hidratov, glukoneogenezi in pri razgradnji nekaterih aminokislin. Ključen je za lepo, gladko kožo, bujne, zdrave in sijoče lase ter nohte.
Pomanjkanje vodi do utrujenosti, slabosti, bolečine v mišicah, kognitivnih in nevroloških motenj, dermatitisa, izpadanja las in krhkih nohtov, pomanjkanje v nosečnosti je lahko zelo škodljivo za plod. Tudi pri sladkorni bolezni, epilepsiji in multipli sklerozi ga primanjkuje (24). Sicer pa do pomanjkanja vit. B7 običajno ne prihaja, saj ga najdemo v številnih živilih (7). Lahko pa se pojavi pri uživanju snovi (npr. avidin v surovem jajčnem beljaku), ki vežejo biotin in ga deaktivirajo, da se potem ne more absorbirati v krvni obtok (30).
1.1.1.7 Folati
Folno kislino skupaj z vsemi njenimi derivati s podobno aktivnostjo imenujemo folati, ki so kemijsko heterociklične strukture 4-[(pteridin-6-ilmetil)amino] benzojske kisline konjugirane z eno ali več L-glutaminskimi enotami. Gre za rumeno-oranžni kristalinični prašek brez vonja in okusa (31). Folna kislina je oksidirana sintezna oblika vit. B9, ki jo najdemo zgolj v obogatenih živilih, prehranskih dopolnilih in zdravilih (32). Nima koencimske aktivnosti in postane aktivna šele po pretvorbi v tetrahidrofolat. 5-metil tetrahidrofolna kislina (THFK) je torej reduciran presnovek folne kisline, ki nastane iz dihidrofolne kisline s pomočjo encima dihidrofolat reduktaze v jetrih in je biološko aktivna
6
oblika folatov v telesu, ki kot kofaktorji sodelujejo pri reakcijah sinteze nukleinskih kislin in aminokislin (33–35). Folati imajo pomembno vlogo pri sintezi, metilaciji in popravljanju DNK, delitvi celic, pri delovanju imunskega sistema, pri rasti in zorenju rdečih krvničk (vzdržuje normalno eritropoezo), spodbuja nastanek serotonina in noradrenalina (7,11,36).
Pomanjkanje folatov je pogosto, saj jih z dnevno prehrano po navadi ne zaužijemo dovolj.
Pomanjkanje se kaže kot megaloblastna anemija (napake v sintezi DNK v eritrocitih), splošna slabost in celo kot depresija. Nujno potreben je tudi hkraten vnos vit. B12 zaradi medsebojno povezanega delovanja. Dodajanje folatov je zlasti pomembno v nosečnosti, kjer lahko pomanjkanje vit. B9 vodi v okvare nevralne cevi zarodka in posledično do okvar v možganih in hrbtenici (7,35,37). Dodatek aktivne oblike folata (THFK) je zelo priporočljiv pri ljudeh z genetskim polimorfizmom v genu metilentetrahidrofolat reduktaze, kjer ima encim zaradi manjše aktivnosti oslabljeno sposobnost pretvorbe folatov v aktivno obliko. Ta polimorfizem povzroči manj biološko razpoložljivega THFK in s tem zmanjšan potencial metilacije, kar vodi do povišane ravni homocisteina in povečanega tveganja za nastanek okvar nevralnih cevi zarodka (38). Vnos THFK ima še dodatne prednosti pred vnosom folne kisline, saj omili hematološke simptome ob pomanjkanju vit. B12 ter izkazuje manjšo interakcijo z zdravili, ki zavirajo dihidrofolat reduktazo (32).
1.1.1.8 Cianokobalamin (B12)
Cianokobalamin, s kobaltovim atomom v središču razvejane molekule, je bil odkrit najkasneje in ima najkompleksnejšo sestavo med vsemi vitamini B kompleksa. Poznamo še metilkobalamin, hidroksikobalamin in adenozilkobalamin, vendar je vit. B12 v izdelkih najpogosteje prisoten v obliki cianokobalamina. Telo ga kopiči v večjih količinah, pretežno v jetrih (7,11,39,40). Kot kofaktor sodeluje pri presnovi makrohranil, pri eritropoezi ter pri sintezi proteinov, DNK in živčnih prenašalcev (41).
Pomanjkanja so pogostejša pri vegetarijancih in veganih, saj ga najdemo večinoma zgolj v živilih živalskega izvora. Za pomanjkanjem trpijo tudi ljudje s kroničnim vnetjem želodčne sluznice, kjer pride do motene absorpcije vit. B12 (41–43). Posledice pomanjkanja se običajno kažejo v obliki perniciozne anemije, utrujenosti, potrtosti, izgube apetita, bledo rumeno obarvane kože, oteklega jezika, odrevenelih okončin, nevroloških težav (izguba spomina), dolgotrajno pomanjkanje vit. B12 (skupaj s pomanjkanjem vit. B9) pa vodi do megaloblastne anemije in okvare živčnega sistema (44).
7 1.1.1.9 Askorbinska kislina (vitamin C)
Vit. C ali L-askorbinska kislina je dobila ime izpeljano iz lastnosti, da je »antiskorbut« (7).
Deluje kot antioksidant in ščiti naše telo pred reaktivnimi kisikovimi spojinami (radikali, peroksidi), samostojno in v kombinaciji z vit. E. Zavira nekontrolirane oksidativne procese, ki oslabijo imunski sistem in povzročajo poškodbe celic, staranje organizma, rakasta obolenja, aterosklerozo, nevrodegenerativne bolezni ter bolezni srca in ožilja. Izboljša absorpcijo železa v prebavnem traktu, kot kofaktor sodeluje pri mnogih encimskih reakcijah in pomaga pri odstranjevanju strupov iz telesa. Pomemben je za sintezo kolagena, hemoglobina, hormonov, za vsa mehka tkiva (dlesni, ožilje, kožo in kosti) in pri dozorevanju eritrocitov. Potreben je tudi za normalno delovanje možganov in živčevja ter imunskega sistema (11,45,46).
Najboljši vir vit. C je sveža, ustrezno skladiščena ter lokalno pridelana zelenjava in sadje (13). Zaradi neuravnotežene prehrane, zlasti pri otrocih, kadilcih, starejših in alkoholikih, prihaja do njegovega pomanjkanja, kar lahko privede do bolezni imenovane skorbut. Zanjo so značilne boleče, otečene in krvaveče dlesni, izguba apetita, bolečine v sklepih in mišicah, slabo celjenje ran in izčrpanost. Dolgotrajno pomanjkanje lahko vodi v slabše delovanja imunskega sistema, povečajo se tudi možnosti za razvoj srčnih bolezni in raka (47,48).
Dnevne potrebe po vitaminu lahko povečajo intenzivna fizična aktivnost, okužbe in poškodbe ter višja temperatura (T) okolja. Presežke vit. C telo izloči z urinom. Pri prevelikem odmerjanju vit. C (npr. več kot 2000 mg) lahko pride do draženja želodca in črevesja, diareje, nastajanja ledvičnih kamnov in motnje stanja bakra v telesu (11). V študijah so ugotovili tudi, da lahko dajanje vit. C v visokih odmerkih izkazuje pro- oksidativno delovanje vitamina, ki bi se lahko izkoriščalo za zaviranje rasti rakavih celic (49,50).
1.2 STABILNOST
1.2.1 STABILNOST NA SPLOŠNO
Stabilnost je pomemben vidik različnih izdelkov – zdravil, hrane, prehranskih dopolnil in drugih. Z zagotavljanjem stabilnosti farmacevtskega izdelka dosežemo, da izdelek ohranja svoje karakteristike znotraj predpisanih mej skozi čas roka uporabnosti, če ga shranjujemo v ustreznem vsebniku pri ustreznih pogojih (51). Ohranjanje stabilnosti zdravilne učinkovine (ZU) oz. farmacevtskega izdelka je ključno za zagotavljanje vseh treh osnovnih lastnosti farmacevtskega izdelka – kakovosti, varnosti in učinkovitosti (52).
8
Zdravilo smatramo kot stabilno, če ohranja vsebnost ZU običajno nad 90 % začetne koncentracije, fizikalne lastnosti zdravila in mikrobiološka kakovost izdelka pa se pri tem bistveno ne spremenijo. Zaradi različnih vzrokov lahko pride do nestabilnosti farmacevtskega izdelka, ki se kaže kot znižanje koncentracije ZU, zvišanje koncentracije ZU, povečan nastanek razgradnih produktov, sprememba biološke uporabnosti ali profila raztapljanja, izguba homogenosti, zmanjšanje mikrobiološke kakovosti, nastanek toksičnih razgradnih produktov, sprememba barve in teksture (51,53).
V okviru stabilnosti obravnavamo štiri vidike: kemijski, fizikalni, mikrobiološki in biofarmacevtski vidik. Kemijska stabilnost pomeni ohranjanje kemijske istovetnosti in jakosti ZU znotraj določenih mej. Pri kemijski nestabilnosti prihaja do razpada ZU (upad vsebnosti ZU v izdelku) in nastanka novih razgradnih spojin zaradi različnih reakcij – oksidacij, dehidracij, fotoliz, solvoliz in drugih. Fizikalna nestabilnost se kaže v vidnih (sprememba izgleda, vonja, enakomernosti vsebine, raztapljanja) in nevidnih (prehajanje med kristalno in amorfno obliko) fizikalnih spremembah ZU ali zdravila. Mikrobiološka stabilnost pomeni odsotnost patogenih organizmov in odpornost na rast mikroorganizmov v okviru določenih zahtev in jo zagotavljamo z dobro proizvodno prakso – GMP (angl. Good manufacturing practice), izbiro primernih vsebnikov in ovojnine, ustreznimi vhodnimi surovinami in dodatkom protimikrobnih sredstev. Stabilnost z biofarmacevtskega vidika je vezana na ohranjanje mehanizma in kinetike procesa prehoda ZU v organizmu (52,54).
Zdravila se uporabljajo glede na njihovo učinkovitost in varnost, zato morajo biti stabilna in ohranjati kakovost do izteka navedenega roka uporabe. Kakovost zdravila je potrebno ohranjati pri vseh pogojih, ki jim je zdravilo izpostavljeno med proizvodnjo, prevozom in shranjevanjem v bolnišnicah, lekarnah ter med uporabo. Zato je ključno razumevanje dejavnikov, ki vplivajo na stabilnost ZU in končnih farmacevtskih izdelkov (52).
1.2.2 STABILNOST VITAMINOV
Vitamini so v splošnem (pogosto) nestabilni, na njihovo stabilnost vplivajo številni dejavniki – kemijska struktura vitaminov in izpostavljenost zunanjim dejavnikom. Na njihovo stabilnost v izdelkih pa dodatno vplivajo še stabilnost pomožnih snovi, interakcije med ZU in pomožnimi sestavinami, farmacevtska oblika (FO), proizvodni postopek, vrsta vsebnika, okolje rokovanja, transportiranja in shranjevanja (51).
9
1.2.2.1 Vpliv farmacevtske oblike, agregatnega stanja in ovojnine
Multivitaminske izdelke najdemo na tržišču v različnih oblikah: šumeče tablete, tablete, kapsule, praški, žvečljive tablete, pastile, podjezične tablete, sirupi, liposomski izdelki in drugi (7). Oblika multivitaminskega izdelka precej vpliva na stabilnost njegovih komponent.
V tekoči obliki lahko molekule prosto reagirajo druga z drugo, medtem ko je v trdnem izdelku verjetnost kemijske interakcije manjša. Pomemben je tudi tip obloge (npr. trda kapsula, mehka želatinasta kapsula, obložena tableta), saj predstavlja zaščitno bariero za dejavnike (vlaga, svetloba, kisik), ki lahko vplivajo na stabilnost izdelka. Tudi velikost delcev sestavin je pomemben dejavnik, saj imajo manjši delci večjo specifično površino, večji delci pa manjšo specifično površino in so torej slednji bolj stabilni zaradi manjše izpostavljenosti dejavnikom okolja (55).
Vitamini morajo biti ustrezno proizvedeni, transportirani in shranjeni pod predpisanimi pogoji. Največ vitaminov se shranjuje pri sobni T, lahko pa tudi pri nižji T – v hladilniku.
Za ohranjanje njihove stabilnosti je izrednega pomena izbira ustrezne ovojnine – debelina, netransparentnost, stopnja prepustnosti plinov, uporaba sušilnih sredstev znotraj ovojnine, inertna atmosfera, prepihovanje z dušikom. Multivitaminski izdelki so najpogosteje shranjeni v plastenkah iz polietilena visoke gostote (HDPE) ali v pretisnih omotih, ki nudijo potrebno zaščito pred zunanjimi dejavniki (3,55).
1.2.2.2 Vpliv zunanjih dejavnikov
Vitamini so skupina kemijsko raznolikih spojin, ki se zelo razlikujejo po svoji stabilnosti oz.
dovzetnosti za razgradnjo. Stopnja razgradnje posameznih vitaminov je odvisna od same strukture in stabilnosti vitaminov in od specifičnih zunanjih dejavnikov. Zelo pomembno je zagotavljanje in ohranjanje stabilnosti, ter s tem ohranjanje učinkovitosti vitaminov, ne le kot samostojnih komponent, temveč tudi kot del končnega farmacevtskega izdelka (55,56).
Do reakcij nestabilnosti vitaminov pride že v vsakodnevni prehrani, kjer lahko z obdelavo živila povzročimo velik upad njihove vsebnosti. Na primer rezanje, lupljenje, mletje, fermentacija, termična in druga mehanska obdelava povzročajo izgube posameznih vitaminov. Na tovrstne metode obdelave so še posebej občutljivi vit. C, B1 in B9. Čas in T predelave ter shranjevanje pomembno vplivajo na vitaminski status živil (57). Zato je smiselno uživati več surove kot predelane zelenjave in sadja, ki sta lokalno pridelana in do uporabe ustrezno skladiščena (58).
Stabilnost vitaminov se lahko zmanjša pod vplivom različnih dejavnikov, kot so: T, prisotnost vode, kislo ali bazično okolje, kisik, svetloba, kovinski ioni (Fe2+, Cu+), interakcije
10
z drugimi vitamini in pomožnimi snovmi, odsotnost stabilizatorjev (antioksidantov), proces izdelave končnega vitaminskega izdelka (npr. vročina in tlak pri peletiranju in iztiskanju) (56). Izpostavljenost večjemu številu stresnih dejavnikov hkrati še potencira negativni učinek na stabilnost vitamina (57).
Temperatura vpliva na vse vrste nestabilnosti ZU. Pri povišanju T se v splošnem poveča hitrost reakcije razgradnje, npr. hitrost reakcije pri sobni T se podvoji v primeru porasta T že za zgolj 10 °C (59). Vpliv atmosferske vlage je odvisen od T zraka in higroskopnosti vzorca. Prisotnost proste oz. nevezane vode je pomembna pri stabilnosti snovi v trdnem agregatnem stanju. Vlaga vpliva na kemijsko (zlasti hidrolize, oksidacije) in fizikalno (spremembakristalnestrukture,hitrostraztapljanja,razpadnost,organoleptičnelastnosti)ter mikrobiološko stabilnost (razraščanje mikroorganizmov) (56). Odziv ZU na absorpcijo in ekscitacijo sončne, UV ali vidne svetlobe lahko vodi do fizikalnih ali kemijskih sprememb.
Občutljivost ZU na določen spekter svetlobe je odvisna od kemijske strukture, fotoreaktivnosti in vrste FO. Razgradni fotoprodukti ZU so lahko nevarni in lahko pri uporabi zdravila povzročijo fototoksične, fotoalergične ali fotosenzitizirane reakcije (60).
Kisik kot oksidant hitro reagira z ZU, ki vsebuje hidroksilno, karbonilno, aldehidno funkcionalno skupino v reakcijah oksidacije. Nastajajo potencialno toksični oksidacijski produkti in prihaja lahko do sprememb organoleptičnih lastnosti (61).
1.2.2.3 Stabilnost vitaminov v raztopinah
V strokovni literaturi najdemo podatke o stabilnosti vodotopnih vitaminov, vendar so le-ti pomanjkljivi,protislovniinpogostosamokvalitativnitervvečinizajemajovitaminevobliki raztopin (razt.). Ključne kvalitativne in določene kvantitativne podatke o občutljivosti vodotopnih vitaminov v raztopinah na različne dejavnike smo zbrali v Preglednici I.
Preglednica I: Zbrani kvalitativni podatki (+ skoraj neobčutljiv/stabilen, ++ delno občutljiv, +++ zelo občutljiv/nestabilen)ostabilnostivodotopnihvitaminovvraztopinahpodvplivomrazličnihdejavnikov(56,62), stresna študija posameznih vit. (posam.) in vit. v zmesi vseh vodotopnih vit., kjer zapisani % predstavljajo preostal % vit. po določenem času – urah (h) (63) in dodatni podatki o stabilnosti vit. v raztopinah.
Vitamin Povišana temperatura
Oksidanti (kisik, H2O2)
Kovinski ioni Vlaga Svetloba pH kisel / bazičen
B1 +++ ++ ++ ++ ++ + / +++
Posam. 48 h – 99 % 48 h – 73 % / / 48 h – 100 % 48 h – 99 % / 59 %
V zmesi 48 h – 88 % 48 h – 90 % / / 48 h – 36 % 48 h – 36 % / 48 %
Dodatno Najbolj stabilen je pri pH 2, z višanjem pH, zlasti nad 6 pa stabilnost vit. B1 upada (3,15,64–66).
B2 + + ++ ++ +++ + / +++
Posam. 48 h – 16 % 48 h – 79 % / / 24 h – 0 % 48 h – 94 % / 17 %
11
V zmesi 48 h – 45 % 48 h – 100 % / / 24 h – 1 % 48 h – 94 % / 44 %
Dodatno V bazičnem okolju je rahlo nestabilen (66). V obliki razt. (posam. in v zmesi vseh vit.) ob prisotnosti svetlobe skoraj popolnoma razpade že v 24 h. V zmesi razt. vit. izrazito zmanjša fotostabilnost drugih vit. (67).
B3 + + ++ + + + / ++
Posam. 48 h – 100 % 48 h – 96 % / / 48 h – 100 % 48 h – 98 % / 42 %
V zmesi 48 h – 97 % 48 h – 100 % / / 48 h – 93 % 48 h – 95 % / 51 %
Dodatno Je nestabilen pri visokih T in v bazičnem okolju pri prisotnosti kovinskih ionov. V kislem in bazičnem okolju je stabilen, prav tako na povišani T, v prisotnosti kisika in svetlobe (65).
B5 ++ + + ++ + +++ / +++
Posam. 48 h – 92 % 48 h – 64 % / / 48 h – 100 % 48 h – 94 % / 24 h – 3 %
V zmesi 48 h –53 % 48 h – 92 % / / 48 h – 72 % 48 h – 84 % / 24 h – 9 %
Dodatno Pantotenska kislina je nestabilna v kislem in bazičnem okolju. Kalcijev pantotenat je stabilen na svetlobi in zraku, nestabilen pri povišani T, kislem ter bazičnem okolju (66).
B6 ++ + + ++ ++ + / ++
Posam. 48 h – 99 % 48 h – 98 % / / 48 h – 100 % 48 h – 100 % / 100 %
V zmesi 48 h – 92 % 48 h – 95 % / / 48 h – 7 % 48 h – 82 % / 1 %
Dodatno Stabilen je v prisotnosti kisika, nestabilen na UV svetlobi, povišani T in v prisotnosti baz. Stabilen je pri pH 1 in v kislih raztopinah, pri pH nad 6,8 je nestabilen (65,66).
B7 ++ +++ + + + ++ / ++
Posam. 48 h – 89 % 24 h – 0 % / / 48 h – 99 % 48 h – 87 % / 100 %
V zmesi 48 h – 18 % 24 h – 0 % / / 48 h – 0 % 48 h – 0 % / 89 %
Dodatno Nestabilen pri oksidacijskih pogojih in v močno kislem ali bazičnem okolju (68).
B9 +++ ++ +++ + +++ ++ / ++
Posam. 48 h – 97 % 48 h – 75 % / / 24 h – 0 % 48 h – 98 % / 95 %
V zmesi 48 h – 23 % 48 h – 52 % / / 24 h – 1 % 48 h – 72 % / 84 %
Dodatno Vit. B9 je zelo nestabilen na povišani T. Na zraku je stabilen, na svetlobi nestabilen. Zelo fotonestabilen je v obliki razt. (posam. ali v zmesi), kjer popolnoma razpade že v 24 h. Stabilen je pri pH pod 5. Do izrazitejšega razpada vit. B9 pod vplivom svetlobe prihaja pri pH 4,0-6,5. Pod 180 °C in pri bazičnem pH je vit. B9 stabilen, pri izpostavitvi UVA in UVB razpade (3,65–69).
Vodna razt. THFK je v bazičnem pH zelo občutljiva, pod vplivom kisika pa oksidira (70).
B12 ++ + +++ ++ ++ ++ / +++
Posam. 48 h – 92 % 48 h – 97 % / / 48 h – 97 % 48 h – 89 % / 1 %
V zmesi 48 h – 7 % 48 h – 50 % / / 24 h – 0 % 48 h – 70 % / 2 %
Dodatno Nestabilen v bazičnih in močno kislih razt. Pod vplivom svetlobe in pH 3,5-6,5 se cianokobalamin pretvarja v hidroksikobalamin (3,65,66).
C ++ +++ ++ +++ + + / +++
Posam. 48 h – 1 % 24 h – 0 % / / 48 h – 3 % 48 h – 41 % / 24 h – 2%
V zmesi 48 h – 0 % 24 h – 0 % / / 48 h – 0 % 48 h – 11 % / 24 h – 9 %
Dodatno Najbolj nestabilen izmed vseh vodotopnih vit. Hkrati prisotna kisik in povišana T, svetloba, bazično okolje ali kovinski ioni (železovi in bakrovi ioni) inducirajo pospešen razpad vit. (3,65,68). Svetloba nima velikega vpliva na vit. C. V zmeseh poveča fotostabilnost ostalih vit. in se uporablja kot stabilizator (65,67,72).
/ – ni podatka
12 1.2.2.4 Stabilnost vitaminov v trdnem stanju
V okviru magistrske naloge smo se osredotočili na stabilnost vodotopnih vitaminov v trdnem stanju. V literaturi najdemo manj podatkov o stabilnosti vodotopnih vitaminov v trdnem stanju, le-te pa smo zbrali v Preglednici II.
Preglednica II: Zbrani podatki o stabilnosti vodotopnih vitaminov v trdnem stanju.
Vitamin Podatki o stabilnosti vitamina v trdnem
B1 Zelo občutljiv na povišano T, pri procesu ekstruzije (80 °C, vlaga, tlak) razpade ≈50 % vitamina (68).
V amorfni obliki manj stabilen kot v kristalni obliki. Pri dodanih polimerih, ki tvorijo več intermolekularnih vezi (pektin bolj stabilizira vitamin kot polivinil pirolidon) je bolj stabilen. Tiamin klorid je bolj stabilen kot tiamin mononitrat, saj slednji povzroči dvig pH v primeru nastanka raztopine, pri katerem je tiamin manj stabilen (15).
B2 Najmanj občutljiv na povišano T izmed vseh vodotopnih vitaminov, skoraj neobčutljiv na proces ekstruzije (80 °C, vlaga, tlak), kjer razpade do 20 % vitamina (68).
B3 Na proces ekstruzije je delno občutljiv, kjer razpade 10-30 % vitamina (68).
B5 Na proces ekstruzije je skoraj neobčutljiva, saj razpade 10-20 % vitamina (68).
B6 Delno občutljiv na proces ekstruzije, kjer razpade 5-25 % vitamina (68).
B7 Na proces ekstruzije je skoraj neobčutljiv, razpade 15-25 % vitamina (68).
B9 Zelo občutljiva na proces ekstruzije, razpade okrog 50 % vitamina (68).
Ekstrapolirani rezultati 18-mesečne študije pri 55, 70 in 85 °C in 30, 50 in 70 % relativne vlažnosti (RV) v trdnem so nakazali 1 % razpad vitamina na leto (31).
B12 Ni podatkov.
C Zelo občutljiv na proces ekstruzije, med procesom razpade do 90 % vitamina (68).
Rezultati 8-tedenske stresne študije: Pri 25 °C in 98 % RV ostane 90 % askorbinske kisline (AK) (rahlo rumeni kristali z vidno vlago), pri 40 °C in 98 % RV pa le 10 % (sprememba belih kristalov v temno rjavo tekočino) (73).
V študiji o vplivu polimera na stabilnost AK so ugotovili, da pri 44 % RV, 25 °C in 0,025 % AK v 1 mesecu ostane 60 % AK pri laktoznem polimeru in > 95 % pri trehaloznem polimeru (74).
V študiji vpliva T in RV na stabilnost vit. C so ugotovili, da nizka prisotnost vlage (0,5 mol vode/mol vit.
C) povzroči spremembo v barvi iz bele v rumeno (po enem tednu) in v rjavo (po več tednih). Rjavo obarvanje se pojavi hitreje kot kemijski razpad. Po 8 tednih pri 22 °C in 0 % RV preostane 83 % vit. C., pri 22 °C in 50 % RV pa 58 %. Po 8 tednih preostane 78 % vit. C pri 40 °C in 0 % RV, pri 40 °C in 25 % RV 39 % vit. C., pri 40 °C in 50 % RV pa vit. C popolnoma razpade (75).
Za ohranjanje stabilnosti je pomembna ustrezna zaščita izdelka pred kritičnimi zunanjimi dejavniki – skrbno izbran proizvodni proces, izbira ustreznih kompatibilnih pomožnih snovi, ustrezna ovojnina in shranjevanje ter uporaba izdelka pod ustreznimi pogoji. Da pa le-te lahko določimo, je nujna izvedba testov stabilnosti (55).
13 1.2.3 TESTIRANJE STABILNOSTI
Testiranje stabilnosti farmacevtskih izdelkov je kompleksen sklop postopkov, ki so strokovno zahtevni in stroškovno ter časovno potratni. So predpogoj za sprejem in odobritev farmacevtskih izdelkov. Stroge regulativne zahteve za načrtovanje in izvedbo študij stabilnosti ZU in končnih zdravil temeljijo na vrsti regulativnih zahtev in svetovalnih smernic ZDA, Evrope in Japonske, ki so usklajene s smernicami ICH (angl. International Council for Harmonisation). Za vrednotenje stabilnosti ZU in končnih farmacevtskih izdelkov sta potrebni zasnova in izvajanje študij stabilnosti z opredelitvijo predpisanih mej za testiranje nečistot s pristopom upravljanja tveganj, ki temelji na GMP (54,76).
Testiranje stabilnosti je pomembno orodje določanja kakovosti ZU (identiteta, koncentracija in čistost) in kakovosti končnih farmacevtskih izdelkov (77). Osnovni namen stabilnostnih testov je ugotoviti, kako se spreminja ZU ali končni produkt s časom pod vplivom raznih zunanjih dejavnikov, kot so T, vlaga in svetloba. Študije stabilnosti zdravil so zasnovane v skladu s klimatskimi conami (I-IV) glede na T in RV. Njihov glavni cilj je določitev roka uporabnosti, roka uporabnosti zdravila po odprtju večodmernega vsebnika, roka ponovnega preskušanja ZU, določitev pogojev shranjevanja in ustrezne ovojnine. Rok uporabnosti je časovno obdobje, v okviru katerega se pričakuje, da zdravilo ostaja znotraj potrjenih specifikacijskih mej, če je shranjevano pri pogojih, navedenih na izbrani ovojnini (54,76,77).
Poznamo tri vrste stabilnostnega testiranja: dolgoročno, pospešeno in stresno.
1.2.3.1 Dolgoročno testiranje (angl. long term testing)
Je del formalnega testiranja. Izvajamo ga pri predvidenih pogojih shranjevanja (ustrezna T in vlaga) z namenom opredelitve roka uporabnosti zdravila oz. roka ponovnega preskušanja ZU (54,77). Izvedba študije poteka po predpisanih protokolih in smernicah. Nove ZU in FO testiramo v klimatski coni I in II (Evropa, Amerika in Japonska) pri 25 °C ± 2 °C/60 % RV
± 5 % RV ali pri 30 °C ± 2 °C/65 % RV ± 5 % RV (tudi za III in IVa cono). Frekvenca vzorčenja je v prvem letu na vsake tri mesece, v drugem letu na vsakih šest mesecev in nato letno do konca roka uporabnosti oz. skupno maksimalno pet let (78).
1.2.3.2 Pospešeno testiranje (angl. accelerated testing)
Je del formalnega testiranja. Njegov namen je dokazovanje odpornosti ZU ali končnega farmacevtskega izdelka na pogoje, ki odstopajo od predvidenih pogojev shranjevanja. S pospešenimi testi pospešimo razpad ZU pri višji T in nato predvidimo rok uporabe pri predvidenih pogojih shranjevanja s pomočjo ekstrapolacije rezultatov iz povišane T. Rok
14
uporabnosti, pridobljen na osnovi pospešenih testov stabilnosti, se mora vedno potrditi z dolgoročnimitestistabilnosti.Izvedbaštudijepotekapopredpisanihprotokolihinsmernicah pri 40 °C ± 2 °C/75 % RV ± 5 % RV. Pri pospešenem testiranju potrebujemo najmanj tri točkevzorčenja(npr.začetnatočka,trijeinšestmesecevzašestmesečnoštudijo)(54,77,78).
1.2.3.3 Stresno testiranje (angl. stress testing)
Stresno testiranje ZU pomaga razjasniti in identificirati verjetne razgradne produkte, verjetno pot razgradnje ZU in intrinzično stabilnost molekule ter je nujno pri razvoju in validaciji stabilnostno-indikativne metode. Oblika stresnega testiranja je odvisna od preiskovane snovi in vrste zdravila. Podrobnosti načrtovanja in strategije stresnega testiranja niso predpisane v smernicah regulativnih organov. Testiranje se večinoma izvaja na eni seriji ZU, pri pogojih, ki izzovejo hidrolitično, termolitično, oksidativno in fotolitično razgradnjo ZU. Stresno testiranje mora inducirati optimalen razpad (5-15 %) ZU, kar ponazarja potencialen razpad ZU ob koncu roka uporabnosti oz. potencialen razpad zaradi neustrezne proizvodnje, pakiranja in rokovanja z zdravilom. Če zaznamo razgradnjo, ki je manjša od 5
%, je potrebno stresne pogoje in trajanje izpostavitve poostriti, da se določijo in predvidijo razgradni produkti (52,78,79).
Stresnotestiranjevključujepogoje,kisoostrejšiodpogojevpospešenega testiranja; vpliv T (npr. 50, 60 ali 80 °C), vlage (npr. 75 % RV ali več), kjer je predvideno, pa tudi oksidacija in fotoliza ZU. Za ZU v obliki raztopine ali suspenzije, se mora oceniti tudi dovzetnost ZU zahidrolizovširokem razponu vrednosti pH. Testiranje fotostabilnosti, katerega standardni pogoji za preskušanje so opisani v ICH Q1B, je prav tako nujen sestavni del stresnega testiranja (78). Običajno stresno testiranje traja 28 dni. Rezultati stresnih študij so nujen sestavni del informacij, posredovanih regulativnim organom (52,78,79).
V stabilnostni študiji se najprej preveri vpliv zunanjih dejavnikov na stabilnost ZU. Ko poznamo te informacije, vemo na katere kritične točke mora biti pozoren tehnolog pri nadaljnjemrazvojuoblikovanjazdravila;torejkaterepomožnesnovi in v kakšnih razmerjih z ZU so kompatibilne ter kateri proizvodni postopek bo primeren. Do registracijske faze, ko se končna FO testira v ovojnini, predvideni za trženje, je še dolga pot vmesnih testiranj stabilnosti. Vse pa se začne s stresnimi testi vpliva okoljskih dejavnikov na ZU (79).
1.2.4 ANALITIKA VITAMINOV
Za vrednotenje stabilnosti vitaminov potrebujemo ustrezno stabilnostno indikativno analizno metodo (SIM), ki omogoča točno in natančno določanje njihove vsebnosti v
15
prisotnosti pomožnih snovi, razgradnih produktov in nečistot (63). Na razpolago je nekaj SIM za vrednotenje posameznih vitaminov (39,80,81). Največkrat pa v izdelkih najdemo več različnih vitaminov skupaj, za kar potrebujemo SIM za njihovo sočasno analizo. Za ločitev večjega števila vitaminov potrebujemo ustrezno separacijsko metodo, kot je tekočinska kromatografija. Ta je največkrat sklopljena z UV detektorjem ali z detektorjem z nizom diod (DAD), pa tudi z masnim spektrometrom, ki ima določene prednosti (občutljivost, selektivnost), vendar je zahtevnejša in manj primerna za rutinsko analizo ali študije stabilnosti (82–84). Analizna metoda mora namreč biti čim bolj preprosta, natančna, selektivna, občutljiva, zanesljiva in predvsem hitra (14,63,85). Pri eksperimentalnem delu in pregledu analiznih metod za sočasno ločbo in analizo večjega števila vodotopnih vitaminov smo se osredotočili na metode na osnovi tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC).
Sočasno vrednotenje vodotopnih vitaminov je zapleteno, saj se pojavljajo v različnih oblikah (vitameri) in odmerkih. Dodatno predstavljajo izziv njihove kemijske strukture, ki se precej razlikujejo po polarnosti. Vit. C, B1, B3 in B6 so zelo polarni, medtem ko so vit. B2, B7, B9 in B12 v vodi slabše topni. Razlikujejo se tudi v stabilnosti, o čemer bomo raziskovali v magistrski nalogi. Večina vitaminov zelo dobro absorbira svetlobo v UV-VIS območju (200- 400 nm), težavnejša pa sta vit. B5 in B7, ki v svoji strukturi nimata prisotnih močnih kromoforjev in absorbirata svetlobo zgolj pri nizkih valovnih dolžinah (210 nm, kjer so vidni vsi vitamini). Razlika, ki prav tako otežuje izvedbo analize multivitaminskih izdelkov, so različni priporočeni dnevni vnosi za posamezne vitamine. RDA za vit. C znaša kar 80 mg, RDA za B12 pa zgolj 2,5 μg. Analiza multivitaminskih izdelkov je dodatno še zahtevnejša, saj so kompleksni in običajno vsebujejo še maščobotopne vitamine, minerale in pomožne snovi ter potencialne razgradne produkte, kar dodatno oteži analizo (63,66,86,87).
Zaradi vseh omenjenih izzivov se pojavijo težave z ločbo vseh vodotopnih vitaminov pri uporabi standardnih kolon in z zgolj enim injiciranjem. Objavljenih je zgolj nekaj SIM HPLC za sočasno vrednotenje vodotopnih vitaminov (88–91), ki omogočajo analizo do največ 7 vitaminov, večinoma brez zahtevnejših B7, B9 in B12 ter v času analize ene ure ali več. Samo ena, najnovejša, kromatografska metoda pa omogoča sočasno vrednotenje vseh glavnih oblik vodotopnih vitaminov – reverznofazna tekočinska kromatografija visoke ločljivosti sklopljene z DAD detektorjem (UHPLC-DAD) avtorjev Temove Rakuša, Grobina in Roškarja, ki smo jo tudi uporabili pri našem eksperimentalnem delu (63).
