MAGISTRSKO DELO

F

MAGISTRSKO DELO

Tilen Pilpah

Ljubljana, 2021

F

MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE KEMIJSKO INŽENIRSTVO

Razvoj in matematični opis miniaturiziranega pretočnega sistema za ločevanje produktov biokatalitske transaminacije

MAGISTRSKO DELO

Tilen Pilpah

M

: prof. dr. Polona Žnidaršič Plazl

Ljubljana, 2021

magistrskega dela

Spodaj podpisani Tilen Pilpah sem avtor magistrskega dela z naslovom: Razvoj in matematični opis miniaturiziranega pretočnega sistema za ločevanje produktov biokatalitske transaminacije.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

• je magistrsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof.

dr. Polone Žnidaršič Plazl;

• sem poskrbel, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v

predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

• sem poskrbel za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;

• je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.

V Ljubljani, 12.06.2021 Tilen Pilpah

inženirstvo. Delo je bilo opravljeno na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo UL.

Senat UL FKKT je za mentorico imenoval prof. dr. Polono Žnidaršič Plazl Recenzenti: prof. dr. Igor Plazl, prof. dr. Aleš Podgornik

Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela Predsednik komisije: prof. dr. Aleš Podgornik

Članica:

Član:

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo prof. dr. Polona Žnidaršič Plazl

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo prof. dr. Igor Plazl

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

nastajanja magistrskega dela in mi priskrbela veliko literature. Zahvaljujem se ji za mentorstvo, pomoč in strokovni pregled magistrskega dela.

Zahvaljujem se tudi prof. dr. Igorju Plazlu in prof. dr. Mitji Laknerju za strokovne nasvete in pomoč pri izdelavi matematičnega modela.

Prav tako bi se zahvalil svoji družini in prijateljem, ki so me spodbujali in mi dajali nasvete pri pisanju magistrskega dela.

Najlepša hvala.

produktov biokatalitske transaminacije Povzetek:

V nalogi sem izvajal separacijo acetofenona (ACP) in metilbenzilamina (MBA) v Y- oblikovanem mikrokanalu z vzporednim laminarnim tokom vodnega pufra z obema spojinama in n-heptana, v katerega se ekstrahira ACP. Modelna raztopina simulira reakcijski sistem transaminacije za proizvodnjo kiralnih aminov, katalizirane z ω- transaminazami. V eksperimentalnem delu sem izbral ustrezne obratovalne pogoje za učinkovito ekstrakcijo in ločbo faz na izstopu iz mikrokanala. Za opis sistema sem na osnovi matematičnega modela in posebej za to načrtovanih eksperimentov določil difuzivnostna koeficienta ACP in MBA v obeh fazah in njuna porazdelitvena koeficienta med fazama. V nadaljevanju sem razvil matematični model za opis ekstrakcije v vzporednem toku obeh kapljevin ter eksperimentalno izvedel ekstrakcijo v mikrokanalu pri različnih obratovalnih pogojih. Preko eksperimentalnih podatkov o vhodnih in izhodnih koncentracijah ACP in MBA sem prilagodil matematični model za opis danega sistema. Matematični model je dobro napovedal delovanje miniaturiziranega ekstraktorja, saj so se rezultati simulacij dobro skladali z eksperimentalno pridobljenimi vrednostmi. Mikrokanal pa se je izkazal za učinkovito napravo za ekstrakcijo, saj je dosegel preko 73 % izkoristek ekstrakcije pri zadrževalnem času manj kot 0,8 s.

Ključne besede: ekstrakcija, separacija, kiralni amini, mikropretočne naprave, matematično modeliranje

Development and mathematical description of a microflow system for biocatalytic transamination products separation

Abstract:

In the thesis, the separation of acetophenone (ACP) and methylbenzylamine (MBA) was performed in a Y-shaped microchannel with a parallel laminar flow of aqueous buffer containing both compounds and n-heptane into which ACP is extracted. The model solution simulates a transamination reaction system for the production of chiral amines catalyzed by ω-transaminases. In the experimental part, the appropriate operating conditions for efficient extraction and phase separation at the exit of the microchannel were selected. To describe the system, the diffusion coefficients of ACP and MBA in both phases and their distribution coefficients between phases were determined on the basis of a mathematical model and specially designed experiments.

Next, a mathematical model to describe the extraction in parallel flow of both liquids was developed and the extraction in a microchannel was performed experimentally under different operating conditions. Through experimental data on ACP and MBA input and output concentrations, a mathematical model to describe a given system was adapted. The mathematical model predicted the operation of the miniaturized extractor well, as the simulation results were in good agreement with the experimentally obtained values. The microchannel proved to be an efficient extraction device, achieving over 73 % extraction efficiency at a retention time of less than 0.8 s.

Keywords: extraction, separation, chiral amines, microflow devices, mathematical modeling

Kazalo vsebine

1 Uvod ... 1

1.1 Namen dela ... 2

2 Teoretični del ... 3

2.1 Proizvodnja kiralnih aminov z biotransformacijami ... 3

2.1.1 Delovanje ω-transaminaz ... 4

2.1.2 Načrtovanje reakcijskih pogojev za doseganje visokih izkoristkov transaminacije ... 5

2.1.3 Acetofenon (ACP) in metilbenzilamin (MBA) kot modelni molekuli procesa transaminacije ... 8

2.2 Ekstrakcija tekoče-tekoče ... 10

2.2.1 Princip delovanja ekstrakcije tekoče-tekoče... 11

2.2.2 Uporaba mikrofluidnih naprav za ekstrakcijo ... 13

2.3 Matematično modeliranje procesov... 21

2.3.1 Kaj je matematični model? ... 22

2.3.2 Stopnje v procesu modeliranja ... 23

3 Matematični model ... 27

3.1 Matematični model za določitev difuzivnostnih koeficientov ... 27

3.1.1 Določitev Reynoldsovega števila za vodno in organsko fazo ... 27

3.1.2 Določitev hitrostnega profila v mikrokanalu ... 28

3.1.3 Izpeljava masne bilance za izbran prostorski bilančni element ... 30

3.2 Matematični model za ekstrakcijo ... 31

3.2.1 Določitev Reynoldsovega števila za vodno in organsko fazo ... 33

3.2.2 Določitev hitrostnega profila v mikrokanalu ... 34

3.2.3 Izpeljava masne bilance za izbran prostorski bilančni element ... 36

3.2.4 Diskretizacija sistema, modelnih enačb in robnih pogojev ... 37

4 Eksperimentalni del ... 41

4.1 Kemikalije ... 41

4.2 Aparature ... 41

4.3 Priprava raztopin... 42

4.4 Določitev razmerja pretokov organske in vodne faze za vzpostavitev fazne meje na sredini kanala ... 43

4.4.1 Dolomite Y-oblikovan mikročip ... 44

4.4.2 Micronit Y-oblikovan mikročip... 46

4.5 Določitev porazdelitvenih koeficientov za ACP in MBA ... 47

4.6 Določitev difuzivnostnih koeficientov za ACP in MBA v organski in vodni fazi z uporabo mikročipa ... 48

4.7 Ekstrakcija ACP in MBA v mikrokanalu z laminarnim tokovnim profilom . 49 4.8 Analiza s HPLC ... 50

4.8.1 Kromatografski pogoji ... 50

4.8.2 Umeritvene premice ... 51

5 Rezultati in razprava ... 55

5.1 Določitev razmerja pretokov organske in vodne faze za vzpostavitev fazne meje na sredini kanala ... 55

5.1.1 Dolomite Y-oblikovan mikročip ... 55

5.1.2 Micronit Y-oblikovan mikročip... 57

5.1.3 Teoretični izračun razmerja pretokov ... 59

5.2 Določitev porazdelitvenih koeficientov za ACP in MBA ... 60

5.3 Določitev difuzivnostnih koeficientov za ACP in MBA v organski in vodni fazi z uporabo mikročipa ... 60

5.3.1 Teoretični izračuni difuzivnostnih koeficientov ... 62

5.4 Ekstrakcija v mikrokanalu z laminarnim tokovnim profilom in primerjava izkoristkov v odvisnosti od pretokov ... 64

5.5 Vrednotenje modela in načrtovanje ekstrakcije... 67

6 Zaključek ... 71

7 Literatura ... 73

Kazalo slik

Slika 1 Shema reakcije, ki jo katalizira aminotransaminaza. ^[8] ... 4 Slika 2 Vezava piridoksalfosfata v aktivno mesto encima. ^[9] ... 5 Slika 3 Shema deaminacije lizina in ciklizacije stranskega produkta transaminacije. ... 7 Slika 4 Shema deaminacije 3-aminocikloheksa-1,5-dien-karboksilne kisline in tavtomerizacije stranskega produkta transaminacije. ... 8 Slika 5 Tokovni profili pri ekstrakciji tekoče-tekoče v mikrofuidnih napravah: a) vzporedni tok ^[37], b) kapljični tok (angl. droplet flow) ^[36], c) segmentiran (Taylorjev) tok. ^[35] ... 15 Slika 6 Laminarni tokovni profil organske (brezbarvna) in vodne (oranžna) faze na vstopu, sredini in izhodu Ψ-oblikovanega mikrokanala: a), b) in c) predstavljajo tokove organske in vodne faze v mikrokanalu z nemodificirano površino, d), e) in f) pa predstavljajo tokove organske in vodne faze v mikrokanalu z modificirano površino. ^[48]

... 18 Slika 7 Pomožne strukture za stabilizacijo medfazne meje: a) shematski prikaz profila mikrokanala z vodili za vzpostavitev treh vzporednih laminarnih tokov, ^[33] b) različni primeri stebričkov za stabilizacijo toka. ^[38] ... 19 Slika 8 Presek mikrokanala z membrano za separacijske namene. Naprava je sestavljena iz zgornje in spodnje plošče, v kateri sta izdolbena kanala, med njiju pa je postavljena membrana. ^[33] ... 20 Slika 9 Shematski prikaz matematičnega modela. ... 23 Slika 10 Shema mikrokanala z navedenimi dimenzijami. Tok teče v "z" smeri in ima parabolični hitrostni profil u(x). Koordinatno izhodišče x=0 je postavljeno na sredino 205 μm stranice. ... 28 Slika 11 Shematski prikaz sistema – prikaz oznak dimenzij kanala in koordinatnih osi.

... 31 Slika 12 Shematski prikaz hitrostnega profila u(x,y) v mikrokanalu. Desna polovica mikrokanala predstavlja n-heptansko fazo, leva polovica pa pufrsko fazo. ... 35 Slika 13 Graf hitrostnega profila u(x) z dodanimi povprečnimi hitrostmi obeh faz. Desna polovica grafa predstavlja n-heptansko fazo, leva polovica pa pufrsko fazo. ... 36 Slika 14 Shema tlorisa sistema z vrisanimi diskretnimi točkami (dejanska delitev mreže je bila gostejša, kot je prikazano na shemi). Indeks "i" poteka po x-osi in indeks "j" po z- osi. Celotna dolžina sistema (z-os) je L=332 mm in celotna širina (x-os) je W=220 μm.

... 38

Slika 15 Dolomite Y-oblikovan mikročip: a) Slika čipa. Za eksperimente sem uporabljal spodnjo polovico čipa, kjer se nahaja Y-Y mikrokanal ^[65]; b) dejanski prečni presek kanala in aproksimacija s pravokotnikom enake višine, kot je višina kanala. ^[66] ... 45 Slika 16 Dolomite Y-oblikovan mikročip v nosilcu postavljen pod mikroskop za in operando vizualno analizo procesa. ... 45 Slika 17 Shema Micronit Y-oblikovanega mikročipa. Dejanski prečni presek kanala in aproksimacija s pravokotnikom enake višine, kot je višina kanala. ^[66] ... 46 Slika 18 Micronit Y-oblikovan mikročip v nosilcu postavljen pod mikroskop za in operando vizualno analizo procesa. ... 47 Slika 19 Graf površine kromatografskega vrha [/] v odvisnosti od koncentracije ACP [mmol/l] za vzorce pufrske faze. ... 51 Slika 20 Graf površine kromatografskega vrha [/] v odvisnosti od koncentracije ACP [mmol/l] za vzorce n-heptanske faze. ... 52 Slika 21 Graf površine kromatografskega vrha [/] v odvisnosti od koncentracije MBA [mmol/l] za vzorce pufrske faze. ... 52 Slika 22 Graf površine kromatografskega vrha [/] v odvisnosti od koncentracije MBA [mmol/l] za vzorce n-heptanske faze. ... 53 Slika 23 Mikroskopska slika tokov na izhodu iz mikročipa. Pretok organske faze 400 μl/min (zgornji tok) in vodne faze 300 μl/min (spodnji tok). ... 55 Slika 24 Mikroskopska slika tokov na izhodu iz mikročipa. Pretok organske faze 400 μl/min (zgornji tok) in vodne faze 200 μl/min (spodnji tok). ... 56 Slika 25 Mikroskopska slika tokov na osrednjem delu mikročipa. Pretok organske faze 400 μl/min (zgornji tok) in vodne faze 200 μl/min (spodnji tok). ... 56 Slika 26 Mikroskopska slika tokov na izhodu iz mikročipa. Pretok organske faze 400 μl/min (zgornji tok) in vodne faze 190 μl/min (spodnji tok). ... 57 Slika 27 Mikroskopska slika tokov na osrednjem delu mikročipa (predzadnji zavoj na izhodu iz mikročipa). Pretok organske faze 400 μl/min (levi tok) in vodne faze 190 μl/min (desni tok). ... 58 Slika 28 Primer spremembe tokovnega profila zaradi nabiranja nečistoč v mikrokanalu.

Na točki, kjer se kanal razdeli, so se naložila vlakna, ki motijo ločbo tokov. V zgornjem delu kanala so na steno vezani segmenti vodne faze, ki jih organska faza ne odplakne. 59 Slika 29 Graf koncentracije ACP v mikrokanalu. Leva polovica grafa predstavlja n- heptansko fazo s pretokom 300 μl/min in desna pufrsko fazo s pretokom 140 μl/min. . 68 Slika 30 Graf koncentracije ACP v mikrokanalu. Leva polovica grafa predstavlja pufrsko fazo s pretokom 140 μl/min in desna n-heptansko fazo s pretokom 300 μl/min.

... 68

Kazalo tabel

Tabela 1 Primerjava lastnosti izbranih amino donorjev in njihovih stranskih produktov transaminacije. [8][10][18] ... 9 Tabela 2 Robni pogoji za pufrsko in n-heptansko fazo ter njihova območja veljavnosti.

... 37 Tabela 3 Razmerja pretokov organske in vodne faze za pare pretokov, ki sem jih uporabil pri končnem eksperimentu za ekstrakcijo. ... 60 Tabela 4 Enačba za izračun porazdelitvenih koeficientov ACP in MBA med vodno in organsko fazo ter izračunane vrednosti pri dveh paralelkah. ... 60 Tabela 5 Preko modela določene vrednosti difuzivnostnih koeficientov ACP in MBA v pufru in n-heptanu. Eksperimenti so bili vodeni pri pretokih, ki so navedeni v levem delu tabele. ... 60 Tabela 6 Izračunane vrednosti difuzivnostnih koeficientov ACP in MBA v pufru preko Wilke-Changove in Scheiblove korelacije ter ustrezne fizikalne lastnosti, ki so potrebne za izračune (za lastnosti pufra sem uporabil podatke od vode, saj je pufer zelo razredčen in se od vode minimalno razlikuje). ... 62 Tabela 7 Izračunane vrednosti difuzivnostnih koeficientov ACP in MBA v n-heptanu preko Wilke-Changove in Scheiblove korelacije ter ustrezne fizikalne lastnosti, ki so potrebne za izračune. ... 63 Tabela 8 Eksperimentalne vrednosti koncentracij ACP in MBA v izhodnem toku pufrske faze pri različnih pretokih. ... 64 Tabela 9 Eksperimentalne vrednosti koncentracij ACP in MBA v izhodnem toku n- heptanske faze pri različnih pretokih. ... 64 Tabela 10 Izmerjene vrednosti koncentracij ACP in MBA v vstopnem toku pufrske faze... 65 Tabela 11 Izračunane vrednosti koncentracij ACP in MBA v vstopnem toku pufrske faze pri različnih pretokih in relativne napake izračunanih vrednosti glede na izmerjene vrednosti koncentracij... 65 Tabela 12 Izkoristki ekstrakcij za ACP pri različnih kombinacijah pretokov pufrske in n-heptanske faze. ... 66 Tabela 13 Zadrževalni časi pufrske faze v mikročipu v odvisnosti od pretokov. ... 66 Tabela 14 Eksperimentalno in modelno določeni izkoristki ekstrakcij za ACP pri različnih kombinacijah pretokov pufrske in n-heptanske faze. ... 67

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

Kratice

ACP acetofenon (angl. acetophenone)

API aktivna farmacevtska učinkovina (angl. active pharmaceutical ingredient) ATA aminotransaminaza (angl. amine transaminase)

EPA Ameriška agencija za varstvo okolja (angl. United States Environmental Protection Agency)

HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (angl. high performance liquid chromatography)

IPA izopropilamin (angl. isopropylamine)

IUPAC Mednarodna zveza za čisto in uporabno kemijo (angl. International Union of Pure and Applied Chemistry)

CMC kritična micelarna koncentracija (angl. critical micelle concentration) MBA metilbenzilamin (angl. methylbenzylamine)

MTBE metiltercbutileter (angl. methyl tert-butyl ether) ODS oktadecilsilan (angl. octadecylsilane)

OTCS oktadeciltriklorosilan (angl. octadecyltrichlorosilane) PFA perfluoroalkoksi alkan (angl. perfluoroalkoxy alkane) PLP piridoksalfosfat (angl. pyridoxal 5′-phosphate)

PMP piridoksaminfosfat (angl. pyridoxamine 5′-phosphate)

PUREX reduktivna ekstrakcija urana in plutonija (angl. plutonium uranium reduction extraction)

UV ultravijolično

Simboli

∆P Laplaceov tlak [Pa]

A konstanta odvoda tlaka in viskoznosti [s^-1m^-1] C koncentracija [mol/l]

D difuzivnost [m²/s]

g gravitacijski pospešek [m/s²] K porazdelitveni koeficient

L dolžina [m]

MW molska masa [g/mol]

p tlak [Pa]

R radij ukrivljenosti [m]

Re Reynoldsovo število [/]

S presek [m²]

t čas [s]

T temperatura [K]

u hitrost toka [m/s]

V prostornina [m³]

VA molska prostornina [m³/mol]

γ površinska napetost [N]

η viskoznost [Pas]

μ viskoznost [Pas]

ρ gostota [kg/m³] ϕ pretok [m³/s]

ΦB koeficient interakcij [/]

Indeksi

* ravnotežno stanje

h n-heptanska faza

i indeks po x-osi

j indeks po z-osi

p pufrska faza

1

1 Uvod

Enantiomerno čisti kiralni amini so pomembni prekurzorji za sintezo farmacevtskih učinkovin in agrokemikalij. Ocenjuje se, da okoli 40-45 % aktivnih farmacevtskih učinkovin (API) in 20 % pesticidov vsebuje kiralni aminski center v svoji strukturi.

[1][2][5] Poleg tega se kiralni amini pogosto uporabljajo kot pomožne kiralne snovi pri kemijskih sintezah in kot sredstva za separacijo kiralnih molekul pri procesu diastereomerne kristalizacije. ^[3]

V sodobnem času pridobiva na pomenu sinteza kiralnih aminov z biokatalitskimi transformacijami, ki v mnogih pogledih presegajo klasične kemijske sintezne poti. Kot učinkoviti encimi za sintezo kiralnih aminov v enantiomerno čisti obliki so se izkazale ω-transaminaze, ki iz amino donorske molekule prenesejo aminsko skupino na v tem primeru prokiralni amino akceptor. ^[2][5] Reakcije, ki jih katalizirajo ω-transaminaze so reverzibilne, zato je pri njih pomembno skrbno načrtovanje reakcijskih pogojev, da zagotovimo ustrezne izkoristke. Obstaja več načinov za izboljšanje konverzije reaktantov, v splošnem pa se vsi, ki ne posegajo v spreminjanje encima, nanašajo na višanje koncentracije reaktantov in nižanje koncentracije produktov v reakcijski mešanici. Obe omenjeni možnosti neposredno vplivata na pomik ravnotežja v smeri nastanka produktov, slednja pa poleg tega še znižuje inhibicijo encima zaradi prisotnosti ketonskih stranskih produktov. ^[8][10]

Za separacijo oziroma odstranjevanje produktov transaminacije iz reakcijske mešanice je uporabna ekstrakcija tekoče-tekoče, saj se topnosti komponent reakcijske mešanice dovolj razlikujejo. Aminski produkti imajo višjo afiniteto do vodne reakcijske mešanice, bolj polarni ketonski stranski produkti pa se v večji meri ekstrahirajo v organsko topilo, ki predstavlja drugo fazo pri ekstrakciji. ^[12][13] Pri ekstrakciji ima pomembno vlogo velikost medfazne površine, preko katere se vrši snovni transport.

Ključno je visoko razmerje površina-prostornina obeh faz, za doseganje katerega je kot nalašč uporaba mikrofluidnih naprav, ki so namenjene intenzifikaciji kemijskih procesov. ^[26][27] Mikrofluidne naprave omogočajo vzpostavitev pogojev, kakršnih v konvencionalnih napravah ni možno doseči. Med drugimi je to tudi vzpostavitev vzporednega laminarnega toka nemešljivih kapljevin. Vzporedni tok nemešljivih kapljevin je primeren za uporabo pri ekstrakciji, ima dobro definirano medfazno površino in mehanizme prenosa snovi ter omogoča enostavno ločbo faz pri kontinuirnem obratovanju. ^[33][35]

2

Zaradi dobro definiranih lastnosti in fizikalnih pojavov pri laminarnem toku je tak sistem možno precej natančno matematično opisati. S postavitvijo matematičnega modela, ki opisuje dan sistem, dobimo boljše razumevanje sistema. Z modelom lahko predvidimo obnašanje sistema v odvisnosti od spreminjanja obratovalnih pogojev in na ta način optimiziramo proces ekstrakcije.

1.1 Namen dela

Namen magistrskega dela je bila:

 Določitev ustreznih obratovalnih pogojev za učinkovito ekstrakcijo acetofenona iz modelne 20 mM ekvimolarne raztopine acetofenona in metilbenzilamina v 20 mM fosfatnem pufru pri pH=6 z uporabo n-heptana kot ekstrakcijskega topila.

 Izdelava matematičnega modela za določitev difuzivnostnih koeficientov ACP in MBA v obeh fazah.

 Določitev porazdelitvenih koeficientov za ACP in MBA med organsko in vodno fazo ter določitev difuzivnostnih koeficientov ACP in MBA v obeh fazah.

 Izdelava matematičnega modela za opis procesa ekstrakcije.

 Izvedba separacije ACP in MBA v Y-oblikovanem mikrokanalu z vzporednim dvofaznim laminarnim tokom modelne raztopine in n-heptana ter analiza vpliva spreminjanja pretokov faz na učinkovitost separacije.

 Validacija matematičnega modela za opis procesa ekstrakcije in primerjava eksperimentalnih rezultatov z modelnimi.

3

2 Teoretični del

2.1 Proizvodnja kiralnih aminov z biotransformacijami

Načini priprave kiralnih aminov v enantiomerno čisti obliki so: stereoselektivna adicija nukleofila na imin, asimetrična aminacija C-H skupine, asimetrična hidroaminacija in asimetrična redukcija enaminov ali iminov. V zadnjem času poteka veliko raziskav na področju redukcije enaminov ali iminov z organskimi oziroma kovinskimi katalizatorji.

Predvsem se raziskujejo novi katalizatorji, ki dajejo višje izkoristke stereoselektivnosti.

Kjer sinteza ne zagotavlja dovolj visoke optične čistosti, se v veliki meri uporablja uvodoma omenjena diastereomerna kristalizacija. ^[1]

Zgoraj omenjene klasične kemijske sintezne poti pogosto zahtevajo dovajanje toplote v reakcijsko okolje, vsebujejo veliko stopenj s strupenimi intermediati in kot katalizatorje uporabljajo okolju nevarne snovi. Biokatalitske transformacije so se izkazale kot dobra alternativa, ki omogoča izogib večini omenjenih slabih lastnosti kemijskih sintez. Še posebej v farmacevtski industriji je biokataliza postala izrednega pomena in se uvaja kot ključna tehnologija za razvoj bolj učinkovitih in okoljsko manj bremenilnih procesov.

Biokataliza daje visoko stopnjo kemo-, stereo- in regioselektivnosti ter visoko katalitsko aktivnost pri milih oziroma celo sobnih pogojih. S pomočjo proteinskega inženirstva oziroma načrtovane izgradnje encimov se odpirajo še dodatne možnosti uporabe bioloških procesov. ^[2][4][5]

Prvi pomembnejši doprinos na področju biokatalitske sinteze kiralnih aminov so naredile dehidrogenaze in α-transaminaze, ki se uporabljajo v industriji za proizvodnjo L- in D-aminokislin preko reduktivne aminacije ustreznih α-keto kislin. V zadnjem času se za sintezo aminokislin povečuje uporaba amonijak liaz in aminomutaz. Sinteznih poti za pripravo optično čistih aminokislin je relativno veliko, primanjkuje pa načinov za asimetrično sintezo aminov, ki niso aminokisline. Do nedavnega je bila edini splošno uporaben način, ki je bil implementiran na industrijskem nivoju, kinetična resolucija racemne zmesi aminov oziroma enantioselektivna acilacija s pomočjo lipaz. V zadnjem času pridobiva na pomenu uporaba ω-transaminaz za sintezo kiralnih primarnih aminov.

Primer uspešno implementiranega biokatalitskega procesa z ω-transaminazo, ki je izpodrinil kemijsko sintezno pot, sta v sodelovanju razvili podjetji Merck & Co. in Codexis, ki sta z usmerjeno evolucijo pridobili učinkovito ω-transaminazo za sintezo sitagliptina, aktivne učinkovine za zdravljenje sladkorne bolezni tipa 2. Za omenjeno delo sta prejeli nagrado ˝Green Chemistry Challenge Award˝, ki jo podeljuje Ameriška agencija za varstvo okolja (EPA). ^[6][7]

4

2.1.1 Delovanje ω-transaminaz

ω-transaminaze so encimi, ki spadajo v skupino transferaz in katalizirajo reverzibilen prenos amino skupine iz amino donorja na amino akceptorsko molekulo. Od α- transaminaz se razlikujejo po tem, da lahko katalizirajo prenos amino skupine, ki je v molekuli aminokisline bolj oddaljena od karboksilne skupine, medtem ko α- transaminaze katalizirajo prenos amino skupine, ki se nahaja na α mestu v aminokislini.

Poskupina ω-transaminaz so aminotransaminaze (ATA), ki ne potrebujejo prisotnosti karboksilne funkcionalne skupine v molekuli substrata. Teoretično lahko ATA katalizirajo transaminacijo med katerimkoli aldehidom oz. ketonom in aminom. S tem zajamejo širši spekter substratov, ki niso izključno aminokislinski, zaradi česar so izredno uporabne pri sintezni kemiji. ^[72][73] Poenostavljeno gledano proces prenosa aminske skupine sestoji iz dveh stopenj (slika 1):

1. Odcepitev aminske skupine iz amino donorja (molekula a). V tem koraku kot produkt iz amino donorja nastane keton (molekula b).

2. Vezava aminske skupine na amino akceptorsko molekulo (molekula c), kar daje kot produkt nov amin (molekula d).

Slika 1 Shema reakcije, ki jo katalizira aminotransaminaza. ^[8]

Pri procesu sodeluje kofaktor piridoksalfosfat (PLP), ki je aktivna oblika vitamina B6. Ta vsebuje aldehidno skupino, ki je ključna pri prenosu aminske skupine in je transaminaze same po sebi ne vsebujejo v stranskih verigah aminokislin, iz katerih so zgrajene. PLP je kovalentno vezan na lizinski ostanek v aktivnem mestu encima, dodatno pa ga stabilizirajo ionske interakcije preko pozitivno nabitega dušikovega

5

atoma in negativno nabite fosfatne skupine (slika 2). Ko pride amino donor v aktivno mesto, se vez PLP-encim prekine in na PLP se kovalentno veže amino donor. Nastali kompleks hidrolitsko razpade na stranski produkt in intermediat piridoksaminfosfat (PMP). Na PMP se kovalentno veže amino akceptor, nastali kompleks pa zopet hidrolitsko razpade na končni produkt in regenerira se PLP. Reakcija poteka po tako imenovanem ping-pong bi-bi mehanizmu. ^[8][9]

Slika 2 Vezava piridoksalfosfata v aktivno mesto encima. ^[9]

2.1.2 Načrtovanje reakcijskih pogojev za doseganje visokih izkoristkov transaminacije

Kot je splošno značilno za katerokoli vrsto procesa, tudi pri kemijskih procesih stremimo k čim višjim izkoristkom oziroma optimalnim pogojem iz ekonomskega in okoljskega vidika.

Pri procesu transaminacije obstaja več dejavnikov na katere se lahko osredotočimo in jih spreminjamo za izpopolnjevanje procesa. Lahko se osredotočimo na sam encim in ga bodisi optimiziramo z uporabo proteinskega inženiringa bodisi iščemo nove vrste encimov z izboljšanimi lastnostmi, lahko pa se osredotočimo na reakcijske pogoje. Pri slednjem je mišljena optimizacija reakcijskega okolja v smislu spreminjanja koncentracij substratov ali produktov, izbire donorjev aminske skupine, izbire konfiguracije reaktorja oziroma separatorja in tako naprej. Skratka, obravnavamo praktično vse, kar spada v domeno kemijskega procesnega inženirstva. ^[8]

6

Cilj magistrske naloge je uspešna separacija produktov transaminacije, kar je eden izmed načinov za izboljšanje produktivnosti oz. intenzifikacijo procesa.

Reakcije, ki jih katalizirajo ω-transaminaze, so reverzibilne. Izkoristek reverzibilne reakcije je odvisen od tega, kam je pomaknjeno ravnotežje. Pri sintezi kiralnih aminov je ravnotežje dostikrat pomaknjeno v smeri nastanka reaktantov, kar slabo vpliva na izkoristek reakcije. ^[8][10] Možnosti za premik ravnotežja v smer nastanka produktov so opisane v nadaljevanju.

2.1.2.1 Presežek amino donorja

Amino donor v reakciji nastopa kot reaktant, zato bo presežek reaktantov spodbudil nastanek produktov. Ta način je uporaben v primeru amino donorjev, ki nimajo inhibitornega učinka na encim. Poleg tega mora biti amino donor dovolj dobro topen v reakcijski zmesi, da ga je možno raztopiti za dosego visoke koncentracije, kar pa v vodnih okoljih ni vedno izvedljivo.

2.1.2.2 Odstranjevanje glavnega ali stranskega produkta

Ta način temelji na podobnem razmišljanju kot predhodni, le da gre tukaj za drug pristop. Nizka koncentracija produkta pomakne ravnotežje v smeri nastanka produkta.

Stranski produkti, ki so ketoni, imajo poleg vpliva na ravnotežje tudi vpliv na encim.

Ketoni inhibirajo transaminaze, zato je pomembno, da se jih odstranjuje. Načinov za odstranjevanje produktov je več, med njimi so fizikalni in kemijski načini.

Separacijske metode

Produkte lahko izločamo iz reakcijske mešanice s pomočjo različnih metod ekstrakcije ali izparevanja. Manjši ketoni so dobro hlapni in se jih lahko enostavno izpari z znižanjem tlaka. Kot amino donor je tako uporaben izopropilamin (IPA), ki se tekom reakcije pretvarja v hlapen aceton. Ta princip so uporabili tudi pri sintezi predhodno omenjenega sitagliptina. ^[11]

Ketoni in amini imajo različne polarnosti, zato jih lahko ločujemo z ekstrakcijo tekoče- tekoče ali trdno-tekoče. Reakcijsko okolje je vodna faza, v kateri je topnost aminov višja od topnosti ketonov. Ketoni se učinkovito ekstrahirajo v organsko fazo, medtem ko amini ostajajo v vodni fazi. Za optimalno ekstrakcijo je potrebno zagotoviti maksimalno topnost ketonov in minimalno topnost aminov v organski fazi. Amini so relativno močne baze, ki lahko sprejmejo protone. Protonirana oblika aminov je zaradi svoje polarnosti slabše topna v organskem topilu kot neprotonirana oblika. Na topnost aminov lahko torej vplivamo s spreminjanjem pH, in sicer bo pri nižjem pH topnost

7

aminov v organski fazi slabša. Na topnost ketonov pH nima velikega vpliva, saj v splošnem ketoni niso dovzetni za sprejem protonov. Težave pri ločevanju z ekstrakcijo lahko nastanejo zaradi podobne topnosti topljencev v obeh fazah oziroma zaradi negativnega vpliva organske faze na encim. ^[12][13]

Uporaba amino donorjev, ki dajejo "pametne" stranske produkte

Kot donor aminske skupine se lahko izbere molekula, katere stranski produkt je nestabilen in razpade ali se pretvori v drugačno obliko ter tako ne nastopa v ravnotežju.

V ta namen se uporabljajo diamini, ki so relativno veliki in imajo aminski skupini na različnih koncih molekule. Po transaminaciji se ena aminska skupina pretvori v ketonsko, ki lahko reagira s preostalo aminsko skupino in nastane ciklični imin.

Primer takega amino donorja je lizin, katerega ketonska oblika se pretvori v 3,4,5,6- tetrahidropiridin-2-karboksilno kislino (slika 3). ^[15][16]

Slika 3 Shema deaminacije lizina in ciklizacije stranskega produkta transaminacije.

Poleg ciklizacije se za odstranjevanje ravnotežnih spojin lahko uporablja tudi keto- enolno tavtomerizacijo. Stranski produkt transaminacije je torej keton, ki se lahko pretvori v enolno obliko. Pri enostavnih ketonih močno prevladuje keto oblika, pri kompleksnejših pa je lahko enolna oblika stabilnejša in je torej primarno prisotna v reakcijski zmesi. ^[14]

Primer amino donorja, ki daje nestabilno tavtomerno obliko kot stranski produkt transaminacije je 3-aminocikloheksa-1,5-dien-karboksilna kislina. Stranski produkt se praktično v celoti pretvori v stabilnejšo tavtomerno obliko 3-hidroksibenzojsko kislino (slika 4). ^[17]

8

Slika 4 Shema deaminacije 3-aminocikloheksa-1,5-dien-karboksilne kisline in tavtomerizacije stranskega produkta transaminacije.

Z omenjenima načinoma ciklizacije oziroma tavtomerizacije stranskega produkta je možno doseči praktično popolno konverzijo substratov z izkoristki nad 98 %. ^[15][17]

Encimske kaskadne reakcije

V živih organizmih potekajo kompleksne encimsko katalizirane reakcije, ki vključujejo večje število encimov, substratov in produktov. Tudi v kemijskem procesu proizvodnje kiralnih aminov lahko poleg ω-transaminaz v sintezno pot dodamo še druge encime, s katerimi preprečimo potrebo po vmesnih izolacijah produktov in s tem izboljšamo produktivnost, skrajšamo reakcijski čas in zmanjšamo količino odpadkov ali strupenih stranskih produktov. Lahko se poslužujemo encimov, ki katalizirajo transformacijo stranskega produkta v neko drugačno molekulo, kar pomakne ravnotežje v smer nastanka produktov, ali pa uporabimo encime, ki stranski produkt transformirajo nazaj v amino donorsko molekulo, ki je ponovno uporabna kot substrat za transaminacijo.

Slednja možnost izboljša izkoristek reakcije zaradi vpliva na ravnotežje in hkrati z recikliranjem substrata zmanjšuje potrebo po uvajanju novega. Na področju proizvodnje kiralnih aminov so prikazali že veliko uspešnih kaskadnih reakcij, ki so jih najpogosteje katalizirale oksidoreduktaze, transferaze in liaze. [8][10][17]

2.1.3 Acetofenon (ACP) in metilbenzilamin (MBA) kot modelni molekuli procesa transaminacije

V prejšnjem poglavju o načrtovanju reakcijskih pogojev za doseganje visokih izkoristkov transaminacije so bili opisani nekateri pristopi, kako izboljšati produktivnost procesa. Opisani pristopi, razen izbire amino donorjev, temeljijo na optimizaciji sistema kot takega, pri čemer ne posegamo v samo konstanto kemijskega ravnotežja. Konstanta ravnotežja je odvisna od fizikalnih pogojev ter od vrste amino donorja in akceptorja.

Amino akceptor je predhodno določen, saj je le ta osnova za želen produkt, amino donorja pa načeloma lahko izberemo po želji Pri reakcijah z α-transaminazami imajo aminokisline in ketokisline približno enako tendenco za oddajo oziroma sprejem aminske skupine, zato so vrednosti konstante ravnotežja pri njih okrog 1. Pri ω-

9

transaminazah pa se amino donorji in akceptorji obnašajo zelo različno. Nekateri amino donorji zlahka oddajo aminsko skupino in so zato zaželeni za uporabo, drugi pa so stabilnejši in se težje pretvorijo v keto obliko. V tabeli 1 so predstavljene lastnosti amino donorjev in njihovih stranskih produktov, ki se pogosto uporabljajo za namene transaminacije. [8][10][22]

Amino

donor/stranski produkt

Deaminacija

amino donorja Inhibicija encima zaradi stranskega produkta

Eliminacija stranskega produkta

MBA/ACP Zelo enostavna Močna Ekstrakcija

IPA/aceton Enostavna Srednja Izparevanje

Alanin/piruvat Težka Zelo nizka Kaskadna reakcija

Tabela 1 Primerjava lastnosti izbranih amino donorjev in njihovih stranskih produktov transaminacije. [8][10][18]

Kot je razvidno iz tabele 1, je alanin slab amino donor, saj nerad odda aminsko skupino, medtem ko je MBA zelo dober amino donor. Razlika med njunima energijama za deaminacijo je slabih 20 kJ/mol. Za uspešno transaminacijo mora biti energija za deaminacijo amino donorja nižja od energije za deaminacijo aminiranega amino akceptorja. Glede na substrate v tabeli bi torej transaminacija MBA dobro potekala v paru s piruvatom, nastala pa bi ACP in alanin.

Kljub temu, da je alanin slab amino donor, je pogosto v uporabi, ker je cenovno ugoden, kompatibilen z večino transaminaz in njegov stranski produkt nima inhibitornega učinka na encim. Uporabo alanina spodbujajo tudi uspešne kaskadne reakcije za odstranjevanje piruvata ali regeneracijo alanina. ^[20]

Izopropilamin (IPA) je relativno dober amino donor. Njegova dobra lastnost je, da kot stranski produkt daje aceton, ki je, kot je bilo predstavljeno v prejšnjem poglavju, enostaven za odstranjevanje iz reakcijske mešanice. Izopropilamin ni kiralen in ga sprejmejo tako S-, kot tudi R-selektivne transaminaze. Kljub temu je učinkovit le pri omejenih vrstah transaminaz. [8][11][19]

MBA je široko uporaben amino donor zaradi svoje narave, da zlahka odda aminsko skupino. Kompatibilen je s praktično vsemi znanimi ω-transaminazami in v primerjavi z ostalimi amino donorji ponavadi dosega višje izkoristke reakcije. Pogosto se njegovo aktivnost pri transaminaciji jemlje kot referenčno vrednost za primerjavo ostalih amino

10

donorjev, ki imajo tudi do tisočkrat nižje aktivnosti. Kot primer bi izpostavil aktivnost MBA, ki je bila štirinajstkrat višja od aktivnosti izopropilamina pri ω-transaminazi iz bakterije Paracoccus denitrificans. Slabost MBA je njegov stranski produkt, ki nastane pri transaminaciji, ACP. ACP ima inhibitoren vpliv na encim, zato ga je potrebno odstranjevati iz reakcijske mešanice. Za odstranjevanje ACP je bilo razvitih več načinov. Najbolj pogosta je ekstrakcija z organskim topilom, obstajajo pa tudi uspešno implementirane encimske kaskadne reakcije. Pozitivna lastnost ACP pa je, da dobro absorbira ultravijolično valovanje in ga je zato enostavno detektirati. [12][18][20][21]

V sklopu magistrske naloge sem se osredotočil na MBA kot amino donor in na odstranjevanje njegovega stranskega produkta ACP z ekstrakcijo v organsko topilo.

2.2 Ekstrakcija tekoče-tekoče

Ekstrakcija tekoče-tekoče oziroma ekstrakcija z uporabo topila je ena izmed separacijskih tehnik, ki se uporabljajo v kemijski industriji za ločevanje topljencev v reakcijski zmesi. Separacijske tehnike se v splošnem uporabljajo v zaključnih fazah kemijskih procesov, angl. downstream processing, za izolacijo oziroma čiščenje končnih produktov. Poleg ekstrakcije so pogosto v uporabi destilacija, kristalizacija, kromatografija, filtracija, elektroforeza in druge tehnike. ^[26]

Izbor separacijske tehnike temelji na lastnostih sistema, ki ga obravnavamo.

Separacijska tehnika mora ustrezati načinu proizvodnje, ki je lahko kontinuiren oziroma šaržen. Nekatere tehnike so na primer pri kontinuirnem obratovanju težje izvedljive.

Zagotoviti moramo tudi, da separacijska tehnika ni destruktivna za spojine, ki jih ločujemo. Posebej pri separaciji manj robustnih spojin, kot so kompleksnejše fine kemikalije oziroma biološke farmacevtske učinkovine, je na primer uporaba destilacije, ki zahteva povišano temperaturo, nemogoča. Poleg navedenega je potrebno vzeti v obzir tudi ekonomsko upravičenost dane separacijske tehnike. Pri proizvodnji bazičnih kemikalij, kjer ni zahtevana zelo visoka čistost kočnega produkta, so stroški zaključnih procesov čiščenja relativno nizki glede na celoten strošek proizvodnje. Pri proizvodnji nekaterih farmacevtskih učinkovin, kot so npr. monoklonska protitelesa ali različni terapevtski encimi, pa lahko procesi čiščenja predstavljajo tudi do 90 % celotnih stroškov proizvodnje. [26][27][28]

Ekstrakcijo tekoče-tekoče se primarno uporablja pri procesih, kjer tehnike z neposredno separacijo snovi, kot sta destilacija ali kristalizacija, niso izvedljive ali so ekonomsko manj ugodne. Ekstrakcija tekoče-tekoče je uporabna za separacijo temperaturno občutljivih ali slabo hlapnih komponent oziroma komponent v nizkih koncentracijah.

11

V kemijski industriji se ekstrakcijo tekoče-tekoče uporablja pri:

- Separaciji komponent s podobnimi temperaturami vrelišča (npr. separacija aromatskih in alifatskih ogljikovodikov)

- Separaciji komponent z visokimi temperaturami vrelišča (npr. vitamini) - Separaciji temperaturno občutljivih komponent (npr. biološke molekule) - Separaciji komponent v nizkih koncentracijah iz vodne raztopine

- Separaciji azeotropnih zmesi (npr. ekstrakcija ocetne kisline iz vodne raztopine v MTBE)

- Separaciji organskih snovi iz solnih raztopin (npr. kaprolaktam) - Separaciji kovinskih ionov iz vodnih raztopin rud nizkih kakovosti - Separaciji kovinskih ionov iz odpadnih vod

- Obnovitvi jedrskih goriv (PUREX proces)

Pričakuje se, da bo ekstrakcija tekoče-tekoče v prihodnosti še pridobivala na pomenu, če se bo sčasoma kot vir surovin začela v večji meri uporabljati biomasa. Komponente biomase imajo namreč več funkcionalnih skupin in so manj hlapne od ključnih komponent surove nafte, ki je trenutno primarna surovina za sintezo širokega spektra produktov. ^[23]

2.2.1 Princip delovanja ekstrakcije tekoče-tekoče

Ekstrakcija tekoče-tekoče je proces, pri katerem je tok, ki ga sestavljata nosilna kapljevina in topljenec, pomešan s tokom topila. Topilo mora biti čimbolj nemešljivo z nosilno kapljevino, imeti pa mora visoko afiniteto do topljenca. Nosilna kapljevina in topilo sta po navadi hidrofilna in lipofilna kapljevina. Ob zadostitvi omenjenih pogojev se topljenec v večji meri prenese v topilo in le manjši delež ga ostaja v primarni nosilni kapljevini. Ločevanje topljencev pri ekstrakciji tekoče-tekoče torej temelji na razlikah v topnostih med obema fazama. S topljencem obogateno topilo imenujemo ekstrakt, nosilno kapljevino z nižjo vsebnostjo topljenca pa rafinat. Ekstrakt in rafinat se v konvencionalnih sistemih najpogosteje ločujeta na podlagi razlike v gostotah obeh faz.

Faza z nižjo gostoto se dvigne nad fazo z višjo gostoto in obratno. [24][25][29]

Ekstrakcija poteka, dokler ni vzpostavljeno ravnotežno stanje med obema fazama. V ravnotežju se prehajanje topljenca sicer ne prekine, vendar sta snovna tokova iz rafinata v ekstrakt in iz ekstrakta v rafinat nasprotno enaka. Kolikor topljenca preide iz rafinata v ekstrakt, toliko ga preide tudi v obratno smer, iz ekstrakta v rafinat. Posledično sta koncentraciji topljenca v eni in drugi fazi konstantni. Takšnemu ravnotežju pravimo

12

dinamično ravnotežje in je v principu enako, kot v prejšnjem poglavju omenjeno ravnotežje reakcije. ^[30]

Ravnotežno stanje opišemo s porazdelitvenim koeficientom, ki predstavlja razmerje med koncentracijama topljenca v obeh fazah po vzpostavitvi ravnotežja (ko sta koncentraciji konstantni):

𝐾 = ^C

∗𝑝𝑟𝑣𝑎 𝑓𝑎𝑧𝑎

C^∗_{𝑑𝑟𝑢𝑔𝑎 𝑓𝑎𝑧𝑎} (1)

V magistrski nalogi sem ga definiral kot 𝐾 = ^{C∗𝑣𝑜𝑑𝑛𝑎 𝑓𝑎𝑧𝑎}

C^∗𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑠𝑘𝑎 𝑓𝑎𝑧𝑎, pogosto pa je definiran kot obratna vrednost, in sicer 𝐾 = ^C∗𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑠𝑘𝑎 𝑓𝑎𝑧𝑎

C^∗_{𝑣𝑜𝑑𝑛𝑎 𝑓𝑎𝑧𝑎} . Slednja definicija se uporablja predvsem v toksikologiji in okoljskem inženirstvu. ^[31][32]

Na čas, ki je potreben za vzpostavitev ravnotežja, vpliva hitrost prenosa snovi med fazama. Kadar faza miruje oziroma ni konvektivnega prenosa snovi, je hitrost snovnega prenosa znotraj faze odvisna od difuzivnosti snovi v dani fazi. Difuzivnostne koeficiente je možno izračunati z uporabo različnih korelacij.

Wilke-Chang korelacija:

𝐷_𝐴𝐵=7,4 ∗ 10⁻⁸(ϕ_𝐵𝑀_𝐵)^0,5𝑇

μ_𝐵V_𝐴^0,6 (2)

V enačbi 2 je DAB [cm²/s] difuzivnost topljenca A v topilu B, ΦB [/] je koeficient, ki zavisi od interakcij med topljencem in topilom, MB [g/mol] je molska masa topila, T [K]

temperatura, μB [mPas] viskoznost topila in VA [ml/mol] molski volumen topljenca pri vrelišču pri normalnih pogojih. Wilke-Chang korelacija se uporablja za določitev difuzivnosti v binarnih razredčenih raztopinah, kjer topljenec ne disocira na ione in ima relativno nizko molekulsko maso. Ocenjena napaka Wilke-Chang korelacije je 20 %. ^[67]

Scheibel korelacija:

𝐷_𝐴𝐵=8,2 ∗ 10⁻⁸𝑇

μ_𝐵V_𝐴^{1 3⁄} [1 + (3V_𝐵 V_𝐴 )

2 3⁄

] (3)

V enačbi 3 je DAB [cm²/s] tudi tukaj difuzivnost topljenca A v topilu B, T [K]

temperatura, VB [ml/mol] molski volumen topila pri vrelišču pri normalnih pogojih, μB

[mPas] viskoznost topila in VA [ml/mol] molski volumen topljenca pri vrelišču pri

13

normalnih pogojih. Scheiblova korelacija je modificirana Wilke-Chang korelacija, pri kateri je eliminiran koeficient ΦB in se uporablja za določevanje difuzivnosti manjših molekul topljenca. ^[66]

2.2.2 Uporaba mikrofluidnih naprav za ekstrakcijo

Mikrofluidne naprave so grobo rečeno pomanjšane različice konvencionalnih kemijskih procesnih naprav za manipulacijo kapljevin za izvedbo kemijskih reakcij, separacij ali analiz. Njihova ključna značilnost so majhne dimenzije kanalov, reda velikosti nekaj deset mikrometrov, po katerih potuje snov oziroma izredno visoko razmerje med površino in prostornino kanalov. Ravno zaradi majhnih dimenzije imajo mikrofluidne naprave svoje posebne lastnosti, kot so izboljšan prenos toplote in snovi, dober nadzor nad procesom, majhna poraba reagentov, večja varnost procesa in podobno. ^[27]

Sistem za ekstrakcijo na mikro nivoju sestoji iz štirih glavnih komponent:

- Mikrofluidna naprava (mikroekstraktor)

- Povezovalne enote med mikro in makro svetom (kapilare za vtok in iztok) - Pomožne naprave (tlačne črpalke, sesalni sistemi)

- Analitske naprave za detekcijo analitov ^[26]

Ključna pri ekstrakciji je mikrofluidna naprava, v kateri se fazi združita. Specifične površine pri mikrofluidnih napravah znašajo med 1×10⁴ in 5×10⁴ m²/m³, medtem ko so pri konvencionalnih napravah okoli 100 m²/m³. ^[27] Iz visokih specifičnih površin naprav izhajajo tudi visoke specifične površine kapljevin, ki se v njih procesirajo. Iz vidika ekstrakcije je visoko razmerje med površino in prostornino faz izrednega pomena, saj se snovni transport vrši preko fazne meje.

Proces ekstrakcije vsebuje dve stopnji: združitev in ločbo nemešljivih kapljevin.

Možnih je več načinov izvedbe obeh stopenj, ki so močno povezani z dvofaznim tokovnim profilom, ki se vzpostavi v mikrokanalu.

2.2.2.1 Tokovni profili pri ekstrakciji tekoče-tekoče

Tokovni profil vpliva na obliko in površino fazne meje, ki nastane med obema fazama in s tem neposredno vpliva na snovni prenos med fazama. Kako se bo obnašala kapljevina v mikrofluidni napravi v večji meri določajo viskozne sile, kot vztrajnostne sile. Viskozne sile, ki predstavljajo nekakšno trenje v kapljevini, povzročajo, da se kapljevina pomika v plasteh, kar se odraža kot laminarni tok. Vztrajnost kapljevine

14

oziroma njena gibalna količina pa nasprotujeta temu gibanju in povzročata nastanek turbulentnega toka. ^[27]

Razmerje med vztrajnostnimi in viskoznimi silami opisuje Reynoldsovo število (Re), ki je v uporabi kot merilo za določevanje vrste tokovnega profila, ki se bo razvil pri danih pogojih. Enačba za izračun Reynoldsovega števila je sledeča:

𝑅𝑒 =𝜌 ∗ 𝑢 ∗ 𝐿

𝜂 (4)

Enačba 4 vsebuje gostoto kapljevine (ρ), hitrost toka kapljevine (u), karakteristično dimenzijo kanala (L) in viskoznost kapljevine (η).

Višja kot je vrednost Reynoldsovega števila, bolj proti turbulentnem območju se bo pomikal sistem in obratno, nižja kot je vrednost Re, bolj se bo sistem pomikal proti laminarnem območju. Okvirna mejna vrednost med laminarnim in turbulentnim tokom znaša od Re=2000 do Re=3000. Torej vrednosti pod 2000 predstavljajo laminarni tok, medtem ko vrednosti nad 3000 predstavljajo turbulentni tok. ^[34]

V mikrofluidnih napravah načeloma prevladujejo viskozne sile in posledično se v njih vzpostavi laminarni tok. Pri enofaznem sistemu je to klasični parabolični tokovni profil, pri ekstrakciji tekoče-tekoče, kjer sta prisotni vsaj dve fazi, pa je več različnih možnosti, kakšen tokovni profil bo nastal.

V primeru dvofaznega toka je poleg fazne meje med kapljevino in mikrokanalom prisotna dodatna fazna meja med obema kapljevinama. Oblika fazne meje oziroma razvoj tokovnega profila pri dvofaznem sistemu je odvisen od:

- Velikosti pretokov in razmerja med pretokoma obeh kapljevin [26][27][33][35][71]

- Lastnosti kapljevin (površinska napetost, viskoznost…) [26][27][33][35][71]

- Lastnosti materiala mikrofluidne naprave (gladkost površine, kompatibilnost s kapljevino – hidrofilnost/hidrofobnost oziroma kot omakanja) [27][33][35][38]

- Geometrije in dimenzij kanalov ter šob [26][27][33][35][71]

Najpogostejši tokovni profili, ki se uporabljajo pri ekstrakciji v mikrofluidnih napravah, so vzporedni tok (slika 5a), kapljični tok (slika 5b) in segmentiran Taylorjev tok (angl.

slug flow) (slika 5c). ^[26][27]

15

Slika 5 Tokovni profili pri ekstrakciji tekoče-tekoče v mikrofuidnih napravah: a) vzporedni tok ^[37], b) kapljični tok (angl. droplet flow) ^[36], c) segmentiran (Taylorjev) tok. ^[35]

2.2.2.1.1 Vzporedni tok nemešljivih kapljevin

Pri vzporednem tokovnem profilu tečeta po mikrokanalu, eden zraven drugega, dva tokova kapljevine, kot je razvidno na sliki 5a, ki prikazuje Y-oblikovan mikrokanal. Ker v mikrokanalu površinska napetost in strižne sile prevladujejo nad volumskimi silami (sila teže), lahko tokova tečeta vodoravno eden zraven drugega tudi, če imata kapljevini različni gostoti. ^[33] Tokova sta laminarna, zato poteka masni transport med fazama izključno z difuzijo. ^[69] S tega vidika je pomembno, da sta tokova relativno ozka, saj njuna širina vpliva na difuzijski čas, ki je definiran z naslednjo enačbo:

𝑡 =𝐿²

𝐷 (5)

D [m²/s] je difuzivnost molekul v kapljevini, L [m] pa je dimenzija, preko katere difundirajo molekule (v primeru mikrokanala je to širina toka ene faze). ^[33][35]

Difuzijski čas lahko zmanjšamo z nadgradnjo mikrokanala, v katerem namesto dveh tokov vzporedno teče večje število tokov. Teoretično lahko okoli toka s substratom dodamo poljubno število tokov topila, kar v skrajnem primeru daje koaksialen tokovni profil, ki sicer doprinese k hitrejšemu prenosu snovi zaradi večje medfazne površine, vendar je iz vidika izvedbe in stabilnosti obratovanja manj ugoden. ^[41] Pogostejša je uporaba Ψ-oblikovanih mikrokanalov, po katerih tečejo trije vzporedni tokovi (sredinski tok nosilne kapljevine s topljencem in stranska tokova topila), kot je razvidno na sliki 6.

[42] Pri treh vzporednih tokovih je difuzijska pot molekul za polovico krajša, kot pri dveh tokovih in posledično je difuzijski čas skrajšan za faktor 4. Poleg tega je ekstrakcijski čas dodatno skrajšan na račun dvojne fazne meje. ^[33][70]

Višina kanala neposredno vpliva na površino fazne meje, preko katere se vrši snovni transport, zato mora biti kanal čimvišji. Po drugi strani pa višina kanala negativno

16

vpliva na stabilnost fazne meje med kapljevinama. Fazna meja med kapljevinama je stabilna, ko je razlika v tlakih med obema tokovoma, ki nastane zaradi različnih padcev tlaka v posameznem toku, uravnovešena z Laplaceovim tlakom, ki nastane zaradi površinske napetosti med kapljevinama. Laplaceov tlak je odvisen od ukrivljenosti fazne meje in pri večji površini prihaja do večjih nihanj ukrivljenosti. Z upoštevanjem mejnih vrednosti radijev ukrivljenosti lahko preko Young-Laplaceove enačbe določimo zgornjo in spodnjo vrednost Laplaceovega tlaka in preko tega z uporabo Hagen–

Poiseuilleove enačbe izračunamo ustrezne pretoke obeh faz. ^[33]

Young-Laplaceova enačba:

∆𝑃 = 𝛾 (1 𝑅₁ + 1

𝑅₂) (6)

∆P [Pa] predstavlja razliko med tlakoma na eni in drugi strani fazne meje, γ [N] je površinska napetost, R1 in R2 [m] pa sta glavna radija ukrivljenosti fazne meje. ^[39]

Poleg stabilnosti fazne meje je pomemben tudi njen položaj v mikrokanalu. Pri vzporednem toku dveh kapljevin, ki imata enaka pretoka vendar različne viskoznosti, ima kapljevina z višjo viskoznostjo tendenco, da zavzame večji del kanala. ^[40] V tem primeru fazna meja ni poravnana na sredini mikrokanala, kar negativno vpliva na ločbo, saj je pri ekstrakciji običajna konfiguracija mikrokanalov Y-Y oblike. Pri Y-Y konfiguraciji fazna meja namreč mora biti uravnana na sredino mikrokanala, da se oba toka ustrezno ločita in potujeta vsak po svojem izhodnem kanalu. Več o določanju obratovalnih pogojev za vzpostavitev fazne meje na sredini kanala je opisanega v poglavju 4.4. Določitev razmerja pretokov organske in vodne faze za vzpostavitev fazne meje na sredini kanala.

Za uravnavanje položaja fazne meje je pomemben enakomeren hidravlični upor skozi celoten mikrokanal. Leva in desna polovica kanala morata imeti enaka upora. Zaželeno je, da mikrokanal predstavlja največji upor glede na preostale komponente (povezovalne kapilare) sistema. Za dosego enakomernega upora so uporabni regulatorji povratnega tlaka, ki se jih namesti na izhodne kanale mikrofluidne naprave in zagotavljajo enako vrednost tlaka na obeh izhodih. V primeru mikrofluidnih naprav so to različno oblikovani silicijevi ali elastomerni membranski regulatorji. ^[74]

17

2.2.2.1.2 Načini stabilizacije vzporednega toka nemešljivih kapljevin

Kot je bilo že predhodno omenjeno, vpliva na obliko fazne meje oziroma na tokovni profil veliko dejavnikov. Za vzpostavitev stabilnega vzporednega toka moramo zadostiti potrebam sistema, ki ima lahko širše ali ožje obratovalno območje. Za razširitev obratovalnega območja, da naredimo sistem bolj robusten oziroma za stabilizacijo vzporednega toka, so na voljo metode, ki so opisane v nadaljevanju.

Modifikacija površine mikrokanala

Stabilnost toka se izboljša v primeru selektivne modifikacije površine mikrokanala, da postane ta podobne narave, kot kapljevina, ki teče po njej. Del kanala z vodno fazo mora biti torej hidrofilen in del kanala z organsko fazo hidrofoben. Površina kanala je v obeh primerih bolje omočena in obe fazi imata tendenco da zavzameta vsaka svojo stran kanala.

Površino mikrokanalov je možno modificirati na različne načine. Pri hidrofilnih steklenih mikrokanalih se pogosto uporablja silanizacija z namenom povečanja hidrofobnosti površin z različnimi silani, kot sta npr. oktadecilsilan (ODS) ali oktadeciltriklorosilan (OTCS). [33][38][43][44][45][48] Za modifikacijo se skozi mikrokanal pretaka raztopino ODS ali OTCS v organskem topilu. ODS in OTCS se kovalentno vežeta na hidroksilne skupine na površini stekla. Pomembno je, da raztopina omoči le ustrezen del kanala, kar se doseže na različne načine, med drugimi z vpihom inertnega plina skozi nemodificiran del kanala, z uporabo dveh tokov kapljevin, pri čemer eden vsebuje modifikator, medtem ko ga drug ne, [44][45][48] z zaščito dela površine z zamrznitvijo inertne kapljevine na njej, ^[43] z izrabo kapilarnega efekta ^[43] ali z modifikacijo ene in druge polovice mikrokanala, če je ta sestavljen iz dveh ločenih plošč. ^[44]

18

Slika 6 Laminarni tokovni profil organske (brezbarvna) in vodne (oranžna) faze na vstopu, sredini in izhodu Ψ-oblikovanega mikrokanala: a), b) in c) predstavljajo tokove

organske in vodne faze v mikrokanalu z nemodificirano površino, d), e) in f) pa predstavljajo tokove organske in vodne faze v mikrokanalu z modificirano površino. ^[48]

Kot alternativa silanizaciji se uporablja tudi modifikacija površine s plazmo, ki reagira s površino in jo funkcionalizira. Plazemsko modificirana površina je lahko hidrofilna, hidrofobna, anionska, kationska, inertna ali reaktivna, odvisno od izbire plazme.

Modificira se lahko površine različnih materialov (steklo, kovina, polimeri). ^[46][47]

Mikrokanali z modificirano površino omogočajo tudi protitočno obratovanje, kar je v primeru nemodificirane površine praktično neizvedljivo. ^[44]

Uporaba pomožnih struktur (angl. guide structures)

K stabilnosti tokov pripomorejo pomožne strukture v mikrokanalih, ki so locirane na linijo, kjer se nahaja fazna meja. Pomožne strukture so lahko nižje izbokline, ki služijo kot vodila za tokove ali pa so stebrički, ki segajo od dna do stropa mikrokanala. Primere različnih pomožnih struktur prikazuje slika 7.

19

Slika 7 Pomožne strukture za stabilizacijo medfazne meje: a) shematski prikaz profila mikrokanala z vodili za vzpostavitev treh vzporednih laminarnih tokov, ^[33] b) različni primeri stebričkov za stabilizacijo toka. ^[38]

Geometrija pomožnih struktur je pomemben dejavnik, ki vpliva na stabilnost fazne meje. Kot je bilo že omenjeno, ima velik vpliv Laplaceov tlak. Pri okroglih pomožnih strukturah je fazna meja bolj ukrivljena kot pri robatih, zato so robate pomožne strukture v splošnem bolj učinkovite pri stabilizaciji fazne meje.

Glavna slabost separacijskih naprav, ki vsebujejo pomožne strukture, je njihovo omejeno obratovalno območje. Te naprave ne omogočajo tako širokih razponov pri pretokih in razlikah v viskoznostih med obema fazama kot klasični mikrokanali.

Spreminjanje viskoznosti je lahko težava, zato ti sistemi niso primerni za uporabo pri ekstrakciji relativno visoko koncentriranih topljencev. Zaradi dodanih pomožnih struktur je medfazna površina, preko katere se vrši masni transport, zmanjšana, kar negativno vpliva na hitrost ekstrakcije. ^[33][38]

Poleg navedenega so mikrofluidne naprave s pomožnimi strukturami težje za izdelavo in imajo posledično višjo ceno. Pomožne strukture so reda velikosti nekaj mikrometrov, za doseganje takšne resolucije pa je potrebna uporaba litografskih metod proizvodnje in ustreznih materialov za izdelavo mikrokanala, kot sta steklo ali silicij. ^[38]

20

Membranske naprave za separacijo

Naslednji način za stabilizacijo medfazne površine je uporaba mikroporoznih membran na sredini mikrokanala. Tokova sta tako med seboj ločena z membrano, kar se odraža v zelo stabilnem obratovanju in dodatni prednosti, da ločevanje faz ni potrebno.

V splošnem se uporabljajo polimerne membrane s povprečnim premerom por pod 1 μm.

Poroznost membran sega od 50 do 70 % in običajno so debele od 30 do 200 μm.

Najpogosteje so v uporabi teflonske hidrofobne membrane. Organska faza membrano omoči, vodna pa je ne in posledično se fazna meja ustvari na stiku membrane z vodno fazo. ^[38]

Slika 8 Presek mikrokanala z membrano za separacijske namene. Naprava je sestavljena iz zgornje in spodnje plošče, v kateri sta izdolbena kanala, med njiju pa je postavljena

membrana. ^[33]

Pri uporabi takšnih membranskih separatorjev je potrebno najprej v mikrokanal uvesti vodno fazo in šele nato organsko, da organska ne omoči kanala za vodno fazo, saj bi lahko v tem primeru prišlo do uhajanja organske faze v vodno. Za preprečitev tega pojava se lahko uporabi tudi nadtlak velikosti nekaj 100 Pa na strani z vodno fazo. ^[49]

Membranske naprave za separacijo omogočajo tudi protitično obratovanje, njihova glavna slabost pa je otežen masni transport med fazama zaradi prisotnosti membrane in nabiranje oblog na membrani (angl. fouling), ki še dodatno poveča upore proti prenosu snovi. ^[38]

Dodatek surfaktantov in višanje pretokov faz

V primerih, ko sistem dopušča spreminjanje lastnosti obeh tokov, lahko za stabilizacijo medfazne površine v kapljevino dodamo surfaktante. Surfaktanti so površinsko aktivne snovi, ki znižajo površinsko napetost med organsko in vodno fazo. Če je površinska napetost med kapljevinama previsoka, prevladajo površinske sile, ki delujejo na površino v smeri normale in površino ukrivijo do te mere, da nastane tok kapljic

21

oziroma segmentiran tok. Z dodatkom surfaktanta lahko velikost površinskih sil znižamo, da začnejo prevladovati viskozne sile, ki delujejo tangentno na površino in jo ravnajo ter tako vzpostavijo stabilen vzporedni tok. ^[33]

Pri spreminjanju površinske napetosti je pomembna količina dodanega surfaktanta. Z dodajanjem surfaktanta v nizkih koncentracijah se površinska napetost močno spreminja, saj medfazna površina še ni nasičena s surfaktantom. Pri dosegu tako imenovane kritične micelarne koncentracije (CMC) pa se površinska napetost z dodajanjem surfaktanta le malo spreminja. CMC je najnižja koncentracija surfaktanta, pri kateri se začenjajo tvoriti miceli in pri CMC je na medfazni površini vzpostavljen monosloj (enojni sloj) surfaktanta. ^[50][68]

V literaturi je bilo objavljenih več uspešnih eksperimentov, kjer je dodatek različnih surfaktantov stabiliziral vzporedni tok. Dva primera sta natrijev dodecilsulfat ^[51] in trikloroocetna kislina. ^[52] Izbira surfaktanta je odvisna od sistema, v splošnem pa stremimo k temu, da je čimbolj inerten in poleg površinske napetosti ne spreminja ostalih lastnosti sistema.

Kot je bilo omenjeno, morajo za vzpostavitev stabilnega vzporednega toka nad površinskimi silami prevladovati viskozne sile. Dodatek surfaktanta je torej način za zniževanje površinskih sil, lahko pa se orientiramo na povišanje velikosti viskoznih sil, kar se tudi odraža v stabilizaciji vzporednega toka. Velikost viskoznih sil se veča s povečevanjem pretokov faz skozi mikrokanal. Več avtorjev navaja segmentiran tokovni profil do neke mejne hitrosti toka, pri višjih hitrostih pa postane stabilen vzporeden laminarni tok. ^[53][54]

2.3 Matematično modeliranje procesov

Matematično modeliranje procesov je naše intelektualno prizadevanje za opis in razlago procesov, ki se dogajajo v realnem svetu. Nameni modeliranja procesov so lahko različni, od raznih dinamičnih ali stacionarnih simulacij, do načrtovanja in nadzora procesov. ^[56]

Inženirji in znanstveniki imajo s pomočjo modeliranja boljše razumevanje danega sistema. Model je zelo uporabno orodje za optimizacijo, povečevanje (angl. scale up), odpravljanje napak in nadzor procesov, kakor tudi za izobraževanje operaterjev o procesu. Iz vidika ekonomije je uporaba modelov zelo pomembna, saj model omogoča pridobitev informacij, ki bi jih sicer dobili z izvedbo eksperimenta, kar pa lahko predstavlja visoke stroške in je časovno potratno. Na primer pri modeliranju kemijskega

22

reaktorja lahko v modelu poljubno spreminjamo dimenzije reaktorja, v realnem svetu pa bi morali izdelati večje število različnih reaktorjev za izvedbo eksperimentov. ^[57]

Pri dinamični simulaciji obravnavamo časovno odvisen sistem, katerega parametri so odvisni od predhodnih pojavov, ki so se zgodili v nekem času. Načeloma so vsi realni procesi dinamični, v primeru, ko so časovne spremembe zelo počasne, pa jih lahko zanemarimo in proces opisujemo v stacionarnem stanju. S simulacijo procesov lahko napovemo obnašanje sistema glede na spreminjanje parametrov. Na ta način dobimo informacije o vplivu posameznih sprememb parametrov na proces.

Pri izdelavi modela za načrtovanje procesa uporabimo model za določitev vrednosti izbranih parametrov sistema. V tem primeru obravnavamo nek dan proces, pri katerem so nekateri parametri neznanke in jih ni možno enostavno izmeriti, ostale parametre pa lahko določimo oziroma jih poznamo. Uporaba modela nam omogoča, da s pomočjo vrednosti znanih parametrov izračunamo neznane parametre. Za reševanje tako zastavljenih problemov se običajno uporabljajo različne optimizacijske tehnike, ki s poskušanjem generirajo takšne vrednosti neznanih parametrov, da model določi vrednosti znanih parametrov z minimalnimi odstopanji od dejanskih vrednosti znanih parametrov. ^[55]

Model, ki je namenjen nadzoru procesa, ima lahko lastnosti statične ali dinamične simulacije, odvisno od lastnosti sistema, ki ga opisuje. Njegov namen je odkrivanje in spoznavanje napak v procesu. Pri vodenju realnih procesov se lahko zgodi, da parametri nihajo v nepričakovanih amplitudah, ki jih model zazna. S pomočjo modela lahko tako določimo ustrezne korektivne ukrepe za normalizacijo procesa. ^[55][58]

2.3.1 Kaj je matematični model?

Kratka definicija matematičnega modela je lahko ta, da je matematični model opisovanje določenih pojavov nematematičnega sistema z matematičnim jezikom. ^[55]

Nekoliko razširjena razlaga je opisana v nadaljevanju in shematsko prikazana na sliki 9.