ANALIZA GENETSKE RAZNOLIKOSTI .1 Izolacija DNA

Izolacijo genomske DNA treh individulanih rastlin za posamezni obravnavani genski vir smo opravili na robotu za izolacijo nukleinskih kislin (MagMax™, Applied Biosystems) po prilagojenem programu glede na navodila proizvajalca. Metodika izolacije je sledila postopku, ki ga je uporabila Pipanova v svoji doktorski disertaciji (2013). Odstopanja in modifikacije osnovnega postopka so opisane v nadaljevanju.

Uporabili smo kemikalije iz kompleta za izolacijo DNA BioSprint 15 DNA Plant (Qiagen).

10 mg rastlinskega materiala vzorčenega v letu 2019 (glej poglavje 3.1 Rastlinski material) smo natehtali v mikrocentrifugirke, dodali dve jekleni kroglici in homogenizirali na razkrojevalcu tkiv (Qiagen, TissueLyser) 8 min pri 30 Hz. Nato smo dodali 250 µL pufra RLT in zmešali na vrtinčniku (MaxiMix II, Thermolyne). Mikrocentrifugirke smo skupaj s kroglicami centrifugirali (Eppendorf centrifuge 5415R) 11 min pri 12.000 g in temperaturi 21 °C. Uporabili smo nastavke z mikrocentrifugirkami MagMAX™ Express plošče proizvajalca Applied Biosystems (Slika 14).

Slika 14: Plošče z odpipetiranim supernatantom in ostalimi reagenti

V prvi valj plošče smo odpipetirali 170 μL supernatanta, dodali 80 μL 2-propanola in 10 μL magnetne suspenzije, ki smo jo predhodno 3 min stresali na vrtinčniku. V drugi valj plošče smo odpipetirali 200 μL hladnega pufra RPW. V tretji in četrti valj plošče smo odpipetirali po 200 μL 96 % etanola, v petega pa 100 μL pufra TE (Tris-EDTA buffer solution, Sigma Aldrich). Vsi uporabljeni reagenti, z izjemo 2-propanola, etanola in pufra TE, so bili del BioSprint 15 DNA Plant kompleta za izolacijo nukleinskih kislin. Večvaljno ploščo smo položili v robota za izolacije nukleinskih kislin MagMAX™ Express. Princip delovanja je prikazan na sliki 15.

Slika 15: Princip delovanja MagMAX ™ Exppress (QiaGen, 2016)

Program izolacije je zajemal vezavo DNA na magnetne delce (4 min), spiranje v alkohol vsebujočem pufru (3,5 min), dvakratno spiranje v etanolu (4,5 min), sušenje (5 min) in spiranje DNA, ki je bila po končani izolaciji raztopljena v TE-pufru (3 min) (Pipan, 2013).

Tako izolirano genomsko DNA smo odpipetirali v mikrocentrifugirke (Slika 16) in shranili na 4 °C.

Slika 16: Mikrocentrifugirke z genomsko DNA, raztopljeno v pufru TE

Prisotnost in kakovost genomske DNA smo preverili s horizontalno gelsko elektroforezo.

DNA je negativno nabita in potuje po agaroznem gelu, ki je pod napetostjo. Agarozni gel, ki smo ga pripravili iz agaroze in pufra TBE (borova kislina 44,5 mmol/L, Trizma Base 44,6 mmol/L, EDTA 10 mmol/L) tvori mrežo, po kateri manjši fragmenti DNA potujejo hitreje kot večji fragmenti, kar nam je služilo za zaznavanje morebitne razkrojenosti DNA, v nadaljnjih fazah poskusa pa za ločevanje različno velikih PCR fragmentov. Ker smo pred potekom elektroforeze dodali fluorescenčno barvilo etidijev bromid, ki se veže na DNA, smo lahko DNA vizualizirali pod UV svetlobo.

Uporabili smo 2 % agarozni gel. V posamezen žepek agaroznega gela smo nanesli 5 μL izolirane DNA, ki smo jo predhodno zmešali s 5 μL pufra za potovanje nukleinskih kislin (pripravljen iz 6X TriTrack DNA loading dye, Thermo fisher, v nadaljevanju LB). Kot DNA dolžinski standard smo uporabili GeneRuler velikosti 1 kb (Thermoscientific™ DNA Ruller™). Ločevanje je potekalo na sistemu za horizontalno elektroforezo (Gibco BRL, Life Technologies). Potovanje celokupne genomske DNA je potekalo 50 min pri električni napetosti 100 V. Vizualizacijo gela smo opravili s sistemom GeneGenius (Syngene) in programsko opremo GeneSnap (Syngene). Koncentracijo izolirane genomske DNA smo izmerili na fluorometru (Qubit™ 3.0; ThermoFisher Scientific) z uporabo kompleta Qubit™

dsDNA Broad Range Assay (Thermo Scientific).

3.6.2 Genotipizacija

Za reakcije pomnoževanja markerjev smo uporabili dva različna seta kemikalij. Primarno so to bile kemikalije Biotools (BT). Reakcijo smo pripravili z 1 μL 10 × PCR pufer (BT reaction buffer, MgCl2 free), 0,5 μL 50 mM MgCl2 (BT MgCl2 solution), 0,2 μL zmesi vsakega 10 mM dNTP (Sigma-Aldrich), 0,1 μL 10 μM začetnega oligonukleotida

»Forward«, 0,25 μL 10 μM začetnega oligonukleotida »Reverse« (Mikro-Polo, Slovenija), 0,183 μL 10 μM univerzalnega fluorescenčnega začetnega oligonukleotida FAM-M13(-21) ali NED-M13(-21) ali HEX-M13(-21) (Applied Biosystems), 0,5 μL 5U Taq DNA-polimeraze (BT) in 1 µL ali 1,2 µL genomske DNA, ki smo jo dodali na koncu.

Volumen dodane DNA smo določili na podlagi meritev koncentracije DNA. V reakcijsko mešanico smo dodali po 1 µL vzorcev, pri katerih smo izmerili koncentracijo DNA nad

5,0 ng/µL in po 1,2 µL, ki so imeli koncentracijo pod 5,0 ng/µL. Skupen volumen reakcijske mešanice in DNA je za posamezen vzorec znašal 11 µL ali 11,2 µL (Pipan, 2013; Pipan in Meglič, 2019). Za bolj zahtevno pomnoževanje fragmentov smo uporabili kemikalije QuantaBio AccuStart™ II PCR ThoughMix (QB), ki smo jim dodali le začetne oligonukleotide in univerzalni fluorescenčni oligonukleotid. Pomnoževanje je potekalo po PCR temperaturnih profilih predstavljenih v preglednicah 2 in 3 (Pipan in sod., 2013; Pipan in sod., 2016; Pipan in sod., 2017; Pipan in Meglič, 2019).

Preglednica 2: PCR postopek piquemal za genotipizacijo genskih virov listnega ohrovta Iniciacijska stopnja 4 min na 94 °C

Denaturacijska stopnja 1 min na 94 °C

15 ciklov Stopnja pripenjanja 1 min na 49,5 °C + 0,7 °C/cikel Stopnja podaljševanja 1 min na 72 °C

Denaturacijska stopnja 30 s na 94 °C 23 ciklov Stopnja pripenjanja 30 s na 53 °C Stopnja podaljševanja 1 min na 72 °C Zaključno podaljševanje 5 min na 72 °C

Reakcijsko zmes za PCR smo pripravili v sterilni komori, t.i. čisti sobi, da bi se izognili morebitnim kontaminacijam. Mikrocentrifugirke z reakcijsko mešanico in DNA smo postavili v ciklični termostat Veriti 96-Well Thermal Cycler (Appliedbiosystems) ali SureCycler 8800 (Agilent Technologies) ter opravili PCR. V prvem koraku smo vsak marker optimizirali z ustreznim postopkom PCR na cikličnem termostatu. Za optimizacijo smo izbrali 7 naključnih vzorcev, na katerih smo izvedli PCR pri različnih pogojih. Ko smo našli ustrezen postopek, pri katerem se je tarčno zaporedje uspešno pomnožilo, smo izvedli PCR vseh vzorcev. Na cikličnem termostatu smo uporabili PCR postopka piquemal in ssr-tail (Pipan in Meglič, 2019), ki sta podrobneje opisana v preglednicah 2 in 3.

Preglednica 3: PCR postopek ssr-tail za genotipizacijo genskih virov listnega ohrovta Iniciacijska stopnja 5 min na 94 °C Denaturacijska stopnja 45 s na 94 °C

10 ciklov Stopnja pripenjanja 45 s na 56 °C - 0,1 °C/cikel Stopnja podaljševanja 1 min in 30 s na 72 °C Denaturacijska stopnja 45 s na 94 °C

30 ciklov Stopnja pripenjanja 45 s na 55 °C

Stopnja podaljševanja 1 min in 30 s na 72 °C Zaključno podaljševanje 8 min na 72 °C

Uporabili smo 12 visokopolimorfnih SSR markerjev za analizo genetske raznolikosti vrste Brassica oleracea s PIC vrednostjo nad 0,71. Marker Ol12-FO2 so objavili Sarikamis in sod. (2010), ostale markerje pa El-Esawi in sod. (2016). Seznam uporabljenih markerjev za genotipizacijo je podan v preglednici 4.

Preglednica 4: Seznam uporabljenih markerjev za genotipizacijo genskih virov listnega ohrovta

2: CATTTCTCAATGATGAATAGT 200–250 piquemal QB Ol10-A03a 1: CTGGTTTTCTCCTTCATCAG

2: CTGTGTAGCTTTTAGTCTTT 50–160 piquemal QB Ol10-F11a 1: TTTGGAACGTCCGTAGAAGG

2: CAGCTGACTTCGAAAGGTCC 64–240 piquemal BT Ol10-H02 1: AACAGGAAGAAACGACGAGG

2: AGAGAGCCATGAGAAGCACC 98–260 ssr-tail BT Ol11-G11 1: GTTGCGGGCGAAACAGAGAAG

2: GAGTAGGCGATCAAACCGAG 70–210 ssr-tail BT Ol11-H02 1: TCTTCAGGGTTTCCAACGAC

2: AGGCTCCTTCATTTGATCCC 96–250 ssr-tail BT Ol12-F11 1: AAGGACTCATCGTGCAATCC

2: GTGTCAGTGGCTACAGAGAC 100–276 piquemal BT Ol13-C12 1: AGAGGCCAACAAAGAACACC

2: GAAGCAGCACCAGTGACAAG 84–196 ssr-tail BT Ra2-E03 1: AGGTAGGCCCATCTCTCTCC

2: CCAAAACTTGCTCAAAACCC 110–245 ssr-tail BT Ra2-E11 1: GGAGCCAGGAGAGAAGAAGG

2: CCCAAAACTTCCAAGAAAAGC 74–208 ssr-tail BT Na12-C08 1: GCAAACGATTTGTTTACCCG

2: CGTGTAGGGTGATCTATGATGGG 68–190 piquemal QB Na14-C12 1: CACATTTTGGTTCAATTCGG

2: TACGACCTGGTTTCGATTC 92–198 piquemal QB

3.6.3 Kvalitativna obravnava PCR fragmentov

Po končanem PCR smo fragmente preverili na horizontalni gelski elektroforezi na 1,4 % gelu, ki smo ga pripravili z 0,5 × TBE, 2,1 g agaroze in 2 µL etidijevega bromida (Slika 17).

Na gel smo nanesli 5 µL pufra za nanašanje in 4 µL PCR fragmenta za vsak marker posebej.

Nanesli smo 2 µL dolžinskega standarda. Ločevanje je potekalo 55 min pri napetosti 100 V.

Gel smo fotografirali s sistemoma GeneGenius in GeneSnap (Syngene). Pri vsakem vzorcu smo za posamezen marker lahko razbrali prisotnost pomnoženega fragmenta na agaroznem gelu, za orientacijo nam je služil podatek o pričakovani velikosti fragmenta, ki smo ga dobili v literaturi in s primerjavo z dolžinskim standardom. V primeru, ko se je pojavilo več pomnožkov različnih velikosti, smo upoštevali vse do velikosti 500 bp.

Na sliki 17, ki predstavlja primer slike gela, levo in desno v obeh dolžinskih standardih vidimo različno velike fragmente nukelinskih kislin, pri katerih najbolj spodnji pomnožek predstavlja fragmente dolžine 100 bp, nad njim sledijo fragment dolžine 200 bp, nato

300 bp, 400 bp, izrazitejši pomnožek fragmente 500 bp, nato pa pomnožki do približno 1000 bp. Med dolžinske standarde so nanešeni pomnožki posameznih vzorcev. V tem primeru vidimo pomnožene fragmente več različnih velikosti med 200 in 500 bp. V spodnji vrstici zadnji trije pomnožki predstavljajo negativne kontrole.

Slika 17: Pomnoženi fragmenti DNA listnega ohrovta z mikrosatelitnimi markerji s sistemoma GeneGenius in GeneSnap (Syngene)

Levi del slike 17 predstavlja marker Na12-C08, na sliki so: v prvi vrsti so od leve proti desni nanešeni dolžinski standard (vsaka lisa predstavlja 100 bp), vzorci 1B, 1C, 1D, 2A, 2B, 2D, 3C, 3D, 4B, 4C, 4D, 5A, 5D, 6A, 6B, 6C, 8A, 9A, 9C, 9D, 10A, 10B, 11A, 11C, dolžinski standard. Druga vrsta: dolžinski standard, vzorci 11D, 12A, 13B, 13D, 14A, 14B, 14C, 15A, 15B, 15D, 16A, 16B, 16D, 17A, 17B, 17D, 18C, 18D, 19B, 20A, 20C, 20D, 21A, 22A, dolžinski standard. In tretja vrsta: dolžinski standard, vzorci 22B, 22C, 23B, 23C, 23D, 24A, 24D, 25A, 5B, 12B, 12D, 18B, 19A, 19D, 24B, 26A, 25B, 26C, 26D, 27A, slepi vzorec (angl. no-template control) (NTC), NTC, NTC, dolžinski standard.

Desni del slike predstavlja marker Na14-C12, na sliki so: V prvi vrsti so od leve proti desni nanešeni dolžinski standard (vsaka lisa predstavlja 100 bp), vzorci 1B, 1C, 1D, 2A, 2B, 2D, 3C, 3D, 4B, 4C, 4D, 5A, 5D, 6A, 6B, 6C, 8A, 9A, 9C, 9D, 10A, 10B, 11A, 11C, dolžinski standard. Druga vrsta: dolžinski standard, vzorci 11D, 12A, 13B, 13D, 14A, 14B, 14C, 15A, 15B, 15D, 16A, 16B, 16D, 17A, 17B, 17D, 18C, 18D, 19B, 20A, 20C, 20D, 21A, 22A, dolžinski standard. In tretja vrsta: dolžinski standard, vzorci 22B, 22C, 23B, 23C, 23D, 24A, 24D, 25A, 5B, 12B, 12D, 18B, 19A, 19D, 24B, 26A, 25B, 26C, 26D, 27A, NTC, NTC, NTC, dolžinski standard.

Slepi vzorec (NTC) pomeni vzorec brez DNA, namesto tega je dodana ddH2O.