DOLOČANJE VSEBNOSTI BIOAKTIVNIH SPOJIN

Vsebnost bioaktivnih spojin smo določili na rastlinskem materialu vzorčenem v letu 2019 (glej poglavje 3.1 Rastlinski material). Za analize AOP, TPC in TFC smo iz liofiliziranih in homogeniziranih listov pripravili ekstrakte.

Ekstrakte smo pripravili tako, da smo v centrifugirke natehtali 120 mg vzorca, dodali 5 mL 70 % etanola (Honeywell, Nemčija) in mešanico 60 s mešali na vrtinčniku. Centrifugirke smo prenesli v ultrazvočno kopel (Pro 70, ASonic) in vzorce inkubirali 1 h v temi na sobni temperaturi. Po inkubaciji smo ekstrakte ponovno vrtinčili 60 s in nato 5 min centrifugirali pri 13,200 rpm. Supernatant smo filtrirali skozi celulozno acetatni filter (Sartorius) z velikostjo por 0,45 µm v mikrocentrifugirke, ki smo jih do analiz hranili v zmrzovalniku.

Meritve absorbanc vzorcev pri izbrani valovni dolžini smo izmerili na spektrofotometru (Cary 8454 UV-Vis, Agilent Technologies).

3.5.1 Določanje antioksidacijskega potenciala

Določitev AOP temelji na reakciji med stabilnim radikalom DPPH• in antioksidantom. Za določanje AOP smo uporabili modificirano metodo določanja po Brand-Williams in sod.

(1995).

Kemikalije/reagenti:

- 560 µmol raztopina 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil radikal (DDPH•) (Sigma-Aldrich, Nemčija); založno raztopino smo pripravili tako, da smo zatehtali 10 mg DPPH• in dodali 45 mL metanola;

- Metanol (Honeywell, Nemčija);

- Trolox (Sigma-Aldrich, Nemčija).

Test:

Tik pred izvedbo testov smo pripravili raztopino DPPH•. Pred samim testom smo pripravili še referenčni vzorec in s tem preverili ustreznost pripravljene DPPH• raztopine. Pazili smo, da je bil DPPH• ves čas v temi, saj je raztopina občutljiva na svetlobo. Teste smo izvajali pri sobni temperaturi. V mikrocentrifugirko smo odpipetirali 1600 µL metanola, nato dodali 400 µL pripravljene raztopine DPPH• in pomerili absorbanco pri 517 nm valovne dolžine.

Izmerjena absorbanca mora biti ≈1,0. Če je absorbanca previsoka, pripravljeno raztopino DPPH• ustrezno razredčimo z metanolom. V mikrocentrifugirke smo odpipetirali 1550 µL metanola, dodali 400 µL raztopine DPPH• in 50 µL ekstrakta vzorca. Mikrocentrifugirke smo premešali in po 50 min v temi na sobni temperaturi izmerili absorbanco pri 517 nm valovne dolžine. Vsak vzorec smo izmerili v treh ponovitvah. Rezultat je razlika v absorbanci med referenčnim vzorcem in posameznim ekstraktom. Večja kot je razlika v absorbanci, večji je antioksidacijski potencial.

Umeritvena krivulja:

Za pripravo umeritvene krivulje smo kot standard uporabili Trolox. V 50 mL bučko smo zatehtali 6 mg Trolox-a in do oznake dopolnili z ekstrakcijsko raztopino. Za pripravo umeritvene krivulje smo pripravili sedem točk s koncentracijami v razponu 12 – 120 mg/L.

Test za točke umeritvene krivulje smo pripravili in izmerili enako kot za vzorce – posamezna točka umeritvene krivulje nadomesti vzorec. Rezultat umeritvene krivulje, ki jo prikazuje slika 11, je premica, na kateri izberemo le točke, ki so znotraj linearnega dela. Na podlagi enačbe umeritvene krivulje smo iz razlike absorbanc referenčnih vzorcev in ekstraktov preračunali antioksidacijski potencial posameznega vzorca. Rezultate smo podali kot ekvivalent Trolox-a (TE) v gramu vzorca (mg TE/g vzorca).

Slika 11: Umeritvena krivulja za določanje AOP z DDPH• testom

3.5.2 Določanje skupnih fenolnih spojin

Metoda temelji na tvorbi modro obarvanega kompleksa fenolnih spojin s Folin-Ciocalteu reagentom. Za določanje TPC smo uporabili modificirano metodo določanja po Singleton in Rossi (1965).

Kemikalije/reagenti:

- Raztopina Folin-Ciocalteu reagenta (F-C reagent), (Sigma-Aldrich, Nemčija); založno raztopino smo si pripravili tako, da smo F-C reagent redčili z destilirano vodo v razmerju 1:2;

- 20 % raztopina natrijevega karbonata (Na2CO3), (Merck, Nemčija);

- Galna kislina (Sigma Aldrich, Nemčija).

Test:

Tik pred izvajanjem testov smo pripravili raztopino F-C reagenta, ki je bila ves čas v temi.

Analizo smo izvedli pri sobni temperaturi. V mikrocentrifugirko smo odpipetirali 1375 µL destilirane vode, dodali 300 µL pripravljene raztopine F-C reagenta in premešali. Takoj zatem smo dodali 25 µL ekstrakta vzorca in dobro premešali. Po 5 min smo dodali še 300 µL 20 % Na2CO3 in ponovno dobro premešali. Po 45 min v temi na sobni temperaturi smo vzorcem izmerili absorbanco pri 765 nm valovne dolžine. Vsak vzorec smo izmerili v treh ponovitvah.

Umeritvena krivulja:

Za pripravo umeritvene krivulje smo kot standard uporabili galno kislino. V 100 mL bučko smo zatehtali 50 mg galne kisline in do oznake dopolnili z destilirano vodo. Za pripravo umeritvene krivulje smo pripravili sedem točk s koncentracijami v razponu 50 – 500 mg/L.

Test za točke umeritvene krivulje smo pripravili in izmerili enako kot za vzorce – posamezna točka umeritvene krivulje nadomesti vzorec. Rezultat umeritvene krivulje, ki jo prikazuje slika 12, je premica, na kateri izberemo le točke, ki so znotraj linearnega dela. Na podlagi enačbe umeritvene krivulje iz absorbanc vzorcev smo preračunali vsebnosti skupnih fenolnih spojin posameznega vzorca. Rezultate smo podali kot ekvivalent galne kisline (GAE) v gramu vzorca (mg GAE/g vzorca).

Slika 12: Umeritvena krivulja za določanje TPC po Folin-Ciocalteujevi metodi

3.5.3 Določanje skupnih flavonoidov

Postopek kvantifikacije flavonoidov temelji na reakciji med flavonoidi in aluminijevim kloridom, pri čemer se tvori kompleks, ki obarva raztopino rumeno. Za določanje TFC smo uporabili modificirano metodo določanja po Lin in Tang (2007).

Kemikalije/reagenti:

- 95 % etanol (Honeywell, Nemčija);

- 10 % raztopina aluminijevega klorida (AlCl3) (Fluka, Nemčija);

- 1 M raztopina kalijevega acetata (CH3COOK) (Sigma-Aldrich, Nemčija);

- Kvercetin (Sigma-Aldrich, Nemčija).

Test:

Tik pred izvajanjem testov smo pripravili vse raztopine. Vse analize smo izvajali pri sobni temperaturi. V mikrocentrifugirke smo odpipetirali 1220 µL vode, dodali 40 µL raztopine CH3COOK, 40 µL raztopine AlCl3, 600 µL 95 % etanol in na koncu še 100 µL ekstrakta vzorca. Reakcijsko raztopino smo večkrat premešali. Po 40 min v temi na sobni temperaturi smo vzorcem izmerili absorbanco pri 415 nm valovne dolžine. Vsak vzorec smo izmerili v treh ponovitvah.

Umeritvena krivulja:

Kot standard smo uporabili kvercetin. V 100 mL bučko smo zatehtali 15 mg kvercetina in do oznake dopolnili s 70 % etanola. Za pripravo umeritvene krivulje smo pripravili sedem točk s koncentracijami v razponu 5 – 150 mg/L. Test za točke umeritvene krivulje smo pripravili in izmerili enako kot za vzorce – posamezna točka umeritvene krivulje nadomesti vzorec. Rezultat umeritvene krivulje, ki jo prikazuje slika 13, je premica na kateri izberemo le točke, ki so znotraj linearnega dela. Na podlagi enačbe umeritvene krivulje iz absorbanc vzorcev smo preračunali vsebnosti TFC posameznega vzorca. Rezultate smo podali kot ekvivalente kvercetina (QE) v gramu vzorca (mg QE/g vzorca).

Slika 13: Umeritvena krivulja za določanje TFC z uporabo AlCl3

3.6 ANALIZA GENETSKE RAZNOLIKOSTI