Genotipizacija je skupek laboratorijskih metod, s katerimi določamo posamezne genetske variante ali posamezne genetske dele, ki jih posameznik ima ali nima. Na podlagi genotipizacije lahko identificiramo sorte, preučujemo genetsko raznolikost rastlin, določamo izvor in sorodnost sort znotraj posamezne vrste (Štajner, 2010).
Morfološka in biokemijska karakterizacija rastlin nam podata prvo oceno o genetski raznolikosti populacije. Ker pa je takšna karakterizacija močno odvisna od biotskih in abiotskih dejavnikov je pogosto manj natančna. Za namene odkrivanja genetske raznolikosti se zato običajno uporabljajo različni DNA markerski sistemi (Adu in sod., 2019). Z genetskimi analizami pridobljene podatke je potrebno ustrezno analizirati. To pomeni, da si s podatki pomagamo pri odgovarjanju na vprašanja kot so kakšna je raznolikost med posameznimi preučevanimi osebki in kako je ta raznolikost porazdeljena znotraj populacije.
Če raznolikosti znotraj vrste oz. populacije ni, potem je izboljšanje posamezne lastnosti zelo težko (Govindaraj in sod., 2015).
Pri raziskavah genetskih analiz razlikujemo med dvema pojmoma: genetska variabilnost (angl. genetic variability) in genetska raznolikost (angl. genetic diversity). Variabilnost so variante alelov posameznega gena, raznolikost pa je širši pojem, njeno vrednost predstavlja število genov. Če ta dva pojma združimo skupaj, ugotovimo, da je genetska variabilnost sestavni del genetske raznolikosti. Raznolikost v rastlinskih genskih virih je pomembna za žlahtnitelje, da izboljšajo ali vnesejo želene lastnosti v že uveljavljene rastlinske linije.
Takšne lastnosti so količina pridelka, velikost semen, odpornost na bolezni, itd. Naravno prisotna genetska raznolikost (npr. divje vrste, sorodne vrste, mutanti) in žlahtnjenje skupaj s selekcijo, omogočajo izbor želenega genotipa oz. rastlin, ki se jih lahko uporabi v nadaljnjih programih žlahtnjenja (Bhandari in sod., 2017).
2.4.1 Genetske analize z različnimi DNA markerji
Pri uporabi RAPD (angl. random amplified polymorphic DNA) markerjev gre za metodo z verižno reakcijo s polimerazo (angl. polymerase chain reaction – PCR), pri kateri uporabljamo kot marker naključno pomnoženo polimorfno DNA in se uporablja pri določanju diverzitete rastlin. Princip metode je uporaba poljubnih kratkih začetnih oligonukleotidov običajno dolgih 10 bp. Segmenti, ki jih ti začetni oligonukleotidi pomnožijo, so naključni in razpršeni po celotnem genomu. Rezultat analize je lahko prisotnost pomnožka, ki ga vidimo na gelu ali njegova odsotnost (Liu in Cordes, 2004).
Okomus in Balkaya (2007) sta opravila raziskavo na 20 populacijah listnega ohrovta z uporabo RAPD markerjev z namenom odkriti genetsko raznolikost lokalnih populacij listnega ohrovta na obmčju Črnega morja. Hkrati sta opravila morfološke analize in primerjala rezultate genetske in morfološke analize. Genetsko razdaljo med posameznimi akcesijami sta izračunala s pomočjo Jaccardov-ega koeficienta, glede na prisotnost ali odsotnost posameznih pomnožkov na gelu. Ugotovila sta, da je za genetsko sorodnost pomembnejši geografski izvor kot morfološka podobnost. Margalé in sod. (1995) so opravili raziskavo z uporabo RAPD markerjev na območju Francije na treh različnih varietetah listnega ohrovta. Z uporabo samo RAPD markerjev niso mogli razločiti med dvema varietetama, zato je bila potrebna morfološka analiza. Genetska raznolikost med varietetami je bila nizka, kar pripisujejo dejstvu, da gre za ekstenzivno gojeno zelenjadnico in ni bilo prisotnega žlahtnjenja. V raziskavi so ugotovili, da se skupine, razporejene glede na RAPD analizo skladajo s skupinami razporejenimi glede na morfologijo, RAPD markerji pa so pomagali morfološko skupino razdeliti na podskupine.
Pri uporabi AFLP (angl. amplified fragment length polymorphism) markerjev gre za PCR metodo, kjer se kot marker uporablja polimorfizem dolžin pomnoženih fragmentov. Z uporabo restrikcijskih encimov DNA razrežemo, dodamo adapterje in začetne oligonukleotide, ter s PCR tehnologijio pomnožimo odseke, kjer so se začetni oligonukleotidi vezali (Liu in Cordes, 2004). Christensen in sod. (2010) so v raziskavi uporabili AFLP markerje za ugotavljanje genetske raznolikosti med in znotraj gojenih ter divjih populacij listnega ohrovta. Z AFLP markerji niso mogli določiti kraja izvora, prav tako niso opazili razlik med gojenimi in divjimi populacijami listnega ohrovta. Z analizo molekularne variance (angl. analysis of molecular variance – AMOVA) so ugotovili 62 % genetsko raznolikost znotraj populacije. El-Esawi in sod. (2015) so raziskovali genetsko raznolikost 25 genskih virov Brassica oleracea L. Z uporabljenimi AFLP markerji so uspeli razlikovati med posameznimi vrstami. Študija je pokazala, da sta cvetača in zelje genetsko bolj povezana med seboj kot pa z listnim ohrovtom. Dokazali so večjo genetsko raznolikost znotraj genskih virov in manjšo raznolikost med genskimi viri. Maggioni in sod. (2014) so s pomočjo AFLP markerjev prišli do podobnih ugotovitev glede genetske raznolikosti med in znotraj posameznega genskega vira. Poleg tega so se divje populacije genetsko jasno
razlikovale od gojenih populacij. Z uporabo AFLP markerjev niso mogli določiti geografskega izvora akcesij.
Polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov (angl. restriction fragment length polymorphism – RFLP) je bil prvi uporabljen molekulski marker, še pred tehnologijo PCR.
Princip metode je razrez genomske DNA z uporabo restrikcijskih encimov, nanos na gel in prenos na najlonsko ali nitrocelulozno membrano oz. Southern-ov prenos, kjer na fragmente prilegajo fluorescentno označene sonde (Liu in Cordes, 2004). Song in sod. (1988) so opravili analizo z RFLP markerji na različnih vrstah rodu Brassica. Ugotovili so, da naj bi Brassica oleracea izvirala iz divjega prednika ali zelo sorodne vrste z devetimi kromosomi.
Z RFLP analizo so razločili posamezne vrste med seboj in znotraj vrst določili posamezne podskupine. Ugotovili so, da so vse tri alotetraploidne vrste na filogenetskem drevesu locirane med diploidni vrsti, iz katerih izhajajo. V drugi raziskavi so Song in sod. (1988) izhajali iz prve raziskave in ugotovili, da imajo genski viri s podobno morfologijo podobne vzorce pri RFLP analizi. Prišli so do sklepa, da je filogenetska razvrstitev genskih virov na podlagi samo ene kombinacije encimov in označevalnih sond nepopolna, saj imajo nekateri fragmenti večji vpliv na filogenetsko razvrstitev kot drugi. V tretji raziskavi so Song in sod.
(1990) raziskovali evolucijo genoma in filogenetsko razvrstitev več vrst rodu Brassica s pomočjo RFLP markerjev. Ugotovili so, da gojene akcesije vrste Brassica oleracea izhajajo iz skupnega divjega prednika, kot možnost skupnega prednika pa omenjajo še Brassica aboglabra ali kitajski ohrovt. Različne podvrste ohrovtov sestavljajo visoko raznoliko skupino in predstavljajo začetne morfotipe iz katerih predvidevajo, da so se razvili brokoli, cvetača in ostale podvrste. Ugotovili so, da je zelje genetsko bolj sorodno ohrovtu, cvetača pa brokoliju. Rezultati omenjene raziskave kažejo, da sta za diploidne vrste možne dve različni evolucijski poti.
2.4.2 Uporaba SSR markerjev v genetskih analizah
Mikrosateliti ali kratke tandemske ponovitve (angl. short tandem repeats) oz. enostavne sekvenčne ponovitve (angl. simple sequence repeats – SSRs) so 2–10 bp dolga ponovljiva nukleotidna zaporedja, ki so sestavni del genoma (Ciofi in sod., 1998). Pomembna lastnost mikrosatelitov, ki jih loči od večine molekulskih markerjev je ta, da se v PCR pomnožujejo predhodno poznane sekvence (lokusi) DNA, ki so določene z nukleotidnim zaporedjem začetnih oligonukleotidov. Odlikuje jih visoka pogostnost pojavljanja in enakomerna razporejenost v genomih evkariontov, so kodominatni, hipervariabilni, visoko polimorfni in zato tudi zelo informativni (Štajner, 2010). Prednosti so še, da je pridobivanje genetskega materiala neinvazivno, prav tako že obstaja veliko različnih PCR protokolov, ki so v splošni uporabi. Uporabljamo lahko označene ali neoznačene začetne oligonukleotide, za prikaz PCR rezultatov pa se uporablja elektroforeza (Ciofi in sod., 1998).
Mikrosatelite delimo na popolne (sestavljeni samo iz enega motiva osnovne ponovitve, ki se ponavlja brez prekinitve, npr.: ctctctctctctctctctctct), nepopolne (ena ali več ponovitev vsebuje bazo, ki ne odgovarja osnovnemu motivu ponovitve, npr.: ctctctctgtctctct), prekinjene (vsebujejo krajšo insercijo baznih parov, ki se ne ujemajo z osnovnim motivom ponovitve, npr.: ctctctctctgggctctctct) in sestavljene (vključujejo dva ali več mikrosatelitov, ki pa se med seboj razlikujejo po tipu ali motivu ponovitve, npr.: ctctctctctctgatgatgatgat) (Štajner, 2010).
Ničti aleli in homoplazija onemogočajo genotipizacijo z uporabo mikrosatelitnih markerjev.
V obrobnih regijah mikrosatelitskih lokusov pogosto nastajajo mutacije in posledica tega je lahko nastanek ničtih alelov. Lažna smrt mikrosatelita se lahko pojavi kadarkoli in je posledica nukleotidnih substitucij, insercij ali delecij, ki nastanejo v obrobnih regijah, zaradi česar začetni oligonukleotidi ne prepoznajo mest prileganja. Rezultat takšnega procesa so ničti aleli, ki se lahko ustalijo v populaciji. Posledica lažne smrti mikrosatelita so številni na videz neuspeli poskusi pomnoževanja lokusov med vrstami. Obstoj ničtih alelov lahko dokažemo tako, da naredimo nove začetne oligonukleotide, ki se prilegajo na drugem mestu obrobne regije mikrosatelita, ki ni bil podvržen mutaciji ali pa ga lahko odkrijemo z analizo segregacije križancev (Štajner, 2010). V populacijskih študijah uporabljamo Hardy-Weinberg-ovo pravilo za iskanje ničtih alelov, vendar je to samo ocena, so še drugi razlogi za pojave odstopanja od pričakovanj pojava alelov (Chapuis in Estoup, 2007).
Mikrosateliti so običajno na osnovi različne strukture in zgodovine nastanka različno dolgi, vendar pa obstajajo tudi aleli enake dolžine, ki so strukturno in evolucijsko popolnoma različni. Ta pojav imenujemo homoplazija. Na genskem nivoju je homoplazija torej pojav, ko sta dva alela identična po svoji pojavni obliki oz. dolžini, ne pa tudi po izvoru (Estoup in sod., 2002). Problem je v tem, da se variabilnost mikrosatelitov običajno vrednoti po dolžinah pomnoženih PCR fragmentov. Tako lahko gre pri alelih enake dolžine bodisi za homoplastične, bodisi za homologne alele, kar iz same dolžine ni moč razbrati. Seveda pa je pri potencialni zamenjavi pojava interpretacija rezultatov lahko napačna (Štajner, 2010).
Lotti in sod. (2018) so opravili raziskave s SSR markerji na listnem ohrovtu iz območja južne Italije. Uporabili so 12 SSR markerjev in določili genetsko raznolikost. Na podlagi rezultatov so ugotovili, da so opazovane in pričakovane heterozigotne vrednosti približno enake, kar ustreza dejstvu, da je listni ohrovt tujeprašna rastlina in ima majhen inbriding.
Prav tako so poročali o večji genetski raznolikosti znotraj genskega vira kot med njimi.
Raznolikost med genskimi viri lahko nakazuje na fiksacijo nekaterih alelov znotraj posameznega genskega vira. Sarikamis in sod. (2010) so uporabili samo en SSR marker imenovan O112FO2. Marker naj bi pomnoževal odsek DNA, pomemben za tvorbo metilsulfonilalkil glukozinolatov in naj bi bil uporaben pri selekciji s pomočjo markerjev (angl. marker assisted selection – MAS). Rezultati analize so pokazali, da je marker O112FO2 polimorfen in pričakovane dolžine 200–250 bp. Nekateri genski viri imajo le po
eno obliko markerja, nekateri obe obliki in te so določili kot heterozigotne za uporabljen marker. Omenili so možnost, da se lahko zaradi velike sorodnosti znotraj rodu Brassica ta marker uporablja tudi pri drugih vrstah. El-Esawi in sod. (2016) so uporabili 12 različnih SSR markerjev na različnih podvrstah Brassica oleracea. Dokazali so, da je znotraj genskih virov višja heterozigotnost kot med njimi. Z uporabo SSR markerjev so lahko razlikovali med posameznimi genskimi viri in podvrstami. Opazovana heterozigotnost je bila višja od pričakovane pri vseh genskih virih. Informacijska vrednost polimorfizma (angl.
polymorphic information content – PIC) ovrednoti informativnost markerja. Gre za izračunano vrednost, pri kateri z markerjem nedvoumno določimo genetsko identiteto posameznika, vključuje pa tako število alelov odkritih na posameznem lokusu kot tudi frekvence posameznih alelov (Štajner, 2010). V raziskavi so potrdili, da je 10 SSR markerjev primernih za razločevanje med akcesijami Brassica oleracea, saj je bil PIC > 0,5 (El-Esawi in sod., 2016). Sicer je bila tudi na KIS opravljena doktorska disertacija, kjer so z uporabo 45 SSR markerjev vrednotili genetsko raznolikost vseh pojavnih oblik vrste Brassica napus in njenih spolno kompatibilnih sorodnikov v Sloveniji (Pipan, 2013).
2.4.3 Novejše genetske analize
Naslednja generacija sekvenciranja (angl. next generation sequencing – NGS) ali druga generacija sekvenciranja so različne metode hkratnega (angl. massively parallel analysis) sekvenciranja več tisoč ali milijonov kratkih molekul DNA (Liu in sod., 2012). Metode temeljijo na sekvenciranju s sintezo (angl. sequencing by synthesis – SBS), kar pomeni, da zaznavamo posamezne dodane baze. Prevladujejo tri različne metode: pirosekvenciranje, sekvenciranje z ligazo in ciklična reverzibilna terminacija s fluorescenčno označenimi nukleotidi (Shendure in sod., 2017). Dolžina odčitkov je od 35 do 400 bp (Pareek in sod., 2011). Ko so zbrani vsi odčitki molekule DNA imamo dve možnosti, lahko jih poravnamo z že znano sekvenco ali pa s kratkimi prekrivajočimi odčitki sestavimo genom. Kljub visoki natančnosti prebranih oz. določljivih sekvenc, težko sestavimo daljše sekvence DNA v območjih, kjer se neka sekvenca ponavlja, saj zaradi kratke dolžine odčitkov ne poznamo točnega prekrivanja posameznih odčitkov in tako težko določimo točno dolžino sekvence.
Deli DNA z nizko ali visoko vsebnostjo nukleotiodv G in C se slabše pomnožujejo in tako imamo lahko zmotno predstavitev o dolžini ali prisotnosti takih sekvenc (Metzker, 2010).
Najnovejše je sekvenciranje tretje generacije. To je sekvenciranje DNA molekule brez predhodne PCR pomnožitve (Schadt in sod., 2010). Prevladujeta dva pristopa sekvenciranja:
tehnologija sekvenciranja eno-molekulske DNA v realnem času (angl. single-molecule real-time sequencing – SMRT) in sekvenciranje z nanoporami. Odčitki so daljši od 1000 bp, tako da je sestavljanje genoma lažje (Schadt in sod., 2010; Shendure in sod., 2017). Referenčni genom so z uporabo NGS najprej določili pri kitajskem zelju Brassica rapa (Wang in sod., 2011), kasneje pa še pri glavnatem zelju Brassica oleracea var. capitata (Liu in sod., 2014).
Genom Brassica oleracea je v primerjavi z genomom Brassica rapa večji, prav tako vsebuje
več protein kodirajočih genov (Sharma in sod., 2014). S pomočjo NGS metod in ustrezne analitike rezultatov so do sedaj uspeli odkriti veliko število mikrosatelitnih markerjev, ki bi bili primerni za razlikovanje med vrstami in podvrstami ter bi lahko pomagali pri selekciji z uporabo markerjev (Li in sod., 2010; Izzah in sod., 2014; Ding in sod., 2015; Taheri in sod., 2018).
3 MATERIALI IN METODE