KAJ SMO MERILI?

3.2.1 Optične lastnosti (presevnost in odbojnost)

Meritve optičnih lastnosti so bile opravljena na po dveh listih iz pod-vzorcev iz prvega in drugega vzorčenja. V laboratorij smo v vedrih z nekaj vode prinesli cele, sveže nabrane rastline, od katerih smo odtrgali liste ter jih do merjenja hranili na navlaženi brisači, pokrite z aluminijasto folijo.

Presevne in odbojne spektre smo izmeril s spektrometrom Jaz Modular Optical Sensing suite (Ocean Optics, Inc., Florida, ZDA). Spektrometer smo z optičnim kablom povezali z sfero ISP-30-6 (Ocean Optics, Inc., Florida, ZDA). Za svetlobni vir je bila uporabljena UV-VIS-NIR (DH-2000, Ocean Optics, Inc., Florida, ZDA). Pred začetkom merjenja je bila naprava umerjena z belim standardom na 100 % in s popolno temo na 0 % odbojnosti.

Odbojnost smo izmeril na način, da je svetlobni žarek presvetlil list z zgornje strani, tako kot svetloba v naravi liste navadno obseva z zgornje strani. Pri meritvah presevnosti je svetlobni žarek vstopil skozi zgornjo in izstopil skozi spodnjo povrhnjico. Pri merjenju smo se izogibali listnim žilam in robnim delom lista. Izmerili smo valovne dolžine med 189,126 in 1031,827 nm z optično resolucijo 0,46 nanometrov.

3.2.2 Biokemijske meritve

3.2.2.1 Klorofili in karotenoidi

Vsebnost klorofilov a, klorofila b in karotenoidov, smo določil po metodi Lichtenthaler in Buschman (2001a, 2001b). Vzorce z znano maso in površino smo strli v terilnici, jih ekstrahirali v 5 ml 100 % acetona (v/v) in jih centrifugirali (4000 rpm, 4 °C, 4 min). Odčitali smo volumen supernatanta in ga prelili v kiveto. Z UV/VIS spektrofotometrom (Lambda 25, Perkin-Emler, Norwalk, CT, ZDA) smo izmeril absorpcijo pri valovnih dolžinah 470, 645 in 662 nanometrov. Vsebnosti klorofila a (3), klorofila b (4) in karotenoidov (5) smo, s pomočjo spodnjih enačb, izrazili na suho maso vzorca.

Kl a [mg/g ss] = ca * V / ss = (11,24 E662 - 2,04 E645) * V / ss …(3) Kl b [mg/g ss] = cb * V / ss = (20,13 E645 - 2,04 E662) * V / ss …(4) Kar [mg/g ss] = (20,13 E470 -1,9 ca - 63,14 cb) * V / ss / 214 …(5) ca, cb = koncentracija klorofila a, oziroma klorofila b

V = volumen ekstrakta [ml]

Ss = suha masa vzorca [g]

E = absorpcija pri izbrani valovni dolžini

3.2.2.2 Antociani

Vsebnost antocianov v vzorcih smo določil po Drumm-u in Mohr-u (Drumm in Mohr, 1978 cit. po Khare in Guruprasad, 1993). Sveže vzorce listov z znano maso in površino smo strli v terilnici in jih ekstrahirali v 10 mL ekstrakcijskega medija (metanol : 37 % HCl = 99:1 (v/v)), centrifugirali (4000 rpm, 4 °C, 4 min; Sigma 2-16 PK, Nemčija) in odčitali prostornine ekstraktov. Z VIS spektrofotometrom (Lambda 25, Perkin-Elmer, Norwalk, CT, ZDA) smo izmeril absorpcijo pri valovni dolžini 530 nanometrov. Vsebnost antocianov na suho maso vzorca smo izrazili v relativni enoti (6).

Ant (relativna enota) = E530 · V· ss^-1 …(6) E530 - absorpcija pri valovni dolžini 530 nm

V - prostornina ekstrakta [mL]

ss - suha masa [g] oz. P- površina vzorca [cm^-2]

3.2.2.3 UV absorbirajoče snovi

Vsebnost UV-B in UV-A absorbirajočih snovi (UV-B 280-320 nm, UV-A 320-400 nm) smo določili po Caldwellu (1968). Sveže vzorce listov z znano maso in površino smo strli v terilnici in jih ekstrahiral v 10 mL ekstrakcijskega medija (metanol : destilirana voda : 37 % HCl = 79:20:1 (v/v/v)). Sledila je 20 minutna inkubacija in centrifugiranje (4000 rpm, 10

°C, 10 min; Sigma 2-16 PK, Nemčija). Po končanem centrifugiranju smo odčital prostornine ekstraktov in z UV/VIS spektrofotometrom (Lambda 25, Perkin-Elmer, Norwalk, CT, ZDA) izmerili absorpcijo pri valovnih dolžinah od 280 do 400 nm z optično resolucijo 1 nanometer.

Pri tem smo uporabil kiveto izdelano iz kvarčnega stekla, ki dobro prepušča UV svetlobo (>85 %).

Vsebnosti UV absorbirajočih snovi smo izračunali kot integral absorpcijskih vrednosti od 280 do 320 nm (UV-B) ter od 320 do 400 nm (UV-A). Vsebnost UV-absorbirajočih snovi je izražena na suho maso vzorca v relativnih enotah (7).

UV abs (relativna enota) = I · V · ss^-1 …(7) I - integral absorpcijskih vrednosti v intervalu 280 - 320 nm (UV-B abs) ter 320 - 400 nm (UV-A abs)

V - prostornina ekstrakta [ml]

ss - suha masa [g]

* Integral absorpcijskih vrednosti je seštevek vseh dobljenih vrednosti v določenem intervalu.

3.2.2.4 Koncentracija rutina v listih, semenih brez luščin in luščinah semen (HPLC)

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) je separacijska tehnika, ki temelji na porazdelitvi vzorca med tekočo mobilno fazo in stacionarno fazo (Vombergar, 2020).

V 10 ml centrifugirke smo natehtali 80 mg liofiliziranega in zmletega vzorca. Dodali smo jim 8 ml 80 % metanola (HPLC čistosti). Vzorce smo premešal ter jih 10 min inkubirali v ultrazvočni kopeli. Po končani inkubaciji smo vzorce centrifugirali (6 min, 4000 rpm, pri sobni temperaturi; Sigma 2-16 PK, Nemčija), odlili supernatant in ga prefiltrirali (celuloza

acetat filter, pore 0,2 µm). Ekstrakte v vialah smo do merjenja koncentracije rutina hranili v hladilniku.

Vsebnost rutina in kvercetina v vzorcih smo pomerili z Luna Omega Polar 5 μm C18 250 x 4,6 mm (Phenomex). Uporabili smo separacijski modul Waters 2695 in detektor 2996 PDA.

Mobilna faza je vsebovala acetonitril (A) 0,1 % fosforno kislino in ddH20 (B). Gradientna elucija je potekala: 0-1 min izokratska elucija (20 % A in 80 % B) ter 1-5 min zvezna (gradientna) elucija (25 % A in 75 % B), 5-15 min (30 % A in 70 % B) and 20-25 min (40

% A in 60 % B). Volumen vzorcev je bil 10 µL, tok skozi kolono (30 °C) je tekel s hitrostjo 1 mL/minuto. Detekcijo smo izvedli pri valovnih dolžinah 265 nm (rutin) in 372 nm (kvercetin). Meja detekcije rutina in kvercetina v vzorcih je bila 1 mg/mL, meja kvantifikacije pa 3,6 mg/mLza vsebnost rutina in 3,3 mg/mL za vsebnost kvercetina.

3.2.3 Morfološke meritve

3.2.3.1 Višina rastlin

Višino nadzemnega dela rastlin, zajetih v vzorec, smo opravil s tračnim merilnikom na mestu vzorčenja.

3.2.3.2 Suha masa nadzemnih delov rastlin (listi, steblo, cvetovi, semena)

Iz rastlin, zajetih v vzorcih, smo ostranili liste, cvetove in semena ter jih, skupaj s stebli, shranili v ločene papirnate vrečke. Pred tehtanjem smo jih 48 ur sušili v pečici pri temperaturi 40 °C. Pri semenih smo poleg mase zabeležili tudi število semen v posameznem podvzorcu (pet rastlin).

Slika 7: Napolnjena semena, prazna semena in ostanki cvetov petih rastlin. Foto: Miha Medvešek

3.2.4 Analiza tal

V primeru opravljenega eksperimenta količina hranil v prsti zaradi izbranega objekta proučevanja in dejstva, da gre za gojeno rastlino, ni pogojena z nadmorsko višino. Sestava prsti v našem poskusu ni bila kontrolirana in je bila pogojena z lokacijo. Na vsaki lokaciji so drugačne naravne danosti, vključno s sestavo prsti. Na Oddelku za agronomijo Biotehniške fakultete, v katedri za pedologijo, smo dobili podatke o sestavi in teksturi prsti s posameznih lokacij.

3.2.5 Meteorološki podatki

Meteorološke podatke sem pridobil na uradni strani Agencije RS za okolje.

3.2.6 Opis statističnih metod

Pripravo podatkovnih tabel smo opravili s programom Microsoft Office Excel. Podatke smo analizirali in grafično predstavili s pomočjo programa R. Za testiranje hipotez smo uporabili metodi f-test in enosmerna ANOVA.

4 REZULTATI

4.1 VSEBNOST RUTINA IN KVERCETINA V RAZLIČNIH DELIH NAVADNE IN