UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO Ljubljana, 2021 GISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM INDUSTRIJSKA FARMACIJA MA MAGISTRSKA NALOGA KATJA PIKL

FAKULTETA ZA FARMACIJO

KATJA PIKL

MAGISTRSKA NALOGA

MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM INDUSTRIJSKA FARMACIJA

Ljubljana, 2021

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

KATJA PIKL

PROUČEVANJE TEHNOLOGIJE IZDELAVE IN LASTNOSTI HIDROFILNIH NANOVLAKEN S SLABO VODOTOPNIMI ZDRAVILNIMI UČINKOVINAMI INVESTIGATION OF TECHNOLOGICAL PRODUCTION PROCEDURE AND

CHARACTERISTICS OF POORLY WATER-SOLUBLE DRUG-LOADED HYDROPHILIC NANOFIBERS

MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM INDUSTRIJSKA FARMACIJA

Ljubljana, 2021

Zahvala

Posebno zahvalo namenjam mentorici izr. prof. dr. Petri Kocbek za vse koristne nasvete in pomoč pri pisanju magistrske naloge ter strokovni pregled končnega dela.

Hvala tudi moji družini, fantu in vsem prijateljem za vso podporo, spodbudne besede in razumevanje v času nastajanja magistrske naloge in vsa leta študija.

Izjava

Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom izr. prof. dr. Petre Kocbek, mag. farm.

Katja Pikl

Komisija za zagovor:

Predsednica komisije: prof. dr. Anamarija Zega, mag. farm.

Mentorica: izr. prof. dr. Petra Kocbek, mag. farm.

Član komisije: izr. prof. dr. Simon Žakelj, mag. farm.

Ljubljana, 2021

I

Kazalo vsebine

Povzetek………...…………...III Abstract………...IV Seznam okrajšav………..V

1 Uvod ... 1

1.1 Izboljšanje topnosti in hitrosti raztapljanja slabo topnih zdravilnih učinkovin ... 1

1.1.1 Topnost, hitrost raztapljanja in biofarmacevtski klasifikacijski sistem ... 1

1.1.2 Metode izboljšanja topnosti in hitrosti raztapljanja ... 3

1.2 Nanovlakna ... 5

1.2.1 Definicija nanovlaken ... 5

1.2.2 Materiali za izdelavo nanovlaken ... 6

1.2.3 Metode izdelave nanovlaken ... 8

1.2.4 Načini vrednotenja izdelanih nanovlaken... 11

2 Namen dela ... 13

3 Metode dela ... 14

4 Rezultati in razprava ... 16

4.1 Metodologija iskanja ustreznih literaturnih virov ... 16

4.2 Analiza obravnavanih literaturnih virov ... 17

4.3 Pregled zdravilnih učinkovin, ki so jih vgrajevali v nanovlakna ... 18

4.4 Analiza sestave nanovlaken ... 20

4.5 Pregled topil za pripravo raztopin za elektrostatsko sukanje ... 23

4.6 Pregled dodanih pomožnih snovi ... 25

4.7 Sestava formulacij nanovlaken in vsebnost zdravilne učinkovine v nanovlaknih ... 27

4.8 Pregled metod izdelave nanovlaken ... 28

4.9 Morfologija izdelanih nanovlaken ... 32

4.10 Kristalna oblika zdravilne učinkovine v nanovlaknih ... 36

4.11 Izboljšanje topnosti in hitrosti raztapljanja zdravilnih učinkovin ... 39

4.12 Združevanje različnih dostavnih sistemov z nanovlakni in izdelava končne farmacevtske oblike 46 4.12.1 Nanovlakna kot končna farmacevtska oblika ali vmesna stopnja pri njeni izdelavi ... 47

4.12.2 Zmanjšanje stranskih učinkov zdravilne učinkovine z vgrajevanjem v nanovlakna ... 47

5 Sklepi ... 49

6 Viri in literatura ... 51 7 Priloga ... I

II

Kazalo slik

Slika 1: Shematski prikaz metod za izboljšanje topnosti in/ali hitrosti raztapljanja težko topnih ZU. ... 4 Slika 2: Shematski prikaz osnovnih delov naprave za elektrostatsko sukanje. (A) batna tlačilka, (B) brizga, (C) polimerna raztopina ali raztopina drugega ustreznega materiala ali talina polimera, (D) vir visoke električne napetosti, (E) elektroda pritrjena na prevodno šobo/iglo, (F) ozemljeno zbiralo (14). 8 Slika 3: Shematska razdelitev parametrov, ki vplivajo na lastnosti elektrostatsko sukanega produkta.

Puščica ↑ ali ↓ pomeni, da se premer NV poveča/zmanjša, če povečamo dotični parameter (7). ... 9 Slika 4: Prikaz dovoda plina pod tlakom in sestavnih delov naprave za izdelavo NV s PG. ... 11 Slika 5: Diagram, ki prikazuje proces iskanja ustreznih literaturnih virov (raziskovalnih znanstvenih člankov). ... 16 Slika 6: Število raziskovalnih znanstvenih člankov, objavljenih v posameznem letu, v obdobju od leta 2012 do 2021 (Iskalnik: Pubmed). ... 17 Slika 7: Razdelitev ZU, ki so jih vgrajevali v NV, glede na terapevtsko skupino, število različnih ZU iz posamezne terapevtske skupine in število raziskovalnih člankov, ki so obravnavali vgrajevanje ZU iz določene terapevtske skupine. ... 19 Slika 8: Razvrstitev ZU, ki so jih vgrajevali v NV, v razrede glede na klasifikacijo BCS. ... 20 Slika 9: Število proučevanih formulacij za posamezen material, ki je bil uporabljen kot ogrodje NV. 21 Slika 10: Teoretična vsebnost ZU v analiziranih formulacijah NV. ... 27 Slika 11: Shematski prikaz tvorbe inkluzijskih kompleksov ZU s CD in nadaljnje ES ter izdelava NV (prirejeno po (46)). ... 31 Slika 12: Kristalna oblika ZU v proučevanih formulacijah NV. ... 37 Slika 13: Faktor izboljšanja raztapljanja ZU, ki je vgrajena v NV, v primerjavi s samo ZU ali fizikalno zmesjo ZU in gradnikov NV (faktor smo lahko določili za raziskave objavljene v 29 člankih, v ostalih raziskovalnih člankih ni bilo ustreznih podatkov za izračun faktorja). ... 41

Kazalo preglednic

Preglednica I: Stopnje topnosti kot jih podaja Evropska farmakopeja in Formularium Slovenicum. .... 2 Preglednica II: Vrste pomožnih snovi, glede na njihovo funkcijo v formulaciji za izdelavo NV. ... 25 Preglednica III: Metode izdelave NV in njihova pogostost uporabe (glede na opis v proučevanih raziskovalnih člankih). ... 29 Preglednica PI: Pregled raziskovalnih člankov in nabor podatkov, ki so bili osnova za pripravo magistrske naloge. Modra barva: izračunana teoretična količina vgrajene ZU. Zelena barva: odčitani podatki o deležu raztopljene ZU v določenih časovnih točkah raztapljanja iz profila raztapljanja.

Oranžna barva: izračunan faktor izboljšanja raztapljanja v primerjavi s samo ZU ali njeno fizikalno zmesjo………....I

III

Povzetek

V zadnjih letih se povečuje delež novo odkritih zdravilnih učinkovin, ki izkazujejo slabo vodotopnost, kar močno otežuje razvoj zdravil. Nanovlakna zaradi svojih izjemnih lastnosti omogočajo, da se vgrajena slabo topna zdravilna učinkovina veliko bolje raztaplja v primerjavi s samo učinkovino. Namen magistrske naloge je bil proučiti tehnologije izdelave in lastnosti hidrofilnih nanovlaken z vgrajenimi slabo topnimi zdravilnimi učinkovinami. Po pregledu objavljenih člankov v podatkovni zbirki Pubmed smo našli 47 člankov, ki so ustrezali kriterijem za vključitev v raziskavo. Po analizi izbranih člankov smo ugotovili, da so raziskovalci poskušali izboljšati topnost različnim zdravilnim učinkovinam, med njimi so glede na terapevtsko področje prevladovale učinkovine s protivnetnim in protirevmatičnim delovanjem in glede na biofarmacevtski klasifikacijski sistem učinkovine iz razreda II. Za ogrodje nanovlaken so najpogosteje uporabili različne polimere in ciklodekstrine.

Najpogosteje uporabljena polimera za izdelavo nanovlaken sta bila polivinilpirolidon in polietilenoksid. V nanovlakna so vgradili različne dežele zdravilne učinkovine: najpogosteje 10 % (m/m), pri 50 % (m/m) ali več pa se je potencialno pojavilo obarjanje raztopljene učinkovine. Z namenom dodatnega izboljšanja raztapljanja, povečanja procesibilnosti formulacije za izdelavo nanovlaken in zaščito vgrajene učinkovine so v formulacije vključili različne pomožne snovi, najpogosteje solubilizatorje. Za izdelavo nanovlaken so najpogosteje izbrali elektrostatsko sukanje, z modifikacijami klasične metode pa so uspeli izdelati kompleksnejša nanovlakna z izboljšanimi lastnostmi, hkrati pa so te metode omogočile proizvodnjo nanovlaken v večjem merilu. V več kot 70 % raziskav je med izdelavo nanovlaken prišlo do pretvorbe zdravilne učinkovine v stabilno amorfno obliko, kar je eden izmed pomembnejših razlogov za povečanje topnosti vgrajene učinkovine. Faktor izboljšanja raztapljanja v primerjavi s kristalno obliko učinkovine ali njeno fizikalno zmesjo je bil za večino formulacij najmanj 1, za kar je zaslužna velika specifična površina na enoto mase in porozna struktura mreže nanovlaken ter amorfna oblika vgrajene zdravilne učinkovine.

Raziskovalci so večkrat izdelali oblike s takojšnjim sproščanjem kot s prirejenim, v 4 raziskavah so izdelali tudi končno farmacevtsko obliko. Zaključimo lahko, da hidrofilna nanovlakna predstavljajo obetaven pristop za izboljšanje topnosti in hitrosti raztapljanja slabo topnih zdravilnih učinkovin, vendar so za njihov prodor na trg in razširjeno uporabo potrebne še nadaljnje raziskave.

Ključne besede: elektrostatsko sukanje, nanodostavni sistemi, nanovlakna, raztapljanje, topnost

IV

Abstract

In recent years, more and more newly discovered active pharmaceutical ingredients have poor water solubility, which makes further drug development challenging. Nanofibers, due to their remarkable properties, enable better dissolution of the incorporated poorly soluble drug compared to the pure drug. The aim of this master thesis was to investigate the technological procedures and characteristics of poorly water-soluble drug-loaded hydrophilic nanofibers.

After reviewing the Pubmed database for published articles, we found 47 articles that met the inclusion criteria. The analysis of the selected articles revealed that scientists have tried to improve solubility of different active pharmaceutical ingredients, many of which belong to the therapeutic group of anti-inflammatory and anti-rheumatic drugs and to class II biopharmaceutical clasification system. Most commonly used materials for production of nanofibers were different polymers and cyclodextrins. Most commonly represented among polymers were polyvinylpyrrolidone and polyethyleneoxide. Nanofibers were loaded with different amounts of drug: most often 10 % (w/w), whereas precipitation of the dissolved drug may occur at drug content 50 % (w/w) or more. Various excipients, most commonly solubilizers, were incorporated to further improve the drug dissolution, increase the processability of the nanofiber formulation, and protect the incorporated drug.

Electrospinning has been the most common method used to produce nanofibers. With modifications of the conventional method, scientiest have been able to produce more complex nanofibers with improved properties and to produce nanofibers on larger scale. In more than 70 % of the studies, the drug was converted into stable amorphous form during nanofiber fabrication, which was one of the most important reasons for incresed drug solubility. The dissolution enhancement factor was at least 1 in most formulations compared to the crystalline drug or its physical mixture. This is due to the high specific surface area per unit mass and the porous structure of the nanofiber web, as well as the amorphous form of the incorporated drug. The scientists have more often produced immediate-release rather than modified-release dosage forms. In four studies they have also produced final dosage form.

In conclusion, hydrophilic nanofibers represent a promising approach to improve the solubility and dissolution rate of poorly water-soluble drugs, however further research is still needed for their market entry and widespread use.

Key words: dissolution, electrospinning, nanodelivery systems, nanofibers, solubility

V

Seznam okrajšav

BCS biofarmacevtski klasifikacijski sistem (angl. Biopharmaceutics Classification System)

CD ciklodekstrini

CMC karboksimetilceluloza DMF dimetilformamid ES elektrostatsko sukanje FO farmacevtska oblika

FTIR Infrardeča spektroskopija s Fourierjevo transformacijo (angl. Fourier- Transform Infrared Spectroscopy)

HP-βCD hidroksipropil-β-ciklodekstrin HPC hidroksipropilceluloza

HPMC hidroksipropilmetilceluloza

HPMCAS hidroksipropilmetilceluloza acetat sukcinat

NV nanovlakna

PAS površinsko aktivna snov PEO polietilenoksid

PG sukanje pod vplivom centrifugalne sile in visokega tlaka (angl. Pressurised Gyration)

PVA polivinilalkohol PVP polivinilpirolidon

PXRD praškovna rentgenska analiza (angl. Powder X-Ray Diffraction) SBE 7-βCD sulfobutil eter (7)-β-ciklodekstrin

SEM vrstična elektronska mikroskopija (angl. Scanning Electron Microscopy) SDS natrijev dodecilsulfat

SOL Soluplus

TEM presevna elektronska mikroskopija (angl. Transmission Electron Microscopy) ZU zdravilna učinkovina

1

1 Uvod

1.1 Izboljšanje topnosti in hitrosti raztapljanja slabo topnih zdravilnih učinkovin

Peroralni vnos zdravil je za bolnika najpreprostejši in najbolj zaželen način vnosa, zato je glavni cilj farmacevtske industrije vgradnja zdravilnih učinkovin (ZU) v peroralne farmacevtske oblike (FO). Izdelava teh oblik s slabo topnimi ZU je velik izziv z vidika doseganja ustrezne biološke uporabnosti ZU, saj je le-ta odvisna od številnih dejavnikov kot so topnost, permeabilnost, hitrost raztapljanja in predsistemski metabolizem ZU. V zadnjih letih se je izkazalo, da je več kot 70 %, po nekaterih ocenah pa celo 90 % novo odkritih ZU takšnih, ki izkazujejo slabo vodotopnost, kar predstavlja zelo velik izziv v razvoju zdravil. Če je topnost učinkovine manjša od 100 µg/mL, je absorpcija omejena z njeno topnostjo in hitrostjo raztapljanja, saj mora biti ZU na voljo v raztopljeni obliki na mestu absorpcije, da se lahko absorbira. Tako je v primeru izdelave peroralne FO s slabo topno ZU potreben velik odmerek ZU, če želimo doseči željeno plazemsko koncentracijo in terapevtski učinek. Velik odmerek pa je lahko problematičen z vidika izdelave FO, povečanja stroškov proizvodnje in pojava neželenih učinkov. Slaba topnost ZU v vodi tako predstavlja enega največjih izzivov v razvoju in oblikovanju novih zdravil za peroralno uporabo (1, 2).

1.1.1 Topnost, hitrost raztapljanja in biofarmacevtski klasifikacijski sistem

Topnost je lastnost trdne, tekoče ali plinaste snovi in predstavlja maksimalno koncentracijo te snovi, ki pri danem volumnu topila in danih pogojih tvori nasičeno in homogeno raztopino. Topnost snovi je največkrat odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti topila in topljenca, temperature in tlaka. Topnost snovi lahko izrazimo na več različnih načinov.

Podana je lahko kot absolutna topnost (koncentracija topljenca v izbranem topilu pri določenih pogojih) ali opisno kot stopnja topnosti, kakor jo podaja tudi Evropska farmakopeja in Formularium Slovenicum (preglednica I) (2, 3).

2

Preglednica I: Stopnje topnosti kot jih podaja Evropska farmakopeja in Formularium Slovenicum (3).

Opis Volumen topila [mL] na 1 g topljenca

Zelo lahko topen < 1

Lahko topen 1 - 10

Topen 10 - 30

Zmerno topen 30 - 100

Težko topen 100 - 1000

Zelo težko topen 1000 - 10000

Skoraj netopen > 10000

Hitrost raztapljanja je definirana kot hitrost prehoda učinkovine iz trdnega v raztopljeno stanje. Proces raztapljanja ZU opisuje Noyes-Whitneyeva enačba (enačba 1), ki temelji na 1. Fickovem zakonu.

𝑑𝑐

𝑑𝑡

=

ℎ

(c

− 𝑐)

V enačbi dc/dt predstavlja hitrost raztapljanja trdne učinkovine, ki je proporcionalna površini delca učinkovine, ki se raztaplja (A), difuzijskemu koeficientu učinkovine (D) in razliki med topnostjo ZU in koncentracijo raztopljene učinkovine v času t (cs – c) ter obratno sorazmerna debelini difuzijske plasti (h) (1). Na hitrost raztapljanja učinkovine lahko vplivamo s spreminjanjem zgoraj omenjenih parametrov, kar bo predstavljeno v nadaljevanju.

Biofarmacevtski klasifikacijski sistem (BSC) razvršča učinkovine glede na njihovo vodotopnost in permeabilnost ter pomaga pri lažjem odločanju o smeri razvoja nove formulacije. Takšna razdelitev učinkovin omogoča tudi, da se za dokaz bioekvivalence lahko odločimo za izvedbo in vitro testov raztapljanja namesto obsežnih kliničnih študij, če je ZU glede na BCS iz razreda I ali III. Učinkovine so glede na BCS razdeljene v 4 razrede:

 Razred I: dobra topnost in dobra permeabilnost

 Razred II: slaba topnost in dobra permeabilnost

 Razred III: dobra topnost in slaba permeabilnost

 Razred IV: slaba topnost in slaba permeabilnost

3

ZU je dobro topna, ko se največji odmerek raztopi v 250 mL medija, ki je v pH območju med 1,2 in 6,8 pri 37 ± 1ºC. Dobra permeabilnost pa pomeni, da se iz črevesja absorbira več kot 85 % apliciranega odmerka (2). Pri formuliranju novega zdravila ZU iz razreda I glede na BCS načeloma ne povzročajo težav pri doseganju želene biološke uporabnosti, saj je hitrost praznjenja želodca edini dejavnik, ki vpliva na hitrost njihove absorpcije.

Absorpcijo učinkovin iz razreda III glede na BCS omejuje njihova permeabilnost skozi steno prebavnega trakta, ki jo lahko nekoliko izboljšamo z omejenim naborom pristopov.

Večji izziv v razvoju predstavljajo ZU iz razredov II in IV glede na BCS, saj moramo pri teh ZU uporabiti različne fizikalno-kemijske pristope, s katerimi izboljšamo njihovo topnost in/ali permeabilnost ter tako dosežemo ustrezno biološko uporabnost.

Najučinkovitejši in pogosto uporabljeni pristopi za ZU iz razreda II glede na BCS so zmanjšanje velikosti delcev, amorfizacija, tvorba soli in uporaba površinsko aktivnih snovi (PAS) (1).

1.1.2 Metode izboljšanja topnosti in hitrosti raztapljanja

Topnost in hitrost raztapljanja slabo topnih ZU lahko izboljšamo z različnimi fizikalnimi in kemijskimi pristopi (1). Ena od možnih delitev teh pristopov je prikazana na sliki 1. Pri izdelavi optimalne formulacije za izbrano ZU se lahko poslužimo ene ali kombinacije večih metod. Izbira pristopa je v veliki meri odvisna od lastnosti ZU in mesta njene absorpcije, prav tako pa na izbiro vpliva načrtovana končna FO, odmerek, način sproščanja (takojšnje ali prirejeno), izbira pomožnih snovi in regulatorne zahteve. Izbira ustrezne metode za povečanje topnosti ZU je ključ do priprave najbolj optimalne formulacije, s katero bomo dosegli želeno biološko uporabnost, zmanjšali število odmerkov in stroške proizvodnje ter nenazadnje dosegli dobro sodelovanje bolnika pri zdravljenju (1).

4

Slika 1: Shematski prikaz metod za izboljšanje topnosti in/ali hitrosti raztapljanja slabo topnih ZU.

V predformulacijski fazi razvoja zdravil se za izboljšanje topnosti pogosto odločimo za tvorbo soli, kokristalov ali predzdravil. Pri oblikovanju končne formulacije pa se za izboljšanje topnosti in hitrosti raztapljanja uporabljajo metode kot so zmanjšanje velikosti delcev, amorfizacija, kompleksiranje s ciklodekstrini (CD) in uravnavanje pH vrednosti mikrookolja. Mikronizacija delcev ZU je pogosto uporabljena metoda za povečanje medfazne površine med ZU in medijem za raztapljanje in posledično za povečanje hitrosti raztapljanja ZU, kot opisuje Noyes-Whitneyeva enačba (enačba 1). S tvorbo različnih polimorfov ZU lahko izboljšamo topnost, saj imajo le-ti sicer enako kemijsko strukturo, vendar se razlikujejo v razporeditvi molekul v kristalni mreži, kar vpliva na gostoto, temperaturo tališča, topnost in stabilnost ZU. Z vidika stabilnosti je zaželeno, da je ZU v termodinamsko najbolj stabilni obliki, saj se tako izognemo polimorfnim prehodom iz metastabilne v bolj stabilno obliko med samo izdelavo in shranjevanjem končne FO. Po drugi strani pa imajo metastabilni polimorfi višjo energijo in so tako bolje topni. Topnost amorfne oblike je lahko od 1,1- do 1000-krat večja v primerjavi z njeno kristalno obliko. Z izdelavo trdnih disperzij lahko pripravimo stabilno amorfno obliko ZU. CD so oligosaharidi s hidrofobno notranjostjo in hidrofilno zunanjostjo, ki lahko z vgrajevanjem lipofilnih ZU v svojo notranjost povečajo njihovo topnost. Raziskovalci so poročali, da se je z vgrajevanjem ZU v CD biološka uporabnost ZU povečala, saj se površina pod krivuljo

Metode za izboljšanje topnosti slabo

topnih ZU

Fizikalni pristopi

Zmanjšanje velikosti

delcev

Mikronizacija Nanosuspenzija

Modifikacija trdnega stanja

Sprememba polimorfne oblike

Amorfizacija

Tvorba kompleksov

Uporaba PAS Ciklodekstrini

Kemijski pristopi

Tvorba predzdravil Tvorba soli Sprememba

pH

5

(angl. Area Under the Curve) po vnosu kompleksirane v primerjavi s kristalno ali liofilizirano obliko različnih ZU poveča od 1,1- do 46-krat (1).

V zadnjih nekaj desetletjih poskušajo biološko uporabnost slabo vodotopnih ZU povečati z vgradnjo v različne nanodostavne sisteme, kot so npr. polimerni nanodelci, trdni lipidni nanodelci, liposomi, nanovlakna (NV), dendrimeri, nanoemulzije, nanosuspenzije. Ti nanodostavni sistemi omogočajo takojšnje ali prirejeno sproščanje ZU, ciljano dostavo ZU, zmanjšajo neželene učinke in pogostost odmerjanja (4). Hkrati se poveča površina dostavnega sistema, ki je na voljo za raztapljanje, in spremeni kristalna oblika ZU ter tako poveča njena topnost in hitrost raztapljanja. Eden novejših pristopov za izboljšanje topnosti je vgrajevanje slabo topnih ZU v elektrostatsko sukan produkt, kjer se med izdelavo NV ZU lahko pretvori v amorfno obliko, izboljša se njena močljivost, hkrati pa imajo NV zelo veliko površino, ki je v stiku z medijem, kar je ključno za izboljšanje raztapljanja (4).

1.2 Nanovlakna

1.2.1 Definicija nanovlaken

NV so široko raziskovan nanodostavni sistem, ki omogoča lokalno ali sistemsko dostavo ene ali več ZU. Z izbiro primernih polimerov in nadzorom njihovega premera, geometrije in poroznosti lahko spreminjamo kinetiko sproščanja ZU in tako dosežemo takojšnje ali prirejeno sproščanje slabo topnih ZU. Prav tako so NV uporabna na področju biomedicine kot obloge za celjenje ran in tkivni nadomestki, saj so sposobna posnemati osnovne gradnike zunajceličnega ogrodja. NV so trdna vlakna z debelino od nekaj 10 nm do 1000 nm in teoretično neomejeno dolžino. Odlikuje jih predvsem velika specifična površina na enoto mase, velika interfibrilarna poroznost mreže NV, dobre adhezivne lastnosti ter večja prožnost in natezna trdnost v primerjavi z drugimi oblikami istega materiala makrometrskih velikosti (4, 5).

Sestavljena so iz ogrodja, ki ga največkrat tvori en ali več polimerov. Za izdelavo NV polimere raztopimo v ustreznem topilu. Najpogosteje uporabljena topila so: prečiščena voda, etanol, ocetna kislina, tetrahidrofuran, dimetilformamid (DMF), kloroform, aceton in etilacetat. Polimeri se v vodi pogosto ne raztopijo popolnoma, zato jim je potrebno dodati sotopila. Z vidika varnosti in biokompatibilnosti je zaželeno, da kot topilo uporabimo le vodo, saj se tako izognemo zaostankom organskih topil. ZU lahko v NV vgradimo na več načinov (6, 7):

6

 Učinkovino vgradimo med izdelavo NV, tako da pripravimo raztopino/disperzijo ZU in polimera v izbranem topilu ter izdelamo NV z izbrano metodo.

 ZU lahko vežemo na površino izdelanih NV fizikalno (vodikove vezi, hidrofobne in elektrostatske interakcije) ali kemijsko (kovalentna vezava s funkcionalnimi skupinami, kot so karboksilna, hidroksilna, amino skupina).

 Izdelamo lahko večslojna NV (struktura jedro-ovojnica), kjer so NV sestavljena iz dveh ali več različnih polimerov. ZU običajno vgradimo v polimer, ki tvori jedro, zunanji polimer pa določa profil sproščanja ZU. Takšna oblika NV omogoča združitev dveh sicer nekompatibilnih ZU, saj lahko eno vgradimo v jedro, drugo pa v ovojnico dvoslojnih NV.

Znanstveniki so do danes v NV uspeli vgraditi že protivnetne in protirakave učinkovine, učinkovine za zdravljenje kardiovaskularnih bolezni, antihistaminike, kontraceptive, antibiotike, antimikotike, imunosupresive in večje biološke molekule (DNA, RNA, rastne dejavnike). NV so primerna za različne načine aplikacije, npr. oralno (bukalno in sublingvalno), peroralno, rektalno, vaginalno, nazalno, okularno, dermalno in transdermalno (4).

1.2.2 Materiali za izdelavo nanovlaken

Ena ključnih odločitev pri izdelavi NV je izbira ustreznega polimera, ki bo služil kot ogrodje, omogočal takojšnje ali prirejeno sproščanje ZU in hkrati zagotovil ustrezno fizikalno in kemijsko stabilnost vgrajene ZU (5). Uporabimo lahko najrazličnejše polimere naravnega ali sinteznega izvora. Naravni polimeri so primerni za vgradnjo hidrofilnih ZU, saj se lahko veliko predstavnikov polimerov naravnega izvora popolnoma raztopi v vodnih medijih. Njihova glavna pomanjkljivost je, da jih ne moremo uporabiti za izdelavo NV brez dodatka polimera, ki ima sposobnost elektrostatskega sukanja. Poleg tega lahko pride do porušenja strukture NV med njihovo nadaljnjo obdelavo (npr. med prečnim premreževanjem), pri določenih polimerih pa nizka viskoznost polimerne raztopine ovira ali onemogoča proces izdelave NV. Omenjeno težavo lahko rešimo z dodatkom manjše količine hidrofilnega sinteznega polimera, ki poveča viskoznost polimerne raztopine in omogoče izvedbo elektrostatskega sukanja (ES). Glavni prednosti sinteznih polimerov sta njihova sposobnost ES in stroškovna učinkovitost pri proizvodnji. Ena večjih slabosti pa ta,

7

da je za raztapljanje teh polimerov pogosto potrebno dodati organska topila, ki se jim želimo v proizvodnji čim bolj izogniti (6, 7).

Eden najpogosteje uporabljenih hidrofilnih sinteznih polimerov je polivinilpirolidon (PVP), ki izkazuje nizko toksičnost, dobro biokompatibilnost ter topnost v vodi in v večini organskih topil. Je higroskopen polimer, ki lahko veže večjo količino vode (8). Soluplus (SOL) je lastniško ime za vodotopen amfifilni »graft«-kopolimer polivinilkaprolaktama, polietilenglikola in polivinilacetata, ki je bil razvit za pripravo trdnih raztopin slabo topnih ZU, lahko pa se uporablja kot polimerno ogrodje za izdelavo NV. Njegova povprečna molekulska masa je od 90.000 do 140.000 g/mol. Primeren je za ES, lahko tvori micele, izkazuje visok solubilizacijski potencial, vzdržuje koncentracijo slabo topne ZU v raztopini višjo od njene topnosti in preprečuje njeno pretvorbo v kristalno obliko, kar pripomore k izboljšanju topnosti in biološke uporabnosti slabo topnih ZU (5, 9). Polietilenoksid (PEO) je sintezni, linearni in dobro vodotopen polimer, ki ob stiku z vodo nabreka. Izkazuje dobre mukoadhezivne lastnosti, nizko toksičnost in dobro biokomatibilnost (10).

Hidroksipropilmetilceluloza (HPMC) je vodotopen, hidrofilni polimer, ki se uporablja predvsem za izdelavo hidrofilnih ogrodnih tablet in večplastnih NV, saj v stiku z vodo nabreka in tvori plast gela, ki nadzira sproščanje ZU. Poznamo več vrst HPMC, ki se med seboj razlikujejo glede na stopnjo substitucije. Ima visoko temperaturo steklastega prehoda (okrog 155 ºC), kar zagotavlja ustrezno fizikalno in kemijsko stabilnost vgrajene ZU med shranjevanjem. HPMC zavira obarjanje prenasičene (angl. supersaturated) raztopine ZU v mediju, kar lahko poveča biološko uporabnost slabo topnih ZU (9). Eudragit je zaščiteno ime za polimetakrilate, ki se v farmaciji uporabljajo za različne namene. Poznamo različne Eudragite (Eudragit RS100, Eudragit L, Eudragit S100), ki se med seboj razlikujejo glede na pH medija pri katerem se pričnejo raztapljati (11).

V zadnjih letih raziskovalci poskušajo izdelati NV brez polimernega ogrodja. Polimer skušajo zamenjati s CD. Gre za ciklične oligosaharide, v katerih je 5, 6 ali 8 molukul piranoze, ki so povezane z α-1,4-glikozidnimi vezmi. Poznamo α-ciklodekstrine, β- ciklodekstrine in γ-ciklodekstrine. Njihova struktura omogoča tvorbo kompleksov, saj imajo hidrofobno notranjost, v katero lahko nekovalentno vežejo hidrofobne molekule in hidrofilno zunanjost. Občutno povečanje topnosti vgrajenih učinkovin pa je odraz njihove amfifilne strukture. S kemijskimi modifikacijami lahko pripravimo derivate CD (npr.

hidroksipropil-CD, sulfobutil eter-βCD), s čimer dodatno povečamo njihovo vodotopnost.

8

CD so se v zadnjih letih izkazali tudi kot material, ki ga lahko elektrostatsko sukamo in tako izdelamo NV brez polimernega ogrodja (12, 13).

1.2.3 Metode izdelave nanovlaken

Obstaja več različnih metod izdelave NV, kot so metoda risanja (angl. drawing), metoda ločevanja faz (angl. phase separation), modelna sinteza (angl. template synthesis), izpihovanje taline (angl. melt blowing), metoda samozdruževanja (angl. self-assembly) in ES. Običajno je izbira metode pogojena z naravo polimera iz katerega želimo izdelati NV (7). Daleč najpogosteje uporabljena metoda za izdelavo NV je ES, ki je podrobneje predstavljena v nadaljevanju.

1.2.3.1 Elektrostatsko sukanje

ES je vsestranska, enostavna in enostopenjska metoda, pri kateri s pomočjo elektrostatskih sil iz raztopine ali taline polimerov izdelamo trdna NV (6, 7). Zaenkrat se uporablja v raziskovalne namene, omogoča pa tudi neprekinjeno proizvodnjo NV v industrijskem merilu. Naprava za ES je sestavljena iz batne tlačilke, brizge s kovinsko iglo (šobo), vira visoke električne napetosti in ozemljenega zbirala, kot je prikazano na sliki 2.

Slika 2: Shematski prikaz osnovnih delov naprave za ES. (A) batna tlačilka, (B) brizga, (C) polimerna raztopina ali raztopina drugega ustreznega materiala ali talina polimera, (D) vir visoke električne napetosti, (E) elektroda pritrjena na prevodno šobo/iglo, (F) ozemljeno zbiralo (14).

Brizgo, vpeto v batno tlačilko, napolnimo z raztopino/talino polimera, ki teče skozi šobo, ki je priključena na izvor visoke električne napetosti. Generator električnega polja med konico igle in zbiralom ustvari električno polje in uvede naboj v polimerno raztopino. Na konici igle se ustvari nabita kapljica, ki se čez čas zaradi delovanja elektostatskih sil in sil površinske napetosti, preoblikuje v tako imenovan Taylorjev stožec. S povečevanjem električne napetosti, elektrostatske sile premagajo površinsko napetost na kapljici, kar povzroči podaljšanje Taylorjevega stožca in nastanek nabitega curka, ki pospešeno potuje

9

proti ozemljenemu zbiralu. Kot lahko vidimo na sliki 2 curek polimerne raztopine (taline) na poti do zbirala vijuga, saj je podvržen nestabilnosti, kar je posledica elektrostatskih odbojnih sil med enako nabitimi funkcionalnimi skupinami verig polimera. Med potovanjem se curek tanjša in daljša (razteza), hkrati pa izhlapi topilo, ki smo ga uporabili za pripravo raztopine. Na zbiralu se zbirajo trdna NV, katerih urejenost je odvisna od vrste zbirala, ki ga uporabimo. Potek ES in morfologija nastalih NV sta odvisna od številnih parametrov, ki jih v grobem lahko razdelimo na formulacijske, procesne in okoljske, ki so predstavljeni na sliki 3 (7).

Slika 3: Shematska razdelitev parametrov, ki vplivajo na lastnosti elektrostatsko sukanega produkta. Puščica

↑ ali ↓ pomeni, da se premer NV poveča/zmanjša, če povečamo dotični parameter (7).

Z optimizacijo zgoraj naštetih parametrov lahko izdelamo kakovostna NV z želenimi lastnostmi in brez neželenih struktur, kot so na primer vozli. Pri izdelavi sta zelo pomembni ustrezna koncentracija polimerne raztopine in molekulska masa polimera. Če ta dva parametra nista ustrezna, lahko namesto gladkih NV nastajajo NV z vozli ali NV sploh ne nastanejo, ampak le (nano)delci. Koncentracija polimera mora biti dovolj visoka, da pride do prepletanja polimernih verig. Polimernih raztopin z nizko prevodnostjo ne moremo elektrostatsko sukati, medtem ko so raztopine s previsoko prevodnostjo nestabilne pri višjih napetostih, kar vodi v večje vijuganje polimernega curka na poti do zbirala in nastanka NV z vozli. Izbrano topilo ali mešanica topil mora imeti dovolj visoko dielektrično konstanto, da lahko izdelamo tanka NV. Običajno za ES uporabimo napetost med 5 kV in 40 kV, pri čemer visoka napetost poveča raztezanje nabitega curka, kar omogoča nastanek tanjših vlaken. Po drugi strani pa se z večanjem električne napetosti

Formulacijski parametri

•električna napetost ↓

•pretok raztopine ↑

•razdalja med konico šobe in zbiralom -

•geometrija zbirala (planarni kolektor, vrteči valj)

Procesni parametri

•vrsta polimera -

•koncentracija polimera ↑

•molekulska masa polimera

↑

•interfacialna viskoznost ↑

•prevodnost raztopine ↓

•površinska napetost -

•dielektrična konstanta topila ↓

Okoljski parametri

•temperatura ↑ ali ↓

•relativna vlažnost ↓

10

poveča masni pretok raztopine polimera, kar se odraža v nastanku debelejših vlaken.

Pretok raztopine je odvisen predvsem od hlapnosti izbranega topila, pri čemer bolj hlapna zahtevajo višje pretoke, posledica tega pa je pogosto nastanek debelejših vlaken, saj je v curku več polimera. Razdalja med konico igle in zbiralom mora biti dovolj velika, da lahko topilo med potovanjem curka do zbirala popolnoma izhlapi, saj v nasprotnem primeru nastanejo debelejša vlakna, ki se lahko zlepijo ali pa pride do tvorbe polimernega filma na zbiralu. Pomembno vlogo ima tudi vrsta zbirala, ki vpliva na urejenost NV. V primeru uporabe planarnega zbirala izdelamo naključno urejena vlakna z mrežasto strukturo, urejenost NV pa se poveča z uporabo zbirala v obliki vrtečega valja. Med samim procesom ES moramo vzdrževati ustrezno temperaturo in relativno vlažnost v prostoru, kjer poteka ES. Višja temperatura lahko pospeši izhlapevanje topila in tako nastanejo debelejša vlakna, hkrati pa lahko povzroči zmanjšanje viskoznosti polimerne raztopine in nastanek tanjših NV. Povečanje relativne vlažnosti omogoča, da se curek počasneje suši oz. dlje časa razteza, zato nastanejo tanjša NV (7).

Za ES lahko uporabimo enostavno enokanalno šobo, ki omogoča izdelavo homogenih enoslojnih NV, medtem ko lahko z uporabo koaksialne šobe izdelamo večslojna ali obložena NV, največkrat dvoslojna z zgradbo jedra in ovojnice. Koaksialna šoba je sestavljena iz koncentrično urejenih kapilar, ki so vstavljene ena v drugo (najpogosteje šobo sestavljata dve kapilari). Raztopini za jedro in ovojnico dovajamo ločeno, vsako iz svoje brizge, s pomočjo dveh batnih tlačilk, v stik pa prideta na koncu šobe, kjer nastane curek, ki potuje proti zbiralu in iz katerega nato nastajajo dvoslojna NV. Proces nastajanja vlaken je precej podoben kot pri uporabi enokanalne šobe, kjer se po tem, ko priključimo vir visoke električne napetosti, ustvari kapljica zunanje raztopine, ki se zaradi delovanja elektrostatskih privlačnih in odbojnih sil podaljša. To povzroči, da se raztegne tudi notranja raztopina in skupaj tvorita sestavljen Taylorjev stožec, iz katerega se razvije dvoslojni curek, ki pospešeno potuje proti zbiralu. Parametri, ki vplivajo na morfologijo izdelanih NV so podobni, določitev optimalnih vrednosti posameznih parametrov oziroma njihovih kombinacij pa je bolj kompleksna (7).

1.2.3.2 Sukanje pod vplivom centrifugalne sile in visokega tlaka

Sukanje pod vplivom centrifugalne sile in visokega tlaka (PG) je nedavno razvita metoda, ki hkrati združuje sukanje pod vplivom centrifugalne sile in izpihovanje raztopine polimera za izdelavo večjih količin homogenih nano- ali mikrovlaken. Napravo za PG sestavlja

11

cilindrična aluminijasta posoda, ki ima na površini številne odprtine premera približno 0,5 mm (slika 4). Posoda je priključena na električni motor, ki omogoča vrtenje posode do 36000 vrtljajev/minuto, na vrhu posode pa je pritrjena cev za dovod plina. Med vrtenjem posode se predhodno napolnjena polimerna raztopina prične iztiskati skozi odprtine posode v obliki curka. Centrifugalna sila povzroči raztezanje in tanjšanje curka, iz katerega med potovanjem do stene zbiralne komore izhlapi topilo in tako omogoči nastanek trdnih NV.

Za razliko od ES omogoča proizvodnjo NV v večjem merilu (angl. scale-up) in brez uporabe visoke napetosti. Tako kot pri ES so tudi pri PG lastnosti NV odvisne od formulacijskih, procesnih in okoljskih parametrov (15, 16).

Slika 4: Prikaz dovoda plina pod tlakom in sestavnih delov naprave za izdelavo NV s PG.

1.2.4 Načini vrednotenja izdelanih nanovlaken

Po izdelavi NV sledi uporaba različnih analitskih metod, s katerimi ovrednotimo morfologijo NV, mehanske in kemijske značilnosti NV, notranjo strukturo NV, količino vgrajene ZU, profil sproščanja ZU iz NV in vsebnost ZU v NV. S pomočjo vrstične elektronske mikroskopije (SEM) in presevne elektronske mikroskopije (TEM) lahko določimo debelino NV. SEM omogoča preiskovanje površine in morfologije NV, medtem ko TEM omogoča proučevanje njihove notranje strukture. Mikroskopija na atomsko silo (angl. Atomic Force Microscopy) omogoča določanje morfoloških lastnosti posameznih vlaken, stopnje nabrekanja NV v vodnem okolju in vrednotenje mehanskih lastnosti NV. S pomočjo diferenčne dinamične kalorimetrije (angl. Differential Scanning Calorimetry), lahko vrednotimo kristaliničnost polimerov in ZU v NV. Spremembo kristalne oblike lahko ovrednotimo tudi z rentgensko praškovno difrakcijo (XRD), ki temelji na sipanju in

12

interferenci rentgenskih žarkov na periodično urejenih kristalih. Jedrska magnetna resonanca (angl. Nuclear Magnetic Resonance) omogoča vrednotenje molekularne strukture in medmolekulskih interakcij v primeru večkomponentnih NV. Infrardeča spektroskopija s Fourierjevo transformacijo (FTIR) omogoča določanje strukturnih sprememb v polimernih verigah med ES in proučevanje interakcij med polimeri v primeru, ko za ogrodje uporabimo zmes polimerov ali proučujemo interakcije med polimerom in vgrajeno ZU. Z merjenjem stičnega kota lahko analiziramo hidrofilnost oz. hidrofobnost površine izdelanih NV (7). Če v NV vgradimo ZU, je smiselno določiti tudi vsebnost ZU (angl. drug loading) v NV, ki jo podajamo kot količino ZU na gram suhih NV. Z izvedbo in vitro testov sproščanja v različnih medijih ugotavljamo profil sproščanja ZU iz NV (17).

13

2 Namen dela

V zadnjih letih se povečuje delež novo odkritih ZU, ki so slabo topne, kar je razlog za iskanje novih metod, s katerimi bi lahko povečali njihovo vodotopnost in hkrati izboljšali njihovo biološko uporabnost. Vgradnja ZU v različne nanodostavne sisteme je eden izmed sodobnejših pristopov, s katerimi lahko povečamo topnost in/ali hitrost raztapljanja ZU.

Namen magistrske naloge je sistematičen pregled in analiza raziskovalnih člankov, ki so bili objavljeni v zadnjem desetletju, s področja hidrofilnih NV z vgrajeno slabo topno ZU.

Oblikovali bomo ustrezen iskalni profil, ki bo dal zadostno število literaturnih virov, ki bodo ustrezali vnaprej določenim vključitvenim kriterijem.

Cilji magistrskega dela so:

 raziskati, katere ZU, materiale za ogrodje, pomožne snovi in topila so raziskovalci uporabili za izdelavo NV ter v kakšnih razmerjih so bile te sestavine v formulacijah NV,

 ugotoviti, katera metoda za izdelavo NV se najpogosteje uporablja,

 primerjati lastnosti izdelanih NV (debelina, površinske lastnosti, vsebnost ZU ter kristalna oblika ZU v NV),

 ovrednotiti uspešnost povečanja topnosti in hitrosti raztapljanja ZU, vgrajene v NV v primerjavi s kristalno obliko ZU, fizikalno zmesjo ali komercialno dostopno referenčno formulacijo (npr. tabletami),

 ugotoviti, ali so bila izdelana NV končna oblika ali so bila le vmesna stopnja pri izdelavi določene končno FO,

 raziskati, ali so raziskovalci s tem, ko so ZU vgradili v NV, dosegli še kaj, poleg povečanja topnosti in hitrosti raztapljanja ZU.

14

3 Metode dela

Za iskanje ustreznih raziskovalnih člankov, ki smo jih vključili v literaturni pregled, smo uporabili iskalnik Pubmed (podatkovna baza MEDLINE). To je brezplačna zbirka podatkov, ki omogoča iskanje znanstvene literature, predvsem s področja biomedicine in drugih naravoslovnih ved. Baza je javno dostopna od leta 1996 in vsebuje več kot 32 milijonov člankov in povzetkov najrazličnejših biomedicinskih člankov (18).

Naš prvi iskalni niz je bil »nanofiber* AND poorly soluble drug*«, ki je dal 53 zadetkov.

Po pregledu naslovov in povzetkov najdenih člankov smo ugotovili, da bo potrebno iskalni niz razširiti, saj je bilo kar nekaj člankov neustreznih. Drugo iskanje smo izvedli z nizom

»nanofiber* AND (poorly soluble drug* OR enhanced solubility)« in dobili 195 zadetkov.

Iskanje v bazi smo izvedli na dan 16. 2. 2021. V obeh primerih smo iskali članke zadnjih 10 let, od leta 2012 do leta 2021. Osredotočili smo se na raziskovalne članke, kjer so vgrajevali ZU v hidrofilno ogrodje, pomembno pa je bilo tudi, da so s testi raztapljanja dokazali izboljšanje topnosti in/ali hitrosti raztapljanja ZU z vgradnjo v NV. Pregleda nabora 195 člankov smo se lotili tako, da smo naprej pregledali le naslove in povzetke ter se že na podlagi tega odločili, ali članek sodi v ožji izbor, ali ga izključimo. Za lažjo selekcijo člankov smo določili vključitvene in izključitvene kriterije, ki so predstavljeni v spodnjih alinejah.

Vključitveni kriteriji:

 članek je v angleškem jeziku,

 v NV so vgrajevali slabo topno ZU,

 ogrodje NV iz hidrofilnih polimerov ali drugih hidrofilnih materialov,

 iz rezultatov v članku je razvidno, da so z vgrajevanjem v NV dosegli izboljšanje topnosti in/ali hitrosti raztapljanja ZU.

Izključitveni kriteriji:

 iz naslova članka je razvidno, da članek, glede na tematiko, ne sodi v našo raziskavo,

 članek je pregleden in ne raziskovalni,

 osnovni gradnik ogrodja NV je hidrofoben polimer (npr. polikaprolakton),

 ZU je dobro vodotopna,

15

 v NV so vgrajevali druge aktivne sestavine in ne učinkovine, ki so uvrščene v anatomsko-terapevtsko-kemično klasifikacijo zdravil (npr. kurkumin, citral, vanilin, vitamin A, vitamin E, timol, linalol, limonen),

 produkt izdelave je drug nanodostavni sistem in ne NV,

 članek ni dostopen v celoti.

Po izboru ustreznih člankov smo pripravili preglednico, v katero smo vpisali iskane podatke iz posameznega raziskovalnega članka. Preglednica se nahaja v prilogi magistrske naloge (preglednica PI). Iz člankov smo izpisali spodnje podatke:

 naslov članka, leto objave, revijo, kjer je bil članek objavljen, vgrajena/e ZU, materiale, ki so jih uporabili kot ogrodje, dodane pomožne snovi, topila za ES, razmerje med sestavinami v različnih formulacij in uporabljeno metodo izdelave NV,

 podatke, v kakšni kristalni obliki so bila izdelana NV in vgrajena ZU,

 teoretično vsebnost ZU v NV ali jo po potrebi izračunali iz sestave NV, če ni bila neposredno podana. V primerih, ko ni bilo ustreznih podatkov (mas posameznih sestavin NV) za izračun, smo to navedli kot komentar,

 debelino NV glede na sestavo formulacije,

 faktor povečanja topnosti ZU vgrajene v NV v primerjavi s kristalno obliko ZU ali njeno fizikalno zmesjo. Dodatno smo v literaturi poiskali podatke o topnosti ZU v vodi pri 25 ºC; v primeru, ko je bila podana topnost pri drugi temperaturi, smo to posebej označili,

 rezultate testov sproščanja in delež sproščene oz. raztopljene ZU po končanem testu. Kadar to ni bilo podano v obliki številčnega podatka, smo delež sproščene ZU ali koncentracijo raztopljene ZU odčitali iz profila. V primerih, ko je bil profil raztapljanja podan tako za NV kot za samo ZU ali fizikalno zmes, smo na podlagi podatkov iz grafa določili faktor izboljšanja raztapljanja.

16

4 Rezultati in razprava

4.1 Metodologija iskanja ustreznih literaturnih virov

Na sliki 5 je diagram, ki predstavlja strategijo iskanja literaturnih virov, ki so bili osnova te magistrske naloge. S končnim iskalnim nizom »nanofiber* AND (poorly soluble drug* OR enhanced solubility)« smo v iskalniku Pubmed dobili 195 zadetkov. Po pregledu naslovov smo izključili 63 člankov, 7 člankov je bilo preglednih, v 6 primerih pa nismo imeli dostopa do celotnega besedila. Tako smo v nadaljnjo analizo vključili 119 raziskovalnih člankov. V naslednji fazi smo prebrali povzetke teh 119 člankov in na podlagi definiranih izključitvenih kriterijev (poglavje 3) izključili še 27 člankov. V ožji izbor se je tako uvrstilo 92 člankov, ki smo jih pregledali v celoti. V naslednjem koraku smo izključili še 18 člankov, kjer so vgrajevali slabo topno aktivno sestavino, ki ne sodi med ZU glede na anatomsko-terapevtsko-kemično klasifikacijo, ter 36 ostalih, ki prav tako niso ustrezali vključitvenim kriterijem. Tako smo prišli do končnega nabora 47 raziskovalnih znanstvenih člankov, ki smo jih v okviru magistrske naloge podrobno analizirali.

Slika 5: Diagram, ki prikazuje proces iskanja ustreznih literaturnih virov (raziskovalnih znanstvenih člankov).

17

4.2 Analiza obravnavanih literaturnih virov

Slika 6 prikazuje porazdelitev literaturnih virov glede na leto objave. Naš iskalni profil je zajel raziskovalne znanstvene članke, ki so bili objavljeni med leti 2012 in 2021 (do dneva zajema iz baze podatkov). Pred letom 2013 ni bilo objavljenih ustreznih člankov, ki bi jih lahko vključili v raziskavo, nakar je z leti naraščalo število objav; daleč največ jih je bilo v letu 2019 (n = 13). Leta 2021 je bila ustrezna samo ena objava, saj smo iskanje izvedli v začetku leta. Da je večina člankov objavljenih po letu 2015, kaže na dejstvo, da so se bolj množične raziskave in razvoj na področju NV, kot sodobnega nanodostavnega sistema za izboljšanje topnosti ZU, razmahnili šele v zadnjih letih.

Slika 6: Število raziskovalnih znanstvenih člankov, objavljenih v posameznem letu, v obdobju od leta 2012 do 2021 (Iskalnik: Pubmed).

Izbrani članki so bili objavljeni v 21 različnih revijah, daleč največ jih je bilo objavljenih v reviji International Journal of Pharmaceutics (n = 14; 30 %). To je tretja najpogosteje citirana revija na področju farmacije, s faktorjem vpliva 4,845 (za leto 2019). Ima posebne rubrike na področju farmacevtske nanotehnologije in personalizirane medicine, objavlja raziskovalne in pregledne znanstvene članke, komentarje in pisma uredniku (19). 6 člankov je bilo objavljenih v reviji European Journal of Pharmaceutical Sciences (n = 6; 13

%), 5 člankov v reviji Pharmaceutics (n = 5; 11 %), 3 članki v reviji Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis (n = 3; 6 %) in po 2 članka v revijah Molecular Pharmaceutics (n = 2; 4 %) in Pharmaceutical Development and Technology (n = 2; 4 %).

0 2 4 6 8 10 12 14

2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020 2021

Število člankov

Leto objave

18

V preostalih 15 revijah je bil objavljen po en članek iz nabora, ki ga obravnavamo v tej magistrski nalogi.

4.3 Pregled zdravilnih učinkovin, ki so jih vgrajevali v nanovlakna

Raziskovalci so v NV vgrajevali 32 različnih ZU, ki smo jih razdelili v 15 terapevtskih skupin, kot je prikazano na sliki 7. Pri tem smo si pomagali z anatomsko-terapevtsko- kemično klasifikacijo zdravil (20). Ugotovili smo, da so največkrat kot modelno ZU izbrali karvedilol (n = 7; 15 %), ki glede na terapevtsko področje sodi v drugo najpogosteje zastopano skupino zdravil, ki jo predstavljajo antagonisti adrenergičnih receptorjev beta.

Karvedilol je neselektivni beta blokator, ki izkazuje slabo vodotopnost in dobro permeabilnost, zato ga uvrščamo v razred II glede na BCS (21). V proučevanih člankih so bile, glede na terapevtsko področje, največkrat zastopane ZU, ki jih uvrščamo med ZU s protivnetnim in protirevmatičnim učinkom (n = 11; 23 %). Izdelali so NV z ibuprofenom (n = 3), piroksikamom (n = 3), ketoprofenom (n = 1), aceklofenakom (n = 1), firokoksibom (n = 1), natrijevim diklofenakom (n = 1) in nifluminsko kislino (n = 1). Vse omenjene učinkovine uvrščamo med nesteroidna protivnetne in protirevmatične ZU, ki izkazujejo slabo topnost v vodi in pogoste neželene stranske učinke, kar velikokrat omejuje njihovo klinično uporabo. Pogosto je za lajšanje bolečin potrebna dolgotrajna uporaba tovrstnih zdravil, kar lahko privede do vnetja želodčne sluznice, razjed in nepopravljivih poškodb želodca. Raziskovalci so poročali, da se z vgradnjo ZU v NV, zmanjša draženje želodčne sluznice, če se ZU v NV nahaja v amorfni obliki. Draženje sluznice povzročajo sicer delci ZU v kristalni obliki. Zaradi povečane topnosti ZU se zmanjša čas zadrževanja v želodcu, hkrati pa se poveča sprejemljivost bolnikov za nesteroidna protivnetna in protirevmatična zdravila (22).

19

Slika 7: Razdelitev ZU, ki so jih vgrajevali v NV, glede na terapevtsko skupino, število različnih ZU iz posamezne terapevtske skupine in število raziskovalnih člankov, ki so obravnavali vgrajevanje ZU iz določene terapevtske skupine (umestitev posamezne ZU v terapevtsko skupino je navedena v preglednici PI).

Učinkovine, ki so jih raziskovalci vgrajevali v NV, smo razvrstili v razrede glede na BCS (slika 8). Največ, kar 75 % ZU, spada v razred II, kar pomeni, da so slabo topne, a dobro permeabilne, 16 % pa jih sodi v razred IV, kar pomeni, da imajo tako slabo topnost kot tudi permeabilnost. Povečanje biološke uporabnosti učinkovin iz razreda IV je lahko precej velik izziv, saj jim lahko povečamo topnost, pa bo njihova absorpcija še vedno omejena s permeabilnostjo ZU, čeprav je le-ta na mestu absorpcije na voljo v raztopljeni obliki (2).

Nabor izbranih člankov je vključeval tudi tri ZU, ki glede na BCS spadajo v razred I (prednizon in metronidazol) ali razred III (aciklovir), kamor sodijo dobro topne ZU.

Prednizon, metronidazol in aciklovir so raziskovalci v člankih opredelili kot slabo topne oz. učinkovine z omejeno topnostjo in so jim za to želeli izboljšati topnost (23, 24, 25). Po kriterijih za umestitev ZU v razred I sta topnost in permeabilnost prednizona na meji z vrednostmi za umestitev v razred II, zato je smiselna uporaba metod za izboljšanje topnosti (26). Prav tako sta topnosti metronidazola in aciklovirja na meji za umestitev v razred I oz.

razred III (24, 25).

20

Slika 8: Razvrstitev ZU, ki so jih vgrajevali v NV, v razrede glede na klasifikacijo BCS.

Analiza raziskovalnih člankov kaže, da se modelne učinkovine, ki so jih izbrali za izdelavo NV, uporabljajo za zdravljenje različnih bolezni. Vsem pa je skupno, da njihova slaba topost v vodi omejuje njihovo peroralno uporabo. To pogosto vodi v povečanje odmerka, dokler ne dosežemo terapevtske plazemske koncentracije ZU. Slaba absorpcija lahko vodi do nezadostne in variabilne biološke uporabnosti, hkrati pa se lahko poveča možnost pojava neželenih učinkov, kar močno zmanjša sodelovanje bolnika pri zdravljenju. S povečanjem odmerka otežimo proizvodnjo končne FO, saj se s tem lahko npr. poslabšajo pretočne lastnosti zmesi za tabletiranje ali granuliranje. Velike količine ZU in otežena izdelava končne FO povečajo stroške razvoja in proizvodnje takšnega zdravila (1, 2).

4.4 Analiza sestave nanovlaken

Raziskovalci so poskušali izdelati NV s slabo topnimi ZU iz različnih materialov, katerih pogostost uporabe v formulacijah je prikazani na sliki 9. Skupno število formulacij na spodnji sliki je večje od števila obravnavanih raziskovalnih člankov, saj so v posamezni raziskavi, ki jo predstavlja določen članek, velikokrat izdelali več različnih formulacij, ki so se med seboj razlikovale po kvalitativni sestavi, uporabljenih topilih ali razmerju med sestavinami v formulaciji. V raziskavo smo vključili vse formulacije, kjer so nastala NV in so z njihovo izdelavo uspeli izboljšati topnost vgrajene ZU. V 10 formulacijah so za ogrodje NV uporabili več kot le en material, največkrat 2 ali 3 različne materiale. Kot ogrodje za izdelavo NV so uporabili polimere, CD, lipide in v enem primeru tudi sukcinsko kislino.

6 %

75 % 3 %

16 %

BCS I BCSII BCS III BCS IV

21

Slika 9: Število proučevanih formulacij za posamezen material, ki je bil uporabljen kot ogrodje NV.

Daleč najpogosteje so kot osnovne gradnike NV uporabili hidrofilne polimere, med katerimi po zastopanosti izstopa PVP, ki so ga uporabili v kar 17 formulacijah, sledi PEO, ki je bil uporabljen v 10 formulacijah, HPMC v 6 formulacijah, Eudragiti v 5 formulacijah, SOL v 4 formulacijah, PVA v 3 formulacijah, ostali polimeri pa v 2 ali manj formulacijah.

PVP zaradi nizke toksičnosti, dobre biokompatibilnosti in topnosti velja za enega najbolj raziskovanih in uporabljenih polimerov za izdelavo NV z ES (8). Uporabili so PVP-je z različnimi molekulskimi masami, in sicer PVP K10, PVP K30, PVP K29/32, PVP K90.

Drugi najbolj pogosto zastopan polimer je bil PEO, ki so ga v 2 formulacijah uporabili samostojno, v 8 formulacijah pa v kombinaciji z drugimi polimeri. V 2 formulacijah je bil uporabljen v kombinaciji s poloksameri, saj NV iz poloksamerov brez dodatnega polimera, ki omogoča ES, NV ne moremo izdelati. PEO je vodotopen polimer, ki so ga v formulacije pogosto dodali kot sekundarni polimer za izboljšanje procesibilnosti primarnega polimera, ki sam ne omogoča ES (27). Primer je izdelava NV z diosminom, kjer so za tvorbo ogrodja NV uporabili zmes 3 polimerov. Kot primarni polimer so uporabili hidroksipropilcelulozo (HPC), ki so ji dodali PEO za povečanje izkoristka in tvorbo tanjših NV, ter polivinilalkohol (PVA), ki je izboljšal nastajanje NV in zaradi dobre vodotopnosti izboljšal topnost vgrajene ZU (28). Kot sekundarni polimer v formulaciji so uporabili tudi karboksimetilcelulozo (CMC), ki izboljša bioadhezivne lastnosti nastalih NV in hkrati poveča viskoznost raztopine za ES, saj je znana kot modifikator viskoznosti (16). Uporabo

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Število formulacij

Material za ogrodje nanovlaken

22

PVA, kot polimera za izboljšanje nastajanja NV, smo zasledili tudi pri izdelavi NV na osnovi hitosana, ki sam ni primeren za ES (29).

V 5 formulacijah so uporabili kopolimere estrov metakrilne kisline (Eudragit E, Eudragit RS100, Eudragit S100, Eudragit L 100-55) in izdelali NV s prirejenim sproščanjem.

Eudragit L 100-55 je gastrorezistenten polimer, ki je topen v mediju s pH > 5,5, zato omogoča zakasnitev sproščanja ZU v prebavnem traktu. Eudragit S100 je pH občutljiv polimer, ki je primeren za izdelavo NV z zadržanim sproščanjem, saj je topen pri pH > 7 (32). Z uporabo Eudragit S100 so izdelali dvoslojna NV, kjer so za jedro uporabili lecitin (lipid), za tvorbo ovojnice pa Eudragit S100, ki za razliko od lecitina omogoča ES.

Kombinacija polimera in lipida v formulaciji zaščiti ZU pred prehitrim sproščanjem in kislimi pogoji v želodcu ter zagotavlja ciljano dostavo ZU v kolon. Lecitin hkrati izboljša permeabilnost črevesne stene za ZU, kar močno poveča njeno absorpcijo. Takšna kombinacija pomožnih snovi je zlasti primerna za izboljšanje biološke uporabnosti ZU iz razreda IV glede na BCS, ki poleg slabe topnosti izkazujejo tudi slabo permeabilnost. V naši raziskavi je bila le ena formulacija, pri kateri so za izdelavo NV uporabili lipid. V lecitinu, pridobljenem iz jajčnih rumenjakov, prevladuje fosfatidilholin, ki se v nanotehnologiji pogosteje uporablja za tvorbo liposomov kot za izdelavo NV, saj sam ni primeren za ES. Uporabili so ga v primeru izdelave večslojnih NV, kjer so ES omogočili z dodatkom polimera, ki je primeren za ES (31). Eudragit RS100 je v pH območju od 1,2 do 7,4 slabo vodotopen polimer, ki ob stiku z vodnim medijem nabreka, zato se uporablja za izdelavo sistemov z nadzorovanim sproščanjem. V kislem okolju je pozitivno nabit polimer, ki izkazuje dobre mukoadhezivne lastnosti in je primeren za izdelavo NV, ki jih apliciramo v ustno votlino (32).

V zadnjih letih se je močno povečalo zanimanje za ES inkluzijskih kompleksov ZU in CD brez uporabe polimera. Prvi tak članek, kjer so pripravili NV brez uporabe polimernega ogrodja, je bil objavljen leta 2013 (33). V tem članku sta predstavljeni 2 formulaciji: pri prvi so za ogrodje uporabili PVP in kot pomožno snov dodali CD, pri drugi pa so uporabili le CD, natančneje hidroksipropil-β-ciklodekstrin (HP-βCD) in tako dokazali, da lahko z ES izdelamo NV brez uporabe polimera. Prednost CD je reverzibilna interakcija med hidrofobno notranjostjo CD in ZU, kar lahko poveča stabilnost ZU, prekrije neprijeten vonj in okus ZU, zmanjša draženje sluznice in poveča topnost lipofilnih ZU. Glavna slabost teh sistemov je, da so za učinkovito kompleksiranje potrebne razmeroma velike količine CD,

23

kar v primeru vgradnje večjega odmerka ZU, zmanjša prednost CD pri povečanju topnosti ZU (33). V pregled NV na osnovi CD smo vključili 7 različnih formulacij, kjer so poleg HP-βCD uporabili še sulfobutil eter (7)-β-ciklodekstrin (SBE 7-βCD), katerega zaščiteno ime je Captisol. Z različnimi kemijskimi modifikacijami naravnih CD lahko dodatno povečamo njihovo topnost in zmanjšamo njihovo nefrotoksičnost. Z ES inkluzijskih kompleksov ZU s CD lahko izdelamo NV in tako izboljšamo topnost vgrajene ZU.

Izdelana NV pa se lahko uporabijo za nadaljnjo izdelavo FO s takojšnjim sproščanjem (12).

Za zmanjšanje neželenih učinkov protirakave učinkovine paklitaksela so raziskovalci sintetizirali konjugate paklitaksela in sukcinske kisline, ki se lahko v vodni raztopini samo sestavijo v NV (angl. self-assemble). Tako lahko ZU vgradimo v NV in dostavimo brez uporabe nosilnega ogrodja. Gre za neko vrsto predzdravila, kjer počasna hidroliza estrske vezi med paklitakselom in sukcinsko kislino zagotavlja zadržano sproščanje paklitaksela, kar podaljša njeno zadrževanje v krvi in poveča protirakavo delovanje (34).

Pregled izbranih raziskovalnih člankov kaže, da so v raziskavah za izdelavo NV uporabili različne materiale, a glede na pogostost uporabe prednjačijo polimeri. Polimerna raztopina, primerna za ES, mora zagotavljati stabilen Taylorjev stožec, neprekinjeno tvorbo NV ter ponovljivo morfologijo vlaken s čim manj nepravilnostmni (npr. vozli) (7). Z modifikacijami klasične metode ES (npr. ES s koaksialno šobo) lahko izdelamo NV tudi iz materialov, ki sami ne izkazujejo najboljših lastnosti za ES, lahko pa NV izdelamo tako, da v formulacijo dodamo sekundarni polimer, ki izboljša lastnosti polimerne raztopine, ki jo bomo ES. Polimeri, ki so jih uporabi kot gradnike NV, pa nimajo le funkcije polimernega ogrodja, ampak lahko zaradi svoje amfifilnosti izboljšajo topnost vgrajene ZU ali preprečijo njeno obarjanje (33), kar bo podrobneje predstavljeno v naslednjih poglavjih.

4.5 Pregled topil za pripravo raztopin za elektrostatsko sukanje

Ko izberemo material, iz katerega želimo izdelati NV, sledi izbira ustreznega topila za pripravo raztopine, ki jo bomo elektrostatsko sukali (7). Izbira ustreznega topila ali kombinacije topil v ustreznem razmerju je temeljnega pomena za potek ES. Izberemo lahko topilo, v katerem sta topna tako polimer kot ZU, ali topilo, v katerem je topen le polimer. V tem primeru ZU vgradimo v NV v obliki delcev. Izbrano topilo mora imeti ustrezne lastnosti za ES, kot so dielektrična konstanta, hitrost izhlapevanja in kapacitivnost. Lastnosti izbranega topila vplivajo na konformacijo polimernih verig v

24

raztopini in viskoelastičnost, na kritično minimalno koncentracijo polimera v raztopini, na kristaliničnost ZU v NV ter na premer, morfologijo in natezno trdnost izdelanih NV. V literaturi lahko najdemo različne načine za oceno in ponazoritev topnostnega parametra polimera, kot je na primer trikotni diagram, ki prikazuje razmerje med disperzijskimi interakcijami, polarnimi interakcijami in vodikovimi vezmi v polimerni raztopini, in se navadno uporablja kot orodje za izbiro sistema ustreznih topil za ES (35).

Z vidika varnosti in biokompatibilnosti je najbolj zaželeno topilo za pripravo raztopin za ES voda. Njena uporaba pa je omejena z vodotopnostjo polimerov, zato ji je pogosto potrebno dodati sotopila. Kljub temu je bila voda v proučevanih člankih najpogosteje uporabljeno topilo za pripravo raztopin za ES, saj so jo uporabili v kar 16 različnih formulacijah. Pri izdelavi NV iz CD je bila voda edino topilo pri vseh formulacijah, saj imajo CD izrazito hidrofilno zunanjost. Prav tako so pri izdelavi vseh formulacij NV na osnovi PVA in HPC uporabili kot topilo samo vodo. V 7 formulacijah so vodi dodali etanol, metanol ali ocetno kislino v različnih razmerjih in tako pripravili raztopine, ki so bile ustrezne za ES. Etanol so kot samostojno topilo uporabili pri 10 formulacijah NV, v kombinaciji še z drugimi topili pa je bil uporabljen v 15 formulacijah. Pri pripravi raztopin PVP so uporabili zelo različna topila in kombinacije topil, in sicer vodo, etanol, kloroform, kombinacijo acetona in N,N-dimetilacetamida ter triklorometana, etanola in DMF, mešanico vode in etanola ali etanola in diklorometana. Pri izdelavi NV z nifluminsko kislino so etanolu dodali 10 % (v/v) DMF za zmanjšanje prevodnosti raztopine (36).

1,1,3,3,3-heksa-fluoro-2-propanol so uporabili pri 4 formulacijah za raztapljanje HPMC, polidioksanona in gliadina. Hitosan so raztopili v razredčeni ocetni kislini, želatino pa v mešanici vode in ocetne kisline. Pri pripravi dvoslojnih NV so za raztapljanje lecitina uporabili etanol, za pripravo raztopine za ovojnico pa so Eudragit S100 raztopili v mešanici etanola in N,N-dimetilacetamida v razmerju 90:10 (v/v) (31).

Glavni pomanjkljivosti organskih topil sta njihova toksičnost in pogosto prevelika hlapnost. Velikokrat je za pripravo raztopine za ES z optimalno viskoznostjo, površinsko napetostjo in hlapnostjo potrebno uporabiti kombinacijo več topil, kot se je izkazalo tudi v raziskavah, objavljenih v izbranih raziskovalnih člankih (7). V kar 42 različnih formulacijah so uporabili več kot le eno topilo, od tega v 2 formulacijah zmes 3 različnih organskih topil.

25

4.6 Pregled dodanih pomožnih snovi

V 19 člankih (40 %) so poročali o formulacijah NV, kjer so poleg sestavin ogrodja NV, ZU in topil, uporabili dodatne pomožne snovi, ki so na različne načine vplivale na lastnosti izdelanih NV ali pripomogle k izdelavi končne FO. Od tega so v 15 člankih poročali o uporabi pomožnih snovi, ki so jih dodali v disperzijo za izdelavo NV, v 3 člankih so pomožne snovi uporabili pri izdelavi končne FO, v katero so vgradili izdelana NV, v 1 primeru pa so uporabili pomožne snovi tako za izdelavo NV kot končne FO. Pomožne snovi, ki so jih uporabili za izdelavo končne FO bodo predstavljene v podpoglavju 4.12.1.

V preglednici II so predstavljene pomožne snovi glede na njihovo funkcijo pri izdelavi NV. Zasledili smo, da so najpogosteje uporabili različne polimerne in anionske PAS, ki so izboljšale raztapljanje slabo topne ZU. Dodani polimeri so dodatno omogočili amorfizacijo ZU in preprečili njeno rekristalizacijo iz prenasičene raztopine.

Preglednica II: Vrste pomožnih snovi, glede na njihovo funkcijo v formulaciji za izdelavo NV.

Vrsta pomožne snovi Predstavniki

Antioksidanti askorbinska kislina, butilhidroksianizol Solubilizatorji PAS: Pluronic F127, hipromeloza acetat sukcinat (Affinisol A716), vitamin E D- α-tokoferil polietilenglikol 1000 sukcinat, Tween 60, SOL

CD: HP-βCD, SBE-βCD sojin fosfatidilholin Snovi za znižanje površinske napetosti

(prevodnosti) raztopine za ES

Anionska PAS: natrijev dodecilsulfat (SDS)

Soli: amonijev acetat, kalcijev klorid Snovi za uravnavanje pH, tvorilci soli ocetna kislina, trietanolamin, citronska

kislina, natrijev hidroksid

Mehčala polietilenglikol 3000

Pri vgradnji ZU, ki je kemijsko nestabilna, moramo poskrbeti, da ohranimo njeno stabilnost med ES ter shranjevanjem končne oblike. Paziti moramo tudi na izbiro polimera, saj nekateri lahko zaradi postopka izdelave npr. vsebujejo peroksidne ostanke (npr. PVP, poloksameri), ki lahko reagirajo z ZU, ki je občutljiva za oksidacijo. Pri izdelavi NV z lovastatinom, ki izkazuje nizko oksidativno stabilnost, so zagotovili stabilnost ZU med izdelavo NV na osnovi poloksamera z dodatkom askorbinske kisline in butilhidroksianizola (37).