UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
NIKOL MRAZ MAGISTRSKA NALOGA
MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM LABORATORIJSKA BIOMEDICINA
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
NIKOL MRAZ
UGOTAVLJANJE USTREZNOSTI IZBRANIH FLUORESCENČNIH SOND ZA DOLGOTRAJNO MIKROSKOPIRANJE ŽIVIH CELIC
SUITABILITY OF SELECTED FLUORESCENT PROBES FOR LONG-TERM LIVE-CELL IMAGING
MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM LABORATORIJSKA BIOMEDICINA
Ljubljana, 2021
Magistrsko nalogo sem opravljala na Univerzi v Ljubljani, Fakulteti za farmacijo, pod mentorstvom doc. dr. Staneta Pajka, mag. farm. Eksperimentalni del magistrske naloge sem opravila na Institutu Jožef Stefan, pod somentorstvom Hane Kokot, mag. fiz.
Zahvala
Iskreno se zahvaljujem mentorju, doc. dr. Stanetu Pajku, mag. farm. in somentorici Hani Kokot, mag. fiz. za strokovno usmerjanje, predano znanje, koristne nasvete, potrpežljivost, trud, odzivnost in odgovore na moja vprašanja. Za pomoč v laboratoriju se zahvaljujem tudi vsem članom laboratorija za biofiziko na IJS, posebej pa Ani Krišelj, ker je poskrbela, da je moje delo v celičnem laboratoriju bilo varno, tako zame kakor tudi za celice.
Hvala tudi dragemu Bogu za moč in pogum ter prijateljem, ki so verjeli vame in mojo študijsko pot naredili nepozabno.
Ob zaključku študija pa se posebej zahvaljujem svoji družini, ki mi je študij omogočila in me vedno spodbujala ter mi stala ob strani. Hvala za vso podporo, ljubezen in potrpežljivost.
Magistrsko nalogo pa posvečam pokojnemu dedku oz. svojemu »studomatu«.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom doc. dr. Staneta Pajka, mag. farm. in somentorstvom Hane Kokot, mag. fiz.
NIKOL MRAZ
Ljubljana, 2021
VSEBINA
1. UVOD ... 1
1.1 Fluorescenca in fosforescenca ... 1
1.3 Fluorescenčne sonde ... 4
1.3.1 Porazdeljevanje sonde znotraj celice... 5
1.3.2 Koncentracijsko območje uporabe in toksičnost sonde ter intenziteta fluorescence ... 5
1.3.3 Izbrane sonde za testiranje ... 6
1.3.3.1 Sonda DRAQ7 ... 6
1.3.3.2 Sonda CellMask Orange ... 7
1.3.3.4 Sonda MitoTracker Orange ... 7
1.3.3.4 Sonda LysoTracker Red ... 8
1.3.3.5 Sonda Nile Red ... 9
1.3.3.6 Sonda SAG-38 ... 10
1.3.3.7 Sonda SAG 50 ... 11
1.3.3.8 Sonda PSM-39 ... 11
1.3.3.9 Sonda SHE-2N ... 12
1.4 Konfokalni mikroskop ... 13
1.4.1 Princip delovanja konfokalnega mikroskopa ... 14
1.5 Celice MH-S ... 15
2. NAMEN DELA ... 16
3. MATERIALI IN METODE ... 17
3.1 Reagenti in topila ... 17
3.2. Aparature in laboratorijska oprema ... 17
3.3 Programska oprema ... 17
4. EKSPERIMENTALNO DELO ... 18
4.1 Gojenje, odmrzovanje in precepljanje celic MH-S ... 18
4.2 Priprava vzorcev ... 19
4.3 Negativna kontrola ... 20
4.4 Pozitivne kontrole ... 22
4.5 Priprava izbranih fluorescenčnih sond za inkubacijo s celicami ... 22
4.5.1 Sonda CellMask Orange... 23
4.5.2 Sonda MitoTracker Orange ... 23
4.5.3 Sonda LysoTracker Red ... 24
4.5.4 Sonda Nile Red... 24
4.5.5 Sonda SAG-38... 24
4.5.6 Sonda SAG-50... 25
4.5.7 Sonda PSM-39 ... 25
4.5.8 Sonda SHE-2N ... 25
4.5.9 Pogoji mikroskopiranja ... 26
4.5.10 Obdelava slik v programu ImageJ ... 27
5. REZULTATI IN RAZPRAVA ... 28
5.1 Sonda CellMask Orange ... 28
5.2 Sonda MitoTracker Orange... 30
5.3 Sonda LysoTracker Red ... 32
5.4 Sonda Nile Red ... 34
5.5 Sonda SAG-38 ... 37
5.6 Sonda SAG-50 ... 40
5.7 Sonda PSM-39 ... 42
5.8 Sonda SHE-2N ... 44
6. SKLEP ... 47
7. LITERATURA ... 48 8. PRILOGE ... 52 Priloga I - Protokol dela v laboratoriju ... 52 Priloga II - Prikaz intenzitete fluorescence celic MH-S po 48-urni inkubaciji različnih koncentracij izbranih sond, pri 60-kratni povečavi ... 53
POVZETEK
Fluorescenca oz. pojav, pri katerem snovi po absorbiranju svetlobe emitirajo svetlobo daljših valovnih dolžin, je vsak dan vse pogosteje uporabljena v okviru različnih področij in tehnik (npr. medicina, biomedicina, molekularna biofizika, itn.). Ena izmed metod, pri kateri uporabljamo fluorescenco in izkoriščamo njene lastnosti, je konfokalna fluorescenčna mikroskopija živih celic. Omenjena metoda ima številne prednosti pred presevno mikroskopijo, med katerimi sta najpomembnejši boljša ločljivost in kontrast pridobljenih slik. Da bi fluorescenco lahko izkoriščali za mikroskopijo živih celic, moramo v vzorec dodati fluorescenčne sonde, molekule, ki fluorescirajo in se lokalizirajo med ustrezne celične organele. Trenutno je na voljo veliko komercialnih fluorescenčnih sond, precej pa se jih tudi sintetizira na novo, z namenom izboljšanja njihovih lastnosti. Za pravilno uporabo posamezne fluorescenčne sonde je med drugim pomembno poznati njeno toksičnost, ustrezno koncentracijsko območje uporabe ter porazdeljevanje med celične organele. Prav to smo, za izbrane štiri komercialno dostopne in štiri sonde, ki so bile sintetizirane na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani, določali v magistrski nalogi. Za tri od štirih komercialno dostopnih sond nam je uspelo določiti ustrezno območje koncentracij, v katerem se lahko uporabljajo za dolgotrajno mikroskopijo živih celic. Pri teh koncentracijah smo namreč dobili primeren signal glede na razmerje signalov sonde in ozadja ter obenem zabeležili visoko viabilnost celic (>90 %). Tudi dve od testiranih štirih na novo sintetiziranih sond sta primerni za dolgotrajno mikroskopijo živih celic, medtem ko so preostale tri sonde pri koncentracijah, potrebnih za vizualizacijo, že po 4-urni inkubaciji izkazale toksične učinke na celice in jih zato za raziskave živih celic ne moremo uporabiti.
KLJUČNE BESEDE: fluorescenčna sonda, citotoksičnost, porazdeljevanje sonde, dolgotrajna mikroskopija živih celic, konfokalna fluorescenčna mikroskopija
ABSTRACT
Fluorescence, a phenomenon in which things emit light of longer wavelengths after the absorption of it, is increasingly used in various fields and techniques (e.g. medicine, biomedicine, molecular biophysics etc.). One of the methods in which fluorescence is used and its characteristics are exploited is confocal fluorescent microscopy of living cells. The mentioned method has many advantages over optical microscopy, among which the most important are better resolution and contrast of the obtained images. In order to use fluorescence for live-cell imaging, fluorescent probes need to be added to the sample - the molecules that fluoresce and localize among cell organelles. There are currently numerous commercial fluorescent probes but many of them are also being synthesized with the intention of improving their performance. For the proper use of a fluorescent probe, it is important to know, among other things, its toxicity, proper concentration area and the redistribution of the probe among cellular organelles, which we have determined in this master's thesis for selected probes - the four commercial ones and the four probes that were synthesized on University of Ljubljana Faculty of Pharmacy. In three out of four commercial probes, we were able to obtain the correct concentration range of use in which the probes can be used for long-term live-cell imaging. At these fluorescent test concentrations, there is at the same time an appropriate signal with respect to the signal-to-noise ratio and high cell viability (>90 %). Also, two of the four newly synthesized probes are also suitable for the long-term microscopy of living cells while the remaining three after four hours of incubation showed toxic effect on cells at the concentrations required for visualization and therefore cannot be used for the long-term live-cell imaging.
KEY WORDS: fluorescent probe, cytotoxicity, probe distribution, long-term live-cell imaging, confocal fluorescence microscopy
SEZNAM OKRAJŠAV
ACN - acetonitril
APD - plazovna fotodioda (ang. avalanche photodiode)
ATCC - ameriška celična banka (ang. American Type Culture Collection) DKM - diklorometan
DMF - dimetilformamid DNP - dinitrofenil
ECACC - evropska celična banka (ang. European Collection of Authenticated Cell Cultures) EtOAc - etil acetat
FBS - fetalni goveji serum (ang. Fetal Bovine Serum)
LCIS - raztopina za mikroskopsko opazovanje živih celic (ang. Live Cell Imaging Solution) LD50 - letalni odmerek
MH-S - celična linija mišjih pljučnih alveolarnih makrofagov
PBS - puferirana raztopina fosfatnih soli (ang. phosphate buffered saline)
RPMI-1640 - hranilno gojišče za celice MH-S (ang. Roswell Park Memorial Institute 1640 medium)
Ф - kvantni izkoristek
KAZALO SLIK
Slika 1: Shema ekscitacijskega in emisijskega spektra ter prikaz Stokesovega premika;
prirejeno po (1).
Slika 2: Prikaz fluorescence in fosforescence s pomočjo diagrama po Jablonskem; prirejeno po (5).
Slika 3: Absorpcijski in fluorescenčni spekter fluorescenčne sonde DRAQ7; prirejeno po (18).
Slika 4: Fluorescenčni spekter CellMask Orange; prirejeno po (19).
Slika 5: Fluorescenčni spekter MitoTracker Orange; prirejeno po (19).
Slika 6: Fluorescenčni spekter LysoTracker Red; prirejeno po (19).
Slika 7: Fluorescenčni spekter Nile Red v etanolu; prirejeno po (19).
Slika 8: Fluorescenčni spekter SAG-38 (povzeto z dovoljenjem doc. dr. Staneta Pajka, mag.
farm.).
Slika 9: Fluorescenčni spekter SAG-50 (povzeto z dovoljenjem doc. dr. Staneta Pajka, mag.
farm.).
Slika 10: Fluorescenčni spekter PSM-39 (povzeto z dovoljenjem doc. dr. Staneta Pajka, mag.
farm.).
Slika 11: Fluorescenčni spekter SHE-2N (povzeto z dovoljenjem doc. dr. Staneta Pajka, mag. farm.).
Slika 12: Shema ekscitacije (levo) in emisije (desno) konfokalnega mikroskopa; prirejeno po (37).
Slika 13: Mikroskopski prikaz dobre negativne kontrole; 10-kratna povečava.
Slika 14: Mikroskopski prikaz slabe negativne kontrole; 10-kratna povečava.
Slika 15: Nastavitve v programu Imspector pri pridobivanju slik mikroskopiranih vzorcev.
Slika 16: Mikroskopski prikaz celic MH-S po 48-urni inkubaciji z 1 µM fluorescenčne sonde CellMask Orange; 60-kratna povečava.
Slika 17: Viabilnost celic MH-S po 4-urni in 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo CellMask Orange.
Slika 18: Intenziteta fluorescence celic po 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo CellMask Orange.
Slika 19: Mikroskopski prikaz celic MH-S po 48-urni inkubaciji z 0,03 µM fluorescenčne sonde MitoTracker Orange; 60-kratna povečava.
Slika 20: Viabilnost celic MH-S po 4-urni in 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo MitoTracker Orange.
Slika 21: Intenziteta fluorescence celic po 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo MitoTracker Orange.
Slika 22: Mikroskopski prikaz celic MH-S po 48-urni inkubaciji z 0,1 μM fluorescenčne sonde LysoTracker Red; 60-kratna povečava.
Slika 23: Viabilnost celic MH-S po 4-urni in 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo LysoTracker Red.
Slika 24: Intenziteta fluorescence celic po 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo LysoTracker Red.
Slika 25: Mikroskopski prikaz celic MH-S po 48-urni inkubaciji z 1 μM fluorescenčne sonde Nile Red; 60-kratna povečava.
Slika 26: Viabilnost celic MH-S po 4-urni in 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo Nile Red.
Slika 27: Intenziteta fluorescence celic po 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo Nile Red.
Slika 28: Mikroskopski prikaz celic MH-S po 48-urni inkubaciji z 0,1 μM fluorescenčne sonde SAG-38 (zelena barva); rdeča barva prikazuje signal sonde DRAQ7, ki označi poškodovane/mrtve celice; 60-kratna povečava.
Slika 29: Viabilnost celic MH-S po 4-urni in 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo SAG-38.
Slika 30: Intenziteta fluorescence celic po 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo SAG-38.
Slika 31: Mikroskopski prikaz celic MH-S po 48-urni inkubaciji s 30 μM fluorescenčne sonde SAG-50; 60-kratna povečava.
Slika 32: Viabilnost celic MH-S po 4-urni in 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo SAG-50.
Slika 33: Intenziteta fluorescence celic po 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo SAG-50.
Slika 34: Mikroskopski prikaz celic MH-S po 48-urni inkubaciji z 1 μM fluorescenčne sonde PSM-39; 60-kratna povečava.
Slika 35: Viabilnost celic MH-S po 4-urni in 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo PSM-39.
Slika 36: Intenziteta fluorescence celic po 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo PSM-39.
Slika 37: Viabilnost celic MH-S po 4-urni in 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo SHE-2N.
Slika 38: Intenziteta fluorescence celic po 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo SHE-2N.
Slika 39: Mikroskopski prikaz celic MH-S po 48-urni inkubaciji z 10 μM fluorescenčne sonde SHE-2N; 60-kratna povečava.
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Potrebni volumni gojišča in celične suspenzije glede na želeno konfluentnost celic.
Preglednica 2: priprava fluorescenčne sonde CellMask Orange z začetno koncentracijo c1
(prevzeto iz laboratorijskega dnevnika »NM-nTOX-01«):
Preglednica 3: priprava fluorescenčne sonde MitoTracker Orange z začetno koncentracijo c1
(prevzeto iz laboratorijskega dnevnika »NM-nTOX-01«):
Preglednica 4: priprava fluorescenčne sonde LysoTracker Red z začetno koncentracijo c1
(prevzeto iz laboratorijskega dnevnika »NM-nTOX-01«):
Preglednica 5: priprava fluorescenčne sonde Nile Red z začetno koncentracijo c1 (prevzeto iz laboratorijskega dnevnika »NM-nTOX-01«):
Preglednica 6: priprava fluorescenčne sonde SAG-38 z začetno koncentracijo c1 (prevzeto iz laboratorijskega dnevnika »NM-nTOX-01«):
Preglednica 7: priprava fluorescenčne sonde SAG-50 z začetno koncentracijo c1 (prevzeto iz laboratorijskega dnevnika »NM-nTOX-01«):
Preglednica 8: priprava fluorescenčne sonde PSM-39 z začetno koncentracijo c1 (prevzeto iz laboratorijskega dnevnika »NM-nTOX-01«):
Preglednica 9: priprava fluorescenčne sonde SHE-2N z začetno koncentracijo c1 (prevzeto iz laboratorijskega dnevnika »NM-nTOX-01«):
1
1. UVOD
1.1 Fluorescenca in fosforescenca
V sodobnem času vse več znanstvenih področij uporablja tehnike, ki temeljijo na fotoluminiscenci. Tako je tudi v medicini, biokemiji in ostalih področjih, kjer se izvajajo poskusi na živih celicah, pri katerih moramo le-te in njihove strukture ustrezno označiti.
Širok nabor aplikacij, ki izkoriščajo fotoluminiscenco in posledično njeno pogosto uporabo, pripisujejo njenim ugodnim značilnostim, npr.: netoksičnosti, možnosti sočasnega označevanja in detekcije več različnih bioloških struktur, izboljšanju kontrasta pri različnih tehnikah, in podobno. Najpogosteje uporabljani obliki fotoluminiscence sta fluorescenca in fosforescenca. Gre za pojava, pri katerih atomi ali molekule najprej absorbirajo svetlobo ali drugo obliko elektromagnetnega valovanja, nato pa preidejo v stanje z višjo energijo, ki ga imenujemo vzbujeno stanje. Tako stanje je nestabilno in zato hitro pride do vračanja v osnovno stanje. Pri tem se del odvečne energije sprošča v obliki svetlobe, kar imenujemo fluorescenca oz. fosforescenca. Emitirana svetloba pa ima manjšo energijo in posledično večjo valovno dolžino od ekscitacijske. To razliko oziroma premik med spektroma absorbirane in emitirane svetlobe imenujemo Stokesov premik (1, 2).
Slika 1: Shema ekscitacijskega in emisijskega spektra ter prikaz Stokesovega premika;
prirejeno po (1).
Ekscitacija Emisija
2 Najpomembnejša razlika med fluorescenco in fosforescenco je v oddajanju svetlobe in v času, ki preteče od ekscitacije do emisije. Pri fluorescenci pride do emisije svetlobe snovi, ki iz vzbujenega singletnega stanja preide v osnovno stanje, kar traja nekaj nanosekund. Pri fosforescenci pa do emisije svetlobe pride zaradi prehoda snovi iz vzbujenega tripletnega stanja v osnovno singletno stanje, kar traja nekaj milisekund ali celo ur po ekscitaciji (2, 3).
Procese, ki se dogajajo od absorpcije do emisije svetlobe, ponazarjamo s pomočjo diagrama elektronskih prehodov, ki ga imenujemo diagram Jablonski. To ime izhaja od prof.
Alexandra Jablonskega, ki je, zaradi svojih številnih dosežkov na področju fluorescence, znan kot oče fluorescenčne spektroskopije. Energijske nivoje v Jablonskem diagramu označujemo s S0, S1, S2, ... Sn, pri čemer predstavlja S0 osnovno stanje, ostala pa so vzbujena stanja. Znotraj vsakega energijskega nivoja obstajajo še različne stopnje vibracijskih energij.
Prehode med nivoji, pri katerih se absorbira oz. emitira foton, označujemo z navpičnimi puščicami, medtem ko vijugaste puščice prikazujejo nesevalno oddajanje energije oz.
vibracijsko relaksacijo in medsistemsko križanje ter interno konverzijo (1, 3-5).
Slika 2: Prikaz fluorescence in fosforescence s pomočjo diagrama po Jablonskem; prirejeno po (5).
3 V diagramu po Jablonskem je fluorescenca prikazana kot navpična puščica, ki gre od vzbujenega singletnega stanja S1 v osnovno stanje S0. Kot smo že omenili, pride pri fluorescenci po obsevanju snovi do absorpcije fotona in s tem do prehoda elektronov iz osnovnega singletnega stanja (S0) v višje vzbujeno stanje (S1, S2, S3, …). Ker pa je vzbujeno stanje nestabilno, hitro pride do oddajanja energije elektrona. Del energije se najprej odda v obliki vibracijske relaksacije zaradi trkov med molekulami. S tem elektron pride v najnižje vzbujeno stanje (S1), in sicer brez zahteve po spremembi njegovega spina. Preostali del odvečne energije pa se potem odda v obliki svetlobe in elektron se vrne v osnovno stanje (S0) (3-6).
Fosforescenca je na Sliki 2 prikazana kot rdeča puščica, ki potuje od vzbujenega tripletnega (T1) v osnovno stanje (S0). Proces vzbujanja in začetnega oddajanja energije je podoben kot pri fluorescenci. Razlika je v tem, da po prehodu v najnižje vzbujeno stanje S1 pride do medsistemskega križanja, pri čemer gre elektron, preden se vrne v osnovno stanje S0, v tripletno vzbujeno stanje T1. Vračanje elektronov iz tripletnega vzbujenega stanja v osnovno stanje je »prepovedano« in zahteva spremembo spina elektrona. Pomembno je vedeti, da izraz »prepovedano« ne pomeni to dobesedno, ampak gre samo za izjemno majhno verjetnost prehoda iz tripletnega vzbujenega stanja v osnovno. Prav zaradi tega elektron ostaja v tripletnem vzbujenem stanju dlje časa, zato je čas prehoda pri fosforescenci daljši.
Ko pa se tak dogodek enkrat zgodi in pride do emisije svetlobe, jo imenujemo fosforescenca (3-6).
1.2 Fluorescenčni spekter
Fluorescenčni spekter predstavlja porazdelitev verjetnosti za absorpcijo in emisijo fotona kot funkcije valovne dolžine ali valovnega števila. Torej, na abscisi prikazujemo intenziteto absorpcije in fluorescence, na ordinati pa bodisi valovno dolžino ali valovno število.
Valovno dolžino najpogosteje navajamo v nm, valovno število pa v cm-1 (1). Fluorescenčni spekter je specifičen za vsako fluorescenčno sondo in prikazuje tako absorpcijski kot emisijski spekter ter njuna vrhova. Absorpcijski spekter predstavlja verjetnost za absorpcijo fotona v odvisnosti od valovne dolžine, emisijski pa verjetnost emisije v odvisnosti od valovne dolžine, in sicer pri konstantni valovni dolžini vzbujanja (28, 43). V primeru prehoda iz osnovnega (S0) stanja v vzbujeno stanje S1 sta si absorpcijski in emisijski spekter sond zrcalni sliki. Izjema je prehod iz stanja S0 v stanje S2, saj emisija iz S2 v S0 večinoma ne poteka. Ta proces je namreč precej počasnejši od relaksacije iz S2 v S1 (1, 2).
4 1.3 Fluorescenčne sonde
Fluorescenca je verjetno najpomembnejši način optičnega pridobivanja in prikazovanja podatkov v biološki konfokalni mikroskopiji, saj je veliko bolj občutljiva in specifična kot absorpcija ali refleksija. Prav te njene lastnosti so v veliki meri odvisne od izbranih fluoroforov (1). Fluorescenčne sonde oz. fluorofori imajo zelo pomembno vlogo pri raziskavah na živih celicah. Uporabljamo jih za označevanje različnih celičnih organelov ter vizualizacijo samih celic (7). Delujejo na principu fluorescence, torej pri valovnih dolžinah, ki so specifične za vsako sondo, absorbirajo svetlobo ter jo oddajajo pri daljših valovnih dolžinah, kar lahko posnamemo, merimo in analiziramo. Običajno so fluorofori molekule, ki imajo nizko molekulsko maso, da lahko, tudi po različnih modifikacijah in vezavi dodatnih molekul nanje, prehajajo v biološke strukture. Za fluorescenčno mikroskopijo so optimalni fluorofori, ki imajo številne konjugirane dvojne vezi ali aromatske obroče s π-vezmi, ki lahko zunanje valenčne elektrone porazdelijo na širokem področju. Pri takih kemijskih strukturah je namreč razlika v energiji orbital vzbujenega in osnovnega stanja dovolj majhna, da lahko fluorescenco vzbudimo že z nizkoenergijskimi fotoni oz. s svetlobo vidnega dela elektromagnetnega spektra. To pa je pri mikroskopiji živih celic izrednega pomena, ker ima svetloba vidnega dela elektromagnetnega spektra nizko energijo in zato ne poškoduje živih celic (8, 9, 14).
Na splošno delimo fluorofore na intrinzične, ki so prisotni v naravi, in ekstrinzične, kamor sodijo sintetična barvila (9). Glede na širok nabor trenutno dostopnih fluorescenčnih sond je pomembno, da znamo izbrati pravo za naš namen uporabe. Idealna fluorescenčna sonda je namreč tista, ki ne vpliva na obliko in funkcijo celic, ima visoko specifičnost označevanja, t.j. selektivno lokalizacijo na ciljnem mestu, visoko fotostabilnost in čim manjšo citotoksičnost (10, 11). Torej, pri izbiri sonde je treba v prvi vrsti upoštevati njene ekscitacijske in emisijske spektre, njeno strukturo, netoksičnost in kompatibilnost z uporabljeno metodo (12).
Poleg tega lahko fluorescenčne sonde delimo še glede na način označevanja celic pri čemer poznamo npr. označevanje s transfekcijo, kjer celice same proizvajajo sondo, označevanje s sondami, ki se porazdeljujejo v celice glede na okolje (kamor sodijo vse testirane v tej magistrski nalogi), itn.
5 1.3.1 Porazdeljevanje sonde znotraj celice
Vsaka sonda lahko torej označi določene celične strukture ali organele. Prehod sonde v celice in njeno porazdeljevanje v njih je odvisno od njene strukture in vrednosti pH celičnih organelov ali pa membranskega potenciala (7, 11). Glede na njihovo strukturo razlikujemo amfifilne, lipofilne in hidrofilne sonde. Amfifilne se umeščajo v plazmalemo, ker imajo tako hidrofilni kot hidrofobni del. Lipofilna sonda prav tako označi plazmalemo, prehaja pa tudi v notranjost celice in se zato umesti tudi v membrane notranjih celičnih struktur. Hidrofilno barvilo pa ne označi celic, saj se ne veže na nobeno celično strukturo in ne prehaja membrane. Imamo torej sonde, ki lahko specifično označijo plazmalemo samih celic in/ali membrane celičnih organelov, lizosomov, endosomov, mitohondrijev, jedra, ipd. Prav tako poznamo tudi sonde, ki prehajajo v celice, a ne označujejo membran (13, 14).
1.3.2 Koncentracijsko območje uporabe in toksičnost sonde ter intenziteta fluorescence
Vsako sondo lahko uporabljamo v določenem koncentracijskem območju. V delovnem koncentracijskem območju želimo imeti dober signal oz. visoko intenziteto fluorescence iz označenih struktur ter čim nižji signal ozadja (7). Koncentracijsko območje uporabe je odvisno tudi od okolja v katerem se nahaja sonda in vrste celic, ki jih raziskujemo.
Pomembno je tudi, da s končno koncentracijo ne vplivamo na viabilnost celic. Prav zato želimo imeti čim večjo intenziteto fluorescence in čim manjšo toksičnost. Toksičnost sonde lahko opredelimo kot njen letalni odmerek (LD50). To je po definiciji odmerek oziroma koncentracija sonde, pri kateri pride do smrti 50 % celic v vzorcu. Glede na to, da sonda za dolgotrajno mikroskopijo živih celic ne sme poškodovati, smo v tej magistrski nalogi kot mejni odmerek upoštevali koncentracijo, ki povzroča poškodbo oz. smrt več kot 10 % celic (LD10). Intenziteta emisije pa je odvisna od kvantnega izkoristka same sonde (Ф), ki ga definiramo kot delež vzbujenih molekul fluorofora, ki emitirajo svetlobo (Enačba 1). Ta lahko zavzema vrednosti med 0 in 1, kjer predstavlja vrednost 0 minimalni izkoristek, vrednost 1 pa maksimalnega, pri čemer to pomeni, da sonda na vsak absorbiran foton tudi enega emitira in ima zato največjo intenziteto emisije. (14, 15, 42).
(Enačba 1)
6 1.3.3 Izbrane sonde za testiranje
V nadaljevanju predstavljamo izbrane sonde, ki smo jim določili lastnosti za uporabo pri dolgotrajni mikroskopiji živih celic. Med izbranimi sondami so 4 komercialne in 4, ki so bile sintetizirane na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani. Komercialno dostopno sondo DRAQ7 smo dodali izključno zaradi označevanja mrtvih celic. Njene lastnosti za uporabo v mikroskopiji živih celic so bile že določene s strani proizvajalcev (15, 16).
1.3.3.1 Sonda DRAQ7
DRAQ7 je fluorescenčna sonda, ki prehaja izključno v mrtve celice preko permeabilne membrane in se veže na njihovo DNA ter jih specifično označi. Zaradi svoje netoksičnosti in stabilnosti se pogosto uporablja v dolgotrajni fluorescenčni mikroskopiji živih celic. Ima dva ekscitacijska maksimuma, in sicer pri 599 in 646 nm (optimalna svetloba za vzbujanje njene fluorescence je torej rumena do rdeča), emisijski maksimum pa pri 697 nm (Slika 3).
V magistrski nalogi jo bomo uporabljali pri testiranju vsake izbrane sonde za označevanje in določanje števila mrtvih celic (15 - 17).
Slika 3: Absorpcijski in fluorescenčni spekter fluorescenčne sonde DRAQ7; prirejeno po (18).
7 1.3.3.2 Sonda CellMask Orange
Fluorescenčna sonda CellMask Orange omogoča hitro in enakomerno označevanje plazmaleme celic. Njeno fluorescenco lahko vzbudimo pri različnih valovnih dolžinah, pri čemer absorpcijski maksimum dosežemo z vzbujanjem pri 561 nm, največjo emisijo pa merimo pri 585 nm (Slika 4). Sonde CellMask Orange so amfifilne narave, za razliko od večine ostalih sond za barvanje celične membrane, ki so lipofilne. Medtem ko lipofilne sonde razmeroma hitro prehajajo v notranjost celice, zagotavlja amfifilna narava sonde CellMask barvanje izključno plazmaleme, in sicer v časovnem okviru 30 do 90 minut, odvisno od tipa celic in eksperimentalnih pogojev. Sonda se uporablja izključno v raziskovalne namene. Ker ekstrakcija z detergentom poškoduje to sondo, je ne uporabljamo v kombinacijah z barvili, ki zahtevajo predhodno celično permeabilizacijo (15, 20, 21).
Slika 4: Fluorescenčni spekter CellMask Orange; prirejeno po (19).
1.3.3.4 Sonda MitoTracker Orange
MitoTracker Orange je oranžna fluorescenčna sonda, katere največjo fluorescenco vzbudimo z lasersko svetlobo 554 nm in ima največjo emisijo pri 576 nm (Slika 5). Sonda pasivno difundira preko plazemske membrane in se zaradi močno negativnega potenciala mitohondrijske membrane kopiči v aktivnih mitohondrijih. Potem, ko je sonda v mitohondriju, pride do njune interakcije in sonda ga ne more več zapustiti. Intenziteta fluorescence je zato odvisna od kopičenja v mitohondrijih. Poleg fluorescenčne mikroskopije in uporabe na živih celicah lahko to sondo uporabljamo tudi za hibridizacijo in situ ter pri različnih metodah imunocitokemije, kjer je potrebna aldehidna fiksacija, saj ta postopek ne vpliva nanjo (15, 22, 23).
8 Slika 5: Fluorescenčni spekter MitoTracker Orange; prirejeno po (19).
1.3.3.4 Sonda LysoTracker Red
LysoTracker Red je visoko selektivna rdeča fluorescenčna sonda za označevanje organelov živih celic, ki imajo kisel pH. Primeri takšnih organelov so: Golgijev aparat, peroksisomi in lizosomi. Sonda ima ekscitacijski maksimum pri 577 nm, emisijskega pa pri 590 nm. Z njo dosežemo učinkovito označevanje v fluorescenčni mikroskopiji že pri nanomolarnih koncentracijah. Poleg fluorescenčne mikroskopije jo lahko uporabljamo tudi pri ostalih metodah, ki potrebujejo fiksacijo, ker ta postopek ne vpliva na njeno delovanje. Za detekcijo te sonde pri metodah, ki potrebujejo fiksacijo pa ne potrebujemo dodatnih protiteles, zato je bolj enostavna/cenejša/hitrejša/… za uporabo kot npr. dinitrofenil (DNP) (15, 24, 25).
9 Slika 6: Fluorescenčni spekter LysoTracker Red; prirejeno po (19).
1.3.3.5 Sonda Nile Red
Nile Red je fluorescenčna sonda, ki obarva oziroma označi lipide, še posebej nevtralne kapljice lipidov v celicah. Sonda je spektralno občutljiva, kar pomeni, da so valovna dolžina ekscitacije in emisije ter kvantni izkoristek, odvisni od polarnosti topila. V vodi in drugih polarnih topilih namreč ne fluorescira, zelo dobro pa fluorescira v nepolarnem okolju (npr.
v metanolu), kjer izkazuje velik Stokesov premik, pri čemer ima absorpcijski maksimum pri 552 nm, maksimum emisije pa pri 636 nm. V amfifilnem okolju sta maksimum ekscitacije in emisije premaknjena, in sicer ekscitacijski maksimum na 485 nm, emisijski pa na 525 nm.
Poleg uporabe v fluorescenčni mikroskopiji se uporablja tudi za detekcijo sfingolipidov pri tenkoplastni kromatografiji ter za barvanje proteinov po elektroforezi v SDS- poliakrilamidnem gelu (15, 26, 27, 41).
10 Slika 7: Fluorescenčni spekter Nile Red v etanolu; prirejeno po (19).
1.3.3.6 Sonda SAG-38
SAG-38 je ekstrinzična lipofilna fluorescenčna sonda, ki označi plazmalemo in jo tudi prehaja. Za raziskovalne namene jo je na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani sintetiziral Alen Gabrič, pod somentorstvom doc. dr. Staneta Pajka. Njen ekscitacijski maksimum dosežemo z vzbujanjem pri 548 nm, emisijski maksimum pa je pri 632 nm (38).
Slika 8: Fluorescenčni spekter SAG-38 (povzeto z dovoljenjem doc. dr. Staneta Pajka, mag.
farm.).
11 1.3.3.7 Sonda SAG 50
SAG-50 je ekstrinzična lipofilna fluorescenčna sonda, ki jo je na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani za raziskovalne namene prav tako sintetiziral Alen Gabrič, pod somentorstvom doc. dr. Staneta Pajka. Sonda označi plazmalemo in jo prehaja ter označi membrane celičnih organelov. Optimalne fluorescenčne lastnosti izkazuje v rahlo polarnih topilih, medtem ko v bolj polarnih, kot so metanol, etanol, aceton, EtOAc, DMF, DKM in ACN, fluorescence ne zaznamo. V toluenu ima ekscitacijski maksimum pri 501 nm, emisijski maksimum pa pri 682 nm (38).
Slika 9: Fluorescenčni spekter SAG-50 (povzeto z dovoljenjem doc. dr. Staneta Pajka, mag.
farm.).
1.3.3.8 Sonda PSM-39
PSM-39 je ekstrinzična lipofilna fluorescenčna sonda, ki je derivat barvila nilsko rdeče (Nile Red) in jo je, na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani, za raziskovalne namene, sintetizirala Monika Stojanovski, pod somentorstvom doc. dr. Staneta Pajka. Sonda označi plazmalemo, jo prehaja in označi še membrane določenih celičnih organel. Podobno kot pri barvilu nilsko rdeče je valovna dolžina ekscitacije in emisije sonde PSM-39 odvisna od topila, v katerem jo pripravljamo. Njen ekscitacijski maksimum se nahaja pri 600 nm, emisijski maksimum pa pri 662 nm (39).
12 Slika 10: Fluorescenčni spekter PSM-39 (povzeto z dovoljenjem doc. dr. Staneta Pajka, mag.
farm.).
1.3.3.9 Sonda SHE-2N
SHE-2N je ekstrinzična amfifilna fluorescenčna sonda, ki jo je, za raziskovalne namene, na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani, sintetizirala Hana Esih, pod mentorstvom doc.
dr. Staneta Pajka. Sonda označi plazmalemo, svoje fluorescenčne lastnosti pa najbolje izkazuje v toluenu, kjer ima ekscitacijski maksimum pri 500 nm, njen emisijski maksimum pa se nahaja pri 570 nm. Visoko emisijo fluorescence izkazuje tudi v EtOAc. Emisijski spekter v DKM je podoben njenemu emisijskemu spektru v toluenu, a je premaknjen proti višjim valovnim dolžinam. Fluorescenčnih lastnosti sonda ne izkazuje v etanolu, metanolu, acetonu, ACN in DMF (29, 40).
13 Slika 11: Fluorescenčni spekter SHE-2N (povzeto z dovoljenjem doc. dr. Staneta Pajka, mag. farm.).
1.4 Konfokalni mikroskop
Eno od glavnih orodij za opazovanje celic in spremljanje njihove fiziologije je fluorescenčna mikroskopija. Klasična fluorescenčna mikroskopija ima pomanjkljivost predvsem v smislu prostorske ločljivosti. Pri njej so vzbujeni vsi fluorofori, ki so osvetljeni z vzbujevalno svetlobo, vključno s tistimi, ki niso v samem fokusu. Rešitev težave pridobivanja slike iz nefokusiranih ravnin predstavlja konfokalna mikroskopija (30). Gre za razmeroma preprosto rešitev, ki jo predstavlja uporaba konfokalne zaslonke z majhno luknjico, postavljene za lečo. Taka zgradba mikroskopa omogoča prepuščanje žarkov svetlobe zbranih iz ene točke vzorca, medtem ko vso ostalo svetlobo zadrži. Lego luknjice lahko spreminjamo tako, da po točkah zajamemo celotno ravnino, ne da bi zajeli sosednjo raven. Debelina rezine, ki jo snemamo, je lahko tanjša od 500 nm (30, 31, 33). Konfokalno mikroskopijo najpogosteje uporabljamo v kombinaciji s fluorescenčno mikroskopijo. Kombinacija obeh metod nam namreč omogoča veliko boljši kontrast in boljšo ločljivost ter posledično opazovanje podrobnosti vzorcev, ki jih s klasično svetlobno mikroskopijo ne moremo opazovati (6, 31).
14 1.4.1 Princip delovanja konfokalnega mikroskopa
Slika 12: Shema ekscitacije (levo) in emisije (desno) konfokalnega mikroskopa; prirejeno po (37).
Slika 12 prikazuje shemo konfokalnega mikroskopa, kjer z laserskim žarkom, ki predstavlja izvor svetlobe, posvetimo za zaslonko, nato pa svetloba preko dikroičnega zrcala in leče pada na vzorec. Dikroično zrcalo je zelo pomemben del konfokalnega mikroskopa, saj prepušča svetlobo samo določenih valovnih dolžin. V konfokalnem mikroskopu je postavljeno tako, da v smeri svetlobe od izvora proti vzorcu prepušča svetlobo izvora, medtem ko pri svetlobi, ki prihaja iz smeri vzorca proti detektorju (fluorescenca in odbita svetloba ekscitacije), prepušča le svetlobo z daljšo valovno dolžino, preostalo pa odbije (6).
Svetloba potem, preden pride do detektorja, potuje še skozi konfokalno zaslonko z luknjico (t. i. »pinhole«), ki omogoči njen prehod izključno iz fokusne oziroma goriščne ravnine.
Torej, edina svetloba, ki na koncu pride do detektorja, je svetloba iz ravnine, ki je konjugirana fokalni ravni konfokalne zaslonke, od koder tudi izvira ime metode - konfokalna mikroskopija (30-33).
15 1.5 Celice MH-S
MH-S je oznaka za komercialno dostopno celično linijo mišjih pljučnih alveolarnih makrofagov. Dobavitelj celic MH-S za področje Evrope je ECACC. Celična linija je bila pridobljena z bronhoalveolarnim izpiranjem pri miškah in nato transfecirana z virusom SV40, kar ji omogoča imortalizacijo. Linijo uvrščamo v gensko spremenjene organizme 1.
razreda. Ameriška celična banka ATCC pa delo z njimi uvršča v 2. biološki varnostni razred.
Za oba navedena varnostna razreda velja, da delo v njiju ne predstavlja posebnega tveganja za človeka in okolje. Uporaba celične linije MH-S je dovoljena izključno za raziskovalne namene (34, 35).
16
2. NAMEN DELA
Namen magistrske naloge bo določiti ustreznost izbranih fluorescenčnih sond za uporabo v dolgotrajni mikroskopiji živih celic. Pri tem nameravamo ugotavljati naslednje lastnosti sond: toksičnost, koncentracijsko območje uporabe in porazdeljevanje v celične organele.
Toksičnost sond bomo določali na podlagi kvantifikacije živih in mrtvih celic na slikah pridobljenih s konfokalnim fluorescenčnim mikroskopom po ustrezni inkubaciji celic z njimi. Kvantifikacijo celic bomo izvedli s pomočjo prosto dostopnega računalniškega programa ImageJ v dveh časovnih točkah, in sicer po 4-urni in po 48-urni inkubaciji.
Viabilnost celic bomo prikazali v obliki grafov deleža živih celic, v odvisnosti od koncentracije uporabljene sonde, v obeh časovnih točkah. Na podlagi viabilnosti celic MH-S in signala sonde oz. intenzitete fluorescence bomo določili tudi ustrezno koncentracijsko območje njene uporabe. Primeren signal sonde je tisti, ki izkazuje visoko intenziteto fluorescence, ob čim manjšem šumu oz. signalu ozadja. Porazdeljevanje posamezne sonde med celične organele bomo ocenjevali s pomočjo slik, pridobljenih s konfokalnim fluorescenčnim mikroskopom pri 60-kratni povečavi. Želeni cilj eksperimentalnega dela magistrske naloge je torej pridobitev podatkov o lastnostih fluorescenčnih sond, ki so nujno potrebne za njihovo pravilno uporabo v nadaljnjih raziskavah na celicah MH-S.
17
3. MATERIALI IN METODE
3.1 Reagenti in topila
V okviru eksperimentalnega dela magistrske naloge smo uporabljali topila in reagente naslednjih proizvajalcev: Ecolab, Minerva Biolabs, Gibco, ATCC, Sigma in Invitrogen.
Proizvajalec komercialnih fluorescenčnih sond, ki smo jih testirali, je Invitrogen, medtem ko so bile ostale testirane sonde pripravljene na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani.
Deionizirana voda, ki smo jo uporabljali pri mikroskopiji, je bila pripravljena v Laboratoriju za biofiziko na Inštitutu Jožef Stefan.
3.2. Aparature in laboratorijska oprema
• centrifugirke: 15 mL - Falcon
• mikrocentrifugirke: 150 µL, 0,5 mL, 1,5 mL, 2 mL - Eppendorf
• pločša µ-Dish Quad, 35 mm - Ibidi
• polavtomatske pipete - Eppendorf in Brand
• nastavki za pipete - Eppendorf in Brand
• gojitvene plastenke za celične kulture T25 - TPP
• osebna zaščitna sredstva - Raffin, Dastex, LLG
• konfokalni fluorescenčni mikroskop - Abberior in Olympus
• optični presevni mikroskop - Leica
• centrifuga LC-320 - Tehtnica Železniki
• sonikacijska in vodna kopel Bransonic ultrasonic cleaner 2510EMT - Branson
3.3 Programska oprema
Slike na konfokalnem fluorescenčnem mikroskopu smo posneli v programu Imspector 16.3, za štetje celic pri 10-kratni povečavi pa smo uporabili prosto dostopni program ImageJ.
Grafe viabilnosti in intenzitete fluorescence smo izrisali s programom MS Excel 2020.
Točke na grafih prikazujejo deleže živih celic pri posamezni meritvi, črtkane črte pa interpolacijo med njimi. Za določitev interpolacije smo uporabili funkcijo Polynomial Trendline, ki je vgrajena v program Excel.
18
4. EKSPERIMENTALNO DELO
4.1 Gojenje, odmrzovanje in precepljanje celic MH-S
Celice MH-S rastejo delno v suspenziji, delno pa pritrjene za podlago. Pri veliki gostoti so v suspenziji. Za svojo rast potrebujejo posebno nadzorovano mikrookolje in ustrezno hranilno gojišče. Mikrookolje predstavlja atmosfera s 5 % CO2 in temperatura 37 °C. Gojimo jih v hranilnem gojišču, to je kompletno gojišče RPMI-1640 (Gibco), ki je sestavljeno iz osnovnega gojišča RPMI-1640, ki mu dodamo 10 % fetalnega govejega seruma (FBS, ATCC), 1 % mešanice streptomicina in penicilina (Sigma), 0,05 mM β-merkaptoetanola (Gibco) in 2 mM L-glutamina (Gibco). Dodajanje antibiotika (mešanice streptomicina in penicilina) ni nujno, zagotavlja pa dobro preventivo proti možnim bakterijskim okužbam, saj ne škodi celicam (34, 36). Celice MH-S smo gojili, odmrzovali in precepljali tako, kot je navedeno v navodilih ATCC (36). Postopek odmrzovanja in precepljanja pa je podan v nadaljevanju magistrske naloge.
Komercialno dostopne celice MH-S, ki smo jih uporabili, so bile shranjene v kriovialah v parah tekočega dušika pri temepraturah pod -130 °C in smo jih morali najprej odmrzniti. Za zagotovitev kar največje viabilnosti celic jih moramo odmrzniti hitro, in sicer v vodni kopeli, ogreti na 37 °C, nato pa jih po prvi kulturi, presajati vsaj 3-krat tedensko. Vse postopke povezane z gojenjem celic smo izvajali pod aseptičnimi pogoji v mikrobiološki komori tipa II. Po odtajanju smo vsebino vsake krioviale najprej prenesli v epruveto za centrifugiranje, ji dodali hranilno gojišče (ogreto na 37 °C) in centrifugirali 5 do 7 minut pri 1500 obr./min ter zavrgli supernatant. Celično usedlino smo resuspendirali v hranilnem gojišču in suspenzijo prenesli v gojitvene plastenke T25 (TPP), ki smo jih inkubirali v inkubatorju pri 37 °C in 5 % CO2 v zraku (95 % vlažnost).
Celične kulture smo presajali v razmerjih 1:2 do 1:6, odvisno od gostote celic v posamezni kulturi. To smo izvedli tako, da smo vso vsebino posamezne gojitvene plastenke T25 najprej odpipetirali v zbiralno epruveto za centrifugiranje. Vsebino plastenke smo sprali s pufrom PBS (Gibco) in ga dodali v zbiralno epruveto. V gojitveno plastenko smo nato dodali 1 - 2 mL tripsina (TrypLETM Select 1 , Gibco) in jo, ne več kot 8 min, pustili bodisi na sobni temperaturi ali na 37 °C, dokler se vse celice niso odlepile od podlage. Če je bilo to potrebno, smo z gojitveno plastenko nekajkrat potrkali ob trdno podlago, da so se vse celice odlepile od rastne podlage. Vsebino gojitvene plastenke smo prenesli v isto zbiralno
19 epruveto in jo nato centrifugirali 10 minut pri 150 g. Supernatant smo zavrgli, celično usedlino resuspendirali v svežem hranilnem gojišču in suspenzijo prenesli v ustrezno število novih gojitvenih posod in jih inkubirali.
4.2 Priprava vzorcev
Celoten postopek priprave vzorcev smo izvajali v aseptičnih pogojih, v mikrobiološki komori tipa II. Pri presajanju celic smo del celične suspenzije pred njenim prenosom v gojitveno posodo, uporabili za pripravo vzorcev. V vsako vdolbinico µ-Dish Quad smo najprej odpipetirali določen volumen hranilnega gojišča, nato pa v vsako še vnaprej izračunan volumen celične suspenzije (končni volumen v vsaki vdolbinici je bil 300 µL).
Potrebni volumni celic in gojišča glede na želeno gostoto oz. konfluentnost presajenih celic so podani v Preglednici 1, pri čemer je bila želena vrednost konfluentnosti, ki smo jo poskušali doseči ~ 70 %. Tako pripravljeno posodico za mikroskopijo µ-Dish Quad smo inkubirali v inkubatorju (5 % CO2 v zraku, 37 °C in 95 % vlažnost) najmanj 1 dan, da so se celice prilepile za podlago. Štiri oz. 48 h preden smo vzorce mikroskopirali, smo v 3 od 4 vdolbinic zamenjali gojišče z gojiščem, v katerega smo dodali določeno koncentracijo testirane fluorescenčne sonde, medtem ko v četrti, ki nam je služila kot negativna kontrola, gojišče zamenjamo s svežim gojiščem brez dodatka sonde. Tako pripravljene vzorce smo inkubirali 4 h oz. 48 h.
20 Preglednica 1: Potrebni volumni gojišča in celične suspenzije glede na želeno konfluentnost celic.
Skupni volumen [mL] 0,300
Gojitvena površina [cm2] 0,85
Konfluentnost [%] V celic [mL] V gojišča [mL]
100 0,102 0,198
90 0,092 0,208
80 0,082 0,218
70 0,071 0,229
60 0,061 0,239
50 0,051 0,249
40 0,041 0,259
30 0,031 0,269
20 0,020 0,280
10 0,010 0,290
Po določenem času inkubacije v inkubatorju smo vzorce analizirali, pri čemer smo, zaradi možnosti gretja mikroskopske mizice, poskrbeli za kratkotrajno zadrževanje posodice za mikroskopijo na mikroskopu (le v času analize). Pred mikroskopiranjem smo iz vsake vdolbinice posodice µ-Dish Quad odvzeli po 150 µL gojišča in ga nadomestili z enakim volumnom raztopine LCIS (ang. Live Cell Imaging Solution, Invitrogen), v katerem celice lahko preživijo izven inkubatorja do največ 4 h, kar pomeni, da smo morali vzorce analizirati znotraj tega časovnega okvirja. V vse vdolbinice smo po dodatku 150 µL raztopine LCIS, dodali še raztopino fluorescenčne sonde DRAQ7 (osnovna raztopina: v 150 µL mikrocentrifugirko najprej odpipetiramo 90 µL raztopine LCIS in dodamo 10 µL 0,3 mM raztopine DRAQ7) za vizualizacijo mrtvih in poškodovanih celic, in sicer tako, da je bila njena končna koncentracija v vzorcu 2 µM.
4.3 Negativna kontrola
Po zamenjavi gojišča z raztopino LCIS in dodatku sonde DRAQ7, smo z namenom vizualizacije celic negativni kontroli dodali še sondo CellMask Orange, pripravljeno v raztopini LCIS (končna koncentracija 100 µg/mL). Njena končna koncentracija v kontrolnih
21 vzorcih je bila 1 µg/mL. Pripravljeno negativno kontrolo smo nato analizirali znotraj 15 minut, da smo se izognili morebitnemu vplivu fluorescenčne sonde na samo kontrolo. Kot ustrezno negativno kontrolo smo opredelili vsako, v kateri smo določili <5 % mrtvih celic.
Kadar je bilo v posamezni kontroli >5 % mrtvih celic, pa smo raziskali vzrok za to in ponovili eksperimente.
Slika 13: Mikroskopski prikaz dobre negativne kontrole; 10-kratna povečava.
Slika 14: Mikroskopski prikaz slabe negativne kontrole; 10-kratna povečava.
Na zgornji dve sliki (Slika 13 in Slika 14) kanal 1 (zelena barva, levo) prikazuje signal fluorescenčne sonde CellMask Orange, medtem ko kanal 2 (rdeča barva, desno) prikazuje signal fluorescenčne sonde DRAQ7, ki označi mrtve celice.
X, Y X, Y
X, Y X, Y
kanal 1 kanal 2
kanal 1 kanal 2
100 μM 100 μM
100 μM 100 μM
kanal 1 kanal 2
22 4.4 Pozitivne kontrole
Poleg negativnih smo uporabljali tudi pozitivne kontrole. Te smo pripravili tako, da smo bodisi povzročili smrt celic s stavrosporinom (1 µM), ali pa celične plazmaleme permeabilizirali s Tritonom X-100 (1 %). S pozitivnimi kontrolami smo opredelili signal sonde DRAQ7 oz. določili, kako pri uporabljeni koncentraciji obarva jedra mrtvih celic in označi citoplazmo poškodovanih celic.
Pri vseh meritvah in analizah pozitivnih kontrol smo detektirali >95 % mrtvih oz.
poškodovanih celic.
4.5 Priprava izbranih fluorescenčnih sond za inkubacijo s celicami
Vse izbrane fluorescenčne sonde smo za inkubacijo s celicami pripravili v hranilnem gojišču RPMI-1640. Za prvo končno koncentracijo, ki smo jo uporabili pri vseh testiranih sondah, smo izbrali 1 µM. Po analizi rezultatov pri tej koncentraciji pa smo določili naslednjo končno testno koncentracijo, in sicer glede na število mrtvih celic pri 1 µM koncentraciji. Pri tistih sondah, kjer je bilo število mrtvih in poškodovanih celic že pri koncentraciji od 1 µM >10 %, smo za naslednjo koncentracijo izbrali nižjo, pri tistih, kjer je delež živih celic >90 %, pa višjo koncentracijo. Vse možne nadaljnje končne koncentracije smo določili vnaprej po logaritemski skali: ... 0,01 µM, 0,03 µM, 0,1 µM, 0,3 µM, 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM ...
Izračunali smo jih z naslednjo enačbo (Enačba 2):
𝑉
1=
𝑐2 ∗ 𝑉2𝑐1
,
(Enačba 2)kjer V1 označuje volumen začetne koncentracije, V2 volumen končne koncentracije, c1 in c2 pa začetno in končno koncentracijo fluorescenčne sonde.
Preden smo pripravili sonde za eksperimente, smo jih odtajali in ogreli v vodni kopeli do 37 °C, saj smo jih imeli shranjene v alikvotih v hladilniku ali zamrzovalniku. Sondo SAG-38 smo potem še dodatno sonicirali v ultrazvočni kopeli, ker shranjena v hladilniku rahlo agregira. Priprava sond za eksperimente je potekala tako, da smo vsako resuspendirali v hranilnem gojišču, do želene končne koncentracije in spremešali s pipeto. Končni volumen za dodatek k posameznemu vzorcu smo vedno opredelili kot volumen, ki je bil za nekaj µL večji od volumna potrebnega za eno vdolbinico posodice za mikroskopijo, ki znaša 300 µL.
23 Skupni volumen smo prilagajali tudi glede na število vzorcev, ki smo jih pripravljali in inkubirali na posamezen dan. S 300 µL tako resuspendirane sonde smo nadomestili obstoječe gojišče v vzorcu, ki smo ga vzeli iz inkubatorja, ga ustrezno označili in ponovno prenesli v inkubator za 4 oz. 48 h. Zamenjavo obstoječega gojišča s tistim, v katerem je resuspendirana sonda, smo izvedli hitro, saj celice ne smejo ostati na suhem, da ne pride do njihove poškodbe in s tem do napake v rezultatih.
Fluorescenčno sondo Nile Red z začetno koncentracijo 10 mM smo imeli pripravljeno v metanolu in je bila shranjena v hladilniku. Zaradi velike začetne koncentracije smo jo najprej redčili do koncentracije 100 µM (99 µL hranilnega gojišča RPMI-1640 in 1 µL 1 mM Nile Red) in nato z njo ravnali kot z vsemi drugimi sondami.
V nadaljevanju podajamo izbrane končne koncentracije in rezultate izračunov za pripravo suspenzij posameznih sond v hranilnem gojišču RPMI-1640.
4.5.1 Sonda CellMask Orange
Preglednica 2: priprava fluorescenčne sonde CellMask Orange z začetno koncentracijo c1
(prevzeto iz laboratorijskega dnevnika »NM-nTOX-01«):
c2 0,3 µg/mL 1 µg/mL 3 µg/mL 10 µg/mL 30 µg/mL
c1 5000 µg/mL 5 µg/mL 5000 µg/mL 5000 µg/mL 5000 µg/mL
V2 1000 µL 500 µL 500 µL 500 µL 1000 µL
V1 0,06 µL 0,1 µL 0,3 µL 1 µL 6 µL
4.5.2 Sonda MitoTracker Orange
Preglednica 3: priprava fluorescenčne sonde MitoTracker Orange z začetno koncentracijo c1
(prevzeto iz laboratorijskega dnevnika »NM-nTOX-01«):
c2 0,01 µM 0,03 µM 0,1 µM 0,3 µM 1 µM
c1 1000 µM 1000 µM 1000 µM 1000 µM 1000 µM
V2 1000 µL 1000 µL 1000 µL 500 µL 500 µL
V1 0,01 µL 0,03 µL 0,1 µL 0,15 µL 0,5 µL
24 4.5.3 Sonda LysoTracker Red
Preglednica 4: priprava fluorescenčne sonde LysoTracker Red z začetno koncentracijo c1
(prevzeto iz laboratorijskega dnevnika »NM-nTOX-01«):
c2 0,01 µM 0,03 µM 0,1 µM 0,3 µM 1 µM 3 µM
c1 1000 µM 1000 µM 1000 µM 1000 µM 1000 µM 1000 µM
V2 1000 µL 1000 µL 1000 µL 500 µL 500 µL 500 µL
V1 0,01 µL 0,03 µL 0,1 µL 0,3 µL 0,5 µL 1,5 µL
4.5.4 Sonda Nile Red
Preglednica 5: priprava fluorescenčne sonde Nile Red z začetno koncentracijo c1 (prevzeto iz laboratorijskega dnevnika »NM-nTOX-01«):
c2 0,01 µM 0,03 µM 0,1 µM 0,3 µM 1 µM
c1 100 µM 100 µM 100 µM 100 µM 100 µM
V2 1000 µL 1000 µL 1000 µL 1000 µL 500 µL
V1 0,1 µL 0,3 µL 1 µL 3 µL 5 µL
4.5.5 Sonda SAG-38
Preglednica 6: priprava fluorescenčne sonde SAG-38 z začetno koncentracijo c1 (prevzeto iz laboratorijskega dnevnika »NM-nTOX-01«):
c2 0,03 µM 0,1 µM 1 µM 3 µM 10 µM
c1 1000 µM 1000 µM 1000 µM 1000 µM 1000 µM
V2 1000 µL 1000 µL 500 µL 500 µL 500 µL
V1 0,03 µL 0,1 µL 0,5 µL 1,5 µL 5 µL
25 4.5.6 Sonda SAG-50
Preglednica 7: priprava fluorescenčne sonde SAG-50 z začetno koncentracijo c1 (prevzeto iz laboratorijskega dnevnika »NM-nTOX-01«):
c2 1 µM 3 µM 10 µM 30µM
c1 1000 µM 1000 µM 1000 µM 1000 µM
V2 1000 µL 1000 µL 500 µL 500 µL
V1 0,1 µL 0,3 µL 0,5 µL 1,5 µL
4.5.7 Sonda PSM-39
Preglednica 8: priprava fluorescenčne sonde PSM-39 z začetno koncentracijo c1 (prevzeto iz laboratorijskega dnevnika »NM-nTOX-01«):
c2 0,01 µM 0,03 µM 0,3 µM 1µM
c1 100 µM 100 µM 100 µM 100 µM
V2 500 µL 1000 µL 500 µL 500 µL
V1 0,5 µL 0,3 µL 1,5 µL 5 µL
4.5.8 Sonda SHE-2N
Preglednica 9: priprava fluorescenčne sonde SHE-2N z začetno koncentracijo c1 (prevzeto iz laboratorijskega dnevnika »NM-nTOX-01«):
c2 0,3 µM 1 µM 3 µM 10 µM 30 µM
c1 1000 µM 1000 µM 1000 µM 1000 µM 1000 µM
V2 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL
V1 0,15 µL 0,5 µL 1,5 µL 5 µL 15 µL
26 4.5.9 Pogoji mikroskopiranja
Pridobivanje slik vzorcev smo izvedli s konfokalnim fluorescenčnim mikroskopom, s pomočjo programa Imspector 16.3, in sicer pri nastavitvah, ki so prikazane na Sliki 15. Čas snemanja ene slikovne točke (ang. total pixel dwell time) smo nastavili na 10 μs, medtem ko je bila velikost zaslonske luknjice (ang. pinhole) vedno 1,07 AU. Glede na ekscitacijske spektre vseh izbranih sond smo za vzbujanje fluorescence uporabili laser, ki emitira svetlobo valovnih dolžin 561 ± 15 nm, z izjemo vzbujanja DRAQ7, za kar smo uporabili laser valovne dolžine 640 ± 15 nm. Za detekcijo izbranih sond smo uporabili plazovno fotodiodo (APD - ang. avalanche photodiode), ki zbira svetlobo valovnih dolžin od 605 do 625 nm, za detekcijo DRAQ7 pa od 650 do 720 nm. Pri vseh posnetih slikah smo uporabili enako intenziteto laserjev. Velikost enega piksla pri 60-kratni povečavi je bila 100 nm, pri 10-kratni pa 800 nm. Za vsak vzorec smo pri 60-kratni povečavi posneli vsaj 6 celic, pri 10-kratni povečavi pa 6 slik velikosti 80 × 80 µm, in sicer na naključno izbranih položajih. Približno število celic na vsaki sliki pri 10-kratni povečavi je bilo med 200 in 350.
Slika 15: Nastavitve v programu Imspector pri pridobivanju slik mikroskopiranih vzorcev.
27 4.5.10 Obdelava slik v programu ImageJ
Štetje živih in mrtvih celic smo izvedli v programu ImageJ, za kar smo uporabili slike, ki smo jih posneli pri 10-kratni povečavi. Slike smo v programu ImageJ razdelili v 2 kanala. V prvem smo imeli prikazane vse celice, v drugem pa le mrtve (označene s sondo DRAQ7).
Vsak kanal smo nato analizirali posebej, in sicer tako, da smo najprej določili mejo fluorescence (»treshold«), nad katero so bile vse celice oz. strukture, ki smo jih želeli prešteti. Tako smo dobili binarno sliko z belim ozadjem in črnimi celicami. Na slikah, na katerih so bile celice zelo blizu skupaj oz. so se dotikale, smo med njimi ročno narisali črto v velikosti 1 piksla, s čimer smo jih ločili in tako pravilno razdelili, nato pa jih s pomočjo programa ImageJ avtomatsko prešteli.
Na slikah, posnetih pri 60-kratni povečavi, pa smo s programom ImageJ določili povprečno intenziteto fluorescence označenih struktur. To smo storili tako, da smo najprej določili mejo fluorescence (»treshold«), glede na to, katere strukture smo morali imeti označene, nato pa nad to mejo izmerili celokupno intenziteto signala uporabljene sonde ter odstotek področja slike, ki je bila fluorescenca. Na podlagi teh meritev smo izračunali končno povprečno intenziteto signala sonde. Poleg tega smo na vsaki sliki izmerili še signal ozadja, pri čemer smo označili del ozadja (področje slike brez celic) in določili njegovo intenziteto.
28
5. REZULTATI IN RAZPRAVA
5.1 Sonda CellMask Orange
Fluorescenčna sonda CellMask Orange pri kratkotrajni inkubaciji (30 - 90 minut) obarva izključno plazmalemo, pri dolgotrajni inkubaciji (4 h in 48 h) pa prehaja plazmalemo in označi tudi notranje strukture celice, z izjemo jedra (Slika 16).
Slika 17 dokazuje, da sonda CellMask Orange ni toksična za žive celice pri koncentracijah, ki so <10 μM (živih >90 % celic), medtem ko pri višjih koncentracijah postaja citotoksična.
Glede na razmerje signala sonde in ozadja, smo zaznali najboljše signale pri koncentracijah med 1 μM in 5 μM (Slika 18). Pri koncentraciji 0,3 μM je bil signal že precej nižji kot pri 1 μM, pri 30 μM pa sta bila signala sonde in ozadja zelo visoka (Slika P4), pri čemer je signal ozadja že motil signal sonde. Gledano v celoti, je torej sonda CellMask Orange pri koncentracijah med 1 μM in 5 μM ustrezna za dolgotrajno in kratkotrajno mikroskopijo živih celic.
Slika 16: Mikroskopski prikaz celic MH-S po 48-urni inkubaciji z 1 µM fluorescenčne sonde CellMask Orange; 60-kratna povečava.
X, Z
X, Y 5 μM
5 μM
29 Slika 17: Viabilnost celic MH-S po 4-urni in 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo CellMask Orange.
Slika 18: Intenziteta fluorescence celic po 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo CellMask Orange.
30 5.2 Sonda MitoTracker Orange
Na Sliki 19, ki prikazuje razporeditev fluorescenčne sonde MitoTracker Orange znotraj celic, se izjemno lepo vidi, da sonda prehaja v notranjost celic, kjer označi predvsem mitohondrije, poleg teh pa rahlo označi tudi citoplazmo (citosol in organele) ter jedro.
Sonda MitoTracker je, pri koncentracijah <0,07 μM, glede na viabilnost celic MH-S po 48-h inkubaciji, primerna za dolgotrajno mikroskopijo živih celic. Pri koncentracijah <0,07 μM smo namreč določili >90 % živih celic, medtem ko je bila pri višjih koncentracijah sonda citotoksična. Signal sonde je bil sicer ustrezen pri vseh testiranih koncentracijah, saj je bil visok, signal ozadja pa je bil razmeroma nizek, a je rahlo naraščal od koncentracije 0,1 μM dalje. Glede na to, da je signal sonde proti nižjim koncentracijam upadal in je bil pri 0,01 μM precej nižji kot pri 0,03 μM in višjih koncentracijah, smo izmerili najboljši signal v koncentracijskem območju med 0,03 μM in 0,07 μM, kjer sonda še ni bila citotoksična.
Splošno gledano je torej sonda MitoTracker Orange pri koncentracijah med 0,03 in 0,07 μM ustrezna za dolgotrajno mikroskopijo živih celic, medtem ko jo za kratkotrajno mikroskopijo lahko uporabljamo tudi pri višjih koncentracijah, do 4 μM.
31 Slika 19: Mikroskopski prikaz celic MH-S po 48-urni inkubaciji z 0,03 µM fluorescenčne sonde MitoTracker Orange; 60-kratna povečava.
Slika 20: Viabilnost celic MH-S po 4-urni in 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo MitoTracker Orange.
X, Z
5 μM
5 μM X, Y
32 Slika 21: Intenziteta fluorescence celic po 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo MitoTracker Orange.
5.3 Sonda LysoTracker Red
Fluorescenčna sonda LysoTracker Red prehaja plazmalemo in označi notranje organele, ki imajo kislo vrednost pH, kot so npr. peroksisomi, lizosomi in podobno, medtem ko se celično jedro ne obarva.
LysoTracker Red ima toksičen učinek na celice MH-S pri koncentracijah >1 μM, pod to vrednostjo pa je viabilnost celic >90 %. Pri tej sondi intenziteta fluorescence oz. signal sonde narašča z njeno koncentracijo, pri čemer narašča tudi signal ozadja, ki pa je pri koncentracijah <0,1 μM izjemno nizek. Pri koncentracijah 0,01 μM in 0,03 μM pa je intenziteta fluorescence oz. sam signal sonde slabši in se približuje velikosti signala ozadja.
Koncentracije med 0,05 μM in 0,1 μM, kjer smo ugotavljali še ustrezno viabilnost celic po 48-urni inkubaciji, pa so še vedno izkazovale prenizko intenziteto fluorescence, zato ta sonda ni ustrezna za dolgotrajno mikroskopijo živih celic.
33 Slika 22: Mikroskopski prikaz celic MH-S po 48-urni inkubaciji z 0,1 μM fluorescenčne sonde LysoTracker Red; 60-kratna povečava.
Slika 23: Viabilnost celic MH-S po 4-urni in 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo LysoTracker Red.
X, Z 5 μM
X, Y 5 μM
34 Slika 24: Intenziteta fluorescence celic po 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo LysoTracker Red.
5.4 Sonda Nile Red
Fluorescenčna sonda Nile Red se, potem ko preide plazmalemo, v celicah porazdeljuje tako, da označi notranje celične strukture oz. organele ter rahlo obarva tudi citoplazmo. Ker ne prehaja jedrne membrane, ostaja celično jedro neoznačeno.
Več kot 90 % viabilnost celic MH-S smo določili po 48-urni inkubaciji s koncentracijami Nile Red, ki so bile <0,05 μM, pri višjih koncentracijah (>0,05 μM) pa je ta sonda delovala citotoksično. Signal ozadja je bil pri inkubaciji z vsemi testiranimi koncentracijami sonde podoben in razmeroma nizek. Intenziteta fluorescence sonde je upadala s koncentracijo in se je pri 0,01 μM že približala signalu ozadja. Ustrezen signal sonde je bil tako pri koncentraciji >0,05 μM, zato sklepamo, da je Nile Red ustrezna sonda za dolgotrajno mikroskopijo živih celic. Njegova optimalna koncentracija za uporabo pri celicah MH-S je pri 0,05 μM, za kratkotrajno mikroskopijo pa lahko uporabljamo nekoliko višje koncentracije, in sicer do 0,07 μM.
35 Slika 25: Mikroskopski prikaz celic MH-S po 48-urni inkubaciji z 1 μM fluorescenčne sonde Nile Red; 60-kratna povečava.
X, Z 5 μM
X, Y 5 μM
36 Slika 26: Viabilnost celic MH-S po 4-urni in 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo Nile Red.
Slika 27: Intenziteta fluorescence celic po 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo Nile Red.
37 5.5 Sonda SAG-38
Fluorescenčna sonda SAG-38 sicer ne prehaja v celično jedro, ker pa označi citoplazmo, vidimo na Sliki 28 jedra tako živih kot tudi mrtvih celic. Vidimo tudi, da SAG-38 označi plazmalemo, ki jo sicer prehaja ter obarva citoplazmo in celične organele.
Najboljši signal fluorescenčne sonde SAG-38 smo izmerili med koncentracijama 1 μM in 3 μM, kjer je bil signal sonde dovolj velik, sočasni signal ozadja pa dovolj nizek, da ga ni motil. Žal pa je bilo v tem koncentracijskem intervalu po 48-urni inkubaciji živih samo
~ 20 % celic. Pri koncentraciji 0,03 μM, kjer je bil signal sonde že precej nižji, še vedno nismo dosegli 90 % viabilnosti celic MH-S. Z analizo slik, posnetih pri 60-kratni povečavi, pa smo dodatno opazili, da imajo praktično vse celice, tudi tiste, ki niso bile označene s sondo DRAQ7 (žive celice), deformirana jedra, ledvičastih oblik (Slika 28 - črnina znotraj celic). Čeprav so imele žive celice nepoškodovane plazmaleme, pa so bile poškodovane zaradi negativnega učinka fluorescenčne sonde v pogojih dolgotrajne mikroskopije.
Omenjeno deformacijo jedra oz. toksični učinek najverjetneje povzroča cianidna skupina, prisotna v strukturi fluoroforja. Omenjeno poškodbo celic MH-S smo opazili pri vseh testiranih koncentracijah, zato sonda SAG-38 ne ustreza pogojem za dolgotrajno mikroskopijo živih celic. Ugotovili smo torej, da je sonda SAG-38 pri vseh testiranih pogojih (vse koncentracije in inkubacijski časi) toksična za celice MH-S.
38 Slika 28: Mikroskopski prikaz celic MH-S po 48-urni inkubaciji z 0,1 μM fluorescenčne sonde SAG-38 (zelena barva); rdeča barva prikazuje signal sonde DRAQ7, ki označi poškodovane/mrtve celice; 60-kratna povečava.
X, Z 5 μM
X, Y 5 μM
39 Slika 29: Viabilnost celic MH-S po 4-urni in 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo SAG-38.
Slika 30: Intenziteta fluorescence celic po 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo SAG-38.
40 5.6 Sonda SAG-50
Fluorescenčna sonda SAG-50 poleg označitve plazmaleme prehaja tudi v notranjost celic, kjer zaradi svoje lipofilne narave označi tudi membrane notranjih celičnih struktur oz.
organel. SAG-50 ne prehaja v celično jedro, ki zato ostaja neoznačeno (Slika 31).
Signal sonde SAG-50 je naraščal z njeno koncentracijo, medtem ko je ostajal signal ozadja pri vseh testiranih koncentracijah približno enak in precej nizek. Na Sliki 32 vidimo, da je bila 90 % viabilnost po 48-urni inkubaciji celic prisotna od koncentracije10 μM navzdol.
Glede na te ugotovitve lahko trdimo, da je sonda uporabna za dolgotrajno mikroskopijo živih celic. Največji signal sonde, pri kateri je ta še primerna za dolgotrajno mikroskopijo živih celic, smo zabeležili pri 10 μM. Sicer pa lahko uporabljamo tudi nižje koncentracije, a glede na to, da je signal ozadja pri 1 μM in 3 μM skoraj enak, signal sonde pa narašča, dajejo višje koncentracije boljše rezultate. Za kratkoktrajno mikroskopijo lahko sondo SAG-50 uporabljamo pri še višjih koncentracijah, pri čemer je zgornja meja 30 μM.
Slika 31: Mikroskopski prikaz celic MH-S po 48-urni inkubaciji s 30 μM fluorescenčne sonde SAG-50; 60-kratna povečava.
X, Z 5 μM
X, Y 5 μM
41 Slika 32: Viabilnost celic MH-S po 4-urni in 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo SAG-50.
Slika 33: Intenziteta fluorescence celic po 48-urni inkubaciji s fluorescenčno sondo SAG-50.
