UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
KATARINA RUPAR
MAGISTRSKA NALOGA
MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM INDUSTRIJSKA FARMACIJA
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
KATARINA RUPAR
NAČRTOVANJE IN PRIPRAVA SKUPKOV MAGNETNIH NANODELCEV Z MEZOPOROZNO OBLOGO IZ SILICIJEVEGA DIOKSIDA
DESIGN AND PREPARATION OF MAGNETIC NANOPARTICLE CLUSTERS WITH MESOPOROUS SILICA SHELL
Ljubljana, 2021
Magistrsko nalogo sem opravljala na Katedri za farmacevtsko tehnologijo Fakultete za farmacijo in na Institutu Jožef Stefan, na Oddelku za sintezo materialov
pod mentorstvom izr. prof. dr. Petre Kocbek in somentorstvom doc. dr. Slavka Kralja. Analize s presevnim elektronskim mikroskopom je izvedel doc. dr. Slavko Kralj na Institutu Jožef Stefan.
Zahvala
Iskreno se zahvaljujem svoji mentorici izr. prof. dr. Petri Kocbek in somentorju doc. dr.
Slavko Kralju za vse strokovne nasvete in vodenje pri izdelavi magistrskega dela.
Zahvaljujem se tudi Sebastjanu Nemcu in ostalim sodelavcem na Odseku za sintezo materialov IJS, za svetovanje pri izvedbi eksperimentalnega dela ter popestritev ur v laboratoriju.
Navsezadnje gre zahvala tudi staršem in Žanu za vso podporo tekom študija.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko delo samostojno izdelala pod vodstvom mentorice izr. prof. dr.
Petre Kocbek in somentorja doc. dr. Slavka Kralja
Katarina Rupar
Komisija za zagovor
Predsednik komisije: izr. prof. dr. Tomaž Bratkovič Član komisije: doc. dr. Izidor Sosič
I KAZALO VSEBINE
1 UVOD 1
1.1 Ciljana dostava zdravilnih učinkovin 1
1.1.1 Magnetno vodenje dostavnih sistemov z vgrajeno ZU 2
1.2 Nanodostavni sistemi 3
1.3 Magnetni nanodelci (MND) 6
1.4 Magnetizem in superparamagnetni nanodelci železovega oksida 7
1.4.1 Magnetni nanoskupki (MNS) 9
1.5 Magnetni nanodelci obdani z oblogo mezoporoznega silicijevega dioksida (silike) 9
1.6 Vrste oblog na površini magnetnih nanodelcev 10
1.7 Funkcionalizacija površine magnetnih nanodelcev 12
1.8 Vgrajevanje zdravilnih učinkovin v ali adsorpcija na funkcionalizirane magnetne nanodelce 14
1.9 Presevna elektronska mikroskopija (TEM) 16
1.10 Merjenje zeta potenciala delcev v disperziji 17
2 NAMEN DELA 19
3 MATERIALI 20
3.1 Materiali 20
3.2 Laboratorijski pripomočki in oprema 20
4 EKSPERIMENTALNO DELO 22
4.1 Sinteza magnetnih nanoskupkov (MNS) 22
4.2 Sinteza primarne neporozne obloge iz silike na površini MNS 23
4.2.1 Postopek 1 (MNS-Si-1) 23
4.2.2 Postopek 2 (MNS-Si-2) 23
4.3 Oblaganje MNS-Si-2 z mezoporozno oblogo iz silike 24
4.3.1 Postopek 1 - Sinteza MNS, obloženih s porozno oblogo iz silike (MNS-1por) 24 4.3.2 Postopek 2 - Sinteza MNS, obloženih s porozno oblogo iz silike (MNS-2por) 24 4.3.3 Postopek 3 - Sinteza MNS, obloženih s porozno oblogo iz silike (MNS-3por) 25 4.4 Odstranjevanje površinsko aktivnih snovi po sintezi mezoporoznih oblog iz silike 25 4.4.1 Odstranjevanje PAS nanoskupkom MNS-1por z etanolno raztopino amonijevega nitrata pri
povišani temperaturi 26
4.4.2 Odstranjevanje PAS nanoskupkom MNS-1por in MNS-2por z raztopino amonijevega nitrata
v acetonu pri sobni temperaturi 26
4.4.3 Odstranjevanje PAS nanoskupkom MNS-3por z etanolno raztopino amonijevega nitrata pri
povišani temperaturi 26
4.5 Funcionalizacija površine magnetih nanoskupkov 27
4.5.1 Uvedba amino skupin na površino MNS-1por (MNS-1por-APS) 27 4.5.2 Uvedba karboksilnih skupin na površino MNS-1por-APS (MNS-1por-APS-SA) 27 4.5.3 Uvedba amino skupin na površino MNS-2por (MNS-2por-APS) 28 4.5.4 Uvedba karboksilnih skupin na površino MNS-2por-APS (MNS-2por-APS-SA) 28 4.5.5 Vezava verig polietilenglikola na površino MNS-2por-APS (MNS-2por-APS-PEG) 28 4.5.6 Vezava verig polietilenglikola na površino MNS-2por (MNS-2por-PEG) 29
4.6 Vrednotenje nanoskupkov 29
4.6.1 Presevna elektronska mikroskopija 29
4.6.2 Meritve magnetnih lastnosti nanoskupkov 29
II
4.6.3 Meritve zeta potenciala in hidrodinamske velikosti magnetnih nanoskupkov 29 4.6.4 Določanje poroznosti obloge in specifične površine MND z metodo Brunauer-Emmett-
Teller (BET) 30
5 REZULTATI IN RAZPRAVA 31
5.1 Priprava magnetnih nanoskupkov 31
5.2 Sinteza tanke neporozne obloge iz silike na površini magnetnih nanoskupkov 32 5.3 Sinteza obloge iz mezoporozne silike na površini MNS-Si-2 33
5.4 Odstranjevanje PAS iz mezoporozne obloge iz silike 36
5.5 Magnetne lastnosti nanoskupkov 38
5.6 Vrednotenje poroznosti oblog iz silike 39
5.7 Vrednotenje funkcionalizacije nanoskupkov 41
6 SKLEP 47
7 LITERATURA 48
KAZALO SLIK
Slika 1. Prikaz nalaganja dostavnega sistema z ZU na tarčnem mestu pod vplivom zunanjega
magnetnega polja [prirejeno po 8]. ... 3 Slika 2. Sinteza mezoporozne obloge iz silike na površini MND [prirejeno po 30]. ... 10 Slika 3. Tvorba vodikove (zgoraj) in ionske vezi (spodaj) med funkcionalnim skupinami na površini
MND in IBU [prirejeno po 42]. ... 15 Slika 4. Shematski prikaz ključnih sinteznih stopenj pri pripravi s silicijevim dioksidom obloženih
magnetnih nanoskupkov (MNS). ... 22 Slika 5. MNS, posneti s presevno elektronsko mikroskopijo pri manjši (A) in večji (B) povečavi. ... 31 Slika 6. Porazdelitev velikosti MNS določena na podlagi analize 100 delcev na sliki, posneti s
presevno elektronsko mikroskopijo... 32 Slika 7. Vrednotenje MNS; MNS-Si s presevno elektronsko mikroskopijo. MNS: MNS-Si-1 (A in B)
in MNS-Si-2 (C in D). Posnetek pri majhni (A in C) in veliki povečavi (B in D). Modre puščice označujejo področja, kjer opazimo agregiranje MNS. ... 33 Slika 8. MNS-1por posneti s presevno elektronsko mikroskopijo. MNS obdani z mezoporozno siliko
po postopku 1 (MNS-1por) pri majhni (A) in veliki povečavi (B). ... 34 Slika 9. MNS-2por posneti s presevno elektronsko mikroskopijo. MNS obdani z mezoporozno siliko
po postopku 2 (MNS-2por) pri majhni (A) in veliki povečavi (B). ... 35 Slika 10. MNS-3por posneti s presevno elektronsko mikroskopijo. MNS obdani z mezoporozno siliko
po postopku 3 (MNS-3por) pri majhni (A) in veliki povečavi (B). Iz posnetka je razvidno, da so nanoskupki z mezoporozno siliko večinoma ločeni in ne tvorijo večjih aglomeratov le v majhnem deležu »dvojčke« (združena dva nanoskupka), označene z modro puščico na sliki A. ... 36 Slika 11. MNS po spiranju z etanolno raztopino amonijevega nitrata pri povišani temperaturi: MNS-
1por (A) in MNS-2por (B). Sliki sta bili posneti s presevno elektronsko mikroskopijo. ... 37 Slika 12. MNS-2por po spiranju z raztopino amonijevega nitrata v acetonu pri sobni temperaturi. Slika je posneta s presevno elektronsko mikroskopijo. ... 37 Slika 13. MNS-3por po spiranju z etanolno raztopino amonijevega nitrata pri povišani temperaturi.
Slika je posneta s presevno elektronsko mikroskopijo. ... 38
III
Slika 14. Krivulje odvisnosti magnetizacije posušenih MNS od apliciranega magnetnega polja izmerjeno pri sobni temperaturi z magnetometrom z vibrirajočim vzorcem: MNS (A), MNS s tanko neporozno oblogo iz silike (MNS-Si-2) (B) in nanoskupki z oblogo iz mezoporozne silike
(MNS-2por), sprani po nedestruktivnem postopku z amonijevim nitratom (C). ... 39
Slika 15. Izotermna krivulja adsorpcije in desorpcije dušika na pore vzorca MNS-3por (levo). Po obliki je krivulja tipa IV z značilno histerezno zanko, kar nakazuje mezoporozno strukturo vzorca. Desna slika prikazuje porazdelitev velikosti por v vzorcu MNS-3por, kjer sta vidni dve večji populaciji por z velikostjo 3,5 nm in ~17 nm. ... 40
Slika 16. Zeta potencial MNS-3por v odvisnosti od pH disperznega medija. ... 41
Slika 17. Zeta potencial MNS-2por-APS v odvisnosti od pH dispernega medija. ... 42
Slika 18. Zeta potencial MNS-2por-APS-SA v odvisnosti od pH disperznega medija. ... 43
Slika 19. Zeta potencial MNS-2por-PEG v odvisnosti od pH disperznega medija. ... 43
Slika 20. Porazdelitev hidrodinamskih velikosti MNS (levo) in MNS-2por (desno), izmerjeno z DLS. ... 44
Slika 21. Porazdelitev hidrodinamskih velikosti delcev MNS-2por-APS (levo) in MNS-2por-APS-SA (desno), izmerjene z DLS. ... 45
Slika 22. Porazdelitev hidrodinamskih velikosti delcev MNS-2por-APS-PEG (levo) in MNS-2por-PEG (desno), izmerjeno z DLS. ... 45
KAZALO PREGLEDNIC Preglednica I: Prikaz kemijskih struktur nekaterih na trgu prisotnih silanov z različnimi funkcionalnimi skupinami [40, 41]. ... 13
Preglednica II: Rezultati meritve adsorpcije/desorpcije dušika na vzorec MNS-3por. ... 40
Preglednica III: Povprečna hidrodinamska velikost delcev in PDI pridobljena z metodo DLS. ... 46
IV POVZETEK
Omejitev klasičnih farmacevtskih oblik predstavlja nespecifično porazdeljevanje in neciljano nalaganje zdravilnih učinkovin v organizmu, kar je gonilo razvoja novih dostavnih sistemov za ciljano dostavo zdravilnih učinkovin. Zlasti aktualni so dostavni sistemi, ki se odzivajo na dražljaje iz okolja. Takšni dostavni sistemi so lahko magnetno vodljivi, zato omogočajo ciljano dostavo zdravilnih učinkovin s pomočjo gradienta magnetnega polja. V tej skupini so posebej zanimivi superparamagnetni nanodelci železovega oksida, ki so s strani regulatornih agencij odobreni kot varni za ljudi. Priprava koloidno stabilne suspenzije takšnih delcev je relativno enostavna, saj se takšni delci v odsotnosti zunanjega magnetnega polja obnašajo kot nemagnetni in se posledično magnetno ne agregirajo. V okviru raziskav magistrskega dela smo načrtovali in pripravili magnetno vodljive nanoskupke. Pripravili smo magnetno vodljive nanoskupke in jih obložili s tanko neporozno oblogo iz silicijevega dioksida (silike) z uporabo dveh različnih postopkov. Tanka obloga iz silike zaščiti magnetne nanodelce ter zagotovi primerno koloidno stabilnost disperzije. Prvi postopek oblaganja je bil neustrezen zaradi težav s koloidno stabilnostjo delcev med sintezo, kar je povzročilo združevanje nanoskupkov. Drugi postopek je bil zaradi dodatka površinsko aktivne snovi uspešen, zato smo tako pripravljene nanoskupke uporabili za nadaljnje raziskave. Na tanko oblogo silike smo dodali debelejšo oblogo iz mezoporozne silike, ki omogoča vgrajevanje zdravilnih učinkovin v nanodostavni sistem.
Osredotočili smo se na pripravo obloge z relativno velikimi in radialno usmerjenimi porami.
Oblogo iz mezoporozne silike smo pripravili po treh različnih postopkih. Pri tem smo proučevali uporabo dveh različnih baz, in sicer trietanolamina in tris(hidroksimetil)aminometana. Pri odstranjevanju površinsko aktivnih snovi po sintezi mezoporozne obloge smo ugotovili, da je nastala najbolj robustna obloga v primeru, ko smo uporabili bazo tris(hidroksimetil)aminometan. Takšna obloga je bila odporna na ostre pogoje med spiranjem, kot sta povišana temperatura in uporaba ultrazvoka. V nadaljnjih raziskavah smo na površino magnetnih nanoskupkov uspešno uvedli amino in karboksi funkcionalne skupine, kar smo ovrednotili z meritvami zeta potenciala delcev. Za pripravo koloidno stabilnih nanoskupkov, ki bodo v prihodnje omogočali vgradnjo zdravilnih učinkovin, smo uporabili še dva postopka pegiliranja, pri čemer smo z neposredno vezavo PEG-silana na površino magnetnih
V
nanoskupkov z oblogo iz mezoporozne silike pripravili obetaven sistem za nadaljnji razvoj magnetno vodljivega nanodostavnega sistema za ciljano dostavo zdravilnih učinkovin.
Ključne besede: magnetni nanoskupki, superparamagnetni nanodelci železovega oksida, mezoporozna obloga iz silike, nanodostavni sistemi
VI ABSTRACT
The limitation of classical pharmaceutical dosage forms is represented by the non-specific distribution and non-targeted delivery of active ingredients in the body, which is the driving force for the development of novel targeted drug delivery systems. Delivery systems that respond to environmental stimuli are particularly relevant. Such delivery systems can be magnetically guidable, thus enabling targeted drug delivery using a magnetic field gradient. Of particular interest in this group are superparamagnetic iron oxide nanoparticles, which are approved by regulatory agencies as safe for humans. The preparation of a colloidally stable suspension of such particles is relatively simple, since they behave as non-magnetic in the absence of an external magnetic field and consequently do not aggregate magnetically. In the scope of the master's thesis, magnetically-responsive nanoclusters were designed and prepared.
Magnetic nanoclusters were prepared and coated with a thin non-porous layer of silicon dioxide (silica) using two different procedures. A thin silica coating protects the magnetic nanoparticles and provides adequate colloidal dispersion stability. The first procedure was unfavorable due to problems with colloidal stability during synthesis, which resulted in the aggregation of nanoclusters. The second procedure was successful due to the addition of surfactant, thus the nanoclusters coated by this procedure were used for further research. They were coated by an additional thicker layer of mesoporous silica, which was added to the thin silica coating.
Mesoporous silica layer enables the loading of the active ingredients. We focused on the preparation of relatively large and radially oriented pores. The mesoporous layer of silica was prepared by three different procedures. The application of two different bases was investigated, namely triethanolamine and tris (hydroxymethyl) aminomethane. When removing surfactants after the synthesis of mesoporous coating, we discovered that the most robust coating was formed when the tris (hydroxymethyl) aminomethane was used as the base. Such a coating was resistant to harsh conditions during rinsing, such as elevated temperature and the use of ultrasound. In further research, we successfully introduced amino and carboxy groups on the surface of nanoclusters, which was evaluated by measuring zeta potential of the particles. To prepare colloidally stable nanoclusters for future drug loading, we used two pegylation procedures, whereby direct binding of PEG-silane to the surface of nanoclusters with
VII
mesoporous silica resulted in a promising system for further development of magnetically guidable nanodelivery system for targeted drug delivery.
Keywords: magnetic nanoclusters, superparamagnetic iron oxide nanoparticles, mesoporous silica coating, nanodelivery systems
VIII SEZNAM OKRAJŠAV
APS--- (3-aminopropil)trietoksisilan
BJH--- teoretični model Barrett-Joyner-Halenda CTAB--- heksadecil(trimetil)amonijev bromid DIPEA--- N,N-diizopropiletilamin
DLS--- dinamično sipanje svetlobe (ang. Dynamic Light Scattering) DMF--- dimetilformamid
EtOH--- etanol IBU --- ibuprofen
MND--- magnetni nanodelci MNS--- magnetni nanoskupki PAS--- površinsko aktivna snov PDI--- polidisperzni indeks
rpm--- obrati na minuto (ang. revolutions per minute) s--- sekunda
SA--- sukcinanhidrid
TEM--- presevna elektronska mikroskopija TEOA--- trietanolamin
TEOS--- tetraetoksisilan
TRIS--- tris(hidroksimetil)aminometan UZ--- ultrazvok
ZU--- zdravilna učinkovina
1
1 UVOD
1.1 Ciljana dostava zdravilnih učinkovin
Dostavni sistem omogoča dostavo zdravilne učinkovine (ZU) na želeno mesto v telesu z vnaprej določeno hitrostjo in načinom sproščanja. Namen načrtovanja dostavnih sistemov za ciljano dostavo ZU je zagotavljanje večje učinkovitosti in/ali zmanjšanje potencialnih neželenih učinkov pri zdravljenju, saj takšni sistemi omogočajo selektivno dostavo ZU na želeno mesto.
Dostava ZU je proces, s katerim s pomočjo ustreznega dostavnega sistema in skrbno načrtovane farmacevtske oblike dosežemo želen terapevtski učinek [1].
Pogosta in velika težava konvencionalnih farmacevtskih oblik je, da z njimi le relativno majhna količina ZU uspe specifično in selektivno doseči želeno terapevtsko tarčo. S ciljano dostavo pa raziskovalci poskušajo ZU usmeriti v tarčni organ/tkivo. Tak pristop vodi v povečano učinkovitost ZU, pri čemer se pomembno zmanjša toksičnost, saj lahko uporabimo nižje odmerke ZU v formulaciji [2]. Za izboljšanje učinkovitosti ZU mora pristop ciljane dostave ZU izpolniti dve zahtevi, in sicer mora celoten odmerek ZU po aplikaciji doseči želeno mesto v nespremenjeni obliki in ZU se mora v tarčnem tkivu sprostiti iz dostavnega sistema, da sproži terapevtski učinek. Na ta način bo ZU povzročila minimalne neželene učinke na zdravo tkivo, saj bo učinkovala preferenčno na ciljane celice v telesu [3]. Dostavni sistemi ZU se lahko v tarčnem tkivu spontano nalagajo, pri čemer izkoriščajo lastnosti tarčnih tkiv, kot na primer povečano prepustnost in prekrvljenost tumorskega žilja, kar imenujemo pasivno ciljanje. V primeru načrtovanja »pametnih« dostavnih sistemov pa z vezavo ligandov, ki specifično prepoznavajo tarčne celice, dosežemo aktivno ciljanje tarčnega mesta v organizmu.
Pasivno ciljanje izkorišča pogoje, ki so prisotni v tarčnem tkivu, da ZU doseže in se zadrži na tarčnem mestu. Tak primer je tumorsko tkivo, katerega žilje pospešeno nastaja in je posledično močno perforirano in izrazito bolj prepustno kot žilje v zdravih tkivih. Skozi takšno žilje lahko nanodostavni sistemi z ZU prehajajo in se nalagajo v večjem obsegu v tkivu kot v zdravem tkivu z zdravim žiljem. Tumorsko mikrookolje se torej fiziološko razlikuje od okolja, ki ga sestavljajo zdrave celice. Tumorske celice morajo vzdrževati visoko stopnjo presnove, saj se nekontrolirano delijo in posledično potrebujejo več hranilnih snovi vključno s kisikom. Povečana potreba po energiji zato spodbudi glikolizo in procese izgradnje, pri čemer tumorsko tkivo ustvarja
2
mikrookolje z nižjo vrednostjo pH. Slednje pogosto izkoriščamo za pripravo dostavnih sistemov, ki so pri fiziološkem pH (7,4) stabilni in imajo vgrajeno ZU, medtem ko se v kislem tumorskem mikrookolju ZU sprosti in deluje selektivno na tumorsko tkivo [4].
Pri aktivnem ciljanju izkoriščamo prisotnost specifičnih antigenov na površini tarčnih celic, ki so prisotni v večjem obsegu na tumorskih celicah v primerjavi z zdravimi celicami. Tipično na površino dostavnega sistema (npr. nanodelcev) vežemo različne ligande (npr. vitamini, peptidi, protitelesa oz. njihovi fragmenti), ki prepoznajo specifične receptorje na površini tumorskih celic in se nanje vežejo [5]. Pogosto so na tumorskih celicah v večjem obsegu izraženi receptorji za rastne dejavnike. Tak dostavni sistem prepozna tarčno mesto in se nanj veže, čemur sledi celični privzem bodisi preko receptorjev, mehanizma endocitoze, ali druge oblike vstopa v celico. Pomembno je načrtovati dostavni sistem, ki ZU sprosti šele po vstopu v celico. Področje raziskav, ki je usmerjeno v pripravo dostavnih sistemov za aktivno ciljanje specifičnih celic je zelo aktivno in hitro se razvijajoče. V tem okviru raziskovalci iščejo tudi rešitve, ki omogočajo nadzorovano sproščanje ZU iz dostavnih sistemov. Najpogosteje načrtujejo dostavne sisteme, ki sprostijo ZU pod vplivom encimov ali pa zaradi nizke vrednosti pH v tumorskem okolju [6].
1.1.1 Magnetno vodenje dostavnih sistemov z vgrajeno ZU
Lastnosti aktivnega ali pasivnega ciljanja lahko nadgradimo, če dostavni sistem z ZU razvijemo v obliko, ki je odzivna na zunanje magnetno polje. Tak sistem omogoča fizično premikanje dostavnega sistema z ZU in njegovo vodenje v tarčno tkivo s pomočjo zunanjega permanentnega magneta. Poleg magnetnega vodenja lahko tak nosilec s pomočjo magnetnega polja tudi kopičimo in zadržimo v tarčnem tkivu. Velik znanstveni izziv predstavlja sinteza ustrezno magnetno odzivnega sistema, saj je potrebno v majhen nosilec (< 100 nm) vgraditi večje število magnetnih nanodelcev (MND) kot tudi ZU. Najnaprednejši magnetni nosilci omogočajo brezstično nadzorovano sproščanje ZU iz dostavnega sistema pod vplivom različnih magnetnih dražljajev. Izmenično magnetno polje (jakost ~ 20 mT) pri visokih frekvencah (>100 kHz) povzroči segrevanje magnetnega nosilca, ki lahko na tarčnem mestu nato sprosti vgrajeno ZU [7]. V zadnjih nekaj letih se raziskovalci intenzivno usmerjajo v pripravo magnetnih dostavnih sistemov anizotropnih (nesferičnih) oblik, pri čemer si obetajo nadzorovano sproščanje ZU na
3
osnovi magnetno mehanskega pristopa z vrtenjem magnetnega nosilca v rotirajočem magnetnem polju pri zelo nizkih frekvencah (~ < 20 Hz).
Torej, z magnetnim vodenjem dostavnih sistemov z ZU poskušamo nakopičiti ZU v tarčnem tkivu ter tako zmanjšati odmerek, ki je potreben za zdravljenje. Za zadržanje magnetnega dostavnega sistema na želenem mestu je potrebno zagotoviti ustrezno zunanje magnetno polje.
To lahko dosežemo s permanentnim magnetom, ki je nameščen na izbranem mestu ali s kirurškim vstavljanjem magneta ob določeno tkivo (po navadi tumorsko). Uporaba zunanjega magneta je možna le za obolela področja, ki so blizu površine kože (npr. rak vratu).
Predvidevajo, da bodo globlja tkiva dosegli z uporabo kirurško vstavljenih trajnih magnetov, pri čemer pa naj izpostavimo, da takšne dostave ZU v klinični praksi danes še ni [8].
Raziskovalci so postavljeni pred izzive, saj je potrebno razviti dovolj magnetno odzivne sisteme, ki bi jih s pomočjo manjših magnetnih polj uspeli brezstično nakopičiti v tarčnem tkivu [9].
Slika 1 prikazuje magnetne dostavne sisteme, ki prenašajo ZU po arteriji in jih zunanji magnet usmeri in zadrži v tarčnem tkivu.
Slika 1. Prikaz nalaganja dostavnega sistema z ZU na tarčnem mestu pod vplivom zunanjega magnetnega polja [prirejeno po 8]. (MND – magnetni nanodelci)
1.2 Nanodostavni sistemi
Hiter razvoj na področju nanotehnologije ponuja nove rešitve za izzive v zdravstvu [10], saj omogoča nove pristope za preprečevanje, diagnostiko in zdravljenje bolezni, pri čemer so takšne rešitve še posebej pomembne na področju ciljane dostave ZU. Uporabo nanotehnoloških pristopov na področju zdravstva in medicine imenujemo nanomedicina. Rešitve v okviru nanotehnologije pa temeljijo večinoma na uporabi nanodelcev, ki so delci organskega ali
4
anorganskega materiala v nanovelikosti (ena dimenzija nano sistema < 100 nm), kot tudi na izkoriščanju specifičnih učinkov, ki jih tako majhni delci izkazujejo [11].
Dostavne sisteme ZU v nanovelikosti imenujemo nanodostavni sistemi. To so nanomateriali, ki jih uporabljamo za transport ZU do tarčnega mesta v organizmu. Razvijamo in pripravljamo jih z namenom zaščite ZU pred biološkimi in okoljskimi dejavniki, pri čemer lahko omogočajo tudi nadzorovano sproščanje ZU na tarčnem mestu. Poleg ZU, ki so majhne organske molekule, lahko nanodostavni sistemi prenašajo tudi ZU, ki so večje molekule, kot so peptidi, proteini in nukleinske kisline [1].
Ena izmed možnosti, ki jih nanodostavni sistem omogoča, je povečanje biološke uporabnosti ZU, saj z vgrajevanjem ZU v nanodostavni sistem spremenimo (podaljšamo) čas zadrževanja ZU v krvnem obtoku in vplivamo na metabolizem in izločanje. Vgradnja ZU v nanodostavni sistem lahko poveča topnost ZU oziroma omogoča uporabo ZU, ki so sicer neuporabne zaradi neustreznih fizikalno kemijskih lastnosti. V primerno načrtovan nanodostavni sistem lahko na primer vgradimo hidrofobne ZU, ki so visoko potentne, vendar so povsem neustrezne za pripravo konvencionalnih farmacevtskih oblik. Nanodostavni sistemi zmanjšajo tudi neželene stranske učinke vgrajene ZU, saj le-to dostavijo na tarčno mesto, tako da ZU deluje selektivno na tarčo, ter omogočajo uporabo nižjih odmerkov, kar posledično zmanjša toksičnost [12].
Nanodostavni sistemi morajo glede varnosti ustrezati vsem zahtevam tako kot konvencionalne farmacevtske oblike, torej morajo biti biokompatibilni in zaželeno je, da so tudi biorazgradljivi [13].
V razvoju nanodostavnih sistemov so raziskovalci v preteklosti posvečali veliko pozornosti organskim materialom, pri katerih pa je bil prehod v klinično uporabo težaven, saj imajo nanodostavni sistemi pogosto majhno kapaciteto za vgradnjo ZU in so slabo koloidno stabilni.
Anorganski materiali v obliki nanokristalov imajo v številnih primerih zelo zanimive in uporabne lastnosti, ki jih pri organskih materialih ne moremo zagotoviti. Primer anorganskega nanomateriala so MND. Njihove magnetne lastnosti omogočajo njihovo manipulacijo na daljavo z zunanjimi magnetnimi polji [9]. Zanimive in uporabne lastnosti, ki so posledica nanometrske velikosti delcev, so poleg magnetnih lastnosti tudi optične lastnosti zlatih nanodelcev, kvantnih pik, »upconverting« nanodelcev in drugih. V zadnjem desetletju pa so raziskave usmerjene v razvoj hibridnih nanomaterialov tj. materialov na osnovi kombinacije
5
anorganskih in organskih materialov, kjer povezava obeh komponent vodi v sinergije in izboljšano učinkovitost nanosistemov [14].
V naslednjih točkah so na kratko predstavljeni najpogosteje proučevani nanodostavni sistemi na osnovi organskih materialov:
1. LIPOSOMI so sferični vezikli, ki omogočajo dostavo različnih vrst ZU. Liposome sestavlja eden ali več lipidnih dvoslojev, pri čemer pa vsebujejo temu enako število prostorov z vodo.
So klinično najbolj uveljavljeni nanodostavni sistemi, saj so biorazgradljivi in omogočajo vgradnjo tako hidrofilnih kot tudi hidrofobnih molekul ZU. Trenutno je v uporabi več zdravil, ki temeljijo na liposomih, še več pa jih je v različnih fazah kliničnih preizkušanj [1, 15].
2. MICELI spontano nastanejo v vodnem mediju iz amfifilnih vodotopnih polimerov, z maščobnimi kislinami in površinsko aktivnimi snovmi (PAS). V vodnem okolju se spontano uredijo tako, da je jedro hidrofobno, zunanjost pa hidrofilna. Hidrofobno jedro micelov je mesto, kamor vgradimo slabo vodotopne učinkovine ali pa amfifilne učinkovine, ki se vgradijo na medfazo in so tako zaščitene pred vodnim okoljem [1, 15].
3. DENDRIMERI so polimerne razvejane (makro)molekule, ki so strukturno simetrične.
Tvorijo jih monomeri, ki se ponavljajoče izgrajujejo radialno iz jedra. Sintezni pristopi omogočajo prilagajanje kemijske sestave, kot tudi spreminjanje njihove velikosti in posledično molekulske mase. Hidrofobne ZU lahko vgradimo v njihovo hidrofobno notranjost, pri čemer je možno ZU (hidrofilno) vključiti oziroma vezati tudi na razvejano površino [1, 15].
4. POLIMERNI NANODELCI so lahko nanosfere ali nanokapsule. Nanosfere so polimerni delci ogrodnega tipa, nanokapsule pa so zgrajene iz sredice, ki je rezervoar učinkovine, in polimerne membrane [1, 15].
5. TRDNE LIPIDNE NANODELCE navadno pripravimo z dispergiranjem staljenih trdnih lipidov v vodno fazo, pri čemer so za stabilizacijo disperzije dodani emulgatorji. Največkrat jih pripravimo z metodo, ki temelji na mikroemulziji, ali s homogeniziranjem pod visokim tlakom. ZU so v ogrodju trdnih lipidnih nanodelcev raztopljene ali dispergirane. V trdne lipidne nanodelce najpogosteje vgrajujemo lipofilne ZU, vgradimo pa lahko tudi hidrofilne ZU. Prednost tega nanodostavnega sistema je v tem, da so sestavljeni iz fiziološko sprejemljivih lipidov, kar je ugodno z vidika nizke toksičnosti. Pri njihovi izdelavi, podobno kot pri ostalih nanodostavnih sistemih, se kolikor je mogoče izogibamo uporabi organskih
6
topil. Steriliziramo jih lahko z avtoklaviranjem (če so stabilizirani s sojinim lecitinom), kar je pomembno za pripravo farmacevtskih oblik za parenteralno uporabo kot tudi uporabo na očesni sluznici [16].
6. NANODOSTAVNI SISTEMI NA OSNOVI OGLJIKA izkazujejo odlične optično- elektronske, mehanske in kemične lastnosti. Mednje uvrščamo fulerene, ogljikove nanocevke in nanodiamante. Te nanodostavne sisteme lahko kemijsko modificiramo na način, da na površino izpostavimo (vežemo) določene funkcionalne skupine, ki povečajo topnost nanodostavnega sistema, vezavo ZU na površino in izboljšajo biokompatibilnost nanodostavnega sistema [1, 15].
1.3 Magnetni nanodelci (MND)
MND so majhni delci (navadno manjši od 30 nm) v kristalni obliki. Njihove magnetne lastnosti so v veliki meri odvisne od velikosti nanokristalov. V osnovi ločimo MND na osnovi kovin in kovinskih oksidov. V biomedicini najpogosteje uporabljajo oksidne nanodelce, in sicer predvsem železova oksida magnetita (Fe3O4) in njegove oksidirane oblike maghemita (γ-Fe2O3).
Pomembno je, da nanodelci niso toksični, zato kljub boljšim magnetnim lastnostim za uporabo niso primerni reaktivni kovinski nanodelci ali oksidi, ki vsebujejo kobalt. Pomembni dejavniki biokompatibilnosti so poleg kemične sestave tudi velikost nanodelcev in sestava obloge, če je prisotna, ter narava površine, ki je v stiku z biološkim okoljem [17].
Ključna lastnost MND je možnost njihove brezstične manipulacije z uporabo magnetnega polja.
Magnetne lastnosti, ki so pri načrtovanju in razvoju MND ključnega pomena, pa so podrobneje predstavljene v naslednjem poglavju.
Zaradi široke uporabe MND na različnih področjih tehnike, biomedicine, biotehnologije, inženirstva, okolja in drugih, je bilo v zadnjih desetletjih veliko pozornosti namenjene učinkovitim postopkom sinteze MND, ki omogočajo njihovo pripravo na veliki skali. Z razumevanjem sinteznih postopkov priprave MND lahko vplivamo na obliko, velikost, porazdelitev velikosti, površinsko kemijo nanodelcev in posledično na njihove magnetne lastnosti [18]. Zaželena je priprava monodisperznih nanokristalov, saj so magnetne lastnosti močno odvisne od dimenzij MND. Še posebej za uporabo v biomedicini si želimo monodisperzne nanodelce, saj tako lažje prilagodimo njihove lastnosti zahtevani aplikaciji [19].
7
Glede velikosti MND pa je potrebno poleg vpliva velikosti na magnetne lastnosti upoštevati tudi omejitve, ki jih določa področje njihove uporabe v biomedicini npr. parenteralna uporaba MND.
Pogosto je pri načrtovanju potreben kompromis med magnetnimi lastnostmi in izpolnjevanjem biomedicinskih zahtev, saj imajo večji MND boljše magnetne lastnosti in so obenem manj primerni za npr. pareneteralno uporabo (injiciranje v krvni obtok), saj obstaja potencialna možnost zamašitve kapilar s takšnimi delci v organih in tkivih [20].
MND so danes že v klinični uporabi, in sicer jih uporabljamo kot kontrastna sredstva za magnetno resonančno slikanje, za nadomeščanje železa pri anemijah, povezanih s pomanjkanjem železa, in v terapiji glioblastoma z magnetno hipertermijo [21, 22]. Glede na namen uporabe MND je treba prilagoditi vse korake priprave MND od načrtovanja in izvedbe sinteze, končne velikosti MND do obdelave njihove površine, ki je po aplikaciji v stiku z biološkim okoljem. Ne glede na namen uporabe MND, tako v tehniki kot v medicini, je potrebno zagotoviti koloidno stabilnost disperzije MND.
1.4 Magnetizem in superparamagnetni nanodelci železovega oksida
MND je zelo širok pojem, ki vključuje materiale z najrazličnejšimi magnetnimi lastnostmi.
Superparamagnetni nanodelci so MND, ki imajo zelo veliko magnetno susceptibilnost, saj že pri majhnih vrednostnih magnetnega polja magnetizacija doseže nasičenje. Pomembno pa je, da se v odsotnosti zunanjega magnetnega polja magnetizacija povrne na vrednost nič, torej tak material nima remanentne magnetizacije in koercitivnega polja. To je ključno za pripravo koloidno stabilnih suspenzij takšnih nanodelcev, saj se le-ti brez prisotnosti zunanjega magnetnega polja obnašajo kot nemagnetni (paramagnetni ali diamagnetni) delci.
Superparamagnetizem je pojav, ko se fero/ferimagnetne snovi obnašajo paramagnetno pod Curie-jevo temperaturo. Pojav je značilen za MND, manjše od določene kritične velikosti, pri določeni temperaturi. Pred podrobnejšo razlago je potrebno spoznati nekaj osnov magnetizma.
Magnetizacija (M) je definirana kot celotni magnetni moment atomov (m) na prostornino snovi (V), kot prikazuje spodnja enačba (enačba 1) [23]:
𝑀 = 𝑚
𝑉 (1) Različne snovi izkazujejo različno odzivnost na zunanje magnetno polje, odziv pa je odvisen od temperature, atomov, ki snov sestavljajo, in kristalne strukture snovi. Materiale lahko glede na
8
odvisnost magnetizacije (M) od jakosti magnetnega polja (H) razdelimo v več skupin. Vpeljati moramo novo brezdimenzijsko količino, magnetno susceptibilnost (χ), ki je sorazmernostni koeficient med H in M, kot prikazuje enačba 2 [23].
𝜒 =𝑀
𝐻 (2) Večina materialov v prisotnosti zunanjega magnetnega polja izkazuje izredno šibek magnetni odziv. Zaradi majhne magnetne susceptibilnosti uvrščamo takšne materiale med paramagnetne materiale. To so materiali, ki so nemagnetni in imajo zelo majhno vendar pozitivno magnetno susceptibilnost. Za magnetne materiale (fero- in ferimagnetne) je značilno urejeno stanje spinov elektronov, torej so urejeni tudi ob odsotnosti zunanjega magnetnega polja. Sestavljeni so iz magnetnih domen (področja magnetnih momentov z enako orientacijo), pri čemer izkazujejo remanentno magnetizacijo in koercitivno magnetno polje. Koercivnost (Hc) je jakost magnetnega polja, ki jo potrebujemo, da izničimo remanentno magnetizacijo feromagnetnega materiala [24].
Pri paramagnetnih materialih so magnetni momenti urejeni povsem naključno, a se v prisotnosti magnetnega polja uredijo paralelno glede na sile magnetnega polja. Po odstranitvi magnetnega polja se ureditev magnetnih momentov ne ohrani. Takšni materiali torej nimajo remanentne magnetizacije, koercivnosti in histerezne zanke [23].
Superparamagnetizem je pojav, ko se fero/ferimagnetne snovi nad kritično Curie-jevo temperaturo (Tc) obnašajo kot paramagnetne snovi. Ko zmanjšujemo fero/ferimagnetne nanodelce do neke mejne velikosti, ti delci postanejo pri kritični velikosti 15-20 nm superparamagnetni že pri sobni temperaturi. Superparamagnetni nanodelci železovega oksida (γ-Fe2O3 in Fe3O4) se najširše proučujejo. γ-Fe2O3 in Fe3O4 sta edina magnetna nanomateriala v klinični uporabi. Uporabljata se pri diagnostiki in zdravljenju tumorjev [3, 8].
Zaradi svojih nekoliko boljših magnetnih lastnosti so pogosteje v uporabi nanodelci magnetita, toda boljšo stabilnost izkazujejo nanodelci iz maghemita [20]. Magnetit je manj stabilen in spontano oksidira v maghemit. Težavo predstavljajo Fe2+ ioni, ki jih magnetit vsebuje, ti katalizirajo Fentonovo reakcijo (Fe2 + + H2O2 [vmesni kompleks] OH˙- + Fe3+ + OH- ) in posledično tvorbo reaktivnih kisikovih zvrsti v telesu. Z uvedbo ustrezne zaščitne obloge na nanodelcih lahko učinkovito preprečimo tvorbo le-teh [25].
9
1.4.1 Magnetni nanoskupki (MNS)
Potreba po pripravi majhnih nanodelcev, ki so primerni za parenteralno uporabo, in hkrati visoki magnetizaciji in magnetni odzivnosti nanodelcev z ohranjenim superparamagnetizmom so zahteve, ki si nasprotujejo. Za izkoriščanje magnetnega vodenja MND je potrebno zagotoviti dovolj veliko magnetno silo, ki deluje na nanodelec, da je le-te mogoče usmerjati po prostoru z zunanjim magnetom. Na magnetno silo ima velik vpliv velikost delcev, in sicer magnetna sila narašča eksponentno s premerom delcev na tretjo potenco. To pomeni, da v telesu lažje magnetno vodimo delce, ki imajo čim večji volumen, torej večje delce. Težava pa je, da večji delci istega materiala z ohranjeno kristalno strukturo ne izkazujejo superparamagnetnih lastnosti, temveč so fero- ali ferimagnetni. To pomeni, da izkazujejo remanentno magnetizacijo, tj. magnetno agregirajo in jih je nemogoče pripraviti v obliki stabilnih koloidnih disperzij.
Raziskovalci so razvili postopek priprave nekoliko večjih magnetnih nanodelcev (nanostruktur), ki so sprejemljivi za biomedicinsko uporabo (velikost 100 - 150 nm) in imajo ohranjen superparamagnetizem. Rešitev temelji na izdelavi skupkov superparamagnetnih nanodelcev (magnetni nanoskupki, MNS), pri čemer tudi nastala nanostruktura ohrani superparamagnetizem kljub povečani velikosti delca. Takšni MNS tvorijo stabilno koloidno suspenzijo in so primerni za magnetno vodenje in magnetno dostavo učinkovin [26].
1.5 Magnetni nanodelci obdani z oblogo mezoporoznega silicijevega dioksida (silike)
Mezoporozen material je po IUPAC-u (Mednarodna zveza za čisto in uporabno kemijo) material, ki ima pore s premerom med 2 in 50 nm. MND z mezoporozno oblogo amorfnega silicijevega dioksida (silike) so nanokompoziti vrste jedro-lupina (ang. core-shell). Namen priprave mezoporoznih oblog na površini MND je povečana kapaciteta za vgradnjo različnih snovi, ki jih ne uporabljamo le na področju ciljane dostave ZU, temveč tudi na področju katalize in varovanja okolja [27]. Porozno oblogo iz silike na MND lahko uporabimo za različne aplikacije, saj imajo takšni kompoziti zelo veliko specifično površino in volumen por. Obenem je silika s strani ameriške agencije za zdravila (FDA) prepoznana kot varna (ang. generally recognized as safe, GRAS). V splošnem velja, da je silika biokompatibilen material, kar omogoča vgradnjo različnih molekul, pri čemer lahko prilagajamo velikost in obliko por ter
10
debelino obloge [28]. Raziskovalci so vložili veliko napora v iskanje različnih načinov sinteze mezoporoznih silik in še posebej v razumevanje postopkov, ki omogočajo nadzorovano pripravo radialno usmerjenih por z velikim premerom. Obvladovanje postopkov sinteze je torej ključno, saj lahko z uravnavanjem hitrosti katalitičnih reakcij sintetiziramo obloge z različno poroznostjo, kar omogoča pripravo dostavnih sistemov z različno kinetiko sproščanja vgrajene ZU [29]. Slika 2 prikazuje ključne sintezne stopnje, ki omogočajo pripravo najprej tanke neporozne obloge iz silike na površini MND in nato sintezo mezoporozne obloge iz silike.
Slika 2. Sinteza mezoporozne obloge iz silike na površini MND [prirejeno po 30]. (TEOS – tetraetoksisilan)
1.6 Vrste oblog na površini magnetnih nanodelcev
Zaradi potrebe po zmanjšanju obsega oz. odsotnosti agregacije nanodelcev ter za izboljšanje stabilnosti koloidne disperzije MND lahko površino nanodelcev obložimo z različnimi oblogami. Le-te omogočajo sterično in/ali elektrostatsko stabilizacijo koloidnih delcev v vodnih medijih ter uvedejo primerne funkcionalne skupine za nadaljnjo vezavo različnih molekul [31].
Obloge na nanodelcih določajo naravo interakcij nanodelcev z biološkim okoljem, zato morajo biti netoksične in biokompatibilne. Narava obloge lahko vpliva na čas zadrževanja nanodostavnega sistema v telesu, na hitrost izločanja nanodelcev iz telesa, kot tudi na porazdeljevanje in difuzijo nanodelcev v tkivih in organih. Pomembno je, da je obloga stabilna in se ne odstrani s površine nanodelcev [32].
11
V osnovi ločimo dve večji skupini oblog, in sicer organske in anorganske obloge. Med anorganske obloge spadajo obloge iz amorfnega silicijevega dioksida, ogljika, zlata in nekaterih drugih plemenitih kovin. Le-te zaščitijo nanodelce pred vplivi okolja. Tvorijo lahko tanke neporozne obloge, pri čemer nadzorovana sinteza zahteva veliko eksperimentalne optimizacije. Obloga iz ogljika zaščiti površino nanodelcev pred kemijskimi vplivi, pri čemer je zelo pomembno, da prepreči raztapljanje. Znano je, da se železovi oksidi v kislem hitro raztapljajo. Zelo pogoste so obloge iz silike, ki imajo na površini silanolne (Si-OH) skupine [33]. Cilj sinteze je čim tanjša in homogena obloga iz silike, saj se magnetne lastnosti kompozita slabšajo z debelino plasti diamagnetne silike. Najpomembnejša prednost obloge iz silike je možnost uvajanja različnih funkcionalnih skupin na površino delcev, kar omogoča nadaljnje kovalentne vezave z različnimi ligandi [27].
Med organske obloge uvrščamo predvsem obloge iz hidrofilnih sinteznih polimerov, kot so polietilenglikol (PEG), polietilenimin, polivinilalkohol in polimetakrilat [34, 35]. Organske obloge so večinoma adsorbirane na površino nanodelcev, torej je za njih značilna relativno šibka interakcija z atomi na površini nanodelcev. Pogosto uporabljamo obloge na osnovi ogljikovih hidratov ter njihovih derivatov. Namenjene so izdelavi biokompatibilnih nanosistemov in so del komercialne formulacije kontrastnega sredstva na osnovi nanodelcev železovega oksida za slikanje z magnetno resonanco [36]. Najpogosteje je za pripravo oblog v uporabi dekstran in njegovi karboksi ali amino derivati. Takšne obloge nanodelcev izkazujejo majhno toksičnost;
za delce s tako oblogo pa je značilen dolg čas zadrževanja v krvnem obtoku [25, 37].
Kot alternativa oblogam, ki se na površini nanodelcev naložijo v debelejšem sloju (običajno vsaj nekaj nanometrov), lahko na površino nanodelcev adsorbiramo snovi v monosloju. Te snovi imajo do površine nanokristalov veliko afiniteto. To so lahko strukturno zelo različne molekule in so lahko tako polimeri kot tudi PAS. Pomembno je, da vsebujejo strukturne dele z veliko afiniteto do železa, kot na primer kateholi, karbamati, karboksilati, fosfati, sulfati in nekatere druge skupine [25].
Za pripravo oblog iz silike uporabljamo prilagojen Stöberjev postopek sol-gel, ki temelji na hidrolizi tetraetoksisilana (TEOS; prekurzor), ter kondenzaciji nastalih prekurzorjev v siliko (kar prikazujeta spodnji kemijski enačbi):
Si(OEt)4 + H2O → Si(OH)4 + EtOH 2Si(OH)4 → (HO)3Si−O−Si(OH)3 + H2O
12
Silanolne skupine v silicijevi kislini (Si(OH)4) polimerizirajo v siloksanske vezi (Si-O-Si) in tako se tvori silika. Stöberjev postopek je bil razvit za sintezo nanodelcev silike, medtem ko je prilagojen postopek namenjen sintezi enakomernih oblog silike na površini nanodelcev. Slab nadzor postopka pogosto vodi v homogeno kondenzacijo silike in nastanek nanodelcev silike [38].
1.7 Funkcionalizacija površine magnetnih nanodelcev
Uporaba MND v biomedicini zahteva nadzorovane interakcije z biološkimi komponentami kot so kri in njene sestavine. Ker želimo zagotoviti selektivno in specifično prepoznavanje tarč z nanodostavnimi sistemi, je potrebno temu primerno prilagoditi površino nanodelcev. V ta namen je potrebno MND funkcionalizirati. To pa pomeni, da na površino uvedemo funkcionalne skupine, ki omogočajo tako zagotavljanje koloidne stabilnosti disperzije MND, vezavo afinitetnih ligandov in možnost vezave (tudi kovalentne) specifičnih molekul. Obstajajo številni pristopi, s katerimi lahko površino MND funkcionaliziramo. Uspešna vezava molekul za funkcionalizacijo na površino nanodelcev omogoča nadaljnjo vezavo ZU ali bioloških (makro)molekul. Torej za uporabo MND v biomedicini je potrebno na njihovo površino vezati različne molekule, ki jih narekuje nadaljnja uporaba samih MND. Potrebno je izbrati postopke, ki omogočajo dovolj stabilno funkcionalizacijo površine MND. Površina MND je lahko inertna in ne omogoča tvorbe močnih kovalentnih vezi. To težavo premostimo z rigidno oblogo na površini nanodelca, ki zagotovi možnost tvorbe kovalentnih vezi s površino obloge na nanodelcu. Kot smo že omenili, je najpogosteje uporabljen pristop oblaganje MND s siliko. Da lahko na površino silike vežemo različne molekule, jo najprej funkcionaliziramo. Torej vežemo molekule s funkcionalnimi skupinami, kot sta karboksilna (COOH) in amino skupina (NH2) ter številne druge [22, 17]. Želene funkcionalne skupine uvedemo z vezavo funkcionalnih alkoksi silanov, ki so navadno molekule s tremi alkoksi skupinami (pogoste so metoksi in etoksi skupine) ter eno alkilno verigo, ki ima na svojem koncu želeno funkcionalno skupino (preglednica I). Alkoksi silani hidrolizirajo v vodi in se nato spojijo s silanolnimi skupinami na površini silike, kar vodi v nastanek močne siloksanske (Si-O-Si) vezi [39].
Pogosto je pri MND za uporabo v biomedicini zaželeno, da na njihovo površino vežemo več različnih vrst (vsaj dve) organskih molekul. Da bi to zagotovili, najprej na obložene MND
13
uvedemo amino skupine s pomočjo (3-aminopropil)trietoksi silana (APS), nato pa na del površinskih amino skupin vežemo anhidrid sukcinske kisline (SA). Na tak način uvedemo na površino nanodelcev karboksilne skupine in tako spremenimo površinski naboj nanodelcem.
Na trgu obstaja tudi veliko različnih silanov za funkcionalizacijo, ki omogočajo uvedbo različnih funkcionalnih skupin na površino MND. Strukture nekaterih komercialno dostopnih silanov so prikazane v Preglednici I.
Preglednica I: Prikaz kemijskih struktur nekaterih na trgu prisotnih silanov z različnimi funkcionalnimi skupinami [40, 41].
STRUKTURNA FORMULA SILANA POIMENOVANJE
Akriloksitrimetilsilan
(3-acetamidopropil)trimetoksi silan
2-[acetoksi(polietilenoksi)propil]trietoksi silan
N-(2-aminoetil)-3-
aminoizobutildimetilmetoksi silan
14 Preglednica II: nadaljevanje.
STRUKTURNA FORMULA SILANA POIMENOVANJE
(3-merkaptopropil)trimetoksi silan
3-izocianatopropiltrietoksi silan
3-tiocianatopropiltrietoksi silan
1.8 Vgrajevanje zdravilnih učinkovin v ali adsorpcija na funkcionalizirane magnetne nanodelce
V različnih raziskavah so proučevali adsorpcijo ibuprofena (IBU) na funkcionalizirano površino mezoporozne silike. Predvidevali so, da se IBU na površino delcev veže preko interakcije karboksilne skupine s silanolno skupino silike. Če delci niso površinsko funkcionalizirani, se med karboksilno in silanolno skupino tvori le vodikova vez, ki je relativno šibka. Če pa površino
15
delcev funkcionaliziramo tako, da so na površini prisotne amino skupine, se med karboksilno in amino skupino tvori bistveno močnejša ionska vez [42]. Na sliki 3 lahko vidimo tvorbo vodikove vezi (zgoraj) med silanolnimi skupinami na površini MND in med IBU ter tvorbo ionske vezi (spodaj) med IBU in modificiranimi skupinami na MND.
Slika 3. Tvorba vodikove (zgoraj) in ionske vezi (spodaj) med funkcionalnim skupinami na površini MND in IBU [prirejeno po 42].
Za vgrajevanje ZU v magnetne nanodostavne sisteme je potrebno površino nanodostavnega sistema najprej kemijsko modificirati. Magnetni nanodostavni sistemi z vezano ZU lahko ciljano dostavijo ZU v tarčno (tumorsko) tkivo in tako povečajo lokalno koncentracijo ZU [22].
Poznamo več vrst vezave ZU na nanodostavne sisteme.
Doksorubicin je eden izmed najpogosteje uporabljenih kemoterapevtikov. Z uvedbo polimerne obloge na MND je možna interakcija med površino MND in prostimi amino in hidroksilnimi skupinami in π-elektroni ZU. Z magnetnim ciljanjem je učinkovitost zdravljenja z doksorubicinom lahko znatno izboljšana [43]. Tietze je skupaj s sodelavci pripravil MND, ki jih je funkcionaliziral z dvoslojem lavrinske kisline. V ta dvosloj so vgradili učinkovino mitoksantron, ki deluje proti raku [44]. Pogosto magnetne nanodostavne sisteme obložimo s
16
slojem poroznega materiala (običajno silike), v čigar pore se lahko vgradi ZU. Na tak način lahko ne le zaščitimo ZU pred razgradnjo, temveč zagotovimo tudi njeno nadzorovano sproščanje in zmanjšamo draženje netarčnega tkiva. Skupina raziskovalcev je pripravila majhne MND, ki so bili obdani s siliko. Nato so jih obložili še s slojem hidroksipropil celuloze. Tako so pripravili nanodostavne sisteme za vgradnjo ZU. V pore silike so vgradili gemcitabin. Po injiciranju v tumorsko tkivo so le-to izpostavili primernemu magnetnemu polju za generiranje hipertermije, kar je izboljšalo terapevtsko učinkovitost in vivo [45]. Kong je s sodelavci razvil votle magnetne nanokapsule, ki so jih obložili s silicijevim dioksidom, in v notranjost vgradili ZU. Nanokapsule lahko prodirajo v notranjost tumorjev, omogočajo lahko nadzorovano »vklop- izklop« sproščanje ZU [46]. Razvili so tudi magnetoliposome, ki so nanokompoziti magnetnih nanodelcev, ki jih obdaja fosfolipidni dvosloj. Njihova prednost je možnost vgradnje tako hidrofobnih kot tudi hidrofilnih ZU [47].
Pri kovalentni vezavi je ZU kovalentno vezana na površino magnetnega nanodostavnega sistema. Pomembno je, da se struktura ZU ne spremeni med kovalentno vezavo, saj bi se tako spremenila njena biološka aktivnost. Za vezavo ZU pogosto izberemo tvorbo amidne vezi, saj le-ta običajno ni nagnjena k hidrolizi pri nizkem pH (pri peroralni aplikaciji). Raziskovalci so pripravili nanodelce, ki so imeli na polietilenglikolski oblogi prisotne amino skupine. Nanje so vezali ZU metotreksat preko sukcinimidil estra. Ugotovili so, da se ti dostavni sistemi prednostno kopičijo in delujejo citotoksično v možganskih tumorskih celicah [48].
Poznani pa so tudi hibridni magnetni nanodostavni sistemi za dostavo ZU, ki združujejo tako nekovalentno kot tudi kovalentno vezavo ZU. Kot primer lahko navedemo delce, ki so jih razvili Gong s sodelavci [49]. Usmerjeni so na folatne receptorje in namenjeni dostavi doksorubicina, vgradili pa so jih v polimerne vezikle. Zaradi endocitoze preko folatnih receptorjev, so ti nanodostavni sistemi pokazali večji celični privzem v primerjavi z vezikli brez folne kisline na površini.
1.9 Presevna elektronska mikroskopija (TEM)
Nanodelci so manjši od meje detekcije optičnih mikroskopov in jih je zato potrebno analizirati z zmogljivejšimi elektronskimi mikroskopi. Presevna elektronska mikroskopija (TEM) je metoda, pri kateri snop elektronov preseva skozi tanek vzorec. Vir sevanja (elektronska puška)
17
ima elektronski mikroskop nameščen na vrhu naprave, in sicer je to kovinski (W žička ali kristal LaB6) filament. Le-ta ustvarja snop elektronov, s katerimi obstreljujemo vzorec in posledično generiramo sliko. Snop elektronov potuje skozi vakuum, ki je potreben za delovanje elektronske puške, obenem pa vakuum preprečuje sipanje elektronov na atomih zraka, kar bi sicer povzročilo artefakte na sliki. Žarek potuje skozi elektromagnetne leče, ki zberejo izsevane elektrone v ozek snop, ki potuje skozi vzorec, ki je nanešen na mrežico in vpet v poseben nosilec.
Tik pod vzorcem se nahaja zaslon na katerega »priletijo« elektroni, ki se niso absorbirali ali odbili od vzorca. Elektroni, ki se ne absorbirajo v vzorcu, torej zadenejo fluorescenten zaslon, ki se nahaja na spodnjem delu elektronskega mikroskopa, ter na njem generirajo svetlo področje.
Na sliki zaznamo svetlejša in temnejša področja zaradi različne elektronske gostote vzorca, debeline vzorca in faznega kontrasta. Temnejše slike na zaslonu predstavljajo gostejše dele vzorca, ki prepustijo manj elektronov snopa elektronov s katerim proučujemo vzorec. TEM je metoda, ki omogoča pridobitev podatkov o morfologiji, kristalni strukturi, površini in kemijski sestavi proučevanega vzorca [50].
1.10 Merjenje zeta potenciala delcev v disperziji
Koloidno stabilnost suspenzije nanodelcev lahko ovrednotimo z merjenjem zeta potenciala delcev. V večini primerov so suspendirani delci nabiti, s svojo nabito površino pa privlačijo delce z nasprotnim nabojem. Ioni blizu površine delca bodo močno vezani na njegovo površino in se bodo v električnem polju gibali skupaj z delcem. Ta sloj z močno vezanimi ioni imenujemo tudi Sternov sloj. Ioni, ki so od nabite površine delca bolj oddaljeni, so vezani manj močno. Ta sloj imenujemo difuzni sloj. Na neki razdalji od delca obstaja meja (še znotraj difuznega sloja) od katere naprej se ioni v električnem polju več ne gibajo skupaj z delcem. To mejo imenujemo strižna plast, na tej plasti pa obstaja električni potencial, ki ga imenujemo zeta potencial [51].
Za zagotovitev stabilnosti koloidne suspenzije je potrebno zagotoviti, da so odbojne sile med nanodelci večje od privlačnih (van der Waals-ovih). Zeta potencial določamo s pomočjo merjenja elektroforezne mobilnosti delcev v suspenziji. Omenjena metoda s pomočjo sipanja laserske svetlobe meri hitrost gibanja delcev, ki so suspendirani v tekočem mediju, v električnem polju. Na zeta potencial vplivajo predvsem pH, temperatura disperznega medija in koncentracija raztopljenih ionov. Koloidno suspenzijo lahko označimo kot koloidno stabilno,
18
če je njena absolutna vrednost zeta potenciala večja od 30 mV. Seveda pa absolutna vrednost zeta potenciala ni edino merilo koloidne stabilnosti, saj so nanodelci lahko tudi sterično stabilizirani z molekulami amfifilnih polimerov, ki ne vplivajo na zeta potencial delcev, temveč fizično onemogočijo približevanje delcev na kritično majhne razdalje, kar bi vodilo v agregiranje. Zeta potencial vedno podajamo skupaj z vrednostjo pH disperznega medija, v katerem so delci dispergirani. Pomembno je poznati vrednost pH disperznega medija, pri kateri zeta potencial doseže vrednost 0. Ta vrednost je imenovana izoelektrična točka. Pri tej vrednosti pH sistem izkazuje najmanjšo koloidno stabilnost [52].
Zeta potencial določimo tako, da razredčen vzorec suspenzije prelijemo v merilno kiveto, skozi njo pa prehaja žarek laserske svetlobe. Svetloba se razdeli na referenčni in vpadni žarek.
Svetloba se na nanodelcih v disperziji sipa. Zaradi električnega polja, kateremu je izpostavljen vzorec, se delci gibljejo proti nasprotno nabiti elektrodi, kar povzroči Dopplerjev efekt (spremeni se frekvenca sipane svetlobe). Frekvenca je sorazmerna hitrosti delcev, kar izmeri aparatura tj. zetasizer [51].
19
2 NAMEN DELA
Zastavljen cilj v okviru magistrske naloge je razvoj in sinteza MND, ki bodo primerni za vgrajevanje in magnetno ciljano dostavo ZU. Namen te naloge je načrtovanje, sinteza in funkcionalizacija magnetno vodljivih nanodelcev, medtem ko vgrajevanje ZU presega okvir te magistrske naloge. V okviru eksperimentalnega dela si bomo prizadevali pripraviti koloidno stabilne suspenzije, saj je to predpogoj za nadaljnji razvoj MND za uporabo v biomedicini.
Načrtovali in pripravili bomo magnetno vodljive nanoskupke, ki jih bomo obložili s tanko oblogo relativno neporoznega silicijevega dioksida (t.i. silike). Na to plast bomo dodali debelejšo plast mezoporozne silike, ki bo imela relativno velike in radialno usmerjene pore za vgradnjo ZU v okviru nadaljnjih raziskav. Sledila bo funkcionalizacija površine MND, pri čemer bomo na površino nanoskupkov, obdanih s porozno oblogo silike, uvedli različne funkcionalne skupine, npr. amino in karboksi, ter verige PEG (PEG-iliranje). PEG-iliranje lahko zagotovi ustrezno koloidno stabilnost suspenzij MND, kar je ključno pri procesu vgrajevanja ZU in njenem sproščanju na tarčnem mestu. Morfološko bomo ovrednotili MND s TEM, velikost por v oblogi iz silike pa s porozimetrijo (BET). Uspešnost funkcionalizacije površine MND bomo vrednotili s pomočjo meritev njihovega zeta potenciala. Porazdelitev hidrodinamskih velikosti MND bomo ovrednotili z dinamičnim sipanjem svetlobe (DLS).
Pripravljene suspenzije funkcionaliziranih MND bomo spremljali tudi vizualno ter opazovali morebiten pojav sedimentacije ali agregacije delcev.
20
3 MATERIALI 3.1 Materiali
Aceton (VWR, ZDA)
Amonijak (25% raztopina, Merck, Nemčija)
Amonijev nitrat (Merck, Nemčija)
Bromovodikova kislina (Merck, Nemčija)
Cetrimonijev bromid (CTAB, C19H42BrN, VWR, ZDA)
Cikloheksan (Carlo Erba, Španija)
Dimetilformamid (Merck, Nemčija)
Etanol (96%, Merck, Nemčija)
Klorovodikova kislina (Carlo Erba, Španija)
N,N-Diizopropiletilamin (DIPEA, Sigma-Aldrich, Nemčija)
Natrijev hidroksid (Fisher Chemical, ZDA)
PEG-Br (CH3-O-PEG-BR oz. ɑ-Methoxy-ω-bromo PEG; Rapp Polymere, Nemčija)
PEG-silan (Trimetoksisilil propoksipolietilenoksid metil eter, Gelest, ZDA)
Prečiščena voda (Millipore, fakulteta za farmacijo, Ljubljana, Slovenija)
Tetraetil ortosilikat (TEOS, Sigma Aldrich, Nemčija)
Trietanolamin (C6H15NO3, Sigma-Aldrich, Nemčija)
Tris(hidroksimetil)amino metan (TRIS, 99,8 %, ACROS ORGANICS, Belgija)
3.2 Laboratorijski pripomočki in oprema
Analitska tehtnica Mettler Toledo XS205 dual range (Mettler Toledo, Švica)
Analizator zeta potenciala Brookhaven Corp ZetaPALS Instrument
Analizator porazdelitve hidrodinamske velikosti delcev Analysette DynaSizer, Fritsch GmbH
Bakrena mrežica za analizo TEM
Centrifugirke (3 mL) (Eppendorf, Nemčija)
21
Centrifugirke s pokrovčkom (50 mL) (Techno Plastic Products, Švica)
Čaše
Grelna kalota
Laboratorijsko mešalo (IKA® RW 11 , Lab egg, Merck)
Magneti za magnetno mešanje
Magnetno mešalo IKA RCT basic (IKA WERKE, Nemčija)
Magnetometer z vibrirajočim vzorcem (VSM; ang. vibrating-sample magnetometer; Lake Shore 7307)
Mehanske mikropipete Biohit (10-100 μL in 100-1000 μL) (Biohit, Finska)
Merilni valj (10, 20, 50, 100, 250 in 500 mL)
Nastavki za pipete (Biohit, Finska)
Oljna kopel
Permanentni magnet (Neotexx, Nemčija)
pH-meter (Mettler Toledo)
Plastične kapalke (1 in 3 mL)
Porozimeter NOVA 2000e Quantachrome Instruments, Boynton Beach, ZDA
Steklene bučke (zaobljene in z ravnim dnom)
Steklene bučke s tremi vratovi
Štoparica
TEM mikroskop (Jeol JEM 2100, Japonska)
Termometer
Ultrazvočna kopel Iskra Sonis 4 (Iskra, Železniki, Slovenija)
Ultrazvočna sonda (Ultrasonic processor, Illinois, ZDA)
Viale (3 mL, 5 mL, 20 mL)
Vibracijsko mešalo Vibramix10 Vortex (Tehtnica Železniki, Slovenija)
Vodna kopel (B-721, Büchi, Švica)
22
4 EKSPERIMENTALNO DELO
Na spodnji shemi (slika 4) je predstavljen postopek priprave oblog iz amorfnega silicijevega dioksida na površini magnetnih nanoskupkov in funkcionalizacije njihove površine. Podrobnejši opisi posameznih sinteznih stopenj sledijo v naslednjih podpoglavjih.
Slika 4. Shematski prikaz ključnih sinteznih stopenj pri pripravi s silicijevim dioksidom obloženih magnetnih nanoskupkov (MNS).
4.1 Sinteza magnetnih nanoskupkov (MNS)
Sintezne postopke priprave magnetnih nanoskupkov so razvili raziskovalci Odseka za sintezo materialov, Inštitut Jožef Stefan, v sodelovanju z nanotehnološkim podjetjem Nanos SCI (Nanos Scientificae d.o.o.). Sinteza temelji na pripravi emulzije z nanometrsko velikostjo dispergiranih
23
kapljic. V notranjo oljno fazo dispergiramo magnetne nanodelce, zunanja faza pa je vodna raztopina PAS. Obe fazi združimo in pripravimo emulzijo, ki jo nato segrevamo in tako odstranimo lahko hlapno hidrofobno topilo iz notranjosti majhnih kapljic. Po koncu reakcije magnetno ločimo nastale skupke magnetnih nanodelcev z izpostavitvijo suspenzije zunanjemu gradientu magnetnega polja. Tako pripravljeni skupki magnetnih nanodelcev (MNS) so komercialno dostopni pod imenom iNANOvative™. Podrobni sintezni protokoli so ustrezno zaščiteni in jih posledično ne razkrivamo.
4.2 Sinteza primarne neporozne obloge iz silike na površini MNS
4.2.1 Postopek 1 (MNS-Si-1)
Volumen suspenzije MNS (40 mL, masa delcev = 1,8 g) smo uravnali na 600 mL s prečiščeno vodo, pri čemer je bila končna koncentracija MNS 3 mg/mL. To suspenzijo smo izpostavili mehanskemu mešanju s hitrostjo 450 obratov na minuto (rpm). Suspenziji smo nato uravnali vrednost pH na 2,9 z 0,1 M HBr. Posebej smo pripravili raztopino 6 mL TEOS in 14 mL EtOH (abs.) ter jo dodali k suspenziji MNS med mešanjem pri sobni temperaturi (~ 26 °C). Po eni uri mešanja smo suspenziji uravnali vrednost pH na 4,15 z raztopino NH3 ter nadalje mešali približno 12 ur. Nato smo uravnali vrednost pH na 8,5 in mešali dodatne tri ure ter ponovno uravnali pH na 9,5 z raztopino NH3, pri čemer smo reakcijsko zmes mešali nadaljnjih 12 ur.
Nato smo MNS iz suspenzije ločili tako, da smo reakcijsko zmes prelili v dve 250mL čaši, ki smo ju postavili na 2 permanentna magneta. Po pol ure smo supernatant odstranili, nanodelce pa dispergirali v 100 mL prečiščene vode in združili v 250mL čaši, disperzijo postavili na magnet ter počakali, da so se MNS posedli. Po spiranju smo MNS dispergirali v 20 mL prečiščene vode in jih shranili v centrifugirki.
4.2.2 Postopek 2 (MNS-Si-2)
Volumen suspenzije MNS (masa delcev = 0,9 g) smo uravnali na 15 mL s prečiščeno vodo, pri čemer je bila končna koncentracija MNS 60 mg/mL. Nato smo pripravili vodno raztopino heksadecil(trimetil)amonijevega bromida (CTAB) tako, da smo 0,8 mg CTAB raztopili v 75 mL prečiščene vode na grelni plošči (100 °C, 500 rpm). Raztopino smo odstavili s plošče in jo ohladili na sobno temperaturo, nato smo jo dopolnili do 150 mL (s prečiščeno vodo), nastavili
24
smo mešanje s propelerskim mešalom (250 rpm) ter znižali pH na 3,3 z 0,1 M HBr. V raztopino CTAB smo med mešanjem dodali 15 mL suspenzije MNS, ki smo jo nato dispergirali z uporabo ultrazvoka (UZ) 30 s. Znižali smo pH na 2,85 z 0,1 M HBr. Dodali smo 7,0 mL raztopine TEOS v 13 mL EtOH (abs.) ter začeli z merjenjem časa. Po 1 h smo dvignili pH na 5,0 z raztopino NH3. Nato smo mešali približno 12 ur na manjši hitrosti vrtenja mešala (100 rpm). Suspenzijo smo nato prelili v 600mL čašo ter postavili na permanentni magnet za približno 30 min.
Supernatant smo odstranili, sediment pa dispergirali v 20 mL prečiščene vode in ga shranili v centrifugirki.
4.3 Oblaganje MNS-Si-2 z mezoporozno oblogo iz silike
4.3.1 Postopek 1 - Sinteza MNS, obloženih s porozno oblogo iz silike (MNS-1por)
V bučki smo pripravili 45 mL vodne raztopine CTAB (0,11 g/mL) in v raztopino dodali 5 mL disperzije MNS s tanko neporozno oblogo iz silike MNS-Si-2 (masa delcev = 60 mg). Nato smo mešali na grelni plošči 5 min pri temperaturi 100 °C. Vročo raztopino smo sonicirali 30 s v UZ kadički. Bučko smo postavili na oljno kopel na 65 °C, mešanje nastavili na 900 rpm ter tako mešali 15 min. Nato smo dodali 120 μL trietanolamina (TEOA) in mešali nadaljnjih 10 min.
Nato smo dodali 166 μL TEOS-a, raztopljenega v 6 mL cikloheksana, in na vrh bučke pritrdili hladilnik. Po 1,5 h mešanja smo ponovno dodali 166 μL TEOS-a, raztopljenega v 6 mL cikloheksana. Nato smo disperzijo mešali na oljni kopeli (65 °C, 900 rpm) čez noč. Naslednji dan smo odstavili reakcijsko zmes ter jo izpostavili magnetnemu polju za približno 1 h.
Supernatant smo odstranili, sediment pa dispergirali v 100 mL prečiščene vode in ga še dvakrat sprali na enak način. Sediment po spiranju smo dispergirali v 35 mL prečiščene vode, disperzijo nakisali na pH 3,6 z 0,1 M HCl ter shranili v centrifugirki.
4.3.2 Postopek 2 - Sinteza MNS, obloženih s porozno oblogo iz silike (MNS-2por)
Pripravili smo 135 mL vodne raztopine CTAB (15,39 g) in v to dodali 7,5 mL disperzije MNS s tanko neporozno oblogo iz silike MNS-Si-2 (masa delcev = 180 mg). Nato smo mešali na grelni plošči 5 min na 100 °C. Nato smo raztopino prelili v 500mL bučko s tremi vratovi ter nastavili teflonsko mešalo. Zagnali smo temperaturni program na kaloti. Mešali smo s hitrostjo 400 rpm. Ko smo dosegli temperaturo 65 °C, smo mešali še 10 minut in nato dodali 360 μL
25
TEOA. Čez naslednjih 10 min smo dodali 499 μL TEOS-a, raztopljenega v 18 mL cikloheksana.
Namestili smo hladilnik in mešali 1,5 h. Po preteku časa smo ponovno dodali 499 μL TEOS-a, raztopljenega v 18 mL cikloheksana. Nato je sledilo mešanje čez noč. Naslednji dan smo prelili reakcijsko zmes iz bučke v 400mL čašo in posedali na permanentnem magnetu 2,5 h.
Supernatant smo odstranili, sediment pa dispergirali v prečiščeni vodi (V = 20 mL) in delce še dva-krat sprali po enakem postopku. Sediment po spiranju smo dispergirali v 35 mL prečiščene vode, disperzijo nakisali na pH 3,6 z 0,1 M HCl ter shranili v centrifugirki.
4.3.3 Postopek 3 - Sinteza MNS, obloženih s porozno oblogo iz silike (MNS-3por) Pripravili smo 138 mL vodne raztopine CTAB (15,39 g) v 500 mL bučki z ravnim dnom in v to dodali suspenzijo (V = 4,0 mL) MNS s tanko neporozno oblogo iz silike MNS-Si-2 (masa delcev
= 180 mg). Nato smo mešali na grelni plošči 5 min pri 100 °C. V suspenzijo smo med mešanjem dodali 329 mg tris(hidroksimetil)aminometana (TRIS). Bučko smo postavili v UZ-kopel za 30 s. Nato smo bučko postavili na oljno kopel (temperatura 65 °C in mešanje s hitrostjo 700 rpm).
Nato smo v bučko dodali 500 μL TEOS-a raztopljenega, v 18 mL cikloheksana. Na bučko smo nastavili vodni hladilnik in pustili mešati še 1,5 h. Nato je sledil še drugi dodatek TEOS-a (500 μL) v cikloheksanu (18 mL). Reakcijsko zmes smo mešali čez noč na oljni kopeli (temperatura 65 °C in mešanje s hitrostjo 700 rpm). Naslednji dan smo bučko odstavili z oljne kopeli in jo ohladili. Suspenzijo smo centrifugirali 15 min pri 14.000 rpm. Supernatant smo odlili, sedimentirane nanoskupke pa še dvakrat sprali s prečiščeno vodo po enakem postopku.
Sediment smo dispergirali v 35 mL prečiščene vode, disperzijo nakisali na pH 3,6 z 0,1 M HCl ter shranili v centrifugirki.
4.4 Odstranjevanje površinsko aktivnih snovi po sintezi mezoporoznih oblog iz silike
Namen odstranjevanja PAS iz mezoporozne obloge iz silike je izboljšanje koloidne stabilnosti delcev in posledično izboljšana učinkovitost nadaljnjih reakcij funkcionalizacije MNS.
Preprosto spiranje delcev s prečiščeno vodo ni dovolj, saj na ta način ni mogoče kvantitativno odstraniti PAS iz obloge in por. Pri spiranju smo uporabljali zunanji permanentni magnet, ki ustvari magnetno polje, da se MNS ločijo iz suspenzije. Jakost magnetnega polja na površini
