UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
SARA ČEBAŠEK
MAGISTRSKA NALOGA
MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM INDUSTRIJSKA FARMACIJA
Ljubljana, 2021
SARA ČEBAŠEK
ANALIZA LITERATURNIH PODATKOV O FIZIOLOŠKIH KONCENTRACIJAH SOLI ŽOLČNIH KISLIN IN
FOSFOLIPIDOV V TANKEM ČREVESU TER PREUČEVANJE SPROŠČANJA IZ SAMO-
MIKROEMULGIRAJOČIH SISTEMOV
LITERATURE ANALYSIS OF PHYSIOLOGICAL VALUES OF BILE SALTS AND PHOSPHOLIPIDS IN SMALL
INTESTINE AND RELEASE STUDY FROM SELF- MICROEMULSIFYING SYSTEMS
MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM INDUSTRIJSKA FARMACIJA
Ljubljana, 2021
Magistrsko nalogo sem opravljala na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani, na Katedri za biofarmacijo in farmakokinetiko, pod mentorstvom prof. dr. Marije Bogataj, mag. farm.
in somentorstvom asist. Katarine Rede, mag. farm.
Zahvala
Zahvaljujem se mentorici, prof. dr. Mariji Bogataj, mag. farm., za vso pomoč in strokovne nasvete pri izdelavi magistrske naloge. Iskrena zahvala gre tudi somentorici, asist. Katarini Rede, mag. farm., za njeno prijaznost, vso strokovno pomoč, vodenje in številne koristne nasvete pri izdelavi magistrske naloge.
Zahvaljujem se še družini in fantu Anžetu za vso podporo, ki so mi jo nudili tekom študija in med pisanjem naloge.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko nalogo izdelala samostojno, pod vodstvom mentorice prof. dr.
Marije Bogataj, mag. farm., in somentorice asist. Katarine Rede, mag. farm.
Sara Čebašek
Predsednik komisije: izr. prof. dr. Janez Mravljak, mag. farm.
Članica komisije: doc. dr. Špela Zupančič, mag. farm.
Ljubljana, 2021
i
Kazalo vsebine
Povzetek ... iii
Abstract ... iv
Seznam okrajšav ... v
Uvod ... 1
1.1. Žolč ... 1
1.2. Žolčne kisline: nastanek, kemijska struktura in razdelitev ... 3
1.2.1. Nastanek žolčnih kislin ... 3
1.2.2. Kemijska struktura žolčnih kislin ... 3
1.2.3. Delitev žolčnih kislin ... 5
1.2.4. Žolčne kisline in soli žolčnih kislin ... 7
1.3. Fiziološke funkcije žolčnih kislin ... 7
1.4. Vloga žolčnih kislin pri prebavi in absorpciji maščob ... 8
1.5. Protimikrobne lastnosti žolčnih kislin ... 10
1.6. Fosfolipidi ... 10
1.7. Enterohepatična cirkulacija žolčnih kislin in fosfolipidov ... 12
1.8. Sinergistično delovanje žolčnih kislin in fosfolipidov ... 12
1.9. Samo-mikroemulgirajoči sistemi (SMES) ... 13
2. Namen dela ... 14
3. Materiali in metode ... 15
Analiza literaturnih podatkov ... 15
3.1.1. Materiali ... 15
3.1.2. Metode ... 15
3.1.2.1. Izbor ustreznih člankov ... 16
3.1.2.2. Analiza podatkov iz člankov ... 16
3.2. Laboratorijski del ... 18
3.2.1. Topila in reagenti ... 18
3.2.2. Aparature in materiali ... 19
3.2.3. Metode ... 19
3.2.3.1. Priprava medijev in mobilnih faz ... 19
3.2.3.2. Dostavni sistem ... 20
3.2.3.3. Priprava raztopin standardov in umeritvenih premic ... 21
3.2.3.4. Testi sproščanja – potek dela... 22
3.2.3.5. Analiza vzorcev ... 23
3.2.3.6. Izračun parametrov sproščanja ter osmolalnosti medijev ... 24
ii
4. Rezultati in razprava ... 26
4.1. Analiza literature ... 26
4.1.1. Porazdelitev glede na leto objave članka ... 27
4.1.2. Splošne značilnosti izvedbe študij ... 28
4.1.3. Porazdelitev glede na pogoje meritev (na tešče/po obroku) ... 28
4.1.4. Koncentracija SŽK ... 30
4.1.4.1. Individualne vrednosti koncentracij SŽK ... 37
4.1.4.2. Koncentracija posameznih vrst SŽK ... 41
4.1.5. Koncentracija FL ... 43
4.1.5.1. Individualne vrednosti koncentracij FL ... 47
4.1.5.2. Koncentracija posameznih vrst FL ... 48
4.1.6. Osmolalnost ... 49
4.1.6.1. Individualne vrednosti osmolalnosti ... 53
4.1.7. Površinska napetost ... 55
4.1.7.1. Individualne vrednosti površinskih napetosti ... 56
4.1.8. Spol in starost prostovoljcev ... 57
4.1.9. Način vzorčenja ... 58
4.1.10. Mesto vzorčenja ... 59
4.1.11. Način shranjevanja vzorcev... 60
4.2. Laboratorijski del ... 60
4.2.1. Povezava med analizo literature in laboratorijskim delom naloge ... 60
4.2.2. Sproščanje ZU iz SMES ... 60
4.2.2.1. Dipiridamol ... 61
4.2.2.2. Dipiridamol brez dodatka 4-BBBA ... 63
4.2.2.3. Paracetamol ... 64
4.2.2.4. Natrijev diklofenakat ... 65
4.2.2.5. Sistemi SMES brez vgrajene ZU (prazni SMES) ... 67
5. Sklep ... 69
6. Literatura ... 71 7. Priloge ... I
iii
Povzetek
Razvoj peroralnih farmacevtskih oblik pogosto omejuje slaba topnost zdravilnih učinkovin.
Ena izmed rešitev je njihova vgradnja v samo-mikroemulgirajoče sisteme. Obnašanje le-teh in s tem zdravilnih učinkovin po peroralni aplikaciji je odvisno od pogojev v prebavnem traktu, na kar pomembno vplivajo fiziološke površinsko aktivne snovi. Poznavanje vpliva fizioloških parametrov je pomembno za optimizacijo in vitro metod za vrednotenje samo- mikroemulgirajočih sistemov. Namen magistrske naloge je bil najprej z analizo že objavljenih študij raziskati fiziološke koncentracije soli žolčnih kislin in fosfolipidov, osmolalnost in površinsko napetost prebavnih tekočin v tankem črevesu, ter nadalje eksperimentalno ovrednotiti sproščanje zdravilnih učinkovin iz samo-mikroemulgirajočih sistemov v različnih medijih.
S sistematičnim pregledom literature v podatkovni bazi Pubmed smo našli 32 člankov.
Koncentracije soli žolčnih kislin v tankem črevesu se na tešče gibajo med 2 in 6 mM, po obroku pa med 7 in 15 mM. Izmerjene koncentracije fosfolipidov so na tešče nižje od 1 mM, po obroku pa se gibljejo med 3 in 6 mM.
Testirali smo sproščanje treh različnih zdravilnih učinkovin (dipiridamol, paracetamol in natrijev diklofenakat), ki so bile vgrajene v modelni samo-mikroemulgirajoči sistem.
Testiranje sproščanja smo izvedli v raztopini HCl, fosfatnem pufru, tris-maleatnem pufru in prebavnem mediju. S tem smo želeli videti vpliv različnih medijev na sproščanje zdravilnih učinkovin z različnimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi iz samo-mikroemulgirajočih sistemov, predvsem z vidika vpliva prisotnosti ali odsotnosti površinsko aktivnih snovi v mediju. Te v primeru celokupnih vzorcev ne vplivajo na deleže sproščene zdravilnih učinkovin (dipiridamol), v primeru vodnih vzorcev pa je njihov vpliv dobro viden. Na podlagi deležev sproščene zdravilne učinkovine smo ugotovili, da so rezultati posledica kombinacije solubilizacije s samo-mikroemulgirajočimi sistemi in pH medija, ki vpliva na obnašanje zdravilnih učinkovin in površinsko aktivnih snovi. To dobro ponazarjajo predvsem celokupni vzorci, saj je v primeru slabe topnosti zdravilne učinkovine v mediju nižji tudi odstotek sproščene zdravilne učinkovine. Deleži sproščenih zdravilnih učinkovin so v primeru vodnih vzorcev nekoliko nižji, za kar bi razlog lahko bil, poleg solubilizacije s samo-mikroemulgirajočimi sistemi in pH, tudi dodatek 4-bromobenzenboronske kisline.
Ključne besede: dvanajstnik, soli žolčnih kislin, fosfolipidi, površinsko aktivna snov, samo- mikroemulgirajoči sistem (SMES).
iv
Abstract
The development of oral pharmaceutical forms has often been limited by the poor solubility of active pharmaceutical ingredients. One possible solution is incorporating them into self- microemulsifying systems. Their behaviour and behaviour of active pharmaceutical ingredient following an oral application depends on the conditions in the digestive tract; one of the important parameters are physiological surface-active agents. Knowledge of the effect of various physiological parameters is important for optimizing in vitro methods for evaluating self-microemulsifying systems. The purpose of the master's thesis was to first conduct a theoretical review of published studies and to search for the physiological concentrations of bile salts and phospholipids, osmolality, and the surface tension of digestive fluids in the small intestine, and, moreover, to experimentally evaluate the release of active pharmaceutical ingredient from self-microemulsifying system in various mediums.
A systematic review of literature in the Pubmed database yielded 32 articles. Concentrations of bile salts range between 2 and 6 mM fasted state and between 7 and 15 mM after a meal.
The release of three different active pharmaceutical ingredient (dipyridamole, paracetamol, and diclofenac sodium), which were incorporated into a model self-microemulsifying system, was tested. The release was tested in HCl solution, a phosphate buffer, a tris-maleate buffer, and a digestive medium. This was done to observe the effect of different media on the release of active pharmaceutical ingredient with different physical and chemical properties from self-microemulsifying system. In total samples these do not affect the proportions of released active pharmaceutical ingredient, but in case of water samples, their influence is clearly visible. Based on the proportions of released active pharmaceutical ingredient, we found that results are consequence of solubilization with self- microemulsifying system and pH of medium, which affect the behavior of active pharmaceutical ingredient and surface-active agent. This is well illustrated by the total samples, as in the case of poor solubility of active pharmaceutical ingredient in the medium, the percentage of released active pharmaceutical ingredient is also lower. The proportions of released active pharmaceutical ingredient are slightly lower in case of water samples, which could not only be due to solubilization with self-microemulsifying system and pH, but also to the addition of 4-bromobenzeneboronic acid.
Keywords: duodenum, bile salts, phospholipids, surface-active agent, self- microemulsifying systems (SMES).
v
Seznam okrajšav
4-BBBA 4-bromobenzenboronska kislina
AUC površina pod krivuljo (angl. Area under the Curve)
BCS biofarmacevtski klasifikacijski sistem (angl. Biopharmaceutics Classification System)
CMC kritična micelska koncentracija (angl. Critical micelle concentration) DPY dipiridamol
FaSSIF umetni črevesni sok, ki posnema pogoje na tešče (angl. Fasted State Simulated Intestinal Fluid)
FeSSIF umetni črevesni sok, ki posnema pogoje po obroku (angl. Fed State Simulated Intestinal Fluid)
FL fosfolipidi
GIT gastrointestinalni trakt
HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (angl. High-Performance liquid chromatography)
MF mobilna faza
Na-DI natrijev diklofenakat PAR paracetamol
PAS površinsko aktivna snov RSD relativni standardni odklon SD standardni odklon
SMES samo-mikroemulgirajoči sistem (angl. Self-Microemulsifying System) SŽK soli žolčnih kislin
TČ tanko črevo
ZU zdravilna učinkovina ŽK žolčne kisline
1
Uvod 1.1. Žolč
Žolč je prebavni sok, ki ima v telesu pomembno vlogo pri emulgiranju lipidov, kot so holesterol (iz prehrane), maščobe in v maščobah topni vitamini. Poleg tega ima pomembno vlogo pri izločanju snovi, ki so netopne in se ne morajo izločiti z urinom (npr. holesterol), dodatno pa s svojo protimikrobno aktivnostjo pomaga pri obrambi telesa pred mikroorganizmi (2). Žolč je rumeno-zelena vodna raztopina organskih in anorganskih spojin. V vodi, ki predstavlja skoraj 95 % njegove sestave, so prisotne žolčne kisline (ŽK), holesterol, fosfolipidi (FL) (predvsem fosfatidilholin), elektroliti (natrijevi, kalijevi in kloridni ioni) in pigment biliverdin. Sestava in lastnosti žolča so predstavljene v preglednici I. V žolč se izločajo tudi nekatere druge substance, kot so v vodi topni vitamini (folna kislina, kobalamin), v lipidih topni vitamini, kortikosteroidi, hormona progesteron in estrogen ter poleg teh še imunoglobulin A in mukus iz žolčnika, ki preprečujeta rast bakterij in njihovo adhezijo v žolčniku in skupnem žolčnem vodu (1, 2).
Preglednica I: Glavne sestavine in kemijske značilnosti žolča (prirejeno po 2).
SESTAVA IN LASTNOSTI ŽOLČA
Na+ (mmol/L) 145
K + (mmol/L) 4
Cl - (mmol/L) 90
ŽK (mmol/L) 40
Holesterol (mmol/L) 3
FL (mmol/L) 7
Suha snov (mg/ml) 20
Osmolalnost (mOsm/kg) 280
pH 7,5-8,0
Žolč se shranjuje v žolčniku. Gre za majhen organ hruškaste oblike, ki leži tik pod jetri.
Žolčnik s pomočjo Na+ K+ izmenjave (Na+ izstopa, K+ vstopa) in absorpcije vode skozi stene žolčnika iz žolča odstrani vodo in elektrolite, ter mu zniža pH vrednost. Pri tem nastaja žolčna kaša. Žolčnik za izločanje žolča sicer ni nujno potreben, vendar pa pomembno olajša njegovo skladiščenje. V fizioloških pogojih v žolčnik vstopa le približno polovica žolča (ta kasneje ob ustreznih pogojih potuje naprej v dvanajstnik) kjer se koncentrira in shranjuje, druga polovica pa ga zaobide, pri čemer ne vstopa v cistični kanal, temveč potuje direktno
2
po skupnem žolčnem vodu in prek Vaterjeve ampule vstopa neposredno v dvanajstnik ter se vključuje v enterohepatični cikel (2).
Odrasli ljudje proizvedejo približno 0,4−0,8 litra žolča na dan. Žolč se sintetizira v hepatocitih in se izloča v majhne kanalčke, imenovane žolčni kanalikuli. Kanalikuli se združijo v žolčne kanale, ki se nato spojijo v jetrne kanale. Skozi slednje žolč zapusti jetra, pri čemer pride do združitve jetrnih kanalov s cističnim kanalom iz žolčnika. Žolč s pomočjo peristaltike (krčenje mišic) prehaja iz cističnega kanala v žolčnik. Nadalje se jetrni kanal in cistični kanal povežeta v skupni žolčni vod. Žolč zapušča skupni žolčni vod in vstopa v dvanajstnik na točki, ki jo imenujemo velika dvanajstnikova papila. Natančneje gre za mesto, kjer razširjeni spoj pankreatičnega kanala in skupnega žolčnega voda vstopa v dvanajstnik.
Spoj imenujemo Vaterjeva ampula in se nahaja na veliki dvanajstnikovi papili. Sproščanje žolča v dvanajstnik regulira Oddijev sfinkter, ki obdaja veliko dvanajstnikovo papilo (slika 1). Pri sproščanju žolča v dvanajstnik ima pomembno vlogo peptidni hormon, imenovan holecistokinin, ki spodbuja krčenje žolčnika ter skupnega žolčnega voda. Pri tem pride do relaksacije Oddijevega sfinktra in povečanega sproščanja vsebine žolčnika v dvanajstnik, kar se v večjem obsegu dogaja predvsem po zaužitju hrane (1, 2, 3, 4).
Slika 1: Žolčni sistem. Žolč se sintetizira v jetrih, shranjuje in koncentrira v žolčniku ter ob ustreznih pogojih sprošča v dvanajstnik (povzeto po 2).
Lumen dvanajstnika
Oddijev sfinkter Žolčnik
Vaterjeva ampula
Pankreatični kanal Skupni žolčni vod
Cistični kanal
Jetra Jetrna kanala
Desni Levi
3
1.2. Žolčne kisline: nastanek, kemijska struktura in razdelitev 1.2.1. Nastanek žolčnih kislin
Žolčne kisline (ŽK) so pomembna sestavina žolča, saj predstavljajo skoraj 50 % vseh njegovih organskih komponent. Sintetizirajo se iz holesterola v jetrih (hepatocitih). Pravimo, da so ŽK končni produkt katabolizma holesterola in tudi najpomembnejša pot za izločanje holesterola iz telesa (nekaj se ga tudi samega izloči z žolčem). ŽK z žolčem preko skupnega žolčnega voda prehajajo v lumen dvanajstnika. Ko se ŽK izločijo v dvanajstnik, postanejo sestavni del micelov oziroma mešanih micelov, ki vključujejo tudi FL (najpogosteje fosfatidilholin) in sterole (večinoma holesterol) (4, 5). Da ŽK lahko opravljajo svoje naloge, mora biti njihova koncentracija v tankem črevesu (TČ) med 4 in 20 mM. Koncentracija ŽK zelo zavisi od časa po zaužitju obroka, saj je v stanju na tešče lahko 2,6 mM, po obroku pa se dvigne tudi nad 15 mM (6, 7). Koncentracija ŽK v dvanajstniku je običajno najvišja pol ure po zaužitem obroku, koncentracijskemu maksimumu pa sledi enakomeren padec koncentracije (3).
1.2.2. Kemijska struktura žolčnih kislin
ŽK so skupina ionskih amfifilnih molekul s specifično molekulsko strukturo. So namreč derivati 5-beta-holanske kisline s cis A-B obročnim stikom, kar rezultira v rahli ukrivljenosti steroidnega skeleta. Zato imajo molekule ŽK dve hemisferi, in sicer konveksno hidrofobno
stran, ki lahko vsebuje metilne skupine na mestih C-18 in C-19 ter konkavno hidrofilno stran, ki vsebuje eno do tri hidroksilne skupine. Na skelet je lahko vezan tudi fleksibilen alifatski rep, ki se konča s karboksilno skupino pri nekonjugiranih ŽK oziroma tavrinom ali glicinom pri konjugiranih ŽK (slika 2) (8). Steroidni skelet vsebuje tri šestčlenske obroče in en petčlenski obroč. V skupini klasičnih amfifilnih molekul polarno glavo običajno sestavlja razmeroma majhna polarna skupina, nepolarni rep pa je dolg prožen ogljikovodik. V nasprotju z njimi, ŽK zaradi svoje značilne zgradbe nimajo jasno opredeljenih skupin repa in glave. Hidrofilni in hidrofobni del kažeta ravninsko razporeditev, kar omogoča tem molekulam specifične interakcije z lipidi in drugimi komponentami hrane (4, 6, 8). Pri nastajanju micelov, hidrofilne hidroksilne skupine ŽK gledajo proti vodni fazi, medtem ko je hidrofobno steroidno jedro obrnjeno proti notranjosti micela. To omogoča ŽK vezavo prehranskih lipidov (5, 6, 7, 8). Poznamo več vrst ŽK, ki se razlikujejo po številu, položaju in stereokemiji hidroksilnih skupin ter vezani aminokislini (slika 3 in preglednica II) (1).
4
Slika 2: Prikaz skeleta ŽK, kjer rumeni del predstavlja hidrofobno stran, modri del pa hidrofilno
stran (8).
Slika 3: Shematska struktura žolčne kisline (ŽK) (prirejeno po 1, 6).
Preglednica II: Predstavitev soli žolčnih kislin (SŽK) ter njihove okrajšave. Oznake R1-R4 se nanašajo na sliko 3 (povzeto po 1).
Sol žolčne kisline Okrajšava R1
(C-3) R2
(C-7)
R3 (C-12) R4 (C-24)
Henodeoksiholat CDC OH OH H O-
Holat C OH OH OH O-
Ursodeoksiholat UDC OH OH H O-
Litoholat LC OH H H O-
Deoksiholat DC OH H OH O-
Glikoholat GC OH OH OH NHCH2COO-
Glikohenodeoksiholat GCDC OH OH H NHCH2COO-
Glikodeoksiholat GDC OH H OH NHCH2COO-
Glikolitoholat GLC OH H H NHCH2COO-
Glikoursodeoksiholat GUDC OH OH H NHCH2COO-
Tavroholat TC OH OH OH NHCH2CH2SO-3
Tavrohenodeoksoholat TCDC OH OH H NHCH2CH2SO-3
Tavrodeoksiholat TDC OH H OH NHCH2CH2SO-3
Tavroursodeoksiholat TUDC OH OH H NHCH2CH2SO-3
Tavrolitoholat TLC OH H H NHCH2CH2SO-3
5
1.2.3. Delitev žolčnih kislin
ŽK lahko delimo na dva načina, in sicer na primarne in sekundarne ŽK ter na konjugirane in nekonjugirane ŽK (1).
Prva razdelitev ŽK deli na primarne in sekundarne. Primarne ŽK se sintetizirajo v jetrih, encimi bakterij v lumnu črevesja pa jih lahko modificirajo na mestu 7 (OH skupina v primeru primarnih ŽK, H v primeru sekundarnih ŽK) v obročni strukturi kisline (slika 3), pri čemer se primarne ŽK pretvorijo v sekundarne ŽK (1, 2, 3, 5, 9).
Primarne ŽK se sintetizirajo de novo iz holesterola, pri čemer sodelujejo številni encimi.
Sinteza se prične s hidroksilacijo holesterola s holesterol-7α-hidrolazo, katere večja aktivnost se odraža v višji hitrosti nastajanja primarnih ŽK (4). Delovanje holesterol-7- hidrolaze je povezano s koncentracijo že prisotnih ŽK v telesu, zato pravimo, da je sinteza ŽK pod vplivom negativne povratne zanke. Primarne ŽK se v žolč prednostno izločajo z aktivnim transportnim mehanizmom (5). Pri večini primarnih ŽK pride najprej do konjugacije -COOH skupine in kovalentne vezave z aminokislinami (tavrin ali glicin) v jetrnih peroksisomih (podrobneje opisano v nadaljevanju tega poglavja), šele nato pa do njihovega aktivnega izločanja iz jeter v žolčnik in TČ. Pri ljudeh sta najpogostejši primarni ŽK holna kislina (CA) oz. njena sol holat (C) in henodeoksiholna kislina (CDCA) oz. njena sol henodeoksiholat (CDC) (1, 2, 5, 9).
Sekundarne ŽK nastajajo v debelem črevesu in terminalnem ileumu, kot posledica bakterijskega metabolizma. Za tvorbo sekundarnih ŽK je najpomembnejša reakcija dehidroksilacije. Nekatere anaerobne bakterije so namreč sposobne odstranjevanja hidroksilne skupine na sedmem C atomu (slika 3) primarnih nekonjugiranih ŽK. Pri tem prihaja do tvorbe novega kemijskega razreda deoksi ŽK (1). Poleg dehidroksilacije pa k tvorbi sekundarnih ŽK v manjši meri prispeva tudi bakterijska hidroliza amidne vezi konjugiranih ŽK. Pri ljudeh sta najpogostejši sekundarni ŽK deoksiholna kislina (DCA) oz.
njena sol deoksiholat (DC) in litoholna kislina (LCA) oz. njena sol litoholat (LC).
Sekundarne ŽK se absorbirajo v krvni obtok in z enterohepatično cirkulacijo zaokrožijo nazaj v jetra, kjer pride do njihove rekonjugacije. Potek je natančneje predstavljen v poglavju 1.7 (1, 9).
Druga delitev ŽK deli na konjugirane in nekonjugirane ŽK. Konjugacija karboksilnih skupin primarnih in sekundarnih ŽK z amidnimi skupinami glicina ali tavrina poteka v jetrih. V procesu konjugacije nastajajo glikokonjugati oziroma tavrokonjugati. V humanem žolču je
6
koncentracija glicinskih konjugatov veliko višja od tavrinskih kljub temu, da je koncentracija tavrina v jetrih višja od koncentracije glicina (2). Postopek konjugacije vodi v spremembo fizikalno-kemijskih lastnosti ŽK, vključno s povečanjem hidrofilnosti in vodotopnosti pri fizioloških vrednostih pH-jev, zmanjšanjem citotoksičnosti in znižanjem tendence obarjanja ŽK pri nizkih pH vrednostih. Koncentracija konjugiranih ŽK je mnogo višja od nekonjugiranih ŽK (4, 8). Konjugirane ŽK imajo večjo sposobnost solubilizacije v primerjavi z nekonjugiranimi ŽK, zato tudi konjugirane ŽK v večji meri pripomorejo k absorpciji lipidov iz hrane kot nekonjugirane ŽK (8).
V splošnem imajo primarne ŽK mnogo višje povprečne kritične micelske koncentracije (CMC) kot konjugirane primarne, sekundarne ali konjugirane sekundarne ŽK. Shema poti nastanka posameznih SŽK je prikazana na slikah 4 in 5.
Slika 4:Shema poti nastanka posameznih SŽK (povzeto po 5 in 10).
Slika 5: Shematski prikaz poti nastanka različnih primarnih, konjugiranih primarnih, sekundarnih in konjugiranih sekundarnih ŽK. V oklepajih so zapisani tudi odstotki SŽK v dvanajstniku, kjer so ti na voljo (povzeto po 4).
7
1.2.4. Žolčne kisline in soli žolčnih kislin
V literaturi glede imenovanja ŽK oziroma SŽK najdemo dve mnenji. Zastopniki prvega pravijo, da so konjugirane ŽK običajno v obliki soli v dvanajstniku, zanje se uporablja izraz SŽK. Večina člankov kot mejnik za ločevanje med ŽK in SŽK izpostavlja prehod skozi veliko dvanajstnikovo papilo oziroma natančneje Vaterjevo ampulo. Gre za mesto stika pankreatičnega kanala in skupnega žolčnega voda, kar je vidno kot majhna luknjica v steni dvanajstnika (slika 1) (4, 8). Ker je pKa konjugiranih ŽK nižji od pKa nekonjugiranih ŽK (preglednica III), konjugirane ŽK v dvanajstniku obstajajo v deprotonirani obliki.
Preglednica III: Primerjava pKa vrednosti holne kisline v odvisnosti od konjugacije (prirejeno po 4).
Žolčna kislina pKa
Konjugacija s tavrinom (tavroholna kislina oz. njena sol tavroholat) 2,0 Konjugacija z glicinom (glikoholna kislina oz. njena sol glikoholat) 3,9
Brez konjugacije (holna kislina oz. njena sol holat) 5,0
Zastopniki drugega mnenja pa pravijo, da za razlikovanje med izrazoma ŽK in SŽK ni pomembna konjugacija, temveč da so zaradi svojih šibkih kislinskih lastnosti ŽK pri fizioloških pogojih TČ prisotne pretežno v ionizirani obliki, torej kot SŽK, zato naj bi se v teh kontekstih uporabljal le izraz SŽK (8).
1.3. Fiziološke funkcije žolčnih kislin
ŽK so pomembno biološko orodje za absorpcijo hranil v TČ, izločanje lipidov, toksičnih primarnih metabolitov in ksenobiotikov iz črevesja. ŽK so pomembne tudi kot signalne molekule in regulatorji presnove, saj aktivirajo jedrne receptorje in z G proteini sklopljene receptorje (GPCR), ki so odgovorni za uravnavanje homeostaze glukoze v telesu (1, 4, 11).
ŽK so biološke površinsko aktivne snovi (PAS), natančneje steroidne PAS, ki imajo ključno vlogo pri prebavi in absorpciji hranilnih snovi. Njihova primarna funkcija je solubilizacija prehranskih lipidov in v lipidih topnih vitaminov v črevesju, transport le teh in pospeševanje njihove absorpcije skozi črevesni epitelij. S tem ŽK predstavljajo ključni element transportne poti od zaužitja hranil do njihove uspešne absorpcije v telo. Če ŽK ne bi imeli, bi se večina prehranskih lipidov neprebavljenih izločila v blato. ŽK so pomembne tudi zato, ker kot že omenjeno omogočajo izločanje odvečnega holesterola iz telesa ter hkrati preprečujejo obarjanje holesterola v žolčniku in s tem nastanek žolčnih kamnov (8, 11).
8
Vse to je pomembno tudi za farmacijo, saj je večina novih zdravilnih učinkovin (ZU) slabo topna v vodi. Novi dostavni sistemi izkoriščajo prednosti ŽK, saj te kot pomembne fiziološke PAS vplivajo na sproščanje ZU iz različnih dostavnih sistemov. S tem je omogočena uporaba takšnih ZU. Z namenom proučevanja njihovega vpliva se ŽK dodajajo tudi v medije za testiranje sproščanja. Čeprav poznamo tudi številne druge sintezne PAS s solubilizacijsko funkcijo primerljivo ŽK, pa je pomembna prednost ŽK predvsem ta, da so le-te biološke substance, naravno prisotne v telesu (8, 12).
1.4. Vloga žolčnih kislin pri prebavi in absorpciji maščob
Povprečen odrasli človek poje približno 150 g lipidov dnevno, katerih 95 % gradijo dolgoverižni trigliceridi in 4−8 g je FL, večinoma fosfatidilholina. Pri ljudeh se proces prebave lipidov začne že v ustih in se nadaljuje v želodcu in TČ (13, 14). Prebava lipidov v želodcu je sicer omejena, saj se tam razgradi le 10 – 30 % zaužitih lipidov, zato večji delež prebave (70–90 %) poteče v TČ. Ko se delno prebavljena hrana pomakne iz želodca v TČ, pride do mešanja z žolčem in izločki trebušne slinavke, pri čemer nastaja emulzija, ki jo stabilizirajo PAS (6, 14).
ŽK igrajo pomembno vlogo pri prebavi maščob. S svojimi značilnimi strukturami omogočajo zmanjšanje velikih maščobnih kroglic na drobne kapljice ter pomagajo pri zniževanju medfazne napetosti. Pri tem se povečuje celokupna površina maščob (poveča se razmerje med površino in volumnom), ki so tako bolj dostopne lipazam. ŽK delujejo tudi kot nosilci maščob, saj s solubilizacijo lipidov in tvorbo mešanih micelov omogočajo njihov transport vzdolž gastrointestinalnega trakta (GIT) (2, 6, 9).
Trigliceridi se v enterocite ne morejo absorbirati v njihovi naravni obliki, ampak morajo biti hidrolizirani, pri čemer iz ene molekule triglicerida nastaneta dve maščobni kislini in en 2- monoacilglicerol. V odsotnosti žolča v TČ je absorpcija trigliceridov z dolgoverižnimi maščobnimi kislinami približno 60−70 %. ŽK namreč zagotavljajo nastanek mešanih micelov, ki poleg ŽK in trigliceridov vsebujejo tudi holesterol in FL. Ti lipidni kompleksi olajšajo transport dolgoverižnih trigliceridov skozi mirujoč (angl. Unstirred water layer) vodni sloj, ki predstavlja glavno difuzijsko bariero med enterociti in lumnom črevesja. V odsotnosti žolča ne pride do nastanka mešanih micelov, zato tudi absorpcija trigliceridov ni popolna, je pa vseeno zadovoljiva (3, 15, 16).
Prebava lipidov je torej rezultat treh zaporednih korakov, in sicer:
9
1. dispergiranja maščob v drobnejše kapljice emulzije, 2. encimske hidrolize lipidov in
3. njihov prenos v limfatični sistem ali portalno kri, preko katerih poteče absorpcija lipidnih prebavnih produktov (13).
Pomembna je tudi vloga ŽK pri absorpciji drugih razredov lipidov, in sicer:
a) Holesterola
Znano je, da je topnost holesterola v vodi zelo slaba (približno 1 nM). Prenos holesterola iz črevesne vsebine do mukoznih celic črevesja je torej neposredno odvisen od emulgiranja in nastanka micelov, za kar so odgovorne predvsem komponente žolča. Prav ŽK (predvsem holna kislina) so tiste, brez katerih do absorpcije holesterola ne bi moglo priti, poleg njih pa ima pri tem zelo pomembno vlogo tudi v žolču prisoten fosfatidilholin (3, 15, 16).
b) V maščobah topnih vitaminov
Tako kot absorpcija holesterola je tudi absorpcija v maščobah topnih vitaminov močno odvisna od delovanja ŽK v lumnu črevesja. Pomanjkanje vitaminov A, D, E in K je vidno ob zmanjšanem izločanju ali popolni odsotnosti žolča (3).
c) Drugih skupin lipidov
Redkeje lahko zaužijemo tudi nekatere druge skupine lipidov, ki so bodisi normalno prisotni v prehrani ali pa so prisotni kot potencialno toksične substance. To so na primer skvalen, heksadekan, oktadekan in policiklični aromatski ogljikovodiki. V eni izmed študij so testirali njihovo sposobnost absorpcije v maščobah. Za nekatere izmed njih so dokazali, da je obseg absorpcije v raztopinah srednjeverižnih trigliceridov z dodatkom žolča zanemarljiv. V nasprotju z njimi pa je v raztopinah dolgoverižnih trigliceridov z dodatkom žolča absorpcija dobra. Danielsson s sodelavci je na podlagi dobljenih rezultatov predpostavil, da kombinacije nekaterih lipidov v raztopinah dolgoverižnih oziroma srednjeverižnih trigliceridov izkazujejo različno sposobnost tvorbe micelov. Ta je namreč ob dodatku žolča v primeru srednjeverižnih trigliceridov neustrezna, kar pa ne velja za dolgoverižne trigliceride (3). Avtorji objavljene študije menijo, da so ŽK nujne za absorpcijo lipidov iz prehrane, v primeru njihove odsotnosti pa pride do sprememb mehanizma absorpcije, s čimer se po drugi poti doseže vsaj delna absorpcija lipidov, ki je nujna za delovanje človeškega telesa (3).
10
1.5. Protimikrobne lastnosti žolčnih kislin
ŽK izkazujejo tudi protimikrobne lastnosti. Jakost delovanja žolča na bakterijske celične membrane je odvisna od koncentracije in sestave žolča ter zgradbe celične membrane.
Eksperimenti so pokazali, da visoke koncentracije ŽK lahko zlahka raztopijo membranske lipide ter povzročijo denaturacijo bakterijskih membranskih proteinov. Na drugi strani pa nizke koncentracije ŽK povzročajo spremembe v integriteti bakterijske membrane, predvsem spremembe v fluidnosti in prepustnosti membrane, kar onemogoča prekomerno rast bakterij v črevesju (2, 4).
Pomemben dejavnik vezave ŽK na bakterijske membranske lipide je hidrofobnost ŽK.
Konjugirane ŽK so pri fiziološkem pH popolnoma ionizirane, zato ostanejo na zunanji strani lipidnega dvosloja. V notranjost membrane lahko vstopijo le v primeru prisotnosti ustreznega transportnega mehanizma. Nekonjugirane ŽK pa zaradi svojih lastnosti lahko prehajajo skozi lipidni dvosloj celične membrane s pasivno difuzijo. Več kot ima ŽK hidroksilnih skupin, počasnejši je ta prehod (2).
1.6. Fosfolipidi
FL so glavna sestavina vseh bioloških membran. V membranah živih organizmov je najbolj razširjen fosfatidilholin (18, 19). FL so sestavljeni lipidi, kjer je alkohol (pri glicerofosfolipidih je to glicerol, pri sfingofosfolipidih pa sfingozin) zaestren z dvema maščobnima kislinama, na tretjem mestu pa s fosforno kislino, na katero je vezana polarna molekula, npr. holin. Dve maščobni kislini predstavljata hidrofobni, nepolarni del molekule.
Glicerol, fosfat in holin pa tvorijo hidrofilni, polarni del FL (slika 6) (17, 18, 19).
11
Slika 6: Shema strukture fosfolipida ter strukturi fosfatidilholina in lizofosfatidilholina (povzeto po 17).
V membranah živih organizmov je najbolj razširjen fosfatidilholin, ki sodi v skupino glicerofosfolipidov (18, 19).
Poznamo dva izvora FL, in sicer endogene FL, ki so človeku lastni ter eksogene FL, ki jih vnesemo s hrano. Prebava, absorpcija in metabolizem FL poteka enako za eksogene FL kot tudi za endogene FL, ki v črevesni lumen pridejo z žolčem. Človek v povprečju s hrano zaužije med 1,7 in 2,7 g FL na dan. Pri tem istem človeku pa se v žolč izloči okrog 11,4 g FL dnevno. Endogeni FL imajo torej kvantitativno gledano veliko večji pomen kot tisti, ki jih zaužijemo s hrano (19).
Poleg ŽK so FL najpomembnejše PAS v humanih prebavnih tekočinah, kamor se izločajo z žolčem. Vloga FL pri prebavi lipidov je bistvenega pomena za oblikovanje mešanih micelov z ŽK in prehranskimi lipidi v lumnu črevesja. Poleg tega tako kot ŽK tudi FL prispevajo k zmanjšanju velikosti maščobnih kapljic ter s tem povečanju njihove dostopnosti lipazam (18, 19, 20, 21, 22). Prevladujoči FL v črevesju je fosfatidilholin (trivialno ime je lecitin) in njegov hidrolizni produkt lizofosfatidilholin, katerih struktura je predstavljena na sliki 6. Ker je fosfatidilholin substrat za fosfolipaze in nespecifične lipaze, ki se izločajo iz trebušne slinavke, ves čas poteka njegova hidroliza, pri čemer nastaja lizofosfatidilholin. To je tudi razlog, da slednji v dvanajstniku prevladuje. V primerjavi s fosfatidilholinom ima lizofosfatidilholin višjo površinsko aktivnost in zato tudi nižji CMC. Zaradi zelo slabe topnosti v vodi (4,6 × 10-10 mol/L) fosfatidilholin prioritetno tvori vezikle (večplastne strukture) v vodnem mediju. Lizofosfatidilholin pa zaradi svoje večje polarnosti prioritetno
12
tvori micele (enoplastne strukture), raje kot vezikle, kar vpliva na boljšo stabilnost novonastalih struktur (7, 23).
1.7. Enterohepatična cirkulacija žolčnih kislin in fosfolipidov
Enterohepatična cirkulacija ŽK je zelo učinkovit in pomemben fiziološki mehanizem, ne le za absorpcijo hranil in odstranjevanje toksičnih snovi iz telesa, temveč tudi za vzdrževanje metabolizma lipidov in glukoze. ŽK, sintetizirane v jetrih, se preko žolča izločajo v TČ, reabsorbirajo v črevesju (terminalnem ileumu) in potujejo nazaj v jetra. To velja tako za konjugirane kot tudi nekonjugirane ŽK. V jetrih se ŽK zopet rekonjugirajo in ponovno izločijo v žolč, pri čemer pa v primeru nekonjugiranih ŽK najprej pride do konjugacije s tavrinom ali glicinom (4, 7, 24). Na tak način se reabsorbira približno 95 % ŽK, ostalih 5 % pa se izloči z blatom (med 0,3 in 0,6 g/dan). Izločene ŽK se nadomesti s sintezo novih ŽK, s čimer se vzdržuje konstanta koncentracija ŽK v človeškem telesu (2). Obseg enterohepatične cirkulacije je odvisen od števila obrokov in sestave zaužite hrane, v splošnem pa naj bi do opisanega procesa prišlo tri do petkrat po vsakem obroku oziroma od osem do desetkrat na dan (5, 9).
Do nedavnega ni bilo znano ali v telesu poleg enterohepatične cirkulacije ŽK, poteka tudi enterohepatična cirkulacija FL. Izvedena je bila študija na podganah, ki ta proces pri njih potrjuje (8, 19). V drugi študiji je analiza črevesne vsebine pri človeku, pridobljene po hranjenju z označenimi FL, pokazala obsežno hidrolizo žolčnih in prehranskih FL, ki je pomemben korak enterohepatične cirkulacije (19, 25). Avtorji izvedenih živalskih in humanih študij na podlagi dobljenih podatkov predpostavljajo, da enterohepatična cirkulacija FL v telesu zanesljivo poteka (15, 16, 19).
1.8. Sinergistično delovanje žolčnih kislin in fosfolipidov
Zaradi podobnih funkcij ŽK in FL, te pri opravljanju različnih nalog v telesu pogosto delujejo sinergistično. ŽK lahko adsorbirajo tudi snovi, ki že same po sebi delujejo kot PAS, kot so na primer FL. Pri tem pride do nastanka posebne vrste micelov, ki jih imenujemo mešani miceli (slika 7) (8). Solubilizacijski potencial takšnih micelov se v primerjavi z običajnimi miceli poveča za več kot trikrat (4).
13 Slika 7: Shema mešanega micela (povzeto po 7).
Sinergistično delovanje FL in ŽK je pomembno tudi z vidika citotoksičnosti. FL imajo namreč citoprotektivni učinek, saj ščitijo žolčevod pred citotoksičnim delovanjem ŽK.
Zaradi velike površinske aktivnosti ŽK, te sicer lahko poškodujejo epitelijske celice žolčevoda, kar lahko vodi v pojav različnih okvar in bolezni. S tvorbo mešanih micelov se zmanjša aktivnost ŽK, da do teh poškodb ne pride (5, 21).
1.9. Samo-mikroemulgirajoči sistemi (SMES)
Samo-mikroemulgirajoči sistemi (SMES) predstavljajo obetaven način za reševanje težav povezanih s slabo topnostjo ZU. Gre za lipidne dostavne sisteme, ki pod vplivom peristaltičnega gibanja želodca in črevesja tvorijo mikroemulzije tipa O/V. V SMES vgrajene ZU so že raztopljene, s čimer se izognemo raztapljanju v GIT, ki v primeru slabo topnih ZU pogosto predstavlja dejavnik, ki zmanjšuje biološko uporabnost ZU (26, 27). Po svoji definiciji so SMES izotropne zmesi lipidov, PAS, vsaj enega hidrofilnega topila ali koemulgatorja in ZU (12, 28). ZU, ki je vgrajena v SMES po vnosu zelo hitro zapusti želodec in se porazdeli po prebavnem traktu (29). Kapljice, ki pri tem nastajajo, so manjše od 100 nm, kar je njihova pomembna lastnost. Seveda pa je za doseganje takšnih učinkov potreben skrben izbor ustreznih kombinacij komponent, ki tvorijo SMES ter premišljena vgradnja ustreznih ZU vanje (12). Zaradi svoje lipidne sestave se tudi komponente SMES vključujejo v mešane micele, s čimer je dosežena hitra in učinkovita absorpcija vgrajenih ZU. Kljub številnim obetavnim prednostim SMES pa zaenkrat ni na voljo dovolj in vitro metod, ki bi bile ustrezne za vrednotenje SMES. V ta namen poteka intenziven razvoj novih metod, ki bodo v večji meri napovedovale, kaj se dogaja s SMES po peroralni aplikaciji (30).
hidrofobni del
14
2. Namen dela
Farmacevtski razvoj se v zadnjem času pogosto sooča z odkritji slabo vodotopnih zdravilnih učinkovin (ZU). Tovrstne težave farmacevtska industrija rešuje na različne načine, mednje spada tudi razvoj novih farmacevtskih oblik, ki izboljšujejo biološko uporabnost takšnih ZU.
Ena izmed opcij so samo-mikroemulgirajoči sistemi (SMES). Razvoj oziroma optimizacija in vitro modela za testiranje sproščanja iz SMES je ključnega pomena za uspešno biofarmacevtsko vrednotenje, čemur smo želeli pripomoči tudi s to magistrsko nalogo. Njen namen je najprej z literaturnim pregledom že objavljenih raziskav preučiti sestavo prebavnih tekočin v tankem črevesu (TČ), natančneje koncentracijo SŽK in FL ter osmolalnost in površinsko napetost tekočin v TČ ter ugotoviti, kateri izmed teh parametrov bi lahko vplivali na sproščanje iz modelnih SMES-ov. Nadalje, v laboratorijskem delu bomo testirali sproščanje iz modelnega SMES-a z vgrajenimi učinkovinami z različnimi fizikalno- kemijskimi lastnostmi, kar bomo izvajali v različnih testnih medijih, pri čemer bodo v nekatere medije vključene površinsko aktivne snovi (PAS), v druge pa ne. S tem bomo pripomogli k razvoju oziroma optimizaciji in vitro modela za testiranje sproščanja.
Pri analizi literaturnih podatkov bomo skušali najti čim več raziskav v podatkovni bazi Pubmed, kjer so se ukvarjali z ugotavljanjem sestave prebavnih tekočin v TČ, s poudarkom predvsem na koncentracijah soli žolčnih kislin (SŽK) in fosfolipidov (FL) ter vrednostmi osmolalnosti in površinske napetosti. S tem bomo dobili informacijo o morebitnem vplivu teh parametrov na sproščanje ZU iz sistemov SMES, saj bo to osnova za oblikovanje načrta in vitro testiranj sproščanja. Nadalje bomo ugotavljali tudi v kakšnem stanju so raziskovalci izvajali vzorčenje (na tešče/po obroku), kakšen način vzorčenja so izbrali, kako so vzorce shranjevali ter morebiten vpliv spola in starosti prostovoljcev na meritve. Podatke bomo izpisali, uredili in ustrezno ovrednotili.
V sklopu laboratorijskega dela bomo določali delež sproščene učinkovine iz SMES-ov, v katere bomo posamezno vgradili tri različne ZU. Sproščanje bomo spremljali v štirih različnih medijih pri čemer bosta v enega izmed njih dodana tudi SŽK (natrijev deoksiholat) in FL (fosfatidilholin). Koncentracijo ZU v vzorcih bomo določali s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC). Pri tem bomo pozorni predvsem na razlike v obnašanju SMES z različnimi ZU v različnih medijih in na sproščanje vgrajenih ZU iz modelnih SMES.
15
3. Materiali in metode
Analiza literaturnih podatkov 3.1.1. Materiali
• Engauge Digitizer, verzija 12.1, Mark Mitchell,
• Pubmed, Ameriška nacionalna knjižnica za medicino, januar 1996.
3.1.2. Metode
Sistematični pregled literature smo izvedli v podatkovni zbirki Pubmed. Iskali smo članke o fizioloških koncentracijah FL in SŽK ter vrste posameznih komponent v TČ, poleg tega pa tudi površinsko napetost in osmolalnost prebavnih tekočin v TČ.
Ker smo želeli dobiti čim večje število uporabnih zadetkov, smo ključne besede iskali v vseh delih članka (naslov, povzetek, ključne besede itd.), zato smo jih v iskalnem nizu označili z
»All Fields«. Iskalne nize smo sproti prilagajali, in sicer tako, da smo izbrano ključno besedo odstranili in pri tem pogledali, če smo izgubili uporabne članke. Prav tako smo tudi obratno, z dodajanjem ključne besede k iskalnem nizu pogledali, če in koliko uporabnih člankov smo pridobili.
Vse uporabljene iskalne nize smo si zapisovali, prav tako tudi število zadetkov in uporabnih člankov, ki smo jih našli s posameznim iskalnim nizom. Za iskalni profil smo uporabili naslednje ključne besede, ki smo jih z operatorji AND, OR, NOT kombinirali v iskalne nize:
• »human«,
• »concentration«,
• »phospholipid«,
• »bile salt«,
• »intestine«,
• »small intestine«,
• »characterization«,
• »gastrointestinal tract«,
• »surface tension«,
• »intestinal fluids«,
• »composition«,
• »osmolality«,
• »physicochemical properties«,
• »bile acid«,
• »duodenum«,
• »jejunum«,
• »gastrointestinal contents«,
• »fasted«,
• »postprandial«,
• »dissolution«,
• »digestion«,
• »serum«,
• »healthy«,
• »cholecystokinin«,
• »simulated«,
• »aspirates«,
• »intestinal«,
• »fluid«,
• »characteristics«.
16
Iskanje smo izvedli v obdobju med 30. 6. 2020 in 11. 8. 2020, iskanja glede na leto objave članka nismo omejili.
3.1.2.1. Izbor ustreznih člankov
Postopek izbire člankov je potekal tako, da smo najprej v iskalno polje vnesli iskalni niz, nato smo v danem naboru člankov pri vsakem najprej prebrali naslov in povzetek. V kolikor je povzetek ustrezal naši temi, smo nadaljevali s prebiranjem celotnega članka.
V analizo smo vključili članke, ki:
• so podajali koncentracije SŽK v TČ in/ali koncentracije FL v TČ in/ali osmolalnosti prebavnih tekočin v TČ in/ali površinske napetosti prebavnih tekočin v TČ,
• so navajali fiziološke podatke za odrasle ljudi,
• so bile v raziskave vključene zdrave osebe (kot proučevana skupina ali kot kontrolna skupina),
• so zajemali meritve koncentracij na tešče ali po obroku hrane.
Izločili smo članke, ki:
• so podajali koncentracije iskanih parametrov po intravenski aplikaciji holecistokinina,
• so vsebovali le podatke za živali,
• so imeli vključene le podatke za novorojenčke, dojenčke ali otroke,
• so podajali le serumske koncentracije iskanih podatkov,
• niso navajali ali gre za meritve na tešče ali po obroku hrane,
• so vsebovali samo podatke za in vitro testiranje (FaSSIF, FeSSIF),
• niso bili v angleškem jeziku.
Iskali smo tako raziskovalne kot tudi pregledne članke. V primeru preglednih člankov smo s pomočjo referenc našli raziskovalne članke, kjer so bili podatki prvič objavljeni. Tako člankov z referencami 57, 58, 59, 60, 61, 62 in 63 nismo našli z iskalnimi nizi, temveč smo do njih prišli preko preglednih člankov.
3.1.2.2. Analiza podatkov iz člankov
Pri pregledu literature smo iskali podatke o koncentracijah SŽK in FL v TČ ter osmolalnosti in površinski napetosti prebavnih tekočin v TČ. Poleg teh informacij so nas zanimali tudi:
• način odvzema vzorcev iz TČ (vzorčenje),
• mesto odvzema vzorcev (del TČ),
• pogoji shranjevanja vzorcev,
17
• stanje na tešče ali po obroku,
• spol prostovoljcev,
• starost prostovoljcev,
• čas odvzema vzorcev po obroku.
Pri tem smo odčitavali različne statistične parametre (mediane in povprečne vrednosti), združene vrednosti ter individualne vrednosti, odvisno od tega, kaj je bilo v članku uporabljeno. Z izrazom »individualne vrednosti« smo poimenovali podatke, kjer so bile številčne vrednosti podane ločeno za vsakega posameznika, udeleženega v študiji. Podatki, ki so bili pridobljeni z v laboratoriju izvedenim, združevanjem vzorcev posameznikov v skupen vzorec, ki je bil nato analiziran, smo označili z »združeni vzorec«. Mediane, povprečne vrednosti in vrednosti združenih vzorcev so bile v vseh člankih podane številčno, individualne vrednosti pa so bile ponekod predstavljene le z grafi. V slednjih primerih smo številčne vrednosti pridobili s pomočjo prosto dostopnega programa Engauge Digitizer. To smo naredili tako, da smo graf iz članka uvozili v program in s pomočjo posebnega orodja označili osi x in y ter točke na grafu. Po končanem označevanju nam je program izračunal vrednosti lokacij posameznih točk na grafu, ki smo jih nato izpisali. Iz pridobljenih podatkov, smo izračunali mediane in povprečne vrednosti za tiste primere, kjer te še niso bile izračunane. Poleg tega smo izračunali tudi povprečja in mediane za nabor vseh najdenih podatkov skupaj.
Izpisane podatke smo prikazali grafično. V postopku razvrščanja smo podatke ločili na podlagi časa po zaužitju obroka (na tešče in po obroku), nato pa v nekaterih primerih še glede na mesto vzorčenja, torej na posamezne dele TČ, in sicer dvanajstnik, jejunum in ileum. Točno mesto vzorčenja je bilo v vseh primerih navedeno v članku. Dodatno smo podatke o koncentracijah SŽK in FL razvrstili še glede na posamezno vrsto SŽK oz. FL.
Poleg tega smo za vsakega od štirih iskanih parametrov, torej koncentracije SŽK in FL, osmolalnosti in površinske napetosti tekočin v TČ izračunali povprečja, kar smo izvedli za posamezne skupine ujemajočih se študij. Pri tem smo izračunali povprečje iz povprečnih vrednosti parametra, ki so bile na voljo s pripadajočo SD, povprečno vrednost iz median parametra, ki so bile na voljo s pripadajočo SD in povprečno vrednost iz združenih vzorcev parametrov, ki so bili na voljo s pripadajočo SD. Pri tem smo ločili podatke na tešče in po obroku.
18
Izračunali smo tudi mediane in povprečne vrednosti posameznih vrst SŽK in FL. To smo naredili tako, da smo koncentracije posameznih vrst SŽK in FL, podane v člankih, sešteli in vsoto delili s številom vseh izpisanih podatkov (za izračun povprečne vrednosti) oziroma z urejanjem podatkov po velikosti poiskali mediano. Podatkov nismo ločevali glede na mesto vzorčenja. Tako smo posamezne vrste SŽK in FL okvirno uredili po pogostosti prisotnosti v TČ.
3.2. Laboratorijski del 3.2.1. Topila in reagenti
• Klorovodikova kislina (HCl), Titrisol® za pripravo 1 M HCl, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
• Ocetna kislina, Sigma-Aldrich CO, St. Louis, ZDA
• Dipiridamol (DPY), Sigma-Aldrich CO, St. Louis, ZDA
• Paracetamol (PAR), p.a. Sigma-Aldrich CO, St. Louis, ZDA
• Natrijev diklofenak (Na-DI), p.a. Sigma-Aldrich CO, St. Louis, ZDA
• Monokalijev fosfat (KH2PO4), Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
• Natrijev hidroksid, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
• Capmul MCM, Abitec, Columbus, ZDA
• Capmul PG-8, Abitec, Columbus, ZDA
• Labrasol ALF, Gattefosse, Nanterre, Francija
• Kolliphor RH40, BASF, Ludwigshafen, Nemčija
• Propilenglikol, Sigma-Aldrich CO, St. Louis, ZDA
• 4-bromofenil boronska kislina (4-BBBA), Sigma-Aldrich CO, St. Louis, ZDA
• Trizma maleat (tris (hidroksimetil) aminometan maleatna sol), Sigma-Aldrich CO, St.
Louis, ZDA
• Natrijev klorid (NaCl), p.a. Sigma-Aldrich CO, St. Louis, ZDA
• Kalcijev klorid dihidrat (CaCl2×2H2O), Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
• Natrijev deoksiholat (C24H39NaO4), Sigma-Aldrich CO, St. Louis, ZDA
• Fosfatidilholin, Sigma-Aldrich CO, St. Louis, ZDA
• Metanol, Ultra Gradient HPLC Grade, J.T. Baker, Phillipsburg, ZDA
• Acetonitril, Ultra Gradient HPLC Grade, J.T. Baker, Phillipsburg, ZDA
• Pufrna raztopina pH = 2 (20 °C), Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
19
• Pufrna raztopina pH = 4 (20 °C), Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
• Pufrna raztopina pH = 7 (20 °C), Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
3.2.2. Aparature in materiali
• Magnetno mešalo s temperaturnim tipalom RCT basic (IKA ret control/t), IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Nemčija
• HPLC (serija 1200) z UV detektorjem, Agilent Technologies, Santa Clara, ZDA, ter kolona Kinetex C18 (2,10 × 50 mm, 2,6 µm), Phenomenex, Torrance, ZDA
• Analizna tehtnica Mettler Toledo AG245, Mettler Toledo GmbH, Schwerzenbach, Švica
• Steklovina za nučanje
• Ultrazvočna kopel Sonis 4, Iskra PIO, Šentjernej, Slovenija
• pH meter MP 220, Mettler Toledo GmbH, Swerzenbach, Švica
• Elektroda za pH meter Inlab Expert Pro, Mettler Toledo GmbH, Schwerzenbach, Švica
• Polavtomatske pipete različnih volumnov Eppendorf Research 2100, Eppendorf, Hamburg, Nemčija
• Vortex stresalnik Lab dancer, IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Nemčija
• Centrifuga 5415 R, Eppendorf, Nemčija
• Filtri za pripravo mobilnih faz z velikostjo por 0,45 µm, Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Nemčija
• Sistem za Mili-Q vodo, A10 Advantage, Millipore Corporation, Burlington, ZDA
• Laboratorijska steklovina
• Magneti
• Laboratorijski pribor (spatule, žličke, pincete)
• Mikrocentrifugirke
• Viale in pokrovčki za viale
• Štoparica
3.2.3. Metode
3.2.3.1. Priprava medijev in mobilnih faz
Za naše delo smo pripravili štiri medije, v katerih smo spremljali procese sproščanja, poleg tega smo pripravili tudi dve mobilni fazi:
• 0,1 % CH3COOH - za mobilno fazo: Za pripravo 1 L 0,1 % CH3COOH smo v litrsko merilno bučko, ki je vsebovala približno 500 mL vode, odpipetirali 0,5 mL CH3COOH
20
in z Mili-Q vodo dopolnili do oznake ter premešali. Raztopino ocetne kisline smo pred uporabo razplinili.
• 50 mM fosfatni pufer (pH = 6,5) - za mobilno fazo: Za pripravo 1 L 50 mM fosfatnega pufra smo v litrsko merilno bučko kvantitativno prenesli 6,8 g KH2PO4 in dodali približno 500 mL Mili-Q vode ter dobro premešali. Nato smo dodali še 14 mL 1 M NaOH ter z Mili-Q vodo dopolnili do oznake. Pripravljeno raztopino smo zopet dobro premešali. pH raztopine je bil 6,5. Pufer smo pred uporabo filtrirali in razplinili.
• 0,01 M HCl - medij: Za pripravo 0,01 M HCl smo najprej pripravili 1 L 1 M HCl, in sicer smo v 1 L merilno bučko najprej nalili nekaj prečiščene vode, nato smo dodali standardno raztopino Titrisol® za 1 M HCl in dopolnili s prečiščeno vodo do oznake. Za pripravo 1 L 0,01 M HCl smo v litrsko bučko, ki je vsebovala približno 500 mL vode, s polavtomatsko pipeto odpipetirali 10 mL 1 M HCl in dopolnili do oznake s prečiščeno vodo ter premešali.
• 50 mM fosfatni pufer (pH = 6,8) - medij: za pripravo 1 L fosfatnega pufra smo v čašo natehtali 6,8 g KH2PO4 in ga kvantitativno prenesli v litrsko bučko. Dodali smo približno 500 mL prečiščene vode in dobro premešali. Nato smo dodali še 22 mL 1 M NaOH, ter bučko skoraj do vrha dopolnili s prečiščeno vodo. pH tako pripravljene raztopine smo uravnali na vrednost 6,8 z 1 M NaOH. Nato smo bučko do oznake napolnili s prečiščeno vodo.
• Tris-maleatni pufer (pH = 7,5) - medij: Za pripravo 250 mL tris-maleatnega pufra smo natehtali 2,97 g Trizma maleata, 2,19 g NaCl in 0,18 g CaCl2×2H2O. Vse substance smo kvantitativno prenesli v bučko in najprej dodali približno 230 mL destilirane vode, nato pa še 13 mL 1 M NaOH. pH vrednost raztopine smo z 1 M NaOH naravnali na 7,5. Nato smo bučko do oznake dopolnili s prečiščeno vodo in premešali.
• Prebavni medij (pH = 7,5) - medij: Za pripravo 40 mL prebavnega medija smo v čašo natehtali 37 mg fosfatidilholina in dodali 40 mL tris-maleatnega pufra. Zmes smo 30 min mešali na magnetnem mešalu (200 obratov/min). Po tem času smo dodali še 81 mg Na- deoksiholata in mešali še 10 min. pH tako pripravljenega medija je bil 7,5. Medij smo uporabili v istem dnevu.
3.2.3.2. Dostavni sistem
Naš dostavni sistem je bil SMES, ki smo ga pripravili tako, da smo v čašo natehtali 25 % (m/m) končne mase Kolliphorja RH-40, 10 % (m/m) propilenglikola, 15 % (m/m) Capmula MCM, 15 % (m/m) Labrasola ALF in 35 % (m/m) Capmula PG-8. Nastalo je 15 g zmesi, ki
21
smo jo čez noč pustili mešati na magnetnem mešalu. Naslednji dan smo v nastali SMES vgradili ZU, pri čemer smo v svežo čašo natehtali 0,15 g ZU (DPY, PAR oziroma Na-DI) in dodali SMES do 15 g (1 % ZU). Nastalo zmes smo mešali čez noč. V enem izmed poskusov smo uporabili SMES brez vgrajene ZU.
3.2.3.3. Priprava raztopin standardov in umeritvenih premic
Izdelali smo umeritvene premice za vse tri ZU, ki smo jih uporabili za testiranje sproščanja.
Za izdelavo umeritvenih premic smo pripravili osnovne raztopine standardov DPY, PAR in Na-DI, ki smo jih redčili, in sicer smo pri DPY in PAR uporabili 0,1 % ocetno kislino (CH3COOH), pri Na-DI pa 50 mM fosfatni pufer s pH 6,5. Redčenje je bilo v primeru PAR in Na-DI vsaj 4-kratno, v primeru DPY pa vsaj 2-kratno. Na ta način smo pripravili raztopine z različnimi koncentracijami, s čimer smo pokrili celotna koncentracijska območja sproščanja posamezne ZU. Po končanih meritvah pri izbranih valovnih dolžinah smo po končani HPLC analizi odčitali površine pod krivuljo (AUC) naših vzorcev. Na podlagi AUC-jev smo izdelali umeritvene premice, določili enačbo premice ter Pearsonov koeficient korelacije (R2), ki je moral biti enak ali večji od 0,999.
a) PAR in Na-DI (v besedilu ZU)
Pripravili smo 3 osnovne raztopine A, B in C s koncentracijo ZU 100 mg/L. Natančno smo natehtali približno 10 mg ZU in jo kvantitativno prenesli v 100 mL bučko ter dopolnili do oznake z 0,1 % CH3COOH v primeru PAR oziroma s 50 mM fosfatnim pufrom s pH 6,5 v primeru Na-DI. Pripravljene raztopine smo za 5 min postavili v ultrazvočno kadičko, da se je ZU v celoti raztopila. Pripravili smo 9 raztopin standardov, s koncentracijami ZU od 2 mg/L do 25 mg/L, kar smo dosegli z redčenjem (4 do 50-kratno) osnovnih raztopin.
b) DPY
Osnovne raztopine DPY smo pripravili po enakem postopku, kot je opisano za PAR in Na- DI, le da smo natančno natehto 10 mg DPY kvantitativno prenesli v 200 mL bučko in do oznake dopolnili z 0,1 % CH3COOH. Pripravljene raztopine smo za 5 min postavili v ultrazvočno kadičko, da se je DPY v celoti raztopil. V tem primeru so bile koncentracije DPY po redčenju (2 do 50-kratno) od 0,5 mg/L do 25 mg/L.
Preglednica IV: Enačbe umeritvenih premic, R2 in valovne dolžine maksimalne absorpcije za posamezno ZU (x = koncentracija ZU [mg/L], y = absorbanca).
ZU Enačba umeritvene premice: c (mg/L) R2 Valovna dolžina
(nm)
DPY y = 27,101x - 1,8679 0,9999 284
22 3.2.3.4. Testi sproščanja – potek dela
Testiranje sproščanja smo izvedli v štirih različnih medijih, katerih priprava je opisana v poglavju 3.2.3.1. Uporabljena farmacevtska oblika je bil SMES, brez vgrajene ZU ali z vgrajeno eno izmed treh izbranih ZU. Njihova priprava in sestava je opisana v poglavju 3.2.3.2.
Pred pričetkom poskusa smo v kristalizirko do polovice nalili vodo in jo postavili na grelno ploščo magnetnega mešala, kjer smo nastavili temperaturo 37 °C. Med tem časom smo v 250 mL čašo odpipetirali 40 mL izbranega medija ter vanjo položili magnet dolžine 40 mm.
Ko se je vodna kopel segrela, smo vanjo postavili čašo in vklopili mešanje (100 obratov na min, pri čemer smo pazili, da je bil magnet popolnoma na sredini čaše. Med čašo in obod kristalizirke smo namestili stiropornati obroč, s čimer smo zagotovili stabilnost čaše. Ko se je medij segreval smo natehtali približno 500 mg SMES-a. To smo naredili tako, da smo prazno brizgo postavili na analizno tehtnico in jo tarirali. Nato smo brizgo napolnili s SMES do oznake približno 0,5 mL, ter jo stehtali. Ko smo dosegli maso okoli 500 mg, smo vsebino brizge izpraznili v tedaj že segret medij v čaši in takoj zagnali štoparico. Izpraznjeno brizgo smo ponovno stehtali in prikazano maso odšteli od celotne natehte, s čimer smo dobili dejansko maso SMES-a, dodanega v medij. Tri paralele so bile izvedene od 5 do 30 min, ena paralela pa do 60 min. V vsaki časovni točki smo izvedli dvojno vzorčenje, in sicer smo pri tem dobili celokupne vzorce (T) in vzorce vodne faze (A). En set mikrocentrifugirk (T) je vseboval komponento A mobilne faze, drugi set (A) pa 4-BBBA. Pri tem smo iz medija odvzeli 100 µL vzorca in ga dali v mikrocentrifugirko T in 1000 µL vzorca in ga dali v mikrocentrifugirko A. Z vzorci napolnjene mikrocentrifugirke smo dobro premešali na vortexu in jih centrifugirali. Pri celokupnih vzorcih smo supernatant prenesli v viale, pri vzorcih vodne faze pa smo dobljeni supernatant najprej redčili s komponento A mobilne faze, ponovili mešanje na vortexu in centrifugiranje ter šele nato supernatant prenesli v viale.
Podrobnejši potek vzorčenja je prikazan na sliki 8. Vzorčenje je bilo enako pri testiranju sproščanja vseh treh ZU. Dvojno vzorčenje smo izvedli zato, ker nas je zanimal vpliv dodatka 4-BBBA na sproščanje ZU iz SMES, saj se 4-BBBA pogosto uporablja v testih lipolize.
PAR y = 29,820x + 5,0885 0,9998 243
Na-DI y = 16,082x + 0,397 0,9991 276
23
Slika 8: Shema vzorčenja pri testih sproščanja (MF-mobilna faza).
Po končanem testu sproščanja smo preostalo vsebino v čaši (35,6 mL po 30 min) kvantitativno prenesli v 200 mL bučko in z ustrezno komponento A mobilne faze dopolnili do oznake. Vsebino bučke smo nato prenesli v mikrocentrifugirko, dobro premešali na vortexu in centrifugirali (10 min, 16000 rcf, sobna temperatura) ter supernatant prenesli v vialo. Na ta način smo določili ostanek. Tako pridobljene vzorce smo analizirali s HPLC.
Drugačen potek dela je bil le v primeru SMES brez vgrajene ZU. V tem primeru, zgoraj opisanega testiranja sproščanja nismo izvedli, ampak smo SMES le dispergirali v mediju in iz disperzije vzeli en vzorec. Tega smo prav tako centrifugirali in nato le vizualno ocenili izgled vsebine mikrocentrifugirk.
3.2.3.5. Analiza vzorcev
Vzorce smo analizirali na HPLC. Osnovni podatki in nastavitve HPLC metode za vrednotenje vsebnosti posamezne ZU v vzorcih testov sproščanja so prikazani v preglednici V.
VZOREC: 40 mL medija + približno 500 mg SMES z ZU (1 %) ali brez
100 µL vzorca + 900 µL del A MF
vortex, centrifugiranje 10 min, 16000 rcf, sobna temperatura
supernatant v viale 1000 µL vzorca + 10 µL
4-BBBA
vortex, centrifugiranje 10 min, 16000 rcf, sobna temperatura
10 x redčenje supernatanta;
100 µL supernatanta + 900 µL del A MF
vortex, centrifugiranje 10 min, 16000 rcf, sobna temperatura
supernatant v viale
V vodni kopeli (37 °C) na magnetnem mešalu
vzorci A vzorci T
24
Preglednica V: Osnovni podatki in nastavitve analize HPLC za posamezno ZU: tip elucije, pretok, temperatura (T) kolone, tip kolone, volumen (V) injiciranja, valovna dolžina detekcije, retencijski čas ZU in sestava komponente A mobilne faze.
ZU Tip elucije Pretok T kolone
Tip kolone (velikost delcev 2.6 µm)
V injiciranja
Valovna dolžina detekcije
Retencijski čas ZU
Komponenta A mobilne faze
DPY Gradientna (min/%
acetonitrila:
0/20, 2/60, 2,5/60, 2,6/20)
0,650 mL/min
37 °C Kinetex C18
5 µL 284 nm 2,6-2,7 min
0,1 % CH3COOH
PAR Izokratska (A/B=95/5)
0,650 mL/min
37 °C Kinetex C18
5 µL 243 nm 0,7-0,8 min
0,1 % CH3COOH Na-
DI
Izokratska (A/B=75/25)
0,650 mL/min
37 °C Kinetex C18
5 µL 276 nm 1,5-1,6 min
50 mM fosfatni pufer
*Poleg komponente A smo pri vseh analizah preko ločenega kanala dovajali tudi komponento B, ki je bil acetonitril. Pri gradientni eluciji se je delež acetonitrila s časom spreminjal.
3.2.3.6. Izračun parametrov sproščanja ter osmolalnosti medijev
Iz dobljenih površin pod krivuljo (AUC) smo s pomočjo enačb umeritvenih premic izračunali koncentracijo ZU v vzorcu v določeni časovni točki. Iz dobljene koncentracije smo izračunali maso sproščene ZU (Enačba 1). S pomočjo tega podatka smo izračunali delež sproščene ZU glede na količino dodanega SMES oz. ZU, vgrajene v dodan SMES, v izbranih časovnih točkah (Enačba 2). Pri računanju smo upoštevali, da smo pri vsakem vzorčenju iz čaše odvzeli 1,1 mL vzorca (100 µL za T in 1000 µL za A).
Masa sproščene ZU v mediju v izbrani časovni točki:
𝑚(𝑡)𝑛 = 𝑐 (𝑡) ∗ (𝑉 (𝑡) + (𝑐 (𝑡1) + 𝑐 (𝑡2) + ⋯ + 𝑐 (𝑡(𝑛 − 1))) ∗ 0,0011 [Enačba 1]
m(t)n … masa sproščene ZU v mediju v izbrani časovni točki [mg c(t) … koncentracija ZU v vzorcu v izbrani časovni točki [mg/L V(t) … volumen medija v čaši za vzorčenje v izbrani časovni točki [L
c(t1) … koncentracija ZU v vzorcu ob prvem odvzemu vzorca [mg/L c(t2) … koncentracija ZU v vzorcu ob drugem odvzemu vzorca [mg/L c(t)n-1 … koncentracija ZU v vzorcu ob (n-1)-tem odvzemu vzorca [mg/L 0,0011 … skupen volumen odvzet za vzorec A (1000 µL) in vzorec T (100 µL) [L]
25
Odstotek sproščene ZU v mediju v izbrani časovni točki:
% 𝑠𝑝𝑟 = 𝑚 (𝑡)𝑛
𝑚 (𝑍𝑈) ∗ 100 [Enačba 2]
% spr … odstotek sproščene ZU v mediju v izbrani časovni točki [% m(t)n … masa sproščene ZU v mediju v izbrani časovni točki [mg
m(ZU) … masa ZU v SMES, dodane v medij [mg
