UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
ŠPELA ERJAVEC MAGISTRSKA NALOGA
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJA
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
ŠPELA ERJAVEC
VREDNOTENJE VPLIVA PREMREŽEVALNIH IONOV NA LASTNOSTI ALGINANTNIH MIKROSFER
INFLUENCE EVALUATION OF CROSS-LINKING IONS INFULENCE ON CHARACTERISTICS OF ALGINATE
MICROSPHERES
UNIFORM MASTER'S STUDY PROGRAMME PHARMACY
Ljubljana, 2021
Magistrsko nalogo sem opravljala na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani na katedri za farmacevtsko tehnologijo pod mentorstvom izr. prof. dr. Alenke Zvonar Pobirk, mag.
farm. in somentorstvom doc. dr. Mirjam Gosenca Matjaž, mag. farm.
Iskreno se zahvaljujem mentorici izr. prof. dr. Alenki Zvonar Pobirk, mag. farm. ter somentorici doc. dr. Mirjam Gosenca Matjaž, mag. farm. za sprejem mentorstva, pomoč, nasvete in usmeritve pri izdelavi magistrske naloge. Velika zahvala za pomoč pri laboratorijskem delu gre tudi strokovnima sodelavkama na Katedri za farmacevtsko tehnologijo, Tatjani Hrovatič, ing. kem. teh., in Mojci Keržan, ing. kem. teh.
Iz srca se zahvaljujem družini in fantu Maticu za vso podporo in vzpodbudne besede tekom celotnega študija.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko delo samostojno izdelala pod vodstvom mentorice izr. prof.
dr. Alenke Zvonar Pobirk, mag. farm. in somentorice doc. dr. Mirjam Gosenca Matjaž, mag. farm.
Špela Erjavec
Predsednik komisije: prof. dr. Samo Kreft, mag. farm.
Član komisije: izr. prof. dr. Tihomir Tomašič, mag. farm .
I
Kazalo vsebine
POVZETEK ... V ABSTRACT ... VII SEZNAM OKRAJŠAV ... IX
1.UVOD ... 1
1.1 MIKROSFERE ... 1
1.1.1 OGRODJE MIKROSFER ... 2
1.2 HIDROGELI ... 6
1.2.1 VREDNOTENJE LASTNOSTI HIDROGELOV ... 7
2. NAMEN DELA ... 13
3. MATERIALI IN METODE ... 14
3.1 MATERIALI ... 14
3.1.1 MATERIALI ZA IZDELAVO IN VREDNOTENJE ALGINATNIH MIKROSFER ... 14
3.1.2 LABORATORIJSKA OPREMA IN NAPRAVE ... 16
3.2 METODE ... 17
3.2.1 PRIPRAVA ALGINATNEGA MATRIKSA ... 17
3.2.2 PRIPRAVA ALGINATNEGA MATRIKSA S PENTOKSIFILINOM ... 17
3.2.3 PRIPRAVA RAZTOPIN ZA PREMREŽEVANJE ... 17
3.2.4 PRIPRAVA MEDIJA ZA TEST SPROŠČANJA ... 19
3.2.5 POSTOPEK IZDELAVE MIKROSFER Z VGRAJENIM PENTOKSIFILINOM ... 19
3.2.6 TEST SPROŠČANJA ... 24
3.2.7 ANALITIKA ZDRAVILNE UČINKOVINE ... 25
3.2.8 DOLOČANJE NABREKANJA IN EROZIJE ... 26
3.2.9 VREDNOTENJE TEKSTURE ... 27
II
4. REZULTATI IN RAZPRAVA ... 31 4.1 VREDNOTENJE NABREKANJA IN EROZIJE ALGINATNIH MIKROSFER .... 31 4.2 VREDNOTENJE TEKSTURE ALGINATNIH MIKROSFER ... 34
4.2.1 DOLOČANJE TOČKE PRELOMA MIKROSFER BREZ IN Z VGRAJENO UČINKOVINO ... 34
4.2.2 TEST RELAKSACIJE MIKROSFER BREZ IN Z VGRAJENO UČINKOVINO ... 36 4.3 VREDNOTENJE SPROŠČANJA PENTOKSIFILINA IZ ALGINATNIH
MIKROSFER ... 38 4.3.1 VPLIV PREMREŽEVALNIH IONOV NA SPROŠČANJE PENTOKSIFILINA V MEDIJIH Z RAZLIČNIMI pH VREDNOSTMI ... 38 5. SKLEP ... 44 6. VIRI ... 46
III
Kazalo slik
Slika 1: Delitev mikrokapsul. ... 1
Slika 2: Struktura polimanuronskega (M) in poliguluronskega (G) odseka alginske kisline ter odseka, kjer se manuronski in guluronski odseki izmenjujejo (MG) . ... 3
Slika 3: Prikaz nastanka alginatnega gela z modelom "škatle za jajca" . ... 4
Slika 4: Struktura hitosana . ... 6
Slika 5: Shema alginatne mikrosfere po vstopu medija. ... 8
Slika 6: Postopek izdelave mikrosfer . ... 20
Slika 7: NIRO-Aeromatic. ... 21
Slika 8: Enkapsulator Inotech IE-50R. ... 21
Slika 9: Aparat za raztapljanje, Dissolution Tester, Van Kel, VK 7000. ... 24
Slika 10: Sprememba materiala po delovanju sile v odvisnosti od časa. ... 28
Slika 11: Reometer Anton Paar Physica MCR 301. ... 29
Slika 12: Določitev presečišča premic linearnih odsekov krivulje. ... 30
Slika 13: Vpliv premreževalnih ionov na delež sproščene učinkovine v odvisnosti od časa v mediju s pH = 3. ... 40
Slika 14: Vpliv premreževalnih ionov na delež sproščene učinkovine v odvisnosti od časa v prečiščeni vodi. ... 40
Slika 15: Vpliv premreževalnih ionov na delež sproščene učinkovine v odvisnosti od časa v mediju s pH = 6,8. ... 41
IV
Kazalo preglednic
Preglednica I: Pri delu uporabljena oprema in pripomočki. ... 16 Preglednica II: Časovni intervali vzorčenja v mediju s pH = 3, prečiščeni vodi in pH = 6,8. ... 25 Preglednica III: Stopnja nabrekanja mikrosfer brez vgrajene modelne učinkovine premreženih z različnimi raztopinami v medijih s pH = 3 in fosfatnem pufru s pH = 6,8.. 33 Preglednica IV: Stopnja erozije mikrosfer brez vgrajene modelne učinkovine premreženih z različnimi raztopinami v medijih s pH = 3 in fosfatnem pufru s pH = 6,8. . ... 34 Preglednica V: Minimalna debelina mikrosfer (mm) brez in z vgrajeno modelno učinkovino v okviru testa stiskanja (t. i. točka preloma). ... 35 Preglednica VI: Vrednosti testa relaksacije mikrosfer brez in z vgrajeno učinkovino. ... 37 Preglednica VII: Vrednosti površine pod krivuljo (AUC) negativnega dela krivulje deformacije za mikrosfere brez in z vgrajeno modelno učinkovino kot merilo adhezivnosti mikrosfer. ... 37
V
POVZETEK
Alginatne mikrosfere spadajo med novejše dostavne sisteme, ki omogočajo tako nadzorovano sproščanje vgrajenih zdravilnih učinkovin in njihovo zaščito pred dejavniki okolja kot tudi prekrivanje njihovega vonja in okusa. Gre za ogrodni tip mikrokapsul, pri katerem sta mikrokapsulirana snov in ogrodni material enakomerno razporejena po celotnem volumnu delca. Pripravimo jih lahko z različnimi kemijskimi, fizikalno- kemijskimi ter fizikalno-mehanskimi metodami. Na uspešnost mikrokapsuliranja ima velik vpliv tudi izbira ustreznega ogrodja, pri čemer je v farmacevtski industriji še vedno v ospredju uporaba naravnih polimerov, kot sta natrijev alginat in hitosan.
V magistrski nalogi smo proučevali vpliv premreževalnih ionov na lastnosti alginatnih mikrosfer. Za izdelavo slednjih smo uporabili metodo z vibrirajočo membrano, ki sodi med fizikalno-mehanske postopke mikrokapsuliranja. Temelji na ekstruziji laminarnega curka tekočine skozi šobo enkapsulatorja, nad katero se nahaja membrana, ki z vibriranjem povzroči razbitje laminarnega toka v enakomerno velike kapljice. Le-te med padanjem proti premreževalni raztopini potujejo skozi električno polje, pri čemer se njihova površina nabije, kar preprečuje njihovo zlepljanje. Za premreževanje mikrosfer smo uporabili različne premreževalne raztopine in sicer 0,3 M in 0,5 M raztopino CaCl2, 0,3 M CuCl2, 0,3 M AlCl3, 0,3 M CaCl2/ZnCl2 ter 0,3 M CaCl2 + 1% raztopino hitosana. Njihov vpliv na lastnosti izdelanih mikrosfer smo proučevali z vrednotenjem nabrekanja in erozije alginatnih mikrosfer ter sproščanje vgrajene dobro topne modelne učinkovine pentoksifilina v mediju s pH = 3, prečiščeni vodi in fosfatnem pufru s pH = 6,8, pri čemer se je slednji izkazal kot najbolj diskriminatoren medij, kar pomeni, da je bil v tem mediju najbolj izražen vpliv premreževalnih ionov na sproščanje vgrajenega pentoksifilina. V vseh medijih se je iz alginatnih mikrosfer sprostila vsa vgrajena zdravilna učinkovina, vpliv različno premreženega gelskega ogrodja pa je bil najbolje viden v fosfatnem pufru s pH = 6,8, v katerem je pentoksifilin tudi slabše topen. Največji delež (94%) vgrajenega pentoksifilina se je tako po prvi uri sprostil iz mikrosfer premreženih z 0,5 M CaCl2, najmanjši delež (81%) pa se je v tem času sprostil iz mikrosfer premreženih z 0,3 M raztopino CaCl2, ki so bile obdane z dodatno hitosansko ovojnico. Vpliv premreževalnih ionov na lastnosti izdelanih mikrosfer smo spremljali tudi z vrednotenjem mehanskih lastnosti gelskega ogrodja. Z vrednotenjem teksture smo ugotovili, da imajo najbolj čvrsto ogrodje mikrosfere, ki smo jih premrežili z 0,3 M raztopino CuCl2, najmanjšo čvrstost pa
VI
izkazujejo mikrosfere, premrežene z 0,3 M raztopino CaCl2 z dodatno hitosansko ovojnico.
Vgradnja zdravilne učinkovine sicer ni vplivala na čvrstost alginatnih mikrosfer. Zaradi dobre vodotopnosti zdravilne učinkovine pentoksifilina je bil manj viden vpliv premreževalnih ionov na sproščanje vgrajene učinkovine kot v primeru slabo vodotopnega furosemida, uporabljenega v predhodnem raziskovalnem delu na Katedri za farmacevtsko tehnologijo. Kljub temu so alginatne mikrosfere obetaven dostavni sistem za dostavo zdravilnih učinkovin, zlasti tistih s slabšimi biofarmacevtskimi lastnostmi.
Ključne besede alginatne mikrosfere, premreževalni ioni, analiza teksture, pentoksifilin, sproščanje
VII
ABSTRACT
Alginate microspheres are novel drug delivery systems used not only for controlled release of incorporated drugs and their protection from environment but also for masking their smell and taste. They are defined as microspheres with encapsulated substance evenly dispersed within the polymeric matrix. Microspheres can be prepared with different chemical, physico-chemical and physico-mechanical methods. Successful production depends on selection of the right matrix polymer, with natural polymers as sodium alginate and chitosan predominantly used in pharmaceutical industry. The aim of the thesis was to evaluate the influence of cross-linking ions on characteristics of alginate microspheres produced by vibrating nozzle technique. This method is based on extrusion of the lamellar liquid jet through the nozzle of the encapsulator, where it is broken into uniformly sized droplets by vibrations produced by the membrane positioned above the nozzle. Between the nozzle and the cross-linking solution formed droplets pass through an electric field creating charge on the surface of unhardened microspheres, which prevents them from sticking together. Cross-linking solutions used for hardening the microspheres were the following: 0.3 M and 0.5 M CaCl2, 0.3 M CuCl2, 0.3 M AlCl3, 0.3 M CaCl2/ZnCl2 and 0.3 M CaCl2 + 1% chitosan solution. In order to evaluate their influence on characteristics of crosslinked matrix, the swelling, erosion and drug release studies were performed of alginate microspheres in purified water and mediums with pH = 3 and phosphate buffer with pH = 6,8 as the most discriminatory medium. Complete release of freely water- soluble model drug pentoxifylline was observed in all mediums, with most pronounced differences between differently crosslinked matrices observed in phosphate buffer with pH
= 6,8 with lowest pentoxifylline solubility. In the first hour the highest percentage of pentoxifylline was released from microspheres cross-linked with 0.5 M CaCl2 solution, while additional chitosan coating contributed to the lowest amount of released drug from the microspheres cross-linked with 0.3 M CaCl2. The influence of cross-linking ions on characteristics of microspheres was also studied by evaluation of their mechanical properties. Their hardness characteristics were obtained from texture analysis performed with rheometer. Results showed that microspheres cross-linked with 0.3 M CuCl2 solution expressed the greatest hardness and they also showed the lowest swelling degree, while the lowest hardness was determined for microspheres cross-linked with 0.3 M CaCl2 solution with additional chitosan coating. Encapsulated drug did not influence the hardness of
VIII
alginate microspheres. Due to good aqueous solubility of pentoxifylline the dependence of drug -release on cross-linking ions used for hardening the alginate microspheres is less pronounced as compared to poorly water-soluble drug furosemide, used in previous experimental work in Department for pharmaceutical technology. Nevertheless, alginate microspheres are promising drug delivery system, especially for drugs with poor biopharmaceutical properties.
Key words alginate microspheres, cross-linking ions, texture analysis, pentoxifylline, dissolution test
IX
SEZNAM OKRAJŠAV
AUC površina pod krivuljo
BCS biofarmacevtski klasifikacijski sistem
E erozija
G α-L-guluronska kislina M β-D-manuronska kislina
S nabrekanje
ZU zdravilna učinkovina
1
1.UVOD
1.1 MIKROSFERE
Mikrokapsule so delci mikrometrskih velikosti, ki jih pridobivamo s postopkom mikrokapsuliranja. Gre za proces obdajanja oziroma oblaganja zelo drobnih kapljic, trdnih delcev ali zračnih mehurčkov s kontinuiranim slojem polimera, lipida ali drugih ustreznih snovi. Zgrajene so iz jedra, ki je lahko v tekoči, trdni ali plinasti obliki ter iz ovojnice (1).
V primeru mikrosfer gre za ogrodni tip mikrokapsul, pri katerem sta mikrokapsulirana snov in ogrodni material enakomerno razporejena po celotnem volumnu delca. Glede na morfološke značilnosti delimo mikrokapsule na enojedrne, večjedrne in ogrodne (slika 1) (1, 2). Mikrosfere lahko pripravimo z različnimi metodami, ki jih lahko v grobem razdelimo na kemijske, fizikalno-kemijske in fizikalno-mehanske metode. Ena izmed pogosteje uporabljenih fizikalno-mehanskih metod temelji na vibrirajoči membrani. Gre za metodo ekstruzije curka tekočine, pri kateri se nad šobo enkapsulatorja nahaja nihajoča membrana, ki razbije laminaren curek tekočine v enako velike kapljice, ki nato potujejo skozi električno polje. Le-to ustvari naboj na površini mikrosfer in nastanek odbojnih sil, ki preprečujejo zlepljanje mikrosfer med padanjem v raztopino premreževala (1).
Slika 1: Delitev mikrokapsul (1).
2 Mikrokapsuliranje izkazuje mnogo prednosti, kot so:
zaščita v jedro vgrajene snovi pred vplivi okolja, kot so npr. vlaga, svetloba, kisik, pH, s čimer se poveča stabilnost vgrajene snovi;
doseganje nadzorovanega sproščanja snovi iz mikrosfer;
prikrivanje barve, vonja in okusa snovi;
preprečevanje medsebojnih interakcij z drugimi snovmi (2).
1.1.1 OGRODJE MIKROSFER
Izbira ustrezne ogrodne snovi ima velik vpliv na uspešnost postopka mikrokapsuliranja in izdelavo čvrstih mikrosfer, zato so njene lastnosti ključnega pomena. Običajno je ogrodni polimer polprepusten, kar omogoča nadzorovano sproščanje zdravilne učinkovine, hkrati pa zdravilno učinkovino varuje pred vplivi okolja. Kot ogrodno snov mikrosfer najpogosteje uporabljamo naravne in sintezne polimere, poleg teh pa tudi voske, lipide in različne proteine. Prednost sinteznih polimerov je ta, da so kemijsko stabilni, hkrati pa lahko njihovo zgradbo in strukturo prilagajamo potrebam izdelave. Kljub temu pa je v farmacevtski industriji v ospredju še vedno uporaba naravnih polimerov zaradi biokompatibinosti in nizke toksičnosti oziroma netoksičnosti (3).
Med najpogosteje uporabljenimi ogrodnimi snovmi za izdelavo mikrosfer sta natrijev alginat in hitosan, ki spadata v skupino naravnih polisaharidov in sta podrobneje predstavljena v nadaljevanju.
Alginska kislina
Alginska kislina sodi med naravne polisaharide in se v obliki kalcijevih, natrijevih, stroncijevih, barijevih in magnezijevih soli nahaja zlasti v različnih vrstah rjavih morskih alg. Sposobnost geliranja in nabrekanja omogočata široko uporabo alginata tudi v farmacevtski industriji. Uporabimo ga lahko kot ogrodni polimer v sistemih s prirejenim sproščanjem, kot polimer za oblaganje farmacevtskih oblik in za pripravo mikrosfer. Poleg tega se uporablja tudi v oblogah za vlažno celjenje ran, pri pripravi farmacevtskih oblik za okularno ali peroralno aplikacijo ter v biotehnologiji (4).
3
V sami strukturi alginske kisline ločimo homogene odseke β-D-manuronske (M) in α-L- guluronske kisline (G) in odseke, kjer se omenjeni kislini izmenjujeta. Slednje prikazuje slika 2, ki opisuje strukturo polimanuronskega in poliguluronskega odseka alginske kisline ter odseka, kjer se slednji izmenjujeta (4, 5).
Slika 2: Struktura polimanuronskega (M) in poliguluronskega (G) odseka alginske kisline ter odseka, kjer se manuronski in guluronski odseki izmenjujejo (MG) (4).
Alginatni geli
Alginska kislina se v vodi nahaja v neionizirani obliki in je v njej netopna, topnost njenih soli pa je odvisna od pH in vrste kationov, ki so prisotni. Alginatni gel je mreža polimera, ki v vodi nabreka, posamezni odseki mreže pa so med seboj povezani z nekovalentnimi vezmi. Za alginatni gel je značilno, da se odseki guluronske kisline ene polimerne verige povežejo z guluronskimi odseki druge polimerne verige in tvorijo gel, ki ima strukturo t. i.
»škatle za jajca«, prikazane na sliki 3 (4, 6).
4
Slika 3: Prikaz nastanka alginatnega gela z modelom "škatle za jajca" (4).
Alginat je sposoben tvoriti dve vrsti gela, in sicer:
Ionotropni (ionski) gel:
Tvori se z interakcijo večvalentnih kationov, kot so Zn2+, Ca2+, Al3+, Ba2+ in polimernih verig alginske kisline. Monovalentni ioni in soli magnezijevih ionov predstavljajo izjemo pri tvorbi ionskega gela, saj v vodi tvorijo viskozne koloidne raztopine, zato slednji niso primerni za tvorbo gela. Pri postopku ionotropnega geliranja se natrijevi ioni iz soli guluronskih kislin izmenjajo z večvalentnimi ioni npr. Ca2+, kar vodi v povezavo posameznih odsekov guluronskih kislin in posledično njihovo preureditev v urejeno tridimenzionalno strukturo, dodatno stabilizirano z vodikovimi vezmi. Nastala oblika navidezno spominja na model »škatle za jajca«. K tvorbi gela prispevajo le poliguluronski odseki, ki imajo večjo afiniteto do večvalentnih kationov. Razlog za takšno afiniteto je v prostorski razporeditvi kisikovih atomov v hidroksilnih in karboksilnih skupinah molekule.
V strukturi ionotropnega gela so prisotne tako elektrostatske interakcije kot tudi koordinacijske interakcije, kjer večavalentni kationi predstavljajo kelatne centre (4).
Dvovalentni kationi izkazujejo različno afiniteto do alginata, ki narašča v naslednjem vrstnem redu Mn2+ < Zn2+ < Fe3+ < Ca2+ < Ba2+ < Cd2+ < Cu2+ < Pb2+. Pri pripravi alginatnega gela moramo upoštevati, da ioni z večjo afiniteto do alginata tvorijo bolj čvrst gel z grobo in nagubano površino. Na lastnosti ionotropnega gela pa vpliva tudi velikost oziroma premer premreževalnega iona. Ioni večjega premera namreč zapolnijo večji prostor med alginatnimi verigami, kar vodi v nastanek stabilnejšega gela, ki pa manj nabreka (4, 7). Poleg premreževalnega kationa na lastnosti ionotropnega gela vplivajo tudi lastnosti alginata. Alginat z visokim deležem enot G tvori gel, ki je bolj stabilen, odporen na erozijo in porozen, medtem ko bo alginat z višjim deležem enot M tvoril gel, ki je bolj elastičen, manj odporen na erozijo in manj porozen. Na lastnosti alginatnega gela vplivata
5
tudi molekulska masa alginata in zaporedje monomernih enot. Molekulska masa alginata pogojuje sposobnost geliranja, saj je le-ta pod določeno molekulsko maso omejena, nad molekulsko maso 2,4 × 105 Da pa slednja ne vpliva več na jakost gela. Zaporedje monomernih enot izkazuje svoj vpliv tako v afiniteti do premreževanja kot tudi v jakosti gela. Afiniteta do premreževanja zavisi od števila in dolžine monomernih enot G. Daljše in številčnejše G enote alginata izkazujejo večjo afiniteto do premreževanja, slednja torej narašča v naslednjem zaporedju MM < MG < GG. Od števila enot MM, GG in MG je odvisna tudi jakost gela in sicer le-ta narašča v naslednjem vrstnem redu MG < MM < GG (4).
Kislinski gel:
Nastane z zniževanjem pH raztopine alginata pod pKa guluronske (pKa = 3,65) in manuronske (pKa = 3,38) kisline. Pri takšnih pogojih se zaradi prehoda raztopine alginata iz sol v gel stanje tvori t.i. kislinski gel, ki je utrjen z intermolekularnimi vodikovimi vezmi. Za nastanek kislinskega gela sta pomembni tako končna vrednost pH raztopine kot tudi hitrost zniževanja pH. Le-ta mora potekati počasi, saj se v primeru prehitrega znižanja pH raztopine alginska kislina obori. Tudi pri tem gelu so glavni gradniki poliguluronski odseki, k tvorbi gela pa v manjši meri prispevajo tudi polimanuronski odseki. Za kislinski gel velja, da z višjim deležem guluronskih odsekov nastane močnejši gel (4).
Alginati se v veliki meri uporabljajo za izdelavo mikrosfer, saj so netoksični, biokompatibilni in biorazgradljivi, so široko dostopni in cenovno ugodnejši kot sintezni polimeri. Poleg tega omogočajo proces kapsuliranja pri sobni temperaturi, brez uporabe organskih topil (4, 8, 9).
Hitosan
Po kemijski definiciji je hitosan linearni kopolimer enot glukozamina in N- acetilglukozamina, povezanih z β-(1,4) glikozidnimi vezmi, čigar strukturo prikazuje slika 4. Pridobiva se z delnim deacetiliranjem hitina, ki ga gradijo N-acetilglukozaminske enote in je drugi najbolj razširjen polisaharid v naravi. Nahaja se zlasti v oklepih rakov, v manjši meri pa je prisoten tudi v nekaterih insektih in gobah. Hitosan je v alkalnih in pH nevtralnih vodnih raztopinah netopen, raztaplja pa se v kislih raztopinah. Na tržišču najdemo hitosane z različno molekulsko maso, viskoznostjo in stopnjo deacetiliranja.
Hitosan lahko tvori soli tako z anorganskimi kot tudi z organskimi kislinami, npr.
glutaminsko, klorovodikovo, mlečno in ocetno kislino. S prilagajanjem temperature,
6
koncentracije hitosana in stopnje deacetiliranja lahko vplivamo na viskoznost disperzij hitosana – nižja temperatura, večja koncentracija hitosana in večja stopnja deacetilacije dajejo bolj viskozne disperzije (10, 11). Hitosan se zaradi svoje biokompatibilnosti in biorazgradljivosti pogosto uporablja kot pomožna snov v prehrambeni industriji, saj omogoča tako zaščito kapsuliranih snovi, kot so npr. arome, kot tudi njihovo nadzorovano sproščanje (12). Bioadhezivne lastnosti hitosana pa izkoriščamo tudi v farmaciji, saj slednje omogočajo podaljšan čas zadrževanja dostavnega sistema na mestu aplikacije ob hkratnem povečanju prepustnosti sluznice, kar vodi v povečanje biološke uporabnosti vgrajenih učinkovin. Hitosan se uporablja tudi kot gradnik mikro- in nanodelcev ter liposomov za vnos polarnih učinkovin, proteinov, antigenov ali DNA v organizem (10).
Slika 4: Struktura hitosana (10).
1.2 HIDROGELI
Tridimenzionalne mreže hidrofilnih polimerov, kot je alginat, ki nastanejo po vezavi velikih količin vode, imenujemo hidrogeli. Sposobnost absorpcije vode zavisi predvsem od hidrofilnih funkcionalnih skupin, ki so razporejene vzdolž polimernih verig. Premreženje med polimernimi verigami, ki je nujno za nastanek tridimenzionalne mreže, določa stopnjo odpornosti hidrogela proti razgradnji (13). Kadar so polimerne verige hidrogela premrežene z ionskimi ali vodikovimi vezmi ali posledica hidrofobnih interakcij ter van der Waalsovih sil, govorimo o t.i. reverzibilnih oziroma fizikalnih hidrogelih. Zanje je značilno, da lahko vezi med polimernimi verigami prekinemo s spremembo dejavnikov,
7
kot so pH, ionska moč in temperatura, pri tem pa se polimer raztopi. Kadar pa so polimerne verige hidrogela premrežene s kovalentnimi vezmi, govorimo o ireverzibilnih oziroma kemijsko premreženih hidrogelih. Zaradi visoke vsebnosti vode, poroznosti in sestave dobro posnemajo človeško tkivo, kar omogoča uporabo hidrogelov na različnih področjih. Za njihovo izdelavo lahko uporabimo tako naravne kot tudi sintezne polimere (14).
1.2.1 VREDNOTENJE LASTNOSTI HIDROGELOV
Hidrogeli se v farmacevtski industriji pogosto uporabljajo kot dostavni sistemi oz.
nastanejo in vivo po aplikaciji, npr. v primeru hidrofilnih ogrodnih tablet ali mikrosfer, zato je pomembno, da dobro poznamo njihove lastnosti, ki so predstavljene v nadaljevanju.
Sproščanje zdravilne učinkovine
Mehanizem sproščanja zdravilne učinkovine iz alginatne mikrosfere je kompleksen in zajema procese, kot so vstop vodnega medija v delec, nabrekanje polimera, raztapljanje zdravilne učinkovine in difuzija le-te skozi nastalo gelsko plast ter erozija nabreklega polimera. Alginatna mikrosfera se ob stiku z vodnim medijem omoči, pri tem poteče hidratacija polimera (alginata), ki vodi v nastanek gelske plasti okoli alginatnega ogrodja delca, hkrati pa se polimer pretvori iz steklastega v gumijasto stanje. Nastala gelska plast omogoča tako vstop vodnega medija in izstop zdravilne učinkovine v okoliški medij kot tudi erozijo ogrodnega polimera. Zaradi vstopanja vode se prične nastala gelska plast večati, hkrati pa poteka razpletanje hidratiranih polimernih verig, ki sčasoma izgubijo svojo strukturo in tako omogočajo sprostitev raztopljene zdravilne učinkovine v medij (15).
Po analogiji s hidrofilnimi tabletami tudi ob vstopu vodnega medija v mikrosfero pride do nastanka različnih front (slika 5), ki nato tekom procesa erozije polimernih verig izginejo:
penetracijska fronta: predstavlja fronto, do katere voda prodre v delec in omoči polimer, vendar je le-ta še vedno v steklastem stanju.
nabrekajoča fronta: ob vstopu vode v ogrodje mikrosfere preide alginat iz steklastega v hidratirano oziroma gelsko stanje. Nabrekajoča fronta ločuje steklasto stanje polimera od hidratiranega (gelskega) stanja.
erozijska fronta: ločuje gelsko plast alginatnega ogrodja od okoliškega medija.
8
difuzijska fronta: se nahaja med nabrekajočo in erozijsko fronto. Ločuje gelsko plast delca, v kateri je raztopljena ZU, od preostalega ogrodja, ki vsebuje neraztopljeno ZU.
Slika 5: Shema alginatne mikrosfere po vstopu medija.
Sproščanje zdravilne učinkovine iz hidrofilnih sistemov, med katere spadajo tudi alginatni hidrogeli, je nadzorovano z vstopom vode v alginatni hidrogel, ki povzroči nabrekanje polimera ali raztapljanje hidrofilnega ogrodja. Na podlagi tega delimo hidrofilne ogrodne sisteme v naslednje skupine:
1. hidrofilni sistemi, pri katerih je sproščanje ZU nadzorovano z nabrekanjem polimera; ob vstopu vode pričnejo polimerne verige alginata nabrekati, pri čemer se tvori gelska plast, skozi katero difundira raztopljena ZU iz ogrodja hidrogela.
Sproščanje ZU je tako nadzorovano z vodo, ki penetrira v hidrogel.
2. hidrofilni sistemi, pri katerih je sproščanje ZU nadzorovano z raztapljanjem hidrofilnega ogrodja; voda vstopi v hidrogel, pri čemer polimer nabrekne in tvori gel, hkrati pa se prične raztapljati in erodirati. Sproščanje ZU je tako nadzorovano s procesom raztapljanja polimera v vodi.
3. hidrofilni sistemi, pri katerih je sproščanje ZU nadzorovano s kombinacijo nabrekanja polimera in raztapljanjem hidrofilnega ogrodja.
9
4. hidrofilni sistemi, pri katerih je sproščanje ZU nadzorovano z erozijo.
5. hidrofilni sistemi, pri katerih je sproščanje ZU nadzorovano z difuzijo (15).
Med prečno premreženimi verigami polimera, ki predstavljajo polimerno mrežo hidrogela, se nahajajo tudi prazni prostori oziroma pore, ki so umeščene med polimernimi verigami.
Od velikosti teh por, ki so lahko zelo različne, je odvisen proces difuzije npr. molekul vode in manjših molekul topljencev skozi pore v okoliški medij. Sama velikost nastalih por pa je odvisna od vrste polimera in premreževala, koncentracije le-tega in tudi od zunanjih dejavnikov, kot sta temperatura in pH. Proces sproščanja učinkovin iz (nastalega) hidrogela je odvisen tudi od lastnosti vgrajene učinkovine. Kadar je velikost pore večja od delcev učinkovine, je sproščanje učinkovine iz mreže hidrogela pogojeno le z difuzijo.
Majhne in dobro topne učinkovine lahko tako prosto difundirajo skozi mrežo hidrogela, pri večjih in slabo topnih učinkovinah pa je sproščanje odvisno tako od velikosti in hitrosti raztapljanja učinkovine kot tudi od nabrekanja in erozije polimernega ogrodja. Difuzija slednjih je zaradi večje velikosti delcev učinkovine otežena, kar se odraža v upočasnjenem sproščanju iz polimernega ogrodja hidrogela (4, 16). Kadar so osnovni gradniki hidrogelov nabiti polimeri (tj. polianioni kot Na-alginat ali polikationi kot hitosan), je sproščanje vgrajene učinkovine odvisno tudi od njenega naboja. Alginat je negativno nabit, zato lahko pozitivno nabite zdravilne učinkovine vstopajo v interakcije z njim, kar vodi v zaviranje sproščanja iz alginatnega ogrodja. V primeru negativno nabitih zdravilnih učinkovin pa se med slednjimi in alginatom ustvarijo odbojne interakcije kar vodi v hitrejše sproščanje negativno nabitih zdravilnih učinkovin (4).
Nabrekanje in erozija
Nabrekanje in erozija hidrogelov v vodnem mediju sta torej parametra, ki pomembno vplivata na lastnosti hidrogelov kot dostavnih sistemov. Kot že omenjeno, slednji v stiku z vodnim medijem vežejo tekočino, ki omogoča difuzijo raztopljenih molekul skozi pore hidrogela; ta proces je odvisen tudi od velikosti por in gostote premreženja hidrogela.
Alginat je hidrofilen polimer, ki v vodnem mediju nabreka, pri čemer sočasno poteka razpletanje polimernih verig in izplavljanje molekul topljenca v medij. Nabrekanje hidrogela lahko nadzorujemo tako s fizikalnimi kot tudi s kemijskimi dejavniki okolja (13, 14).
10
Na nabrekanje alginatnih mikrosfer vplivajo pH medija, ionska sestava in ionska moč medija, lastnosti vgrajene zdravilne učinkovine (npr. velikost, topnost in naboj) ter lastnosti ogrodja. V kislem pH so karboksilne skupine alginata, ki se nahajajo na površini mikrosfer protonirane (-COOH), na površini delca pa nastane plast alginske kisline, ki je v kislem netopna. Med karboksilnimi skupinami se tvorijo vodikove vezi, ki povečajo stabilnost alginatnega ogrodja, skupaj s plastjo v kislem netopne alginske kisline pa ovirajo penetracijo medija globlje v notranjost mikrosfere, kar omejuje nabrekanje le-teh. Ker je v tem mediju alginat netopen, poteka difuzija raztopljene učinkovine skozi netopno ogrodje alginata. V nevtralnem pH je topnost alginata večja, kar vodi v nabrekanje in erozijo ogrodja mikrosfer; raztopljena učinkovina tako difundira skozi nabreklo plast gela, k njenemu sprošččanju pa prispeva tudi erozija ogrodja. Nabrekanje alginatnih mikrosfer je bolj kot v kislem in nevtralnem mediju izraženo v fosfatnem pufru s pH = 6,8. Slednji vsebuje ione Na+, ki se izmenjujejo z ioni Ca2+, ki v gelu premrežujejo karboksilne skupine alginata. Tako Na+ ioni izpodrinejo Ca2+ ione, kar povzroči razpad značilne strukture alginatnega ogrodja (t.j. »škatle za jajca«). Hkrati se pričnejo polimerne verige alginata razpletati, kar dodatno olajša vstop medija v strukturo in nabrekanje alginatnega delca. Na hitrost in obseg nabrekanja vplivajo tudi lastnosti alginatnega ogrodja, in sicer vrsta in količina premreževalnega iona ter sestava, koncentracija in molekulska masa alginata (podrobneje predstavljeno v poglavju (1.1)) (4, 17).
Vrednotenje teksture
V literaturi zasledimo številne definicije reologije, v splošnem pa lahko reologijo definiramo kot interdisciplinarno vedo o tokovnem obnašanju in deformaciji materiala.
Čeprav je pojem reologija prvič opredelil E. C. Bingham leta 1929, pa njeni začetki segajo že v 17. stoletje, ko je bil na osnovi teorije elastičnosti izpeljan Hook-ov zakon (18). Za opis reoloških lastnosti uporabljamo osnovne reološke parametre kot so: i) strižna deformacija, ki je odgovorna za spremembo oblike telesa; ii) strižna napetost, ki jo snov doseže pri obremenitvi s silo in se zmanjša pri razbremenitvi ter povzroči strižno deformacijo; iii) strižna hitrost, ki opredeljuje tekočinsko deformacijo; ter iv) viskoznost, ki definira notranjo upornost tekočin pri pretakanju. Poznavanje reoloških lastnosti je ključnega pomena tudi v farmaciji, za spremljanje fizikalne stabilnosti vhodnih materialov, ovojnine in končnih zdravilnih formulacij v okviru optimizacije in kontrole kakovosti, obnašanja snovi pod vplivom temperature, prav tako je ena izmed komplementarnih metod
11
razvoju in vrednotenju inovativnih dostavnih sistemov. V sklopu reoloških meritev lahko s tehniko vrednotenja teksture ovrednotimo tudi mehanske lastnosti materiala. Začetnika na področju vrednotenja teksture sta Bourne in Szczesniak, ki sta razvila značilni profil analize teksture (ang. Two-bite test), ki sestoji iz dveh zaporednih mehanskih deformacij materiala. Analiza teksture omogoča določanje kompleksnejših parametrov materiala (npr.
kohezivnosti in elastičnosti). Omenjena tehnika je primerna za širok nabor vzorcev, med drugim pa se kot relativno nova metoda uporablja za vrednotenje mehanskih in reoloških lastnosti sistemov s polimernim ogrodjem (npr. hidrogelov) (19, 20).
Za reološke analize, v sklopu katerih se izvaja tudi vrednotenje teksture, uporabljamo reometer, s katerim preko odziva materiala na stiskanje in nato relaksacije dobimo podatke o mehanskih lastnosti materiala, natančneje trdnosti, kohezivnosti, elastičnosti in adhezivnosti. Glede na način merjenja ločimo dve vrsti reometrov: i) rotacijski reometer z nastavljivo strižno hitrostjo, pri katerem vzorec obremenimo s strigom pri določeni strižni hitrosti/deformaciji ter izmerimo strižno napetost; ii) rotacijski reometer z nastavljivo strižno napetostjo, pri katerem nastavimo strižno napetost, merimo pa strižno hitrost/deformacijo. Za uspešno merjenje reoloških lastnosti vzorcev je pomemben tudi izbor primernega senzorskega sistema, ki zavisi od lastnosti uporabljenega vzorca. Tako lahko izbiramo med naslednjimi senzorskimi sistemi:
sistem koaksialnih valjev: vzorec se nahaja v reži med dvema valjema, pri tem en valj rotira z določeno hitrostjo, drugi pa miruje.
sistem stožca in plošče: vzorec se nahaja v reži med stožcem in ploščo, pri čemer se stožec vrti na vzorcu.
sistem dveh vzporednih plošč: vzorec se nahaja v reži med dvema ploščicama, katerih razmik lahko nastavimo sami. Sistem je uporaben za merjenje reoloških lastnosti tako visoko viskoznih tekočin in poltrdnih snovi kot tudi koncentriranih suspenzij (18).
Viskoelastičnost hidrogelov
Hidrogele uvrščamo med viskoelastične sisteme, za katere je značilno, da izkazujejo tako viskozno kot tudi elastično obnašanje. Reološka kompleksnost se kaže v obnašanju med obremenitvijo, saj se v začetni fazi deformacije obnašajo kot trdna snov, v končni fazi pa kot tekočina, kar je tudi razlog, da za njihov opis uporabimo kompleksne reološke enačbe
12
stanja. Po razbremenitvi pa se vrnejo v prvotno obliko v odvisnosti od elastičnega deleža (19). S testom natezne trdnosti (ang. Tensile test) in testom prožnosti (ang. Bending test) običajno vrednotimo elastičnost, vendar nista primerna za vrednotenje elastičnosti hidrogelov, saj imajo slednji bistveno nižjo konsistenco in se v okviru teh meritev hitro pretrgajo in razpadejo. Primerne metode za določanje mehanskih lastnosti, med katere sodi tudi elastičnost hidrogelov, so oscilacijske meritve, test stiskanja materiala v eni smeri ter določanje trdnosti materiala (21).
13
2. NAMEN DELA
Namen magistrskega dela je proučiti vpliv koncentracije (0,3 M vs. 0,5 M) in vrste premreževalnih ionov (Ca2+, Cu2+, Al3+, kombinacij Ca2+ in Zn2+ ter Ca2+ ionov in hitosana) na lastnosti alginatnih mikrosfer. Mikrosfere bomo pripravili iz 1,5% vodne raztopine natrijevega alginata z uporabo enkapsulatorja Inotech IE-50R z enokanalno šobo premera 500 μm, ki temelji na metodi vibrirajoče membrane. Kot modelno učinkovino bomo uporabili pentoksifilin, ki spada med dobro topne učinkovine (BCS razred I). S proučevanjem vpliva sestave medija za premreženje na lastnosti alginatnih mikrosfer z dobro topno učinkovino želimo tudi nadgraditi rezultate, ki so bili pridobljeni na primerljivih alginatnih mikrosferah s slabo topno zdravilno učinkovino v okviru predhodnega raziskovalnega dela na Katedri za farmacevtsko tehnologijo.
Alginatne mikrosfere bomo utrdili z namakanjem v različnih raztopinah za premreženje ter jih posušili v zvrtinčenih plasteh zraka; pri tem nastale pore v ogrodju bomo zapolnili z dodatkom laktoze in natrijevega klorida. Vpliv koncentracije in vrste premreževalnega iona na profil sproščanja vgrajene dobro topne učinkovine pentoksifilina bomo proučevali v medijih sproščanja s pH = 3 in 6,8. Pridobljene rezultate bomo povezali tudi z reološkimi lastnostmi nastalega gelskega ogrodja v okviru vrednotenja teksture ter s študijami nabrekanja in erozije proučevanih mikrosfer.
14
3. MATERIALI IN METODE
3.1 MATERIALI
3.1.1 MATERIALI ZA IZDELAVO IN VREDNOTENJE ALGINATNIH MIKROSFER
Alginska kislina, natrijeva sol (Sigma-Aldrich, Nemčija)
Natrijeva sol alginske kisline je svetel rumenorjav prah brez vonja in okusa. Gre za netoksičen polisaharid s sposobnostjo geliranja. Sama alginska kislina je v vodi netopna, zaradi prostih karboksilnih kislin v svoji verigi. V obliki soli, kot je natrijeva, pa se njena topnost v vodi izboljša. Alginat je v industriji široko uporabljan za pripravo alginatnih hidrogelov, mikrokapsul, ogrodij dostavnih sistemov za tkivni inženiring (22).
Kalcijev klorid, brezvoden (Merck KGaA, Nemčija)
Brezvoden kalcijev klorid je bel kristaliničen prah s temperaturo tališča 772 ºC in dobro topnostjo v vodi. Komercialno dostopen je kalcijev klorid s približno 98% čistoto (23).
Natrijev klorid (Merck, Nemčija)
Natrijev klorid se nahaja v obliki belih kristalčkov. Komercialno dostopen je natrijev klorid z vsebnostjo 99,5% (24).
Natrijev (di)hidrogenfosfat (Merck, Nemčija)
Natrijev dihidrogenfosfat je brez vonja, dostopen pa je v obliki prahu, kristalov ali granul (25).
Natrijev hidroksid (Merck, Nemčija)
Natrijev hidroksid se najpogosteje nahaja v obliki grudic, ploščic, paličic ali kroglic bele ali skoraj bele barve. Ob stiku z vodo nastane precej eksotermna reakcija, zato je dobro, da raztopino natrijevega hidroksida v vodi pripravljamo na ledeni kopeli (26).
Pentoksifilin (Krka, Slovenija)
Pentoksifilin je dostopen v obliki belega prahu. Spada v skupino perifernih vazodilatatorjev in je indiciran za zdravljenje motenj perifernega arterijskega obtoka, zdravljenje motenj v venskem krvnem obtoku, zdravljenje motenj možganskega krvnega
15
obtoka ter za zdravljenje prekrvavitvenih motenj očesa. Mehanizem njegovega delovanja temelji na zmanjšanju viskoznosti krvi in povečanju prožnosti eritrocitov, saj povečuje koncentracije ATP, cAMP in drugih cikličnih nukleotidov v eritrocitih. Poleg tega pa pentoksifilin tudi močno zavira agregacijo trombocitov ter spodbuja sintezo prostaciklina (prostaglandina 12). Njegova absorpcija je po peroralnem jemanju hitra in popolna.
Največjo koncentracijo v serumu pa doseže po 2 do 3 urah. Presnavlja se večinoma v jetrih, v manjši meri pa tudi v eritrocitih. Zanj je značilen in tudi izrazit učinek presnove ob prvem prehodu skozi jetra. Presnovki pentoksifilina se večinoma izločajo s sečem.
Pentoksifilin izkazuje dobro topnost v vodi, saj se pri 25 ºC v vodi raztopi 77 g/L (27 ,28).
Laktoza 200MESH (Lek, Slovenija)
Laktoza je disaharid, sestavljen iz glukoze in galaktoze, ki sta povezani z β-1,4-glikozidno vezjo. Gre za bel kristaliničen prah, ki se dobro topi v vodi. Je netoksična, brez vonja in relativno inertna. V industriji se uporablja kot polnilo pri izdelavi kapsul in tablet, v farmaciji pa se zelo pogosto uporablja kot pomožna snov, saj ima mnogo ugodnih lastnosti, kot so nizka cena, dostopnost, dobra kompatibilnost z drugimi snovmi, dobra topnost v vodi (26, 29).
Cinkov sulfat, heptahidrat (Sigma, Nemčija)
Cinkov sulfat vsebuje > 99% ekvivalenta ZnSO4 × 7 H2O. Običajno se nahaja v obliki belega kristaliničnega prahu, lahko pa ga najdemo tudi v obliki brezbarvnih transparentnih kristalov. Je dobro topen v vodi, v alkoholu pa se ne raztaplja (26, 30).
Bakrov klorid, dihidrat (Merck, Nemčija)
Bakrov klorid je dostopen v brezvodni obliki ali v obliki dihidrata, ki ga sestavljajo modrozeleni ortorombični kristali. Topen je v vodi, metanolu, etanolu, acetonu itd.
Dodatek HCl ali NH4Cl njegovo topnost zmanjša, medtem ko jo dodatek NaCl poveča (26).
Aluminijev klorid, heksahidrat (Merck, Nemčija)
Aluminijev klorid je rumenkast prah, ki eksplozivno reagira z vodo, pri čemer se sprosti velika količina toplote. Ima nizko tališče in sublimira že pri 178 ºC. Pridobiva se s prepihovanjem klora skozi ogljik in aluminijev oksid pri temperaturi okoli 800 ºC.
16
Aluminijev klorid heksahidrat pa se nahaja v vodni obliki, kar pomeni, da z dodatkom vode ne bo nastala eksplozivna reakcija (26).
Hitosan (Sigma, Nemčija)
Hitosan je bel ali umazano bel prah brez vonja. Je naravni polisaharid s kemijskim imenom poli-β-(1,4)-2-amino-2-deoksi-D-glukoza in se pridobiva z delnim deacetiliranjem hitina, ki je skoraj v celoti sestavljen iz N-acetilglukozaminskih enot, povezanih z β-1,4- glikozidnimi vezmi. Topen je v kislem vodnem mediju, njegova topnost pa je odvisna od stopnje deacetiliranja. Zaradi njegove biokompatibilnosti in nizke toksičnosti ga v farmacevtski tehnologiji uporabljamo za izdelavo pripravkov s prirejenim sproščanjem (26).
Ocetna kislina, koncentrirana (Merck, Nemčija)
Ocetna kislina je bistra, brezbarvna, hlapna tekočina z ostrim vonjem, ki se meša z vodo, alkoholom in etrom. V farmaciji jo večinoma uporabljamo za uravnavanje pH (26).
3.1.2 LABORATORIJSKA OPREMA IN NAPRAVE
V Preglednici I so zbrani in na kratko predstavljeni naprave in pripomočki, ki smo jih uporabili pri izdelavi in vrednotenju izdelanih mikrosfer.
Preglednica I: Pri delu uporabljena oprema in pripomočki.
Oprema Proizvajalec
Magnetno mešalo IKA RO 15 IKA, Nemčija
Magnetno mešalo IKA RET basic IKA, Nemčija
Magnetno mešalo Rotamix 560 MMH Tehtnica Železniki, Slovenija Analitska tehtnica AG245 Mettler Toledo, Švica
Precizna tehtnica Vibra AJ Tuning-Fork Balance
Železniki, Slovenija
Enkapsulator IE-50 R Inotech, Švica
Ultrazvočna kadička Sonis 4 Iskra, Slovenija Spektrofotometer Agilent / HP 8453
Spectrophotometer
Agilent Technologies, ZDA
17
Top-spray komora Strea-1 NIRO-Aeromatic, Švica
Naprava za test raztapljanja Dissolution Tester VanKel VK 7000
VanKel, ZDA
Brizge (60mL) OMNIFIX 60ml Braun, Švica Brizge (5mL) ICO Plus2 5 mL Novico, Italija
pH meter MA235 Mettler Toledo, Švica
Filtri za filtracijo raztopin Minisant RC 0,45μm
Santorius, Nemčija
Filtri za filtracijo raztopin Celulozni acetat 0,2 μm
Sartorius, Nemčija
Parafilm Bemis, ZDA
Reometer Anton Paar Physica MCR 301 Anton Paar, Avstrija
3.2 METODE
3.2.1 PRIPRAVA ALGINATNEGA MATRIKSA
Alginatni matriks predstavlja ovojnico mikrosfer. Za izdelavo slednjih smo pripravili raztopino natrijevega alginata in sicer tako, da smo k 92,5 g prečiščene vode dodali 5 g laktoze in 1 g NaCl ter vse skupaj mešali na magnetnem mešalu toliko časa, da sta se laktoza in NaCl popolnoma raztopila. Nato smo dodali 1,5 g natrijevega alginata in pustili pokrito s parafilmom mešati 24 ur, da je nastala homogena raztopina.
3.2.2 PRIPRAVA ALGINATNEGA MATRIKSA S PENTOKSIFILINOM
Za pripravo alginatnih mikrosfer s pentoksifilinom smo k 100 g alginatnega matriksa, ki smo ga pripravili po zgoraj opisanem postopku, dodali 0,5 g pentoksifilina in vse skupaj mešali na magnetnem mešalu do nastanka homogene suspenzije.
3.2.3 PRIPRAVA RAZTOPIN ZA PREMREŽEVANJE 0,3 M raztopina CaCl2
Za pripravo te raztopine smo k 965,7 g prečiščene vode dodali 34,3 g kalcijevega klorida ter vse skupaj mešali na magnetnem mešalu toliko časa, da je nastala bistra raztopina.
0,5 M raztopina CaCl2
18
Za pripravo te raztopine smo k 942,8 g prečiščene vode dodali 57,2 g kalcijevega klorida ter vse skupaj mešali na magnetnem mešalu toliko časa, da je nastala bistra raztopina.
0,3 M raztopina AlCl3
Za pripravo te raztopine smo k 927,57 g prečiščene vode dodali 72,43 g AlCl3 × 6 H2O ter vse skupaj mešali na magnetnem mešalu toliko časa, da je nastala bistra raztopina.
0,3 M raztopina CuCl2
Za pripravo te raztopine smo k 948,86 g prečiščene vode dodali 51,14 g CuCl2 × 2 H2O ter vse skupaj mešali na magnetnem mešalu toliko časa, da je nastala bistra raztopina.
0,15 M raztopina ZnCl2 in 0,15 M raztopina CaCl2
V ločenih čašah smo pripravili 0,3 M raztopino CaCl2 in 0,15 M raztopino ZnSO4. Raztopino CaCl2 smo pripravili tako, da smo k 265,7 g prečiščene vode dodali 8,85 g CaCl2 (97% (m/m)) in vse skupaj pustili mešati na magnetnem mešalu do nastanka bistre raztopine. Raztopino ZnSO4 pa smo pripravili tako, da smo k 292,5 g prečiščene vode dodali 6,5 g ZnSO4 × 7 H2O in vse skupaj pustili mešati na magnetnem mešalu do nastanka bistre raztopine. Nato smo med mešanjem na magnetnem mešalu v raztopino CaCl2 počasi dolivali raztopino ZnSO4. Pri tem je potekla naslednja reakcija:
CaCl2 + ZnSO4 → CaSO4 + ZnCl2
Pri reakciji je nastala bela oborina CaSO4, ki je v vodi slabo topna. Po eni uri mešanja smo oborino odfiltrirali. V končni raztopini je po reakciji ostala 0,15 M raztopina CaCl2
(presežek, ki v reakciji ni zreagiral) in 0,15 M raztopina ZnCl2. Končno raztopino smo uporabili za premreževanje izdelanih mikrosfer.
Raztopina hitosana (1% (m/m))
Raztopino hitosana smo pripravili v obliki 1 % (m/m) raztopine hitosana v 1% (m/m) ocetni kislini. Najprej smo pripravili 1% (m/m) ocetno kislino in sicer tako, da smo 1 mL 100% (m/m) ocetne kisline prenesli v 100 mL bučko in dopolnili s prečiščeno vodo do oznake. Nato smo k 99 g pripravljene 1% (m/m) raztopine ocetne kisline dodali 1 g hitosana. Vse skupaj smo pustili mešati 24 h do nastanka homogene raztopine.
19
3.2.4 PRIPRAVA MEDIJA ZA TEST SPROŠČANJA Vodna raztopina HCl s pH=3
Raztopino smo pripravili tako, da smo k 1 L vode dodali 0,08 mL HCl (37% (m/m),
=1,19 kg/L). S pH metrom smo nato umerili pH in ga po potrebi uravnali s kislino oziroma bazo.
Fosfatni pufer s pH = 6,8
Za pripravo fosfatnega pufra s pH = 6,8 smo najprej v ločenih bučkah pripravili 0,2 M raztopino NaOH in 0,2 M raztopino NaH2PO4 × 2 H2O. Raztopino NaOH smo pripravili v 1 L merilni bučki tako, da smo 8 g NaOH raztopili v majhni količini prečiščene vode, nato pa raztopino s pomočjo lijaka prenesli v merilno bučko in dopolnili s prečiščeno vodo do oznake. Raztopino NaH2PO4 × 2 H2O smo pripravili v 2 L merilni bučki tako, da smo 62,4 g NaH2PO4 × 2 H2O raztopili v majhni količini prečiščene vode, nato pa raztopino s pomočjo lijaka prenesli v merilno bučko in dopolnili z vodo do oznake. Ker nismo imeli na voljo natrijevega dihidrogenfosfata, smo uporabili natrijev hidrogenfosfat, katerega maso smo ustrezno preračunali glede na maso dihidrogenfosfata.
Fosfatni pufer s pH = 6,8 smo nato pripravili tako, da smo v 5 L merilni bučki zmešali 1250 mL 0,2 M raztopine NaH2PO4 × 2 H2O in 560 mL 0,2 M raztopine NaOH ter dopolnili s prečiščeno vodo do oznake. Pripravljenemu pufru smo s pH-metrom izmerili še pH in ga po potrebi uravnali s kislino oziroma z bazo.
3.2.5 POSTOPEK IZDELAVE MIKROSFER Z VGRAJENIM PENTOKSIFILINOM
Za izdelavo alginatnih mikrosfer smo uporabili enkapsulator Inotech IE-50 R , pri čemer smo mikrosfere izdelali s kapljalno metodo s pomočjo enokanalne šobe velikosti 500 μm.
Alginatni matriks s homogeno suspendiranim pentoksifilinom smo prenesli v 60 mL brizgo, s pomočjo katere smo ga nato dovajali skozi šobo. Pred samim začetkom procesa pa smo na kontrolni plošči nastavili parametre procesa - frekvenco vibriranja membrane na 3000 Hz, amplitudo na 3, napetost na 0,8 kV in relativno hitrost pretoka matriksa na 220.
Shematski prikaz procesa izdelave mikrosfer je prikazan na sliki 6.
20
Slika 6: Postopek izdelave mikrosfer (31).
Med procesom izdelave smo nastajajoče mikrosfere zbirali v 100 mL raztopine za premreževanje (0,3 M CaCl2, 0,5 M CaCl2, 0,3 M AlCl3, 0,3 M CuCl2, 0,3 M CaCl2/ZnCl2
in 0,3 M CaCl2 + 1% hitosan), ki se je neprekinjeno mešala na magnetnem mešalu.
Po 15 minutah smo premrežene mikrosfere odnučali in sprali s 150 mL prečiščene vode.
Tako pripravljene mikrosfere smo posušili v vrtinčnoslojnem sušilniku (slika 7) (tako dolgo, da je temperatura izhodnega zraka dosegla 50 ºC).
21
Slika 7: NIRO-Aeromatic.
Enkapsulator Inotech IE-50R (prikazan na sliki 8) je naprava za kapsuiranje zdravilnih učinkovin ter rastlinskih, živalskih in mikrobnih celic pa tudi drugih biomolekul. Izdelava mikrosfer temelji na metodi vibrirajoče membrane, za katero je značilno, da laminarni tok tekočino razbije na enakomerno velike kapljice. Naprava se uporablja tako za izdelavo ogrodnega tipa mikrosfer kot tudi za izdelavo enojedrnih in večjedrnih mikrosfer (32).
Slika 8: Enkapsulator Inotech IE-50R.
Glavni enoti enkapsulatorja sta kontrolna enota in reakcijska posoda.
22
Kontrolna enota je tisti del enkapsulatorja, ki združuje vse sisteme za nastavitev različnih parametrov izdelave mikrosfer:
vibracijska enota za nadzor amplitude in frekvence elektromagneta membrane:
ta enota omogoča ponastavljanje frekvence nihanja membrane v dveh območjih in sicer v nizkem ter visokem območju. V nizkem območju se vrednosti gibljejo med 50 in 440 Hz, medtem ko so v visokem območju te vrednosti med 430 in 7000 Hz.
Nastavitev amplitude je relativna z razponom od 1 do 7;
enota za kontrolo električne napetosti: električna napetost ustvari električni naboj na površini mikrosfer in tako prepreči zlepljanje delcev v reakcijski posodi. V praksi se uporablja območje napetosti med 400 in 1800 V;
enota za nastavitev in kontrolo relativne hitrosti tlačilke za brizgo: relativno hitrost pretoka raztopine ogrodnega polimera lahko nastavimo med 0 in 1000, dejanska hitrost pa je odvisna od premera šobe ter viskoznosti same raztopine;
enota za kontrolo magnetnega mešala: hitrost mešanja magnetnega mešala lahko nastavimo od 1 do 7, izbira hitrosti pa je odvisna tako od volumna raztopine za premreževanje kot tudi od volumna raztopine ogrodnega polimera, ki ga kapsuliramo;
stroboskop: omogoča takojšnjo kontrolo procesa kapsuliranja, saj nam podaja informacijo o razbitju laminarnega curka tekočine (32).
Reakcijska posoda je priključena na kontrolno ploščo in predstavlja enoto, ki vsebuje raztopino za premreževanje, mešajočo na magnetnem mešalu, v katero zbiramo nastajajoče mikrosfere. Ta sistem je lahko tudi zaprt in omogoča avtoklaviranje, s tem pa zagotavlja ustrezno okolje za aseptično izdelavo mikrosfer (32).
Tehnologija izdelave mikrosfer
Raztopino ogrodnega polimera z raztopljeno ali suspendirano zdravilno učinkovino napolnimo v brizgo, ki je lahko volumna 1-60 mL in jo nato s pomočjo črpalke v laminarnem toku potiskamo skozi enokanalno šobo z izbrano velikostjo odprtine. Na izhodu iz šobe se laminarni curek tekočine pod vplivom vibriranja membrane razbije na enako velike kapljice, ki nato padajo skozi električno polje med šobo in elektrodo. Pri tem se površina kapljic nabije, to pa preprečuje njihovo zlepljanje. V končni stopnji te nepremrežene polimerne mikrosfere ujamemo v raztopino za premreževanje, kjer se
23
polimerno ogrodje utrdi in dobimo končno obliko mikrosfer. S pomočjo stroboskopske luči pa lahko ves čas opazujemo nastajanje mikrosfer (33).
Splošna pravila izdelave mikrosfer
Za izdelavo mikrosfer veljajo določena splošna pravila, ki so zbrana v naslednjem odstavku:
velikost mikrosfer je odvisna od velikosti šobe in je praviloma dvakrat večja od njenega premera;
pri uporabi nižjih frekvenc dobimo večje mikrosfere in obratno;
pri izdelavi manjših mikrosfer potrebujemo nižjo električno napetost;
v primeru bolj viskozne raztopine ogrodnega polimera potrebujemo za dosego kontinuiranega toka polimera nižje frekvence in večjo hitrost (32).
Težave pri izdelavi mikrosfer
Tudi pri izdelavi mikrosfer se srečujemo z nekaterimi težavami, ki so navedene spodaj:
nestabilen tok raztopine ogrodnega polimera: nastane zaradi zamašene šobe, prenizke hitrosti curka ali previsoke frekvence ali amplitude;
nestabilna »veriga kapljic«: nastane zaradi premajhne ali prevelike hitrosti curka, prenizke ali previsoke frekvence ali amplitude, lahko tudi zaradi nečiste šobe;
nehomogena porazdelitev velikosti mikrosfer: nastane zaradi prevelike hitrosti curka, previsoke frekvence in prevelike napetosti;
nizki izkoristki procesa kapsuliranja: izkoristek procesa je v veliki meri odvisen od parametrov šobe, ki kljub povečanju le-teh še vedno niso dovolj visok za doseganje velikih produkcijskih volumnov (32).
24 3.2.6 TEST SPROŠČANJA
S testom sproščanja smo določili količino pentoksifilina, ki se je v določenem časovnem intervalu sprostila iz suhih mikrosfer. Test smo izvajali na USP aparaturi 2 z veslastim mešalom (Dissolution Tester, Van Kel, VK 7000, ZDA) (slika 9) pri 50-ih obratih/min in pri konstantni temperaturi 37 ºC.
Slika 9: Aparat za raztapljanje, Dissolution Tester, Van Kel, VK 7000.
V 900 mL medija za raztapljanje (vodna raztopina HCl s pH = 3, prečiščena voda in fosfatni pufer s pH = 6,8) smo dispergirali približno 500 mg suhih mikrosfer z vgrajenim pentoksifilinom. Da bi zagotovili enake pogoje sproščanja, smo vzorčenje izvedli ob v predhodnem raziskovalnem delu določenih časovnih intervalih (Preglednica II). Odvzeli smo 10 mL vzorca ter ga filtrirali skozi filter Minisant RC 0,45 μm (Santorius, Nemčija).
Odvzetega medija nismo nadomeščali. Test smo za vsako serijo mikrosfer izvedli v treh paralelkah.
Odvzete vzorce smo nato analizirali z UV spektrofotometrom (Agilent / HP 8453 Spectrophotometer, ZDA) in iz umeritvene premice izračunali koncentracijo pentoksifilina ob določenem času. Delež sproščenega pentoksifilina (enačba 2) smo nato izračunali z upoštevanjem volumna medija (enačba 1) in predhodno določene točne vsebnosti pentoksifilina v natehti. Slednjo smo določili tako, da smo v 200 mL medija dispergirali približno 500 mg suhih mikrosfer in pustili mešati 24 ur. Nato smo spektrofotometrično analizirali raztopino in iz umeritvene premice izračunali koncentracijo pentoksifilina, ki predstavlja 100% vsebnost v natehti.
25
Enačba 1 Vm = V0 − Vvz + (c(t-1)∗ 10)
pri čemer Vm predstavlja dejanski volumen medija, V0 začetni volumen medija (900 mL), Vvz volumen odvzetega vzorca (10 mL), c(t-1) koncentracijo vzorca v prejšnji časovni točki in (c(t-1) * 10 mL) maso v prejšnji točki odvzetega vzorca.
Enačba 2 % (sproščene ZU) = (m(sproščene ZU)
m(celotne ZU) ) ∗ 100
pri čemer % (sproščene ZU) predstavlja delež sproščenega pentoksifilina, m (sproščene ZU) maso sproščenega pentoksifilina v času t in m (celotne ZU) maso pentoksifilina, določeno s točno vsebnostjo v zatehti.
Preglednica II: Časovni intervali vzorčenja v mediju s pH = 3, prečiščeni vodi in pH = 6,8.
medij raztapljanja
časovni interval pH = 3 prečiščena voda pH = 6,8
15 min x x x
30 min x x x
45 min x x x
1 ura x x x
4 ure x x x
8 ur x x
24 ur x x
3.2.7 ANALITIKA ZDRAVILNE UČINKOVINE
Za določanje zdravilne učinkovine smo kot analizno metodo uporabili UV/VIS spektrofotometrijo. Pentoksifilin ima absorpcijski maksimum pri valovni dolžini 274 nm, zato ga lahko analiziramo z UV/VIS spektrofotometrijo. Območje merjenja absorbance je od 0,1 do 1,5, saj to območje podaja linearen odnos med absorbanco in koncentracijo učinkovine. Koncentracijo učinkovine v raztopini pa preračuna računalnik na podlagi absorbance in umeritvene krivulje, ki smo jo predhodno posneli iz petih standardnih raztopin. Pri meritvah absorbance smo uporabili kiveto iz kvarčnega stekla, meritve pa smo izvajali v treh paralelah.
S pomočjo UV/VIS spektrofotometrije smo določili sproščeno koncentracijo pentoksifilina iz alginatnih mikrosfer, premreženih z 0,3 M CaCl2, 0,5 M CaCl2, 0,3 M CaCl2 + 1%
hitosan, 0,3 M CuCl2, 0,3 M AlCl3 ter 0,3 M CaCl2/ZnCl2 in vseh treh medijih sproščanja (pH = 3, prečiščena voda in pH = 6,8).
26
Osnovno standardno raztopino vzorca smo pripravili tako, da smo v 100 mL merilno bučko natehtali 20 mg pentoksifilina, ga raztopili v nekaj mililitrih prečiščene vode in dopolnili z medijem za raztapljanje do oznake. Bistro raztopino smo prefiltrirali skozi membranski filter z velikostjo por d = 45 μm in tej raztopini izmerili absorbanco. Nato smo osnovno raztopino redčili toliko časa, da smo dobili 5 razredčenih raztopin z absorbanco med 0,1 in 1,5.
3.2.8 DOLOČANJE NABREKANJA IN EROZIJE
Nabrekanje in erozijo alginatnih mikrosfer smo določali z uporabo aparature za raztapljanje z vesli pri 50-ih obratih/minuto in 37 ºC. V mrežaste (čajne) kroglice premera
~ 4 cm smo natehtali približno 500 mg suhih mikrosfer in jih potopili v 900 mL medija za nabrekanje (medij s pH = 3, prečiščena voda in fosfatni pufer s pH = 6,8). Časovne intervale vzorčenja smo določili za vsak medij sproščanja (pH = 3 in pH = 6,8) z ozirom na pH vrednosti posameznega medija, saj slednji izrazito vpliva na raztapljanje alginatnega ogrodja. Tako smo v mediju s pH = 3 vzorčili ob časovnih intervalih 1 h in 24 h, v fosfatnem pufru s pH = 6,8 pa ob intervalih 1 h in 2 h. Pri tem smo kroglice z mikrosferami odstranili iz medija, jih odcedili, odvečno vodo narahlo popivnali s papirnato brisačko in vsebino kroglice ponovno stehtali. Test smo izvajali v treh paralelkah. Za izračun nabrekanja smo uporabili naslednjo enačbo:
Enačba 3 S (%) = (m(t)−m0(suhe,ki so nabrekale)
m0(suhe,ki so nabrekale) ) ∗ 100
pri čemer S (%) predstavlja nabrekanje izraženo v odstotkih, m(t) maso nabreklih mikrosfer, m0 pa začetno maso mikrosfer, ki so nabrekale.
Erozijo smo določali sočasno s spremljanjem nabrekanja. Ob zgoraj določenih časovnih intervalih smo iz medija za nabrekanje odvzeli mikrosfere, jih stehtali in nato sušili do konstantne mase in jih ponovno stehtali.
Parameter m0 (za E) za erozijo smo izračunali po spodnji enačbi:
Enačba 4 m0(za E) = (m(0)∗m(suhe povpr) m(0)(suhe povpr) )
pri čemer m(0) predstavlja začetno maso mikrosfer, ki so nabrekle, m(suhe povpr) povprečno končno maso ponovno sušenih mikrosfer ter m(0)(suhe povpr) povprečno začetno maso
27
mikrosfer, ki so nabrekale. S pomočjo parametra m0(za E) smo nato izračunali erozijo po enačbi 5:
Enačba 5 E (%) = (m0(za E)−m(suhe,ki so nabrekale)
m0(za E) ) ∗ 100
pri čemer E (%) predstavlja erozijo izraženo v odstotkih, m(suhe, ki so nabrekale) pa maso ponovno sušenih mikrosfer, ki so predhodno nabrekale.
3.2.9 VREDNOTENJE TEKSTURE
Čvrstost mikrosfer lahko določamo z metodo analize teksture, pri kateri spremljamo mehanske lastnosti materialov oz. krivuljo deformacije, ki predstavlja odziv materiala po izpostavitvi določeni sili. Na sliki 10 je predstavljena značilna krivulja deformacije: i) trdnost je definirana kot sila, ki je potrebna da dosežemo popolno deformacijo materiala. V krivulji deformacije je le-ta opredeljena z vrhom prvega stiskanja; ii) adhezivnost je definirana kot sila, potrebna za premaganje privlačnih sil med površino materiala, ki ga testiramo in površino plošče senzorskega sistema. Poenostavljeno, gre za silo, ki je potrebna da se testiran material (npr. mikrosfera) odlepi od plošče senzorskega sistema reometra. Negativna površina pod krivuljo deformacije predstavlja adhezivnost materiala;
iii) elastičnost opredelimo kot stopnjo, do katere se material povrne po prenehanju delovanja sile; iv) kohezivnost pa predstavlja moč intermolekularnih vezi, ki povezujejo material. V krivulji deformacije je kohezivnost snovi predstavljena s površino pod krivuljo pozitivnega odseka krivulje (34).
28
Slika 10: Sprememba materiala po delovanju sile v odvisnosti od časa (34).
Analizo teksture smo izvedli na neposušenih mikrosferah brez in z vgrajeno zdravilno učinkovino z namenom ovrednotenja čvrstosti mikrosfer, premreženih z različnimi premreževalnimi raztopinami (0,3 M Ca2+, 0,5 M Ca2+, 0,3 M Ca2+ z dodatno hitosansko ovojnico, kombinacija 0,3 M Ca2+ in Zn2+, 0,3 M Cu2+ ter 0,3 M Al3+). Analizo smo izvedli z reometrom znamke Anton Paar model- Physica MCR 301 (Graz, Avstrija) (slika 11) z merilnim sistemom ploščica – ploščica (nastavek PP50), z začetnim razmikom 3 mm v primeru premreženja z Al3+ oz. 4 mm v primeru premreženja z ostalimi kationi. Za meritve smo uporabili neposušene mikrosfere, ki smo jih predhodno 15 minut namakali v raztopini za premreževanje in nato odcedili, potem pa enakomerno nanesli na ploščo merilnega sistema. Pri tem smo bili pozorni, da med posameznimi mikrosferami ni bilo praznih prostorov. V okviru meritev smo spremljali vrednosti normalne sile (FN) v odvisnosti od razmika med ploščama (Gap d).
29
Slika 11: Reometer Anton Paar Physica MCR 301.
Za posamezno serijo mikrosfer smo izvedli meritve stiskanja in relaksacije v treh ponovitvah.
Test stiskanja smo izvedli tako, da smo v 100 korakih vzorec stisnili iz začetnih 4 oz. 3 mm na 0,5 mm, pri čemer smo merili odvisnost normalne sile (FN) od razdalje med ploščicama. Tip meritve smo določili v okviru preliminarnega testiranja, kjer smo spremljali nastanek platoja krivulje, tj. pri katerih vrednostih se proces stiskanja ustavi. V tej točki se namreč mikrosfere sploščijo do te mere, da ne oddajajo nobene sile več. Pri naslednjih meritvah smo zato stiskanje ustavili en korak pred točko platoja. S tem testom smo določili točko preloma mikrosfer, ki predstavlja minimalno debelino mikrosfer brez in z vgrajeno zdravilno učinkovino, tj. pentoksifilinom, ter odraža čvrstost posameznih mikrosfer.
Test relaksacije smo izvedli z namenom ovrednotenja sposobnosti povrnitve mikrosfer v prvotno obliko po obremenitvi. V ta namen smo predhodno za vsako serijo mikrosfer določili mejo elastičnosti. To je točka, do katere lahko stisnemo mikrosfere, da le-te še vedno ohranijo svojo značilno obliko. Določa jo presečišče dveh linearnih premic naklona krivulje meritve stiskanja. Presečišče, ki predstavlja mejo elastičnosti, smo določili v programu Excel, v katerem smo krivuljo stiskanja za posamezen vzorec v okviru preliminarnega testiranja razdelili na linearne odseke in dodali linearni trendni črti (slika
30
12). V okviru testa relaksacije smo na podlagi določene meje elastičnosti za posamezen vzorec prilagodili začetno nastavitev razmika med ploščicama, medtem ko je bila končna nastavitev razmika pri vseh vzorcih enaka, in sicer 4 mm oz. v primeru mikrosfer premreženih z Al3+ 3 mm. Tudi test relaksacije smo izvedli v 100 korakih in merili odvisnost normalne sile od razdalje med ploščicama, za vsako ponovitev pa smo uporabili svež vzorec neposušenih mikrosfer.
Slika 12: Določitev presečišča premic linearnih odsekov krivulje.
Iz krivulje relaksacije lahko pridobimo podatke o adhezivnosti mikrosfer. To je sila, ki je potrebna, da se mikrosfera odlepi od ploščice reometra. Adhezivnost smo določili tako, da smo v negativnem delu krivulje relaksacije s trapezoidno metodo izračunali površino pod krivuljo (AUC), ki se razlikuje med posameznimi premreževalnimi ioni.
