SANDI KRALJ MAGISTRSKA NALOGA ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJA

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

SANDI KRALJ

MAGISTRSKA NALOGA

ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJA

Ljubljana, 2022

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

SANDI KRALJ

DOLOČANJE TOPNOSTI KANABIDIOLA V RAZLIČNIH TOPILIH

SOLUBILITY ASSESSMENT OF CANNABIDIOL IN DIFFERENT SOLVENTS

ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJA

Ljubljana, 2022

Magistrsko nalogo sem opravljal na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani na Katedri za farmacevtsko biologijo pod mentorstvom doc. dr. Eve Tavčar, mag farm.

Zahvala

Iskreno se zahvaljujem svoji mentorici doc. dr. Evi Tavčar za vso pomoč, napotke in

prijaznost pri izdelavi moje magistrske naloge. Hvala tudi ostalim zaposlenim na Katedri za farmacevtsko biologijo za pomoč pri izvedbi laboratorijskega dela.

Posebna zahvala gre tudi moji družini in prijateljem, ki so mi tekom študija stali ob strani.

Izjava

Izjavljam, da sem magistrsko delo samostojno izdelal pod mentorstvom doc. dr. Eve Tavčar, mag. farm.

Ljubljana, 2022

Sandi Kralj

I

KAZALO VSEBINE

POVZETEK ... IV ABSTRACT ... V SEZNAM OKRAJŠAV ... VI

1 UVOD ... 1

1.1 Navadna konoplja (Cannabis sativa L.) ... 1

1.2 Kanabidiol ... 1

1.2.1 Endokanabinoidni sistem ... 2

1.2.2 Potencialna uporaba CBD in obstoječa zdravila ... 3

1.3 Farmakokinetika CBD ... 4

1.4 Topnost ... 5

1.4.1 Biofarmacevtski klasifikacijski sistem (BCS) ... 6

1.4.2 Stopnja topnosti ... 7

1.4.3 Načini določanja topnosti ... 7

1.4.4 Računalniški modeli ... 9

1.5 Hitrost raztapljanja ... 10

1.6 Stabilnost CBD ... 11

1.7 Olja, ki so vehikli za CBD kapljice ... 12

1.8 Najnovejši pristopi k izdelavi formulacij s CBD ... 13

1.9 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) ... 13

1.9.1 Reverznofazna HPLC (RP-HPLC) ... 14

2. NAMEN DELA ... 15

3 MATERIALI IN METODE ... 16

3.1 Materiali ... 16

3.1.1 Standard CBD ... 16

3.1.2 Reagenti in topila ... 16

3.1.3 Aparature ... 17

3.1.4 HPLC analiza (slika 4) ... 17

3.1.5 Računalniški programi ... 18

3.1.6 Ostala laboratorijska oprema ... 18

3.2 Metode dela in priprava vzorcev ... 19

3.2.1 Izbira topil za analizo ... 19

II

3.2.2 Priprava HPLC mobilne faze ... 20

3.2.3 Modifikacija HPLC metode ... 20

3.2.4 Izdelava umeritvene krivulje CBD ... 20

3.2.5 Priprava vzorcev ... 21

3.2.6 Parametri HPLC analize ... 24

4 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 25

4.1 Pregled pogostosti uporabe različnih nosilnih topil v CBD kapljicah in pršilih ... 25

4.2 Umeritvena krivulja ... 29

4.3 Topnost CBD v analiziranih topilih ... 30

4.3.1 Rastlinska olja ... 31

4.3.2 Propilenglikol in njegove vodne raztopine ... 33

4.3.3 Topnost CBD v ostalih topilih ... 34

4.3.4 Laboratorijska topila ... 36

4.4 Opis vloge topil v zdravilih ... 38

4.5 Zmes glicerola in etanola ... 38

4.6 Zmes PEG 400–voda ... 39

4.7 Primerjava literaturnih podatkov topnosti CBD z rezultati ... 41

5. SKLEP ... 43

6. LITERATURA ... 44

7. PRILOGA ... 49

III

KAZALO SLIK

Slika 1. Skeletna formula CBD. ... 2

Slika 2. Na sliki je prikazan princip določanja ravnotežne topnosti. Topilu je dodana presežna količina topljenca, ki se le deloma raztopi. ... 8

Slika 3. Skica raztapljanja trdnega delca. Pri raztapljanju je prisoten difuzni sloj, v katerem je prisoten koncentracijski gradient topljenca od nasičene topnosti do koncentracije raztopine izven difuznega sloja. ... 10

Slika 4. HPLC naprava, ki smo jo uporabili pri našem delu. ... 18

Slika 5. Centrifugirke s suspenzijami CBD v olju konopljinih semen, MCT olju in čijevem olju tik pred stresanjem na stresalniku. ... 22

Slika 6. Na sliki je postopek filtracije suspenzije, s katerim pridobimo nasičeno raztopino. .. 22

Slika 7. Delež posameznih vehiklov na slovenskem trgu glede na 49 obravnavanih izdelkov. ... 25

Slika 8. Delež posameznih vehiklov na tujem trgu, glede na 141 obravnavanih izdelkov. ... 26

Slika 9. Delež posameznih nosilnih topil na slovenskem in tujem trgu skupaj. ... 27

Slika 10. Umeritvena premica CBD v enotah mg/mL raztopine. ... 29

Slika 11. Umeritvena premica v enotah mg/g raztopine. ... 30

Slika 12. Kromatogram vzorčne raztopine CBD pri 220 nm. Vrh CBD je pri 4,15 min. ... 30

Slika 13. Topnost CBD v rastlinskih oljih pri 25 °C. ... 32

Slika 14. Vpliv masnega deleža vode na topnost CBD. ... 34

Slika 15. Topnost CBD v laboratorijskih topilih. ... 37

Slika 16. Levo in v sredini sta zmesi CBD v 70% glicerolu–28,17% etanolu–1,83% vodi. Desno je zmes CBD v 50% glicerolu–48% etanolu–2% vodi. Pri vseh 3 zmeseh je prišlo do ločitve faz. ... 39

Slika 17. Levo na sliki je homogena raztopina CBD v 90% PEG 400 in 10% vodi (w/w) ... 40

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica II: Vrednosti dielektričnih konstant nekaterih topil pri 25 °C (21) ... 5

Preglednica III: Razredi spojin glede na BCS (22) ... 6

Preglednica IV: Stopnje topnosti kot so navedene v Evropski farmakopeji (24) ... 7

Preglednica V: Parametri analize s HPLC ... 24

Preglednica VI: Zmesi olj ... 28

Preglednica VII: Topnosti CBD v rastlinskih oljih ... 31

Preglednica VIII: Topnost CBD v propilenglikolu in njegovih vodnih raztopinah ... 33

Preglednica IX: Topnost CBD v ostalih topilih ... 35

Preglednica X: Topnost CBD v laboratorijskih topilih ... 36

Preglednica XI: Literaturni podatki topnosti CBD ... 41

IV

POVZETEK

Navadna konoplja (Cannabis sativa, L.) je rastlina, ki jo človeštvo s pridom izkorišča že tisočletja. V konoplji je prisotnih preko 100 kanabinoidov, med katerimi sta najpomembnejša kanabidiol (CBD) in tetrahidrokanabinol (Δ⁹-THC). Farmakološki učinek pri vretenčarjih dosežeta z delovanjem na kanabinoidne in nekatere druge receptorje. Δ⁹-THC je psihotropna substanca in zaradi tega zakonodajno regulirana kot prepovedana droga v veliko državah.

Drugače velja za CBD, ki ni psihoaktiven in zato bolj varen za uživanje. V zadnjih desetih letih se je njegova uporaba v farmaciji, hrani in kozmetiki močno povečala. Vedno bolj je tudi poznan javnosti. Na tujih trgih sta že 2 zdravili, ki vsebujeta CBD (Epidyolex in Sativex). Kljub temu je v literaturi malo podatkov, ki opisujejo njegovo topnost v različnih topilih. Zato smo v magistrski nalogi določili topnost CBD v topilih, ki so za njegovo uporabo najbolj pomembna.

Najprej smo raziskali spletni trg izdelkov s CBD, pri katerih so prevladovale kapljice in pršila, da smo ugotovili, katera topila se najpogosteje uporabljajo. Zadetke smo v spletnem brskalniku iskali v slovenščini in angleščini. Največkrat so pregledani izdelki kot nosilna topila vsebovali MCT olje, olje konopljinih semen, olivno olje in njihove zmesi. Zato smo topnost določili v vseh treh omenjenih oljih. Poleg tega smo topnost določili tudi v čijevem olju, propilenglikolu (in njegovih vodnih raztopinah), trietil citratu, PEG 400, triacetinu, 96% etanolu, metanolu, izooktanu, acetonu, izopropanolu, DMSO, 1-butanolu, DMF, cikloheksanu, diklorometanu in dietiletru.

Za določanje topnosti smo uporabili»shake-flask« metodo, pri čemer smo pripravili suspenzije CBD (na sobni temperaturi), jih stresali 48 h na stresalniku, filtrirali, redčili in določili koncentracijo CBD s HPLC metodo. CBD je v vodi zelo slabo topen, vendar to ne velja za večino drugih topil, v katerih smo določali topnost. Najbolje so ga raztapljali aceton, metanol in dietileter ter le malenkost slabše ostala laboratorijska topila. Tudi v topilih, ki se uporabljajo za izdelavo izdelkov, je bil CBD zelo dobro topen. Med njimi je bila topnost najvišja v triacetinu, PEG 400 in trietil citratu. Nekoliko slabša je bila v propilenglikolu in še nižja v rastlinskih oljih. V vodnih raztopinah propilenglikola se je izkazalo, da že nizka vsebnost vode močno zniža topnost CBD. Med rastlinskimi olji je bil CBD najbolje topen v MCT olju, najslabše pa v olivnem olju.

Ključne besede: CBD, kanabidiol, topnost, kanabinoid, shake-flask metoda

V

ABSTRACT

Cannabis (Cannabis sativa, L.) is a plant that has been used by mankind for thousands of years.

It contains over 100 cannabinoid molecules, the most important of which are cannabidiol (CBD) and tetrahydrocannabinol (Δ⁹-THC).They achieve their pharmacological effects on vertebrates by acting on cannabinoid receptors and some other receptors. Δ⁹-THC is a psychotropic substance and is therefore highly regulated as an illicit drug by most authorities around the world. CBD on the other hand is not psychotropic and has a more favorable safety profile.Over the last ten years, its use has increased significantly as has its recognition among the general public. There are already two CBD-containing medicines on the market (Epidyolex and Sativex).Nevertheless, there is little data in the literature describing its solubility in various solvents. Therefore, we determined the solubility of CBD in the solvents that are most important for its use.

Firstly, we researched the online market of CBD products (drops and sprays) to find out which solvents are most commonly used.We searched for results in the web browser in Slovene and English language. The reviewed products most often contained following carrier solvents: MCT oil, hemp seed oil, olive oil, and their mixtures. Therefore, we determined the solubility in all 3 mentioned oils. We also measured the solubility of CBD in chia seed oil, propylene glycol, and its aqueous mixtures, triethyl citrate, PEG 400, triacetin, 96 % ethanol, methanol, isooctane, acetone, isopropanol, DMSO, 1-butanol, dimethylformamide, cyclohexane, dichloromethane, and diethyl ether.

Solubility was determined by using shake-flask method. Firstly, CBD suspensions were prepared (at room temperature), then shaken for 48 h on a shaker, filtered, and diluted. Then the CBD concentration was determined by the HPLC method. CBD is very poorly soluble in water in contrast to most other solvents we tested. Measured solubility was highest in acetone, methanol, and diethyl ether, followed by other laboratory solvents. CBD was also very soluble in the solvents that are often used for production of CBD products. Among them, solubility was highest in triacetin, PEG 400, and triethyl citrate.It was slightly worse in propylene glycol and even lower in vegetable oils. By adding water to propylene glycol, we discovered that even a small addition of water greatly reduces the solubility of CBD. Among vegetable oils, CBD was most soluble in MCT oil and least soluble in olive oil.

Keywords:CBD, cannabidiol, solubility, cannabinoid, shake-flask method

VI

SEZNAM OKRAJŠAV

AUC – površina pod krivuljo (ang. area under curve) BCS – biofarmacevtski klasifikacijski sistem

BLQ – pod mejo določljivosti (ang. below the limit of quantification) CBD – kanabidiol

CBDA – kanabidiolna kislina

Δ⁹-THC – delta-9-tetrahidrokanabinol GIT – gastrointestinalni trakt

HPLC – tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (ang. high performance liquid chromatography)

LCT – dolgoverižni triglicerid (ang. long-chain triglyceride)

MCT – triglicerid s srednjeverižnimi maščobnimi kislinami (ang. medium-chain triglyceride)

MF – mobilna faza pri kromatografiji RSD – relativna standardna deviacija SF – stacionarna faza pri kromatografiji

t95 – čas, v katerem razpade 5 % zdravilne učinkovine z. u. – zdravilna učinkovina

1

1 UVOD

1.1 Navadna konoplja (Cannabis sativa L.)

Je rastlina enoletnica, ki jo uvrščamo v družino konopljevk (Cannabaceae). Odrasla rastlina je visoka 0,2–6 metrov. Konoplja raste skoraj na vseh geografskih širinah in se dobro prilagaja okoljskim dejavnikom. Po najbolj uveljavljeni sistematiki konopljo razvrščamo v tri podvrste:

Industrijska konoplja (Cannabis sativa L., ssp. sativa), indijska konoplja (Cannabis sativa L., ssp. indica) in ruderalna konoplja (Cannabis sativa L., ssp. ruderalis). Ker je večina varietet dvodomnih, lahko razlikujemo ženske rastline, ki tvorijo semena in moške rastline, ki oprašujejo ženske rastline. Do oprašitve pride s pomočjo vetra. Moške rastline vsebujejo manjše količine kanabinoidov kot ženske. Ženska rastlina namreč na svojih cvetovih tvori več žleznih laskov (trihomov), ki vsebujejo sekundarne metabolite, kanabinoide in terpenske spojine.

Kanabinoidi so molekule, ki v telesih vretenčarjev delujejo na kanabinoidne receptorje. Glede na izvor ločimo fitokanabinoide, ki nastanejo v rastlini, sintezne kanabinoide, ki jih pripravimo sintezno in endogene kanabinoide, ki nastajajo v človeškem organizmu. V konoplji je prisotnih preko 100 različnih kanabinoidnih molekul, med katerimi sta najpomembnejša kanabidiol (CBD) in psihoaktivni delta-9-tetrahidrokanabinol (Δ⁹-THC). Slednji je v določenih varietetah prisoten v večjih količinah, zaradi česar je konoplja uvrščena med prepovedane droge.

Industrijska konoplja pa vsebuje navadno več CBD in zelo malo Δ⁹-THC, zato je gojenje nekaterih njenih sort v Sloveniji dovoljeno, v kolikor kmet pridobi dovoljenje za posevek pri Ministrstvu za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano. Pri tem je prisotna še zakonska omejitev, da mora biti vsebnost Δ⁹-THC manj kot 0,2 % mase posušene rastline, vzorčene na določeni velikosti posevka (1, 2, 3).

1.2 Kanabidiol

V industrijski konoplji je navadno prevladujoči kanabinoid kanabidiolna kislina (CBDA). CBD nastane šele po segrevanju CBDA, pri čemer se odcepi CO2. Proces se imenuje dekarboksilacija in po navadi poteka pri 100–150 °C. Pri sobni temperaturi je CBD prisoten v obliki bele do rumene kristalinične trdnine (2). CBD in Δ⁹-THC sta lipofilni zdravilni učinkovini (z. u.), ki delujeta na osrednji živčni sistem in mnoge druge farmakološke sisteme v telesu (5).

2

LogP CBD je 6,1 (4). Njegova topnost v vodi je nizka (0,01 mg/mL), kar predstavlja velik izziv pri izdelavi farmacevtskih oblik (4). Zaradi tega so oljne in alkoholne raztopine pogoste formulacije s to učinkovino. CBD je šibko kisel (pKa = 9,1), ionizira resorcinolni del molekule, ampak pri fizioloških pogojih (pH = 7,4) je 98 % CBD v neionizirani obliki. V preglednici I so predstavljeni fizikalni podatki o CBD (4).

Preglednica I: Nekateri fizikalni podatki o CBD

Temperatura tališča 67 °C

pKa 9,1

Molska masa 314 g/mol

CBD (slika 1) ni psihoaktiven in je tudi nizko toksičen v odmerkih, ki jih je mogoče zaužiti.

Pridobiti ga je mogoče z izolacijo iz rastlinskega materiala ali sintezno. Pri izolaciji iz rastlin rastlinski material navadno najprej ekstrahiramo, nato uporabimo postopke destilacij in preparativno kromatografsko ločbo. S tem lahko dobimo CBD s čistoto nad 98 % (2).

Slika 1. Skeletna formula CBD.

1.2.1 Endokanabinoidni sistem

Kanabinoidi v telesu delujejo na endokanabinoidni sistem, katerega del sta med drugim receptorja tipa CB1 in CB2, ki sta sklopljena z G-proteinom.

3

CB1 receptorji so večinoma izraženi na nevronih, medtem ko so CB2 receptorji najbolj prisotni na celicah imunskega sistema. Endogena agonista kanabinoidnih receptorjev sta anandamid in 2-arahidonoilglicerol. CBD je negativni alosterični modulator CB1 receptorjev in zniža anksioznost, inducirano z uporabo Δ⁹-THC (6, 7).

1.2.2 Potencialna uporaba CBD in obstoječa zdravila

• Epilepsija  V 80. letih prejšnjega stoletja so raziskovalci začeli izvajati študije o vplivu CBD na paciente z nekontrolirano epilepsijo. Pacienti so CBD dobro prenašali, brez znakov toksičnosti in neželenih učinkov. CBD je zmanjšal pogostost konvulzivnih epizod (8, 9).

• Anksioznost  CBD naj bi anksioznost zaviral z delovanjem na CB1 in 5HT1A receptorje.

Glede na dosedanje raziskave ima CBD velik potencial za zdravljenje anksioznih stanj, vseeno bo potrebno učinkovitost potrditi z nadaljnjimi študijami (10).

• Psihoza  Obstoječa zdravila za zdravljenje psihoznih motenj pogosto povzročajo neželene učinke in pri določenem deležu pacientov tudi niso učinkovita. Pacienti s psihozo imajo povišane vrednosti anandamida v krvi in likvorju. Pri tem je prisotna tudi povečana ekspresija CB1 receptorjev v perifernih imunskih celicah. CBD kot negativni alosterični modulator CB1 receptorjev predstavlja velik potencial pri zdravljenju teh stanj. Njegovo delovanje bo potrebno še ovrednotiti s kliničnimi študijami (11).

 CBD se je v nekaterih študijah izkazal kot učinkovit tudi pri spastičnosti, kronični bolečini, nekaterih vrstah raka in pri zasvojenosti s konopljo zaradi Δ⁹-THC (8).

Na trgu sta dve zdravili s CBD. Epidyolex je peroralna raztopina, uporablja se kot dodatna terapija pri redkih oblikah epilepsije (Lennox-Gastaut sindrom in Dravetov sindrom) za paciente, starejše od 2 let (9).

Sativex je oralno pršilo, ki vsebuje CBD in Δ⁹-THC v enakih razmerjih, ki sta prisotna v obliki dveh ekstraktov navadne konoplje. Ekstrakte proizvajalec izdeluje z uporabo ekstrakcije s superkritičnim CO2. Uporablja se za terapijo spastičnosti pri odraslih pacientih z multiplo sklerozo, ki se ne odzivajo na ostala zdravila (12).

4

1.3 Farmakokinetika CBD

CBD je najbolj biološko uporaben pri inhalaciji (v določenih raziskavah 31 %), v primeru peroralnega vnosa pa 6 % (13). Ob inhalaciji je bila maksimalna plazemska koncentracija CBD dosežena že v 3–10 min, medtem ko so bile pri peroralni aplikaciji v povprečju za to potrebne 3,0 h (13). Čas, v katerem je bila dosežena maksimalna koncentracija CBD v plazmi ob peroralni uporabi raztopine v sezamovem olju, je bil približno 4 h (14).

Nizka biološka uporabnost po peroralni aplikaciji je posledica slabe topnosti CBD v vodi in obsežnega predsistemskega metabolizma v jetrih. Če ga per os apliciramo v obliki praška, je biološka uporabnost nižja kot v primeru oljnih raztopin (14). Absorpcija je tudi boljša, če ga zaužijemo skupaj s hrano, ki vsebuje maščobe (13).

Hitrost absorpcije CBD in biološka uporabnost se razlikujeta tudi med peroralnimi oljnimi raztopinami. Do tega pride zaradi različnih načinov absorpcije med olji srednjeverižnih trigliceridov (MCT) in olji dolgoverižnih trigliceridov (LCT). Trigliceridi se v gastrointestinalnem traktu (GIT) z lipolizo razgradijo do prostih maščobnih kislin in monogliceridov. Kratko in srednjeverižne proste maščobne kisline se hitro absorbirajo v enterocit in po portalni veni preko jeter dosežejo sistemski krvni obtok. Medtem v jetrih pride do metabolizma prvega prehoda (14).

Dolgoverižne proste maščobne kisline se absorbirajo v enterocite in v njih tvorijo hilomikrone.

Slednji iz enterocitov preidejo v limfni sistem, po katerem se transportirajo do sistemskega krvnega obtoka. Tudi CBD se pridruži hilomikronom in z njimi potuje po telesu. Ta pot absorpcije zaobide portalno veno in s tem pride do izognitve začetnemu jetrnemu metabolizmu.

Zaradi tega je prisotna razlika med absorpcijskim profilom CBD v MCT olju in CBD v LCT oljih (14, 15).

CBD ima zelo velik volumen distribucije in se počasi eliminira iz telesa (16). Metabolizira se v jetrih z encimi CYP450 in UGT. Metabolizem 1. faze omogočata encimski izoformi CYP2C19 in CYP3A4. Od reakcij 2. faze največ poteka glukuronidacija, ki jo izvajajo encimske izoforme UGT1A7, UGT1A9 in UGT2B7 (9).

5

1.4 Topnost

Topnost je največja količina topljenca, ki z danim volumnom ali maso topila tvori nasičeno homogeno molekularno disperzijo. Odvisna je od kemičnih in strukturnih lastnosti topljenca in topila, ki določajo vzajemne interakcije. Nanjo vplivajo tudi temperatura, tlak, pH in prisotnost drugih snovi v topilu (17).

Definicije topnosti:

 Intrinzična topnost je ravnotežna topnost proste kisline ali baze pri pH, pri katerem se v celoti nahaja v neionizirani obliki.

 Ravnotežna topnost oz. termodinamska topnost je koncentracija topljenca v nasičeni raztopini, ko je prisotna presežna trdnina in sta raztopina in trdnina v ravnotežju.

 Kinetična topnost je koncentracija substance v času, ko se prvič pojavi oborina (18).

Eno prvih pravil topnosti je bilo: »Podobno se topi v podobnem«. Načelo je izpeljano iz dejstva, da so večinoma polarne spojine topne v polarnih topilih, medtem ko so nepolarne bolje topne v nepolarnih topilih. To pravilo ima sicer veliko izjem. Dielektrična konstanta je merilo polarnosti topil, večja kot je, bolj je topilo polarno (preglednica II) (19, 20).

Preglednica II: Vrednosti dielektričnih konstant nekaterih topil pri 25 °C (21)

Topilo Dielektrična konstanta (ε)

aceton 20,7

1-butanol 17,8

N,N-DMF 37,6

DMSO 46,2

etanol 24,6

izooktan 1,94

izopropanol 19,9

metanol 32,7

voda 77,46

6

1.4.1 Biofarmacevtski klasifikacijski sistem (BCS)

Topnost v vodi je ena od ključnih lastnosti pri razvoju zdravilne učinkovine. Predstavlja tudi eno od meril pri uvrščanju zdravilnih učinkovin glede na BCS. Drugo merilo pri tem je prehajanje bioloških membran (permeabilnost). BCS (preglednica III) omogoča določanje kritičnega koraka pri absorpciji z. u. iz črevesja.

Preglednica III: Razredi spojin glede na BCS (22)

Razred I

DOBRA TOPNOST

DOBRA PERMEABILNOST

Razred II

SLABA TOPNOST

DOBRA PERMEABILNOST Razred III

DOBRA TOPNOST

SLABA PERMEABILNOST

Razred IV

SLABA TOPNOST

SLABA PERMEABILNOST

Z. u. se smatra za dobro topno, če se največji odmerek učinkovine raztopi v 250 mL vode s pH

= 1,2–6,8 pri 37 ± 1 ºC. Poskus je potrebno izvesti pri vsaj 3 različnih pH znotraj intervala, obvezno pa pri pH = 1,2; 4,5 in 6,8.

Najnižjo izmerjeno topnost znotraj pH intervala 1,2–6,8 uporabimo za razvrščanje substance po BCS (22). CBD spada v BCS razred 2, je slabo topen v vodi, a dobro prehaja biološke membrane (23).

7

1.4.2 Stopnja topnosti

Evropska farmakopeja topnost določa z intervali, ki tvorijo stopnjo topnosti (preglednica IV).

Tako je npr. substanca zelo lahko topna, če se 1 g substance raztopi v manj kot 1 mL topila.

Preglednica IV: Stopnje topnosti kot so navedene v Evropski farmakopeji (24)

Stopnja topnosti Volumen topila, potreben za raztopitev 1,0 g vzorca

Zelo lahko topno < 1 mL

Lahko topno 1–10 mL

Topno 10–30 mL

Zmerno topno 30–100 mL

Težko topno 100–1000 mL

Zelo težko topno 1000–10000 mL

Praktično netopno > 10000 mL

1.4.3 Načini določanja topnosti

Obstaja več načinov določanja topnosti substanc. Najpogosteje se uporabljata termodinamska in kinetična metoda.

Termodinamska shake-flask metoda je zlati standard pri določanju topnosti. Temelji na vzpostavitvi ravnotežja med nasičeno raztopino in neraztopljenim trdnim topljencem. Poleg ostalih omenjenih dejavnikov je ta topnost odvisna tudi od časa za vzpostavitev ravnotežja, pogojev mešanja, polimorfizma, čistote substance in oblike ter velikosti trdnih delcev (25).

Postopek določanja je sledeč: topljenec damo v topilo in ga raztapljamo do vzpostavitve ravnotežnega stanja (slika 2). Sledi ločitev trdnega topljenca od nasičene raztopine. Nato analiziramo nasičeno raztopino in izračunamo topnost. Pri pripravi vzorca je pomembno, da topilu dodamo presežno količino topljenca. Ni pa nujno zatehtati maso topljenca, ker ravnotežna topnost načeloma ni odvisna od mase dodanega topljenca (26). Ravnotežje pri tej metodi je doseženo, ko je topnost v različnih časovnih točkah enaka. Z dobrim mešanjem je ravnotežje pogosto doseženo v 24 h. Kljub temu pri nekaterih substancah to traja tudi od 48 h do 2 tednov, še posebej pri z. u., ki so slabo topne (25).

8

Čas za vzpostavitev ravnotežja je možno skrajšati z intenzivnim mešanjem z uporabo vorteks naprave oz. ultrazvočne kadičke. Pri separaciji trdnega zaostanka od nasičene raztopine je možno uporabiti sedimentacijo, centrifugiranje in filtracijo.

Slabost filtracije je sorpcija na filter v primeru slabo topnih in hidrofobnih substanc. To je še posebej problematično pri filtraciji majhnih volumnov suspenzij. Nasičene raztopine primerno redčimo in analiziramo spektrofotometrično, s HPLC metodo ali z drugimi primernimi metodami za merjenje koncentracij. Shake-flask metoda je zanesljiva, a časovno potratna. Poleg tega za njeno izvedbo potrebujemo tudi relativno veliko količino substance (25). Omenjene pomanjkljivosti so raziskovalce spodbudile k razvoju hitrejših miniaturnih različic te metode.

Slika 2. Na sliki je prikazan princip določanja ravnotežne topnosti. Topilu je dodana presežna količina topljenca, ki se le deloma raztopi.

Miniaturizirana shake-flask metoda omogoča natančno določanje topnosti z uporabo minimalne količine učinkovine. Vsebuje vse korake navadne shake-flask metode, le da je izvedena v manjšem obsegu (po navadi z 2 mL topila). Metoda je preprosta in poceni, vendar je manj zanesljiva pri ionizirajočih topljencih. Ni primerna za rešetanje visokih zmogljivosti (High-Throughput Screening), ker z njo lahko določimo le topnost za približno 20 substanc na teden. Kljub temu je njena prednost visoka kakovost pridobljenih rezultatov (25).

9

Shake-flask metoda v majhnem merilu (ang. Small Scale Shake-Flask Method) omogoča določanje topnosti v majhnih volumnih topila (50–1000 µL). Uporaba majhnih volumnov topila pa ne vpliva na točnost rezultatov. Pri tem je možno določiti topnost z uporabo le nekaj mikrogramov topljenca. Metodo je možno avtomatizirati in omogoča rešetanje visokih zmogljivosti (ovrednotenje topnosti velikega števila na novo odkritih substanc) (25, 27).

Kinetično topnost navadno določamo v zgodnjih fazah razvoja z. u.. Omogoča testiranje velikega števila učinkovin. Razlog je enostavno in hitro določanje. Poleg tega potrebujemo nizko maso učinkovine (1 mg). Pogosto jo merimo tako, da pripravimo koncentrirano osnovno raztopino učinkovine v organskem topilu (navadno v DMSO). To raztopino nato v majhnih volumnih dodajamo določenemu volumnu vode, dokler prvič ne opazimo oborine. Takrat je dosežena kinetična topnost. V končni raztopini naj ne bi bilo več kot 1 % DMSO, ker poveča topnost topljenca v vodi. Zato mora biti osnovna raztopina topljenca v DMSO dovolj koncentrirana.

Kinetična topnost je višja od termodinamske topnosti za isti topljenec zaradi supersaturacije, ki je prisotna pred obarjanjem. Zaradi variabilnih pogojev določanja ni možno med seboj primerjati rezultatov kinetične topnosti. Vseeno pa so rezultati nedvomno uporabni pri ovrednotenju topnosti velikega števila substanc (28, 29, 30).

1.4.4 Računalniški modeli

Pri zelo slabo topnih učinkovinah je težko dobiti ponovljive rezultate topnosti. Poleg tega so eksperimentalne metode tudi časovno potratne. Določanje topnosti omejuje tudi kemijska nestabilnost preiskovanih spojin. Zaradi tega se za oceno topnosti v vodnih sistemih pogosto uporabljajo in silico metode. Obstaja mnogo modelov, ki omogočajo napoved topnosti, vendar se med seboj razlikujejo glede na nabor parametrov, ki jih zajemajo. Kot eno prvih meril za oceno topnosti se je uveljavila molska masa učinkovine. Kasneje so raziskovalci dodali še porazdelitveni koeficient oktanol-voda (polarnost), temperaturo tališča, sposobnost tvorbe vodikovih vezi, doprinos posameznih atomov in funkcionalnih skupin, itd. Metode se razlikujejo po kompleksnosti in številu upoštevanih kriterijev. Pri tem večja kompleksnost ne pomeni nujno večje točnosti ocene. Te metode še niso povsem zanesljive in jih je potrebno izboljšati (31, 32).

10

1.5 Hitrost raztapljanja

Hitrost raztapljanja je hitrost prehoda posameznih molekul substance iz trdnih delcev v raztopino (slika 3). Odvisna je od enakih parametrov kot topnost (temperatura, tlak, lastnosti topljenca in topila), poleg tega pa še od površine topljenca, izpostavljenega topilu, omočenja, viskoznosti topila in mehanskih vplivov (npr. mešanje). Hitrost raztapljanja je višja pri povečani površini topljenca, izpostavljenega topilu. Poveča se tudi ob dvigu temperature, saj s tem upade viskoznost topil. Opisuje jo Noyes-Whitneyeva enačba (Enačba 1), pri tem je dC/dt hitrost raztapljanja, D difuzijski koeficient substance, S površina izpostavljenega dela topljenca, V volumen raztopine, h debelina difuznega sloja. C je koncentracija raztopljene substance ob danem času, Cs je absolutna topnost substance (33, 34).

𝑑𝐶

𝑑𝑡

=

ℎ×𝑉

× (𝐶𝑠 − C)

Slika 3. Skica raztapljanja trdnega delca. Pri raztapljanju je prisoten difuzni sloj, v katerem je prisoten koncentracijski gradient topljenca od nasičene topnosti do koncentracije raztopine izven difuznega sloja.

11

1.6 Stabilnost CBD

V raziskavi (Kosović et al., 2021) se je 99,9% CBD v prahu izkazal za stabilnega 270 dni pri temperaturi 25 °C in relativni vlagi 60 %. CBD raztopljen v sončničnem olju je izkazal stabilnost vsaj 180 dni (T = 25 °C, RH = 60 %). V 1 letu je koncentracija CBD v raztopini v sončničnem olju upadla za 42 % (pri T = 25 °C, RH = 60 %). Poskusi so bili izvedeni v temnih komorah (35).

Fraguas-Sánchez in sodelavci so izvedli stabilnostne analize in dobili naslednje rezultate:

Etanolna raztopina CBD je bila na sobni temperaturi stabilna 117 dni (t95 = 117 dni). Pri shranjevanju na 5 °C je bila enaka raztopina stabilna vsaj 1 leto. CBD etanolna raztopina je bila zelo občutljiva na oksidacijske pogoje (prisotnost H2O2), t95 = 1,8 dni. Občutljiva je bila tudi na svetlobo, za katero se zdi, da je pospešila potek oksidacijske reakcije. CBD je bil bolj stabilen v etanolu kot v vodnem mediju, v katerem se je 10 % CBD razgradilo v 24 h (pri T = 37 °C in pH = 7,4) (36).

Stabilnost je velik izziv pri peroralnih kapljicah s CBD, v katerih je CBD raztopljen v različnih oljih. Glede na raziskavo, ki so jo izvedli Pavlovic in sod., je kar 9 od 14 izdelkov, ki so jih kupili preko interneta v EU, vsebovalo manj CBD od 90 % deklarirane vsebnosti. Poleg tega so pri nekaterih izdelkih proizvajalci vsebnost CBD navajali kot vsoto CBD in CBDA, kar ni smiselno, ker CBDA ob peroralni uporabi nima farmakološkega učinka. Tako so nekatere peroralne kapljice vsebovale večjo količino CBDA kot CBD (37).

CBD, ki je raztopljen v MCT olju, je precej manj občutljiv za oksidacijo kot CBD, ki je raztopljen v olivnem olju ali olju konopljinih semen. To je morda povezano s tem, da olivno in konopljino olje vsebujeta nenasičene maščobne kisline, ki so bolj dovzetne za oksidacijo kot nasičene maščobne kisline MCT olja (38).

Julija Hrastnik je v svoji magistrski nalogi pripravila in primerjala različne ekstrakte konoplje in dognala, da je CBD stabilnejši v obliki heksanskega kot etanolnega ekstrakta. CBD je bil pri vseh razmerah shranjevanja veliko bolj stabilen kot Δ⁹-THC. CBD je bil v obliki etanolnega in heksanskega ekstrakta stabilen pri 40 °C vsaj 4 mesece (39).

12

Peter Sebanc je v svojem magistrskem delu preučeval stabilnost CBD in z rezultati potrdil, da je CBD vsaj 99 dni stabilen v obliki raztopine v olju konopljinih semen, kakavovem maslu, MCT olju in kokosovem olju (1).

1.7 Olja, ki so vehikli za CBD kapljice

MCT olje (Medium-chain triglycerides oil) je sestavljeno iz trigliceridov, ki vsebujejo maščobne kisline s 6–12 ogljikovimi atomi. Kokosovo olje vsebuje približno 60–70 % MCT.

Dober vir MCT je tudi palmovo olje. Pogosto se MCT olje uporablja pri bolnikih s podhranjenostjo ali malabsorpcijskimi sindromi, ker za absorpcijo ni potrebne dodatne energije.

Nekatere študije kažejo tudi na to, da MCT olje znižuje telesno maso in količino uskladiščene maščobe pri debelosti (40). MCT olje se hitreje absorbira in izkoristi od olj dolgoverižnih maščobnih kislin. Večinoma se MCT olje oksidira v jetrih, kjer predstavlja vir energije.

Zato je delovanje MCT olja bolj podobno glukozi kot maščobam. Užitna MCT olja po navadi pridobivamo z lipidno frakcionacijo, taka olja vsebujejo večinoma trigliceride oktanojske in dekanojske kisline v razmerju od 1 : 1 do 4 : 1 (41).

Olje konopljinih semen se pridobiva s stiskanjem ali ekstrakcijo iz semen navadne konoplje.

Vsebuje 55 % linolne kisline, ki spada med omega-6 maščobne kisline. Nadalje vsebuje 20 % α-linolenske kisline, ki spada med omega-3 maščobne kisline. Na tretjem mestu po vsebnosti je γ-linolenska kislina, katere delež je 1–4 %. Skoraj nobeno drugo naravno živilo ne vsebuje toliko esencialnih maščobnih kislin. Ker vsebuje trigliceride s polinenasičenimi maščobnimi kislinami, je olje konopljinih semen precej nestabilno, zato ga je treba shranjevati pri čim nižji temperaturi in zaščititi pred svetlobo. Večina pridelovalcev tega olja je manjših podjetij, ker je olje slabo stabilno in zato manj zanimivo za večja podjetja (42).

Olivno olje se pridobiva s stiskanjem oliv. Obstaja preko 260 sort oljk, kar je razlog, da se lahko posamezna olivna olja v sestavi precej razlikujejo. V olivnem olju lahko razlikujemo med oljno in ne-oljno frakcijo. Oljna predstavlja 98–99 % delež in je sestavljena iz trigliceridov, ki vsebujejo 55–85 % mononenasičenih maščobnih kislin. Glavna izmed njih je oleinska kislina.

13

Ne-oljna frakcija olivnega olja predstavlja le 1–1,5 % celotnega olja, vsebuje terpene (npr.

skvalen), karotene, pigmente (npr. klorofil), tokoferole (npr. vitamin E) in sterole. Slednji znižujejo krvni holesterol z zaviranjem absorpcije holesterola v tankem črevesu.

Značilni vonj in okus olju dajejo nekateri alkoholi, ketoni, estri, etri in furani. Olivno olje je bistven del mediteranske prehrane, ki je povezana z nižjim tveganjem za srčno-žilne zaplete (43).

Čijevo olje je olje pridobljeno iz semen oljne kadulje (Salvia hispanica). Izhaja iz Mehike in Gvatemale. Vsebuje 54–67 % α-linolenske kisline in 12–21 % linolne kisline. Zaradi velike vsebnosti polinenasičenih maščobnih kislin je tudi to olje podvrženo lipidni peroksidaciji in slabo stabilno (44). Olje konopljinih semen, olivno olje in čijevo olje spadajo med LCT olja.

1.8 Najnovejši pristopi k izdelavi formulacij s CBD

Topnost CBD v vodi je 0,01 mg/mL, kljub temu se z uporabo γ-ciklodekstrinov lahko poveča do 5,3 mg/mL (4, 45). Izgelov in sodelavci so pripravili tudi samo-mikroemulgirajoči dostavni sistem s CBD, ki omogoča predvidljivejši farmakokinetični profil ob peroralni aplikaciji.

Pri tem so formulacijo pripravili tako, da so sezamovemu olju dodali emulgatorje in sotopilo (etanol) ter to vgradili v mehke želatinske kapsule. Pri raztapljanju v vodnem okolju formulacija spontano tvori O/V emulzijo. S tem se poveča topnost CBD v vodnem okolju v GIT in olajša njegova absorpcija v enterocite (14).

1.9 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC)

Tekočinska kromatografija je separacijska tehnika, pri kateri se komponente, ki jih ločujemo, porazdeljujejo med mobilno in stacionarno fazo (SF). Mobilna faza (MF) je tekoča in se premika v določeni smeri. Komponente vzorca se skupaj z MF premikajo mimo SF. Analiti po navadi tvorijo različne interakcije s SF in MF. Ker je SF fiksirana, se analiti, ki z njo tvorijo interakcije, premikajo počasneje. Analiti, ki s SF ne tvorijo interakcij, se premikajo najhitreje.

Interakcije analita s fazama določajo čas, ki je potreben, da prepotuje kromatografsko kolono.

Po prehodu kolone naprava analit zazna s pomočjo detektorja. Rezultati so predstavljeni v obliki kromatogramov.

14

Čas, ki ga analit potrebuje, da prepotuje kolono od injektorja do detektorja, se imenuje retencijski čas. Čas potovanja mobilne faze od injektorja do detektorja se imenuje mrtvi čas (46).

HPLC je napredna oblika tekočinske kromatografije, ki se uporablja za ločevanje spojin znotraj kompleksnih kemijskih in bioloških vzorcev. Z njo lahko določeno komponento zmesi separiramo, identificiramo in kvantificiramo (47).

1.9.1 Reverznofazna HPLC (RP-HPLC)

Pri reverznofazni kromatografiji je MF bolj polarna od SF, kar je ravno obratno kot pri normalnofazni kromatografiji. Med elucijo se najhitreje eluirajo najbolj polarne spojine.

Mobilna faza je po navadi mešanica metanola ali acetonitrila z vodo. Metoda omogoča analizo polarnih, srednjepolarnih in nekaterih nepolarnih analitov. Je najpopularnejša oblika tekočinske kromatografije zaradi njene široke uporabnosti (48).

15

2 NAMEN DELA

CBD je med ljudmi vedno bolj priljubljen zaradi različnih dokazanih, potencialnih in domnevnih pozitivnih učinkov na zdravje. V literaturi je malo podatkov o njegovi topnosti v različnih topilih. Redki podatki, ki so dostopni, se med seboj precej razlikujejo. Več podatkov najdemo v varnostnih listih brez navedenih referenc, zelo malo pa v znanstveni literaturi. Dobro poznavanje topnosti CBD v nosilnih topilih za izdelavo formulacij bi koristilo proizvajalcem pri načrtovanju formulacij produktov. Topnost je pomemben faktor tudi pri ekstrakciji CBD iz rastlinskega materiala. Namen našega dela je določiti topnost CBD v topilih, ki so pomembna za rokovanje s CBD.

16

3 MATERIALI IN METODE

3.1 Materiali

3.1.1 Standard CBD

Kot standard CBD smo uporabili (-)-kanabidiol v prahu od proizvajalca Dr. Ehrenstorfer. Ta prašek smo uporabili kot standard za izdelavo umeritvene premice in tudi za določanje topnosti v različnih topilih. Na embalaži je bilo navedeno, da je vsebnost CBD 98,62 % mase standarda.

Da ne bi prišlo do razpada, smo ga hranili pri temperaturi 4–8 °C. Država porekla: Nemčija, CAS: 13956-29-1.

3.1.2 Reagenti in topila

Topila, v katerih smo določali topnost CBD

 96% etanol farmakopejske kakovosti (CARLO ERBA REAGENTS, Francija, CAS: 64- 17-5). Vsebuje 92,6–95,2 % (w/w) etanola in 7,4–4,8 % vode (w/w).

 metanol (CARLO ERBA REAGENTS, Francija, CAS: 67-56-1),

 DMSO (Sigma Aldrich, Francija, CAS: 67-68-5),

 aceton (CARLO ERBA REAGENTS, Francija, CAS: 67-64-1),

 izopropanol (CARLO ERBA REAGENTS, Francija, CAS: 67-63-0),

 1-butanol (EMSURE® (Merck), Nemčija, CAS: 71-36-3),

 izooktan (CARLO ERBA Reagents, Francija, CAS: 540-84-1),

 dietileter (CARLO ERBA Reagents, Francija, CAS: 60-29-7),

 N,N-dimetilformamid (Sigma, Nemčija, CAS: 68-12-2),

 cikloheksan (CARLO ERBA Reagents, Francija, CAS: 110-82-7),

 diklorometan (J. T. Baker, Francija, CAS: 75-09-2),

 rastlinski glicerol (Tovarna Organika, Slovenija, CAS: 56-81-5),

 trietil citrat (Alexmo cosmetics, Nemčija, CAS: 77-93-0),

 propilenglikol (Natural Loti, Slovenija, CAS: 57-55-6),

 triacetin (Sigma Aldrich, ZDA, CAS: 102-76-1),

 olivno olje (Lekarna Ljubljana, Slovenija, CAS: 8001-25-0),

 čijevo olje (Tovarna Organika, Slovenija, CAS: 93384-40-8),

17

 MCT olje (Aliacura, Nemčija, CAS: 73398-61-5),

 olje konopljinih semen (KEFO, Slovenija, CAS: 89958-21-4),

 deionizirana voda s pipe.

Topila in reagenti za HPLC

 prečiščena voda za HPLC (J. T. Baker, Poljska, CAS: 7732-18-5),

 acetonitril za HPLC (J. T. Baker, ZDA, CAS: 75-05-8),

 trifluoroocetna kislina (Fisher Scientific U. K., Združeno kraljestvo, CAS: 76-05-1).

3.1.3 Aparature

 Analitska tehtnica (Mettler Toledo, XS205, Greinfensee, Švica),

 avtomatski pipetor (Dispensette S, Brand, Nemčija),

 vorteks mešalnik (Vibromix 10, Domel, Slovenija),

 stresalnik (Tehtnica Vibromix, Domel, Slovenija).

3.1.4 HPLC analiza (slika 4)

 Razplinjevalec: DGU-20As (Shimadu, Kyoto, Japonska),

 črpalka: LC-20AD XR (Shimadu, Kyoto, Japonska),

 avtomatski vzorčevalnik: SIL-20AC XR (Shimadu, Kyoto, Japonska),

 prostor za kolono: CTO-20AC (Shimadu, Kyoto, Japonska),

 detektor: SPD-M20A (Shimadu, Kyoto, Japonska),

 kromatografska kolona: Phenomenex Kinetex C18 (Medical Products UK Ltd, Aldershot, Hants, Združeno Kraljestvo).

18 Slika 4. HPLC naprava, ki smo jo uporabili pri našem delu.

3.1.5 Računalniški programi

 Lab Solutions (Shimadzu, Kyoto, Japonska),

 Excel (Microsoft Corporation).

3.1.6 Ostala laboratorijska oprema

 Čaše (10 mL, 25 mL, 50 mL, 100 mL),

 injekcijske brizge,

 injekcijske igle,

 filter HPLC (0,20 μm; Frisenette, Danska),

 temne viale za HPLC analizo s pokrovčki,

 centrifugirke,

 pribor za tehtanje,

 stojalo za epruvete,

 3 mL plastične pipete (Pasteur pipeta),

 steklene pipete,

 žogica za pipetiranje.

19

3.2 Metode dela in priprava vzorcev

3.2.1 Izbira topil za analizo

Topnost CBD je pomemben parameter pri pridobivanju CBD iz rastlinskega materiala in pri pripravi formulacij, ki vsebujejo to učinkovino. Na spletu smo poiskali podatke o tem, katera topila so najpomembnejša za različne procese ravnanja s kanabidiolom.

 Ekstrakcijska topila

Proizvajalci CBD največkrat ekstrahirajo iz rastlinskega materiala s superkritičnim CO2, z etanolom, metanolom, heksanom, etilacetatom in mešanicami teh topil z drugimi topili (npr.

10% kloroform v metanolu) (49). Ker smo imeli v laboratoriju na voljo tudi nekatera topila, ki se pri ekstrakcijah redkeje uporabljajo, smo določili topnost CBD tudi v njih.

 Topila za izdelavo farmacevtskih oblik

Na trgu se CBD pojavlja v različnih farmacevtskih oblikah (dermatološke kreme, kapljice, pršila, bonboni in podobno). Za vgradnjo v formulacije je pomembna topnost CBD v vehiklu, ki je fiziološko sprejemljiv. Da bi določili topnost CBD v vehiklih, ki se najpogosteje uporabljajo, smo raziskali ponudbo CBD kapljic in pršil na internetnih straneh. Ločeno smo iskali zadetke v slovenščini z iskalnima nizoma: »CBD kapljice« in »CBD pršilo«. Nato smo na spletu iskali še v angleščini z iskalnima nizoma »CBD drops« in »CBD spray«.

Pregledali smo spletne strani, ki smo jih dobili z iskalnimi nizi in si izpisali ime podjetja, farmacevtsko obliko, vrsto vehikla, volumen izdelka, vsebnost CBD (w/V %), ceno izdelka in spletno stran. Pri posameznem proizvajalcu smo izpisali le 1 izdelek, če je oglaševal več različnih izdelkov z enakim nosilnim topilom. Pregled trga smo izvedli 28. 6. 2021, s tem smo ugotovili, katera topila se najpogosteje uporabljajo v kapljicah in pršilih s CBD. Rezultate raziskave trga smo objavili v poglavju 4 Rezultati, razpredelnici z izpisanimi podatki pa smo dali med priloge.

20

3.2.2 Priprava HPLC mobilne faze

Mobilna faza A: Z merilnim valjem smo v posodo nalili 5 L dodatno prečiščene vode, nato 102 mL acetonitrila in nato smo s pomočjo steklene pipete dodali še 5 mL TFA. Nastalo zmes smo mešali 5 min.

Mobilna faza B: Z merilnim valjem smo v posodo nalili 5 L acetonitrila, nato 102 mL dodatno prečiščene vode in nato smo s pomočjo steklene pipete dodali še 5 mL TFA. Nastalo zmes smo mešali 5 min.

3.2.3 Modifikacija HPLC metode

Kot metodo za določanje koncentracije CBD smo uporabili HPLC metodo, opisano v diplomski nalogi Matevža Štefančiča z naslovom: Validacija HPLC metode za selektivno določanje kanabinoidov. Slednja omogoča selektivno določanje več različnih kanabinoidov. Pri valovni dolžini 220 nm lahko z metodo določamo kanabidivarinsko kislino, kanabidivarin, CBDA, CBD, kanabigerolno kislino in Δ⁹-THC. Pri valovni dolžini 280 nm pa lahko z metodo določamo kanabigerol, kanabinol, tetrahidrokanabinolno kislino inkanabikromen. Izvedba ene analize po metodi je trajala 60 min, retencijski čas CBD pri tem je bil 18,3 min. Ker smo pri naši nalogi v raztopinah določali le CBD in v naših vzorcih nismo zaznali vrhov, ki bi motili kvantifikacijo CBD, smo se odločili metodo skrajšati. Da smo to dosegli, smo spremenili gradient in čas trajanja posamezne analize skrajšali na 12 min (50).

3.2.4 Izdelava umeritvene krivulje CBD

Ker smo modificirali HPLC metodo za določanje CBD, smo še enkrat izdelali umeritveno krivuljo. To smo naredili tako, da smo standard CBD zatehtali na analitski tehtnici in ga redčili s 96% etanolom. S tem smo pripravili osnovno raztopino s koncentracijo 1 mg/mL oz. 1,2 mg CBD/g raztopine.

21

Osnovno raztopino smo nato redčili tako, da smo pridobili 10 standardnih raztopin CBD z naslednjimi koncentracijami:

 0,005 mg/mL oz. 0,0058 mg CBD/g raztopine,

 0,01 mg/mL oz. 0,012 mg CBD/g raztopine,

 0,02 mg/mL oz. 0,024 mg CBD/g raztopine,

 0,048 mg/mL oz. 0,057 mg CBD/g raztopine,

 0,066 mg/mL oz. 0,079 mg CBD/g raztopine,

 0,092 mg/mL oz. 0,11 mg CBD/g raztopine,

 0,13 mg/mL oz. 0,16 mg CBD/g raztopine,

 0,17 mg/mL oz. 0,20mg CBD/g raztopine,

 0,20 mg/mL oz. 0,25 mg CBD/g raztopine,

 0,23 mg/mL oz. 0,28 mg CBD/g raztopine.

Za izdelavo umeritvene krivulje v enotah mg/mL smo alikvote osnovne raztopine in dodane volumne etanola merili z avtomatskimi pipetami. Hkrati smo ob pipetiranju alikvote tudi tehtali na analitski tehtnici in tehtali maso dodanega 96% etanola. To nam je omogočilo, da smo določili umeritveno premico v enotah mg CBD/g raztopine. Pripravljene standardne raztopine smo prefiltrirali v temne viale in jih analizirali s HPLC napravo.

3.2.5 Priprava vzorcev

V strokovni literaturi in v varnostnih listih smo poiskali obstoječe literaturne podatke o topnosti CBD v različnih topilih. Izpisani podatki so predstavljeni v poglavju 4 Rezultati.

Pri vsakem topilu smo začeli topnost določati tako, da smo najprej zatehtali določeno količino CBD v centrifugirko. Nato smo tehtnico tarirali in tehtali topilo, ki smo ga počasi dodajali, dokler ni izginil še zadnji kristal.

S tem smo določili približno koncentracijo nasičene raztopine. Nato smo pri naslednjih poskusih dodali 15–30 % večjo maso CBD in enako količino topila.

S tem smo pripravili suspenzije CBD v poljubnem topilu (slika 5). Suspenzije smo nato 10 min mešali na vorteks napravi, da se je raztopila večina CBD. Nadalje smo centrifugirke na stojalu dali na stresalnik, ki jih je stresal 48 h.

22

Slika 5. Centrifugirke s suspenzijami CBD v olju konopljinih semen, MCT olju in čijevem olju tik pred stresanjem na stresalniku.

Filtracija vzorca in priprava za analizo

Po 48 h stresanja smo stojalo vzeli s stresalnika in preverili, da so bili v vsaki od centrifugirk res prisotni kristali. Vzorce smo pustili stati 10 min. Sledila je filtracija suspenzije. Izvedli smo jo tako, da smo z injekcijsko brizgo posrkali vzorčno suspenzijo in nato na brizgo namestili filter. Suspenzijo smo prefiltrirali (slika 6) v 2 mL mikrocentrifugirko, ki smo jo takoj po filtraciji neprodušno zaprli, da ne bi topilo odparevalo v okolico.

Slika 6. Na sliki je postopek filtracije suspenzije, s katerim pridobimo nasičeno raztopino.

23

Nasičeno raztopino smo nato redčili, da smo dobili koncentracijo CBD, ki je v linearnem območju glede na HPLC metodo. Pri redčenju smo alikvote raztopine in dodani 96% etanol za dosego večje natančnosti tehtali. Redčeno raztopino smo prefiltrirali v temno HPLC vialo in izvedli HPLC analizo. Za večino topil smo izvedli vsaj po 2 analizi z različnima količinama dodanega presežnega CBD v suspenziji.

Ob izvedbi eksperimentov smo si zapisovali temperaturo zraka v laboratoriju. Tej temperaturi so bile 48 h izpostavljene tudi vzorčne suspenzije, zato je bila temperatura zraka približno enaka temperaturi suspenzije. Temperature zraka v laboratoriju ob analizi topnosti v posameznih topilih so navedene v poglavju 4 Rezultati. Pri vseh analizah je bila temperatura zraka v laboratoriju 25–27 °C.

Pri topilih, v katerih smo topnost CBD določili v 3 poskusih, smo izračunali tudi relativno standardno deviacijo (RSD) topnosti. Za izračun RSD smo uporabili enačbo 2 (50). Pri tem je 𝑥i = posamezna meritev topnosti,

𝑥̅ = povprečna vrednost topnosti, N = število meritev.

𝑅𝑆𝐷 (%) =

𝑥̅

√

N − 1

24

3.2.6 Parametri HPLC analize

Preglednica V: Parametri analize s HPLC

Mobilna faza A Voda + 2 % acetonitrila + 0,1 % trifluoroocetne kisline (V/V %) Mobilna faza B Acetonitril + 2 % vode + 0,1 % trifluoroocetne kisline (V/V %) Čas analize 12 min

Gradient mobilne faze B

0–0,2 min 62 %

0,2–0,21 min 62 %  44 %

0,21–6 min 44 %  100 %

6–10 min 100 %

10–10,10 min 100 %  62 %

10,10–12 min 62 %

Pretok 2 mL/min

Temperatura kolone

40 °C

Kolona l = 100 mm, ø = 4,6 mm, velikost delcev = 2,7 μm Volumen

injiciranja

5 μL

Valovna dolžina detekcije

220 nm

25

4 REZULTATI IN RAZPRAVA

4.1 Pregled pogostosti uporabe različnih nosilnih topil v CBD kapljicah in pršilih

Z iskalnima nizoma »CBD kapljice« in »CBD pršilo« smo na spletu (brskalnik Google) našli 49 izdelkov. Najpogosteje so izdelki vsebovali olje konopljinih semen (61,2 %), pogosto uporabljena sta bila še MCT olje (14,3 %) in olivno olje (8,2 %). Rezultati pregleda spleta so prikazani na sliki 7.

Slika 7. Delež posameznih vehiklov na slovenskem trgu glede na 49 obravnavanih izdelkov.

Ko smo iskali v angleščini s ključnimi besedami »CBD drops« in »CBD spray«, smo na spletu (brskalnik Google) dobili 141 zadetkov. Največkrat uporabljena nosilna topila v teh izdelkih so bila MCT olje (62,4 %), olje konopljinih semen (14,9 %), olivno olje (3,5 %) in olje semen grozdja (2,1 %).Rezultati pregleda spleta v angleškem jeziku so prikazani na sliki 8.

26

Slika 8. Delež posameznih vehiklov na tujem trgu, glede na 141 obravnavanih izdelkov.

Prisotna je precejšnja razlika med izdelki, ki so na trgu v Sloveniji in tistimi, ki so na trgu v tujini. V Sloveniji večina proizvajalcev kot nosilno topilo uporablja olje iz konopljinih semen, medtem ko večina proizvajalcev, ki izdelke prodaja na tujih trgih, uporablja MCT olje. Eden izmed razlogov za to bi lahko bila razlika v oglaševanju. V Sloveniji proizvajalci izdelke iz industrijske konoplje pogosto oglašujejo kot »povsem naravne«, MCT olje pa je predelano s kemijskimi postopki (frakcionacija in deodorizacija) in zato ni v skladu s to navedbo (41).

Veliko se pri oglaševanju izpostavlja tudi teorija, ki pravi, da olje konopljinih semen ojača delovanje CBD. Poleg tega so slovenska podjetja, ki se ukvarjajo z izdelavo kapljic in pršil s CBD, pogosto majhne kmetije, ki razpolagajo z lastno proizvodnjo olja konopljinih semen.

Slabosti olja konopljinih semen sta specifičen vonj in okus, kar je lahko pomemben faktor pri odločanju za nakup. MCT olje je brez vonja in okusa, kar ob dodatku arom omogoča izdelavo kapljic in pršil z raznovrstnimi vonji in okusi.

MCT olje se pridobiva iz kokosovega ali palmovega olja (41). Pridelava palmovega olja ima negativen vpliv na okolje, saj povzroča izsekavanja obsežnih območij tropskih gozdov jugovzhodne Azije. To nadalje povzroča izgubo biotske raznovrstnosti, na plantažah oljne palme so tudi pogostejši požari (62). Zato bi se okoljsko ozaveščen kupec raje odločil za nakup CBD kapljic z oljem konopljinih semen.

27

Olje konopljinih semen vsebuje mnogo nenasičenih esencialnih maščobnih kislin, ki blagodejno delujejo na zdravje, a tudi zmanjšajo stabilnost olja, ki je zato uporabno krajši čas (42).

Tako v Sloveniji kot v tujini je na tretjem mestu olivno olje, čeprav je v Sloveniji pogosteje uporabljeno kot v tujini.

Celotno smo obravnavali 190 izdelkov (slika 9), med njimi je bilo največkrat kot nosilno topilo uporabljeno MCT olje (50,0 %), sledita olje konopljinih semen (26,8 %) in olivno olje (4,7 %).

Zato smo se odločili topnostCBD določiti v vseh treh omenjenih oljih.

Slika 9. Delež posameznih nosilnih topil na slovenskem in tujem trgu skupaj.

28 Zmesi olj

Zmesi olj je bilo med 190 pregledanimi izdelki 18 in so predstavljale 9,5 % vseh vehiklov na trgu. V večini je šlo za zmesi dveh olj, redkeje tudi treh. V preglednici VI je predstavljeno, kolikokrat se je posamezno olje pojavilo v zmeseh olj.

Preglednica VI: Zmesi olj

Olje Število zmesi olj, v katerih je olje prisotno

Delež zmesi olj, v katerih je olje prisotno (%)

Olje konopljinih semen 13 72,2

MCT olje 12 66,7

Ostala olja 7 38,9

Olje iz semen grozdja 5 27,8

Kokosovo olje 3 16,7

Najpogostejša zmes, ki je bila prisotna na trgu, je zmes MCT olja z oljem iz konopljinih semen.

Med izdelki je bila prisotna 8 ×, kar predstavlja 44,4 % vseh zmesi olj in 4,2 % vseh pregledanih izdelkov. Vse ostale zmesi olj so bile prisotne le v 1 ali 2 izdelkih.

Delež zmesi olj je večji na tujem trgu kot na slovenskem. Razlog za to je lahko dejstvo, da je v Sloveniji večji delež manjših proizvajalcev s preprostejšimi formulacijami in lastno proizvodnjo enega tipa olja.

Vodne formulacije

CBD je v vodi zelo slabo topen. Kjer je v vehiklih prisotna voda, gre večinoma za nano- formulacije oz. formulacije z liposomi. Na trgu so 3 taki izdelki. Vsak izmed njih ima zapleteno sestavo, ki je proizvajalci niso v celoti razkrili. Kljub temu imajo ti izdelki nizke vsebnosti CBD (1–3 % (w/V)).

Izdelki z etanolom

Na trgu smo našli 2 izdelka, ki vsebujeta etanol. Pri tem je etanol v prvem izdelku samostojno nosilno topilo, v drugem pa je v zmesi z glicerolom (60 % V/V). Etanol zelo dobro raztaplja CBD in ima tudi vlogo konzervansa. Kljub temu se pri razvoju novih izdelkov njegovi uporabi izogibamo zaradi toksičnosti in vpliva na kognitivne in gibalne funkcije. Odsvetuje se ga tudi pri nosečnosti, določenih bolezenskih stanjih in uporabi določenih zdravil (51).

29

4.2 Umeritvena krivulja

Umeritveni premici smo naredili pri T = 25 °C. HPLC programska oprema je po končani analizi po programu, ki smo ga napisali, integrirala kromatografske vrhove in rezultate predstavila v obliki številčne vrednosti območja pod krivuljo (AUC). Za izračun umeritvenih krivulj smo uporabili kromatograme standardnih raztopin. Najprej smo umeritveno premico izračunali v enotah mg/mL raztopine (slika 10). Dobili smo dobro ujemanje, saj je bil R² = 0,9998, kar je blizu 1. Linearno območje je bilo prisotno pri koncentracijah 0,005–0,230 mg/mL.

Slika 10. Umeritvena premica CBD v enotah mg/mL raztopine.

Pri določanju topnosti v našem primeru je bila bolj uporabna umeritvena krivulja v enotah mg CBD/g raztopine, ker so bile filtrirane nasičene raztopine večinoma zelo viskozne in ni bilo možno natančno volumsko pipetiranje ob redčenju. Pri tem je bilo linearno območje prisotno v intervalu 0,0058–0,280 mg CBD/g raztopine (slika 11). Pri določanju koncentracije s HPLC smo vse filtrirane nasičene raztopine redčili toliko, da so bile znotraj linearnega območja in redčitve upoštevali pri izračunu rezultatov.

30 Slika 11. Umeritvena premica v enotah mg/g raztopine.

AUC = 7100952 × c + 12117; R² = 0,9998 Umeritvena premica je ustrezna, saj je R² > 0,98.

4.3 Topnost CBD v analiziranih topilih

Slika 12. Kromatogram vzorčne raztopine CBD pri 220 nm. Vrh CBD je pri 4,15 min.

Datafile Name:8 standard 0,1 SANDI .lcd Sample Name:8 standard 0,1 SANDI

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 m in

-50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550m AU

220nm ,4nm 220nm ,4nm

31

4.3.1 Rastlinska olja

V preglednici VII so izmerjeni podatki o topnosti CBD v nekaterih rastlinskih oljih pri 25 °C.

Pri vseh oljih smo topnost določili v treh poskusih, izračunali povprečno topnost in relativno standardno deviacijo (RSD). Iz topnosti v obliki masnega deleža CBD v nasičeni raztopini smo izračunali še topnost v enotah mg CBD/g topila.

Preglednica VII: Topnosti CBD v rastlinskih oljih

Olje Gostota samega olja pri 25 °C

(mg/mL)

Topnost kot masni delež CBD v nasičeni

raztopini (w/w (%))

Povprečje topnosti v obliki

masnega deleža (w/w (%))

RSD (%)

Topnost v mg CBD/g

topila Olje

konopljinih semen

0,9225 (vir: 54) 31,75 30,25 7,2 433,69

31,26 27,75

MCT olje 0,9450

(vir: navedba proizvajalca)

42,88 41,89 2,1 720,96

41,25 41,55

Čijevo olje 0,9241 (vir: 53) 31,93 30,75 3,4 444,11

30,37 29,96

Olivno olje 0,9151 (vir: 52) 32,53 29,33 9,5 414,97

27,93 27,52

Glede na CBD kapljice in CBD pršila je bolj uporaben podatek topnosti v mg/mL topila, zato smo se odločili topnost pretvoriti v te enote (slika 13). Za izračun smo uporabili literaturne podatke o gostoti olj, ki smo jih navedli v preglednici VII.

32 Slika 13. Topnost CBD v rastlinskih oljih pri 25 °C.

Kot najboljše topilo z vidika topnosti CBD se je med olji izkazalo MCT olje. To je bilo pričakovano, saj smo v literaturi našli podatek, da je večina slabo vodotopnih zdravilnih učinkovin bolje topnih v MCT olju kot v LCT oljih. Razlog za to naj bi bila višja polarnost MCT olja od LCT olj. V primerjavi z ostalimi olji MCT vsebuje trigliceride krajših maščobnih kislin. MCT olje je bolj prečiščeno in vsebuje manj primesi, ki bi lahko zmanjšale topnost CBD.

Razlika v topnosti je lahko tudi posledica tega, da MCT olje vsebuje nasičene maščobne kisline, ostala olja pa večinoma nenasičene maščobne kisline (4). V MCT olju je topnost 681,31 mg/mL olja, v ostalih pa okrog 380–410 mg/mL olja.

Večina CBD kapljic vsebuje 10–250 mg CBD/mL raztopine. Pri 25 °C bi tako lahko izdelali CBD izdelke s takšnimi koncentracijami v vseh analiziranih rastlinskih oljih. Težava bi potencialno nastala pri temperaturah nižjih od 25 °C, saj topnost večine snovi upada z nižanjem temperature.

33

4.3.2 Propilenglikol in njegove vodne raztopine

Povprečne topnosti pri 26 °C iz treh meritev smo predstavili v preglednici VIII.

Preglednica VIII: Topnost CBD v propilenglikolu in njegovih vodnih raztopinah

Topilo Topnost kot masni delež CBD v nasičeni raztopini (w/w (%))

Povprečje topnosti v obliki masnega deleža (w/w (%))

RSD (%)

Propilenglikol 44,68 43,84 1,7

43,47 43,36 95% Propilenglikol–

5% voda (w/w)

22,20 21,25 5,7

21,67 19,89 90% propilenglikol–

10% voda (w/w)

7,81 7,89 12,9

8,95 6,92 85% propilenglikol–

15% voda (w/w)

2,00 (samo ena meritev) / /

CBD je bil v čistem propilenglikolu dobro topen (780,56 mg CBD/g topila). Kljub temu je že majhen dodatek vode topnost močno znižal (slika 14).

Pri 5% masnem deležu vode v propilenglikolu je bila topnost CBD 269,89 mg/g topila. Ob 15%

(w/w) dodatku vode, je bila topnost CBD samo še 20,37 mg/g topila. To je bilo pričakovano, glede na zelo slabo topnost CBD v vodi (4).

34 Slika 14. Vpliv masnega deleža vode na topnost CBD.

4.3.3 Topnost CBD v ostalih topilih

Topnost CBD smo v triacetinu določili v treh poskusih, medtem ko smo jo v ostalih topilih določili samo enkrat. Rezultati so predstavljeni v preglednici IX.Pri določenih topilih nismo dosegli nasičene raztopine (npr. trietil citrat). Do tega je prišlo, ker smo dodali premalo CBD in po 48 h stresanja ni bilo več prisotne suspenzije, ampak le raztopina. Poznamo torej le količino topljenca, pri kateri je snov zagotovo še topna. Vrednost, prikazana v tabeli je najverjetneje manjša od meje topnosti (<).

Pri nekaterih zmeseh glicerola in vode je bila topnost CBD nižja od najnižje koncentracije, ki je še v linearnem območju, zato pri njih nismo mogli določiti topnosti. To smo označili z BLQ (pod mejo določljivosti).

Pri topilih iz te skupine smo topnost določali pri temperaturi 26 °C, izjema je le triacetin, ki smo mu topnost določili pri 25 °C.

35 Preglednica IX: Topnost CBD v ostalih topilih

Topilo Topnost kot masni delež CBD v nasičeni raztopini (w/w (%))

Topnost v mg CBD/g topila

95% glicerol–5%

voda (w/w)

BLQ BLQ

80% glicerol–20%

voda (w/w)

BLQ BLQ

Trietil citrat >53,97 >1172,69

PEG 400 > 56,83 > 1316,53

95% PEG 400–5%

voda (w/w)

> 44,17 > 791,09

90% PEG 400–

10% voda (w/w)

> 48,65 > 947,42

Triacetin 58,82 Povprečje =

57,15 % RSD = 2,7 %

1333,61 55,73

56,89

100% glicerol je bil preveč viskozen za določanje topnosti CBD z našo metodo. Zato smo poskusili določiti topnost CBD v 95% (w/w) glicerolu in 5% (w/w) vodi. Pri tem je bila topnost CBD tako nizka, da je nismo mogli določiti.

Topnost CBD v trietil citratu je bila višja od 1172,69 mg CBD/g topila. Zaradi dobrega raztapljanja je to topilo potencialno uporabno pri izdelavi tekočih formulacij s CBD.

PEG 400 je brezbarvna, viskozna tekočina, topnost CBD v njej je bila višja od 1316,53 mg/g topila. Tudi 10% (w/w) dodatek vode k PEG 400 topnosti CBD ni znižal bistveno, saj je bila topnost vseeno višja od 947,42 mg/g topila.

Triacetin je brezbarvna, viskozna tekočina, v kateri je bil CBD dobro topen (1333,61 mg CBD/g topila).

36

4.3.4 Laboratorijska topila

Od laboratorijskih topil smo topnost določili v 96% etanolu, metanolu, izooktanu, acetonu, izopropanolu, DMSO, 1-butanolu, DMF, cikloheksanu, diklorometanu in dietiletru. Rezultati topnosti so navedeni v preglednici X.

Preglednica X: Topnost CBD v laboratorijskih topilih

Topilo Topnost kot masni delež CBD v nasičeni raztopini (w/w (%))

Povprečje topnosti v obliki masnega deleža (w/w (%))

T (°C)

Etanol (96%) 79,20 78,93

(RSD = 1,1 %)

25,5 77,96

79,63

Metanol 82,69 82,49

(RSD = 0,7 %)

26 82,94

81,84

Izooktan 25,50 / 25,5

Aceton 84,59 / 27

Izopropanol 74,05 / 27

DMSO 81,15 81,30 26,5

DMSO 81,45

1-Butanol 74,55 / 27

DMF 81,18 / 27

Cikloheksan 65,43 / 27

Diklorometan 74,72 75,44 27

Diklorometan 76,16 26

Dietileter 82,40 / 26

CBD je bil zelo dobro topen v večini laboratorijskih topil, od tega najbolje v acetonu (5490,01 mg CBD/g topila), metanolu (4711,02 mg CBD/g topila) in dietiletru (4681,82 mg CBD/g topila) (slika 15).

37

Aceton, metanol, dietileter, DMSO, DMF in etanol, v katerih je topnost najvišja, imajo funkcionalne skupine, ki lahko delujejo kot akceptorji vodikovih vezi. Molekula CBD vsebuje resorcinolno funkcionalno skupino, ki lahko deluje kot donor vodikovih vezi. Tvorba vodikovih vezi bi lahko pojasnila tako visoke topnosti.

Z izračunom iz topnosti (ob upoštevanju molskih mas topila in CBD) ugotovimo, da je v nasičeni raztopini CBD v acetonu in dietiletru razmerje med molekulami CBD in molekulami topila približno 1 : 1. V nasičeni raztopini CBD v metanolu sta na molekulo CBD prisotni približno 2 molekuli metanola. Razlog za tako visoke topnosti v laboratorijskih topilih je lahko tudi nizko tališče CBD (67 °C) (4).

Topnosti CBD v diklorometanu, 1-butanolu, izopropanolu in cikloheksanu so bile znotraj intervala 1800–3100 mg CBD/g topila. Od izbranih laboratorijskih topil je bila topnost najnižja v izooktanu, pri katerem ni presegala niti 500 mg CBD/g topila.

Slika 15. Topnost CBD v laboratorijskih topilih.

38

Temperature, pri katerih smo določali topnost pri posameznem topilu, so bile v intervalu 25–

27 °C. Ker razlike v temperaturi niso bile velike, smo predpostavljali, da niso bistveno vplivale na interpretacijo rezultatov. Pri nekaterih topilih smo topnost določili le v 1 poskusu, kar zmanjša zanesljivost podatka. To smo večinoma storili pri topilih, ki so manj pomembna za rokovanje s CBD in smo podatek pridobivali le za orientacijo.

4.4 Opis vloge topil v zdravilih

Z rezultati topnosti lahko delno pojasnimo vlogo nosilnih topil v registriranih zdravilih s CBD.

Epidyolex je raztopina, ki vsebuje 100 mg/mL CBD. Vsak mL raztopine vsebuje 79 mg brezvodnega etanola in 736 mg rafiniranega sezamovega olja (9). Večinski del vehikla je sezamovo olje, etanol pa ima vlogo sotopila, saj je v njem CBD bolje topen. Glede na to, da sezamovo olje spada med LCT olja (topnost CBD v njih je približno 380–410 mg CBD/mL topila pri 25 °C), sklepamo, da bi lahko pripravili 100 mg/mL raztopino tudi v čistem sezamovem olju. Morda je pri temperaturi, nižji od 25 °C topnost CBDtoliko slabša, da bi se CBD lahko oboril, če ne bi bilo dodatka sotopila.

Sativex oralno pršilo vsebuje 25 mg/mL CBD in 27 mg/mL Δ⁹-THC v obliki dveh ekstraktov.

Vsebuje zmes brezvodnega etanola in propilenglikola v enakem razmerju (12). CBD je v propilenglikolu pri 26,5 °C dobro topen, ampak zdravilo Sativex se shranjuje v hladilniku na 2–8 °C. Pri tako nizkih temperaturah shranjevanja pa je lahko topnost CBD pomembno nižja.

Etanol ima tako vlogo sotopila. V pršilu so prisotni še Δ⁹-THC in druge spojine, ki se morda v samem propilenglikolu tudi ne bi raztopile.

4.5 Zmes glicerola in etanola

Zmes glicerol–etanol–voda naj bi tvorila raztopino v vseh razmerjih, a pri dodatku CBD smo opazili razslojevanje (55). Pri določanju topnosti smo najprej zatehtali glicerol in 96% etanol ter ju združili v centrifugirki. Zmes smo nato vorteksirali 3 min in pri tem dobili na videz homogeno zmes brez ločitve faz. Nato smo dodali presežno količino CBD za določanje topnosti.