UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
LEJLA AGOVIĆ
MAGISTRSKA NALOGA
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
LEJLA AGOVIĆ
RAZVOJ IN VALIDACIJA ANALIZNE METODE ZA DOLOČANJE PLAZEMSKIH KONCENTRACIJ ANTIDEPRESIVOV DESVENLAFAKSINA, DULOKSETINA,
MIRTAZAPINA, SERTRALINA IN VENLAFAKSINA MAGISTRSKA NALOGA
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF ANALYTICAL METHOD FOR PLASMA CONCENTRATION DETERMINATION OF ANTIDEPRESSANTS
DESVENLAFAXINE, DULOXETINE, MIRTAZAPINE, SERTRALINE AND VENLAFAXINE
MASTER'S THESIS
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
Ljubljana, 2021
Magistrsko nalogo sem opravljala na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani, na Katedri za biofarmacijo in farmakokinetiko, pod mentorstvom izr. prof. dr. Tomaža Vovka, mag. farm.
Eksperimentalno delo je bilo opravljeno na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani.
ZAHVALA
Iskreno se zahvaljujem mentorju izr. prof. dr. Tomažu Vovku, mag. farm. za mentorstvo pri magistrski nalogi, usmerjanje, pomoč in prijaznost. Prav tako hvala vsem zaposlenim na Katedri za biofarmacijo in farmakokinetiko za pomoč in za lepe spomine na delo v laboratoriju.
Zahvaljujem se svoji sestri in staršem za veliko, stalno in brezpogojno podporo, spodbudo in pomoč.
Hvala tudi Saši, Sari, Damjanu, Sabrini, Maruški, Tini, Rebeki, Petri, Bilki, Eni ter ostalim prijateljem in kolegom, ki ste mi polepšali obdobje študija in izkazovali podporo in pomoč.
IZJAVA
Izjavljam, da sem magistrsko delo samostojno izdelala pod vodstvom mentorja izr. prof. dr.
Tomaža Vovka, mag. farm.
Lejla Agović
Predsednik magistrske komisije: Prof. dr. Janez Ilaš, mag. farm.
Mentor: Izr. prof. dr. Tomaž Vovk, mag. farm.
Članica magistrske komisije: Doc. dr. Eva Tavčar, mag. farm.
KAZALO VSEBINE
1 UVOD ... 1
1.1 Antidepresivi ... 1
1.1.1 Osnovna razdelitev antidepresivov ... 1
1.1.2 Farmakološke značilnosti analitov ... 2
1.2 Optimizacija farmakoterapije s pomočjo terapevtskega spremljanja koncentracij zdravil ... 8
1.2.1 Terapevtsko spremljanje koncentracij zdravil ... 8
1.2.2 Terapevtsko spremljanje koncentracij zdravil v nevropsihiatriji ... 9
1.3 Pregled literature na področju analitike desvenlafaksina, duloksetina, mirtazapina, sertralina in venlafaksina ... 11
2 NAMEN DELA ... 16
3 MATERIALI ... 17
3.1 Biološki material ... 17
3.2 Standardi ... 17
3.3 Reagenti in topila ... 17
3.4 Naprave in pribor ... 18
4 METODE ... 20
4.1 PRIPRAVA STANDARDNIH RAZTOPIN IN TOPIL ... 20
4.1.1 Priprava osnovnih in delovnih raztopin ... 20
4.1.2 Priprava kalibratorjev za umeritveno krivuljo ... 20
4.1.3 Priprava kontrolnih vzorcev ... 21
4.1.4 Priprava internega standarda ... 22
4.1.5 Priprava vodnih vzorcev ... 22
4.2 OPTIMIZACIJA PRIPRAVE PLAZEMSKIH VZORCEV ... 24
4.2.1 Priprava vzorca po izhodiščni metodi ... 24
4.2.2 Priprava vzorcev obogatene plazme ... 24
4.2.3 Ekstrakcija ... 26
4.2.4 Sušenje in raztapljanje suhega preostanka po sušenju... 27
4.2.5 Končna metoda priprave vzorca ... 27
4.2.6 Končno ovrednotenje absolutne uspešnosti ekstrakcije ... 28
4.3 OPTIMIZACIJA KROMATOGRAFSKE ANALIZNE METODE ... 28
4.3.1 Izbor mobilne faze ... 28
4.3.2 Izbor stacionarne faze ... 30
4.3.3 Končna kromatografska metoda ... 30
4.3.4 Priprava mobilne faze ... 31
4.4 VALIDACIJA ... 32
4.4.1 Umeritvena krivulja in območje metode ... 32
4.4.2 Spodnja meja kvantifikacije LLOQ ... 33
4.4.3 Točnost ... 33
4.4.4 Natančnost ... 34
4.4.5 Selektivnost ... 34
4.4.6 Stabilnost vzorcev v avtomatskem vzorčevalniku ... 34
5 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 35
5.1 OPTIMIZACIJA PRIPRAVE PLAZEMSKIH VZORCEV ... 35
5.1.1 Priprava vzorcev obogatene plazme ... 35
5.1.2 Ekstrakcija ... 37
5.1.3 Sušenje in raztapljanje suhega preostanka po sušenju... 41
5.1.4 Končno ovrednotenje absolutne uspešnosti ekstrakcije ... 41
5.2 OPTIMIZACIJA KROMATOGRAFSKE ANALIZNE METODE ... 42
5.2.1 Izbor mobilne faze ... 42
5.2.2 Izbor stacionarne faze ... 48
5.3 VALIDACIJA ... 50
5.3.1 Umeritvena krivulja in območje metode ... 50
5.3.2 Spodnja meja kvantifikacije LLOQ ... 54
5.3.3 Točnost ... 56
5.3.4 Natančnost ... 58
5.3.5 Selektivnost ... 61
5.3.6 Stabilnost vzorcev v avtomatskem vzorčevalniku ... 61
5.3.7 Ovrednotenje uspešnosti validacije ... 62
5.4 PREDLOGI IZBOLJŠAV ... 65
6 SKLEP ... 66
7 LITERATURA ... 67
8 PRILOGE ... 74
8.1 Priloga 1: Kromatogrami vodnih vzorcev analitov pri različnih pH pufra ... 74
8.2 Priloga 2: Kromatogrami analize s 4. programom elucije ... 76
8.3 Priloga 3: Absorpcijski spektri analitov ... 77
8.4 Priloga 4: Kromatogrami vzorcev LLOQ ... 78
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: Razdelitev antidepresivov po mehanizmu delovanja ... 1
Preglednica II: Fizikalno - kemijske lastnosti desvenlafaksina ... 2
Preglednica III: Farmakokinetične lastnosti desvenlafaksina ... 3
Preglednica IV: Fizikalno - kemijske lastnosti duloksetina ... 3
Preglednica V: Farmakokinetične lastnosti duloksetina ... 4
Preglednica VI: Fizikalno - kemijske lastnosti mirtazapina ... 5
Preglednica VII: Farmakokinetične lastnosti mirtazapina... 5
Preglednica VIII: Fizikalno - kemijske lastnosti sertralina ... 6
Preglednica IX: Farmakokinetične lastnosti sertralina ... 6
Preglednica X: Fizikalno - kemijske lastnosti venlafaksina ... 7
Preglednica XI: Farmakokinetične lastnosti venlafaksina... 8
Preglednica XII: Vrednosti parametrov za kvantifikacijo in interpretacijo rezultatov TDM za analite ... 11
Preglednica XIII: Pregled raziskav na področju analitike preiskovanih analitov z ekstrakcijo tekoče-tekoče in analizo s HPLC ... 13
Preglednica XIV: Uporabljeni standardi ... 17
Preglednica XV: Uporabljeni reagenti in topila ... 17
Preglednica XVI: Priprava kalibratorjev ... 20
Preglednica XVII: Priprava delovnih raztopin za pripravo kalibratorjev... 21
Preglednica XVIII: Priprava delovnih raztopin za obogatitev kontrolnih vzorcev ... 22
Preglednica XIX: Priprava delovnih raztopin paroksetina ... 22
Preglednica XX: Priprava delovnih raztopin za vodne vzorce ... 23
Preglednica XXI: Priprava vodnih vzorcev ... 23
Preglednica XXII: Naalkaljenje plazme v postopku priprave vzorca v literaturi in pri naši izhodiščni metodi ... 25
Preglednica XXIII: Program gradientne elucije pri izhodiščni metodi ... 29
Preglednica XXIV: Drugi preizkušeni program gradientne elucije ... 29
Preglednica XXV: Tretji preizkušeni program gradientne elucije ... 29
Preglednica XXVI: Četrti preizkušeni program gradientne elucije... 29
Preglednica XXVII: Peti preizkušeni program gradientne elucije ... 29
Preglednica XXVIII: Šesti preizkušeni program gradientne elucije ... 29
Preglednica XXIX: Lastnosti preizkušenih kolon ... 30
Preglednica XXX: Pogoji kromatografske analize pri optimizirani metodi ... 31
Preglednica XXXI: Program gradientne elucije, uporabljen pri optimizirani metodi ... 31
Preglednica XXXII: Vpliv bazičnosti plazme na površine vrhov analitov ... 35
Preglednica XXXIII: Retencijski časi analitov in IS v literaturi in pri naši izhodiščni analizi . 36 Preglednica XXXIV: Površine odzivov analitov pri različnih razmerjih plazme in topila ... 37
Preglednica XXXV: Izkoristki ekstrakcij z različnimi volumni ... 38
Preglednica XXXVI: Izkoristki ekstrakcij s topili izoamilni alkohol:heksan 1:9 (v/v) in izoamilni alkohol:heksan 2:98 (v/v) ... 38
Preglednica XXXVII: Izkoristki ekstrakcij z etil acetatom, dietil etrom, TBME in cikloheksanom ... 39
Preglednica XXXVIII: Izkoristki ekstrakcij z mešanicami topil etil acetata ali TBME s cikloheksanom ... 40
Preglednica XXXIX: Izkoristki ekstrakcij s topili etil acetat:cikloheksan 1:9 (v/v) in TBME:cikloheksan 3:7 (v/v) ... 40
Preglednica XL: Povprečje površin odzivov pri sušenju pri 25 °C in pri 40 °C ... 41
Preglednica XLI: Povprečni izkoristki ekstrakcije pri izhodiščni in razviti metodi... 41
Preglednica XLII: Povprečni izkoristki ekstrakcije v literaturi in pri razviti metodi ... 42
Preglednica XLIII: Retencijski časi analitov pri različnih pH pufra v MF ... 43
Preglednica XLIV: Retencijski časi pri analizah z različnimi programi elucije ... 45
Preglednica XLV: Retencijski časi analitov v literaturi in pri naših analizah ... 48
Preglednica XLVI: Retencijski časi na kolonah C18 in C8 ... 48
Preglednica XLVII: Izbrane valovne dolžine, pri katerih smo detektirali analite ... 50
Preglednica XLVIII: Izračunane koncentracije kalibracijskih standardov in pripadajoče točnosti iz umeritvene premice desvenlafaksina ... 51
Preglednica XLIX: Izračunane koncentracije kalibracijskih standardov in pripadajoče točnosti iz umeritvene premice duloksetina ... 51
Preglednica L: Izračunane koncentracije kalibracijskih standardov in pripadajoče točnosti iz umeritvene premice mirtazapina ... 52
Preglednica LI: Izračunane koncentracije kalibracijskih standardov in pripadajoče točnosti iz
umeritvene premice sertralina ... 52
Preglednica LII: Izračunane koncentracije kalibracijskih standardov in pripadajoče točnosti iz umeritvene premice venlafaksina ... 53
Preglednica LIII: Nakloni, odseki na ordinati in koeficienti korelacije umeritvenih premic analitov ... 54
Preglednica LIV: Povprečne površine odzivov LLOQ vzorcev in petkratniki odzivov slepega vzorca... 54
Preglednica LV: Dnevna in meddnevna točnost vzorcev LLOQ ... 55
Preglednica LVI: Dnevna in meddnevna natančnost vzorcev LLOQ ... 55
Preglednica LVII: Dnevna točnost QC vzorcev ... 56
Preglednica LVIII: Meddnevna točnost QC vzorcev ... 58
Preglednica LIX: Dnevna natančnost QC vzorcev ... 59
Preglednica LX: Meddnevna natančnost QC vzorcev ... 60
Preglednica LXI: Selektivnost razvite metode ... 61
Preglednica LXII: Spremembe odzivov QC vzorcev v 24 urah ... 62
Preglednica LXIII: Referenčna terapevtska območja analitov v plazmi ... 63
Preglednica LXIV: Območja v literaturi in pri razviti metodi ... 63
KAZALO SLIK
Slika 1: Strukturna formula desvenlafaksina ... 2
Slika 2: Strukturna formula duloksetina ... 3
Slika 3: Strukturna formula mirtazapina ... 4
Slika 4: Strukturna formula sertralina ... 6
Slika 5: Strukturna formula venlafaksina ... 7
Slika 6: Plazemski profil hipotetičnega nevropsihofarmaka, apliciranega peroralno ... 10
Slika 7: Kromatograma desvenlafaksina (DE) s koncentracijo 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi z izhodiščno metodo ... 44
Slika 8: Kromatograma mirtazapina (MI) s konc. 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi z izhodiščno metodo ... 44
Slika 9: Kromatograma venlafaksina (VE) s koncentracijo 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi z izhodiščno metodo ... 44
Slika 10: Kromatograma paroksetina (PA) s koncentracijo 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi z izhodiščno metodo ... 44
Slika 11: Kromatograma duloksetina (DU) s koncentracijo 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi z izhodiščno metodo ... 44
Slika 12: Kromatograma sertralina (SE) s koncentracijo 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi z izhodiščno metodo ... 44
Slika 13: Kromatograma desvenlafaksina s konc. 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 5. programom ... 46
Slika 14: Kromatograma mirtazapina s konc. 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 5. programom ... 46
Slika 15: Kromatograma venlafaksina s konc. 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 5. programom ... 46
Slika 16: Kromatograma paroksetina s konc. 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 5. programom ... 46
Slika 17: Kromatograma duloksetina s konc. 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 5. programom ... 46
Slika 18: Kromatograma sertralina s konc. 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 5. programom ... 46 Slika 19: Kromatograma desvenlafaksina s koncentracijo 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 6. programom (optimalna metoda) ... 47 Slika 20: Kromatograma mirtazapina s koncentracijo 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 6. programom (optimalna metoda) ... 47 Slika 21: Kromatograma venlafaksina s koncentracijo 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 6. programom (optimalna metoda) ... 47 Slika 22: Kromatograma paroksetina s konc. 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 6. programom (optimalna metoda)... 47 Slika 23: Kromatograma duloksetina s konc. 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 6. programom (optimalna metoda)... 47 Slika 24: Kromatograma sertralina s konc. 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 6. programom (optimalna metoda)... 47 Slika 25: Kromatograma dvojnega slepega vzorca (modra) in vzorca s koncentracijo 10 ng/ml (rdeča), merjenega pri valovni dolžini 230 nm, na koloni Eclipse XBD C18 ... 49 Slika 26: Kromatograma dvojnega slepega vzorca (modra) in vzorca s koncentracijo 10 ng/ml (rdeča), merjenega pri valovni dolžini 230 nm, na koloni Luna C18(2) (optimalna metoda)... 49 Slika 27: Kromatogram vodnega vzorca s koncentracijo 100 ng/ml, pri analizi s pH pufra 3,5 ... 74 Slika 28: Kromatogram vodnega vzorca s koncentracijo 100 ng/ml, pri analizi s pH pufra 2,0 ... 74 Slika 29: Kromatogram vodnega vzorca s koncentracijo 100 ng/ml, pri analizi s pH pufra 2,7 ... 75 Slika 30: Kromatogram vodnega vzorca s koncentracijo 100 ng/ml, pri analizi s pH pufra 4,7 ... 75 Slika 31: Kromatogram vodnega vzorca s koncentracijo 100 ng/ml, pri analizi s pH pufra 7,0 ... 75 Slika 32: Kromatograma desvenlafaksina s koncentracijo 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 4. programom ... 76
Slika 33: Kromatograma mirtazapina s koncentracijo 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 4. programom ... 76 Slika 34: Kromatograma venlafaksina s koncentracijo 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 4. programom ... 76 Slika 35: Kromatograma mirtazapina s koncentracijo 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 4. programom ... 76 Slika 36: Kromatograma duloksetina s koncentracijo 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 4. programom ... 76 Slika 37: Kromatograma sertralina s koncentracijo 10 ng/ml (rdeča) in dvojnega slepega vzorca (modra), pri analizi s 4. programom ... 76 Slika 38: Absorpcijski spektri analitov desvenlafaksina, duloksetina, sertralina in venlafaksina ... 77 Slika 39: Kromatogrami desvenlafaksina s konc. LLOQ 5 ng/ml (rdeča) in 10 ng/ml (zelena) ter dvojnega slepega vzorca (modra) ... 78 Slika 40: Kromatogrami mirtazapina s koncentracijo LLOQ 5 ng/ml (rdeča) in 10 ng/ml (zelena) ter dvojnega slepega vzorca (modra) ... 78 Slika 41: Kromatogrami venlafaksina s koncentracijo LLOQ 5 ng/ml (rdeča) in 10 ng/ml (zelena) ter dvojnega slepega vzorca (modra) ... 78 Slika 42: Kromatogrami duloksetina s konc. LLOQ 5 ng/ml (rdeča) in 10 ng/ml (zelena) ter dvojnega slepega vzorca (modra) ... 78 Slika 43: Kromatogrami sertralina s konc. LLOQ 5 ng/ml (rdeča) in 10 ng/ml (zelena) ter dvojnega slepega vzorca (modra) ... 79
POVZETEK
Terapevtsko spremljanje koncentracij zdravil (angl. Therapeutic Drug Monitoring – TDM) omogoča oblikovanje personaliziranega režima zdravljenja za posameznika z določanjem koncentracij učinkovin v bioloških tekočinah. Tak režim upošteva farmakokinetične in farmakodinamične variabilnosti posameznika. S tem zagotavlja najvišjo učinkovitost terapije in najmanj možnosti za pojav toksičnih ali neželenih učinkov, ter za pojav recidiva.
V okviru magistrske naloge smo razvili metodo za sočasno določanje antidepresivov desvenlafaksina, duloksetina, mirtazapina, sertralina in venlafaksina. Vzorce obogatene plazme smo naalkalili in dodali paroksetin kot interni standard. Metoda je temeljila na ekstrakciji tekoče-tekoče s topilom etil acetat:cikloheksan 1:9 (v/v), sušenjem s prepihovanjem z dušikom in raztapljanjem suhega preostanka s topilom acetonitril:fosfatni pufer 1:9 (v/v).
Kromatografsko metodo smo razvili na reverzno fazni koloni. Uporabili smo gradientno elucijo, s pretokom mobilne faze 1,2 ml/min, ki je trajala 20 minut. Desvenlafaksin in venlafaksin smo detektirali z UV-VIS detektorjem pri valovni dolžini 226 nm, duloksetin pri 230 nm, sertralin pri 220 nm, paroksetin pri 290 nm, mirtazapin pa s fluorescenčnim detektorjem pri ekscitacijski valovni dolžini 290 nm in emisijski valovni dolžini 370 nm.
Razvito metodo za določanje plazemskih koncentracij desvenlafaksina, duloksetina in mirtazapina smo uspešno validirali po smernicah za validacijo bioanaliznih metod EMA.
Dosegli smo območja metode med 10 in 300 ng/ml za desvenlafaksin, 5 in 200 ng/ml za duloksetin ter 10 in 200 ng/ml za mirtazapin. Metoda je selektivna, točna in natančna znotraj in med dnevi za te tri analite. Stabilnost vzorcev v avtomatskem vzorčevalniku pri 10 °C je za desvenlafaksin manj kot 6 ur, za duloksetin vsaj 24 ur in za mirtazapin 6 ur. Metode za določanje sertralina in venlafaksina nismo uspešno validirali.
Na osnovi uspešnosti ekstrakcije razvite metode, uspešnosti ločbe analitov in validacijskih parametrov lahko ocenimo, da je razvita metoda primerna za določanje desvenlafaksina, duloksetina in mirtazapina pri terapevtskem spremljanju koncentracij zdravil.
Ključne besede: antidepresivi, TDM, desvenlafaksin, duloksetin, mirtazapin, paroksetin, sertralin, venlafaksin
ABSTRACT
Therapeutic Drug Monitoring enables determination of personalized treatment regimen created for individuals by determination of plasma concentrations of drugs in bodily fluids. Such regimens take into account pharmacokinetic and pharmacodynamic variability, thus ensuring the highest effectiveness of therapy and the least chance of toxic or side effects, as well as relapse.
In master thesis we developed the analytical method for determination of antidepressants desvenlafaxine, duloxetine, mirtazapine, sertraline and venlafaxine. Spiked plasma samples were alkanized and paroxetine was added as internal standard. Analytes were extracted with liquid-liquid extraciton with solvent ethyl acetate:cyclohexane 1:9 (v/v), evaporated and reconstituted with acetonitrile:phosphate buffer 1:9 (v/v).
Chromatographic separation was achieved using reversed phase column. Mobile phase was delivered at 1,2 ml/min with gradient program, with run time of developed method 20 minutes.
UV-VIS detection was performed at wavelenght 226 nm for desvenlafaxine and venlafaxine, 230 nm for duloxetine, 290 for paroxetine and at 220 nm for sertraline. Mirtazapine was detected with fluorescence detector (λex 290 nm / λem370 nm).
Developed analytical method was successfully validated for determination of desvenlafaxine, duloxetine and mirtazapine, according to EMA guideline on bioanalytical method validation.
Ranges were 10 – 300 ng/ml for desvenlafaxine, 5 – 200 ng/ml for duloxetine and 10 – 200 ng/ml for mirtazapine. Method is selective, accurate and precise within-run and between-run for these three analytes. Stability in autosampler at 10°C was less than 6 hours for desvenlafaxine, at least 24 hours for duloxetine and 6 hours for mirtazapine. Method was not successfully validated for determination of sertraline and venlafaxine.
Based on successful recoveries of extraction, separation on the column and validation we can conclude that the developed method for plasma concentration determination of desvenlafaxine, duloxetine and mirtazapine is suitable for use in TDM.
Key words: antidepressants, TDM, desvenlafaxine, duloxetine, mirtazapine, paroxetine, sertraline, venlafaxine
SEZNAM OKRAJŠAV
A Površina odziva
ACN Acetonitril
c Koncentracija
𝐜̅ Povprečna koncentracija CV Koeficient variacije CYP Citokrom P450
DE Desvenlafaksin
DNRI Zaviralci ponovnega privzema dopamina in noradrenalina
DO Dopamin
DR Delovna raztopina analitov DRP Delovna raztopina paroksetina
DRRR Referenčno območje, povezano z odmerkom (angl. Dose-related reference range)
DRV Delovna raztopina analitov za pripravo vodnih vzorcev
DU Duloksetin
EDTA Etilendiamintetraocetna kislina EMA Evropska agencija za zdravila FLD Fluorescenčni detektor
HPLC Tekočinska kromatografija visoke zmogljivosti
IS Interni standard
k Naklon umeritvene premice
LLE Ekstrakcija tekoče-tekoče LLOQ Spodnja meja kvantifikacije
MAOI Zaviralci encima monoamino-oksidaze
MF Mobilna faza
MI Mirtazapin
MPR Razmerje med presnovki in učinkovino (angl. Metabolite to parent compound ratio)
n Odsek umeritvene premice na y osi
NA Noradrenalin
NaSSA Noradrenergični in selektivni serotoninergični antidepresivi NRI Zaviralci ponovnega privzema noradrenalina
OF Organska faza
OR Osnovna raztopina
PA Paroksetin
r2 Koeficient determinacije
QC Kontrolni vzorec
QCH Kontrolni vzorec pri visoki koncentraciji QCL Kontrolni vzorec pri nizki koncentraciji QCM Kontrolni vzorec pri srednji koncentraciji
SA Serotonin
SD Standardni odklon
SE Sertralin
SER Serotoninski receptorji
SERT Prenašalni proteini serotonina
SMS Modulatorji in stimulatorji serotoninskih receptorjev
SNRI Netriciklični zaviralci ponovnega privzema serotonina in noradrenalina SSRI Selektivni zaviralci ponovnega privzema serotonina
TBME Terc-butil metil eter TCA Triciklični antidepresivi
TDM Terapevtsko spremljanje koncentracij zdravil (angl. Therapeutic Drug Monitoring)
tR Retencijski čas
TRR Referenčno terapevtsko območje (angl. Therapeutic reference range) UFLC Tekočinska kromatografija ultra visoke hitrosti
UGT Uridin 5'-difosfo-glukuronoziltransferaza
UHPLC Tekočinska kromatografija ultra visoke zmogljivosti ULOQ Zgornja meja kvantifikacije
UV – VIS Ultravijolična – vidna (svetloba)
v/v Volumsko-volumski
VE Venlafaksin
VF Vodna faza
λ Valovna dolžina
λmax Valovna dolžina, pri kateri spojina absorbira največ svetlobe
1
1 UVOD
1.1 Antidepresivi
Antidepresivi so zdravila za zdravljenje duševnih motenj, kot so depresivne motnje in različne anksiozne motnje, ter tudi za zdravljenje nevropatske bolečine, migrene, fibromialgije, sindroma razdražljivega črevesa in stresne urinske inkontinence (1).
1.1.1 Osnovna razdelitev antidepresivov
V preglednici 1 je razdelitev antidepresivov glede na način delovanja po Roche et al. (2) in Dale in Haylett (3).
Preglednica I: Razdelitev antidepresivov po mehanizmu delovanja
Skupina Mehanizem delovanja Predstavniki
Selektivni zaviralci ponovnega privzema serotonina (SSRI)
Zaviranje presinaptičnega privzema serotonina (SA) v živčne končiče z zaviranjem prenašalnih proteinov serotonina (SERT). Posledično se poveča koncentracija SA v sinaptičnih špranjah in zveča aktivacija
serotoninskih receptorjev (SER), kar vodi v zmanjšano občutljivost SER, manjšo ekspresijo SERT in zmanjšano nastajanje SA v centralnem živčevju. Te spremembe naj bi bile razlog za delovanje SSRI (2).
Citalopram, escitalopram, fluoksetin, fluvoksamin,
paroksetin in sertralin (2).
Triciklični antidepresivi (TCA)
Zaviranje privzema serotonina in noradrenalina (NA).
Poleg tega tudi zaviralno delovanje na številne druge receptorje (muskarinske, α1-adrenergične in histaminske H1-receptorje) in natrijeve kanalčke, kar se kaže v številnih neželenih učinkih (2).
Amitriptilin, amoksapin, klomipramin,
dezipramin, doksepin, imipramin,
nortriptilin, protriptilin in trimipramin (2).
Zaviralci encima monoamino- oksidaze (MAOI)
Zaviranje delovanja encimov monoaminooksidaze A in B v živčnih končičih, s čimer se zmanjša obseg oksidativne deaminacije SA, NA, adrenalina in dopamina (DO). To vodi v njihovo povečano koncentracijo v sinaptični špranji (2,3).
Fenelzin in tranilcipromin (2).
Atipični antidepresivi
Pod atipične antidepresive štejemo več različnih skupin antidepresivov (2):
Netriciklični zaviralci ponovnega privzema
Zaviranje prenašalcev serotonina in noradrenalina, ki sodelujejo pri ponovnem
Atomoksetin, desvenlafaksin, duloksetin,
2 serotonina in noradrenalina
(SNRI)
privzemu v sinapsi in tako zavirajo presinaptični privzem SA in NA (2).
levomilnacipran in venlafaksin (2).
Zaviralci ponovnega privzema dopamina in noradrenalina (DNRI)
Zaviranje ponovnega privzema DO in NA z zaviranjem njunih prenašalcev, ter spodbujanje sproščanja DO in NA (2).
Bupropion (2).
Modulatorji in stimulatorji serotoninskih receptorjev (SMS)
Delovanje na serotoninske receptorje, ki se odraža z zaviranjem sproščanja SA, acetilholina, GABA-e in NA. Izkazujejo tudi šibko zaviralno delovanje na ponovni privzem SA (2).
Nefazodon, trazodon, vilazodon in
vortioksetin (2).
Noradrenergični in selektivni serotoninergični
antidepresivi (NaSSA)
Antagonist α2-adrenergičnih receptorjev, ter specifično serotoninskih 5-HT2 in 5- HT3 receptorjev (2,4).
Mirtazapin (2).
Zaviralci ponovnega privzema noradrenalina (NRI) (3)
Selektivno zaviranje prenašalcev NA in posledično zaviranje ponovnega privzema NA (5,6).
Reboksetin in maprotilin (3).
1.1.2 Farmakološke značilnosti analitov 1.1.2.1 DESVENLAFAKSIN
Desvenlafaksin (slika 1) spada v skupino netricikličnih zaviralcev ponovnega privzema serotonina in noradrenalina (SNRI). Izkazuje desetkrat višjo selektivnost za zaviranje privzema serotonina kot noradrenalina (7). Desvenlafaksin oziroma O-desmetilvenlafaksin je aktivni presnovek venlafaksina in sicer se v desvenlafaksin presnovi približno 70 % venlafaksina (2).
V preglednici 2 so predstavljene fizikalno-kemijske lastnosti desvenlafaksina.
Preglednica II: Fizikalno - kemijske lastnosti desvenlafaksina
Kemijska formula C16H25NO2 (8) Molekulska masa 263,37 g/mol (8)
pKa Kisel center: 10,11; Bazični center: 8,87 (2)
logP 2,26 (2)
Topnost v vodi 3,7 g/L pri 25 °C (8)
Slika 1: Strukturna formula desvenlafaksina
3 Farmakokinetika desvenlafaksina
Aplikacija učinkovine je peroralna, pri čemer je absorpcija dobra (9). Hrana nima znatnega vpliva na farmakokinetiko desvenlafaksina (9,10). Najvišjo plazemsko koncentracijo doseže v sedmih urah in pol (2). Vezava na plazemske proteine je neodvisna od koncentracije (9).
Desvenlafaksin nima farmakološko aktivnih presnovkov. Glavna presnovna pot je konjugacija v jetrih z encimi uridin 5'-difosfo-glukuronoziltransferaze (UGT), v manjšem obsegu poteka tudi oksidativni metabolizem s citokromom P450 3A4 (CYP3A4). Izloča se v materino mleko (11). V preglednici 3 so predstavljene farmakokinetične lastnosti desvenlafaksina.
Preglednica III: Farmakokinetične lastnosti desvenlafaksina
Biološka uporabnost 80 % (9)
Volumen porazdelitve 3,42 L/kg (12)
Vezava na plazemske proteine 30 % (1)
Presnovki Desvenlafaksin O-glukuronid in N,O-didesmetilvenlafaksin (2,9)
Razpolovni čas 11 ur (2,7)
Izločanje urin 30 % (2)
1.1.2.2 DULOKSETIN
Prav tako kot desvenlafaksin je duloksetin (slika 2) zaviralec privzema serotonina in noradrenalina in ima desetkrat višjo selektivnost za zaviranje privzema serotonina kot noradrenalina (7). V preglednici 4 so predstavljene njegove fizikalno-kemijske lastnosti.
Preglednica IV: Fizikalno - kemijske lastnosti duloksetina
Kemijska formula C18H19NOS (13) Molekulska masa 297,4 g/mol (13)
pKa Bazični center: 9,7 (2)
logP 3,73 (2)
Topnost v vodi 13 mg/L pri 25 °C (13)
Slika 2: Strukturna formula duloksetina
4 Farmakokinetika duloksetina
Pri peroralni aplikaciji je absorpcija duloksetina dobra (2). Hrana nima pomembnega vpliva na absorpcijo (14). Veže se na albumin in alfa-1 kisli glikoprotein (15). Najvišje plazemske koncentracije doseže med šesto in deseto uro po aplikaciji (2). Duloksetin nima farmakološko aktivnih presnovkov, glavna pot presnove pa poteka v jetrih z encimi CYP2D6 in CYP1A2 in sicer poteče N-demetilacija s CYP2D6 in hidroksilacija naftalena s CYP1A2, naprej pa še konjugacija (15). Duloksetin je zmerni inhibitor encima CYP2D6 (2,16) in substrat prenašalca glikoproteina P (ABCB1) (16). V preglednici 5 so predstavljene farmakokinetične lastnosti duloksetina.
Preglednica V: Farmakokinetične lastnosti duloksetina
Biološka uporabnost > 90 % (2)
Volumen porazdelitve 1640 L (17)
Vezava na plazemske proteine 96 % (15)
Presnovki Glukuronidni konjugat 4- hidroksi duloksetina in sulfatni konjugat 5-hidroksi 6-metoksi duloksetina (14)
Razpolovni čas 12 ur (2,7)
Izločanje urin 70 %, blato 20 % (2)
1.1.2.3 MIRTAZAPIN
Mirtazapin (slika 3) je noradrenergični in selektivni serotoninergični antidepresiv (NaSSA), ki z antagonističnim delovanjem na centralne presinaptične α2-adrenergične receptorje in z blokiranjem postsinaptičnih serotoninskih 5-HT2 and 5-HT3 receptorjev poveča prenos noradrenalina in selektivno preko 5-HT1 receptorjev tudi serotonina v centralnem živčevju (2,18,19). V preglednici 6 so predstavljene njegove fizikalno-kemijske lastnosti.
Slika 3: Strukturna formula mirtazapina
5
Preglednica VI: Fizikalno - kemijske lastnosti mirtazapina
Farmakokinetika mirtazapina
Aplikacija je peroralna in absorpcija hitra ter zelo dobra (2). Hrana nima pomembnega vpliva na farmakokinetiko. Najvišjo plazemsko koncentracijo mirtazapin doseže dve uri po odmerjanju (2). Na plazemske proteine se veže nespecifično (21). Presnova poteka v jetrih in sicer z encimi CYP1A2, CYP2D6 in CYP3A4, ki jih mirtazapin tudi šibko inhibira. Glavne presnovne poti so 8-hidroksilacija s CYP2D6 in CYP1A2, ter N-oksidacija in N-demetilacija s CYP3A4, ki jim sledi konjugacija (2,21). V preglednici 7 so predstavljene farmakokinetične lastnosti mirtazapina.
Preglednica VII: Farmakokinetične lastnosti mirtazapina
Biološka uporabnost 50 % (2)
Volumen porazdelitve 107 ± 42 L (21)
Vezava na plazemske proteine 85 % (2)
Presnovki 8-hidroksimirtazapin in N-desmetilmirtazapin, ki izkazujeta šibko farmakološko aktivnost (2)
Razpolovni čas 16 – 40 ur (2)
Izločanje urin 75 %, blato 15 % (2)
Kemijska formula C17H19N3 (20) Molekulska masa 265,35 g/mol (20)
pKa Bazični center: 6,67 (2)
logP 2,75 (2)
Topnost v vodi 1,1 g/L (20)
6 1.1.2.4 SERTRALIN
Sertralin (slika 4) je selektivni inibitor presinaptičnega privzema serotonina. Kot vsi SSRI izkazuje tudi šibko zaviralno delovanje na privzem noradrenalina in dopamina (2). V preglednici 8 so predstavljene njegove fizikalno-kemijske lastnosti.
Preglednica VIII: Fizikalno - kemijske lastnosti sertralina
Kemijska formula C17H17Cl2N (22) Molekulska masa 306,2 g/mol (22)
pKa Bazični center: 9,85 (2)
logP 4,81 (2)
Topnost v vodi 3,8 mg/mL (22)
Farmakokinetika sertralina
Sertralin se aplicira peroralno pri čemer je absorpcija zelo dobra. Močno se veže na plazemske proteine in obsežno porazdeljuje po telesu. Biološka uporabnost je precej nizka, kar nakazuje na obsežen metabolizem prvega prehoda (2). Najvišjo plazemsko koncentracijo doseže v osmih do desetih urah po odmerjanju (23). Sertralin in presnovki se izločajo v materino mleko (2).
Najprej se presnovi do svojega glavnega metabolita N-desmetilsertralina v največji meri z encimom CYP2B6, v manjši meri pa tudi z CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 in CYP3A3, nato pa pri obeh pride do oksidativne deaminacije, hidroksilacije obroča in nato glukuronidne konjugacije z UGT1A1 (16). Sertralin je substrat prenašalca glikoproteina P (ABCB1) (16). V preglednici 9 so predstavljene farmakokinetične lastnosti sertralina.
Preglednica IX: Farmakokinetične lastnosti sertralina
Biološka uporabnost 20 – 36 % (2)
Volumen porazdelitve 17 (9-25) L/kg (2)
Vezava na plazemske proteine 98 % (2)
Presnovki N-desmetilsertralin (2)
Razpolovni čas 24 (19 – 37) (2)
Izločanje Urin: 51 – 60 %, blato: 24 – 31 % (2)
Slika 4: Strukturna formula sertralina
7 1.1.2.5 VENLAFAKSIN
Venlafaksin (slika 5) je zaviralec privzema serotonina in noradrenalina, pri čemer pa izkazuje tridesetkrat višjo selektivnost za zaviranje privzema serotonina kot noradrenalina (7). Selektivnost delovanja je odvisna tudi od odmerka in sicer je selektivni zaviralec privzema serotonina pri odmerkih 75 mg dan, pri odmerkih, ki so večji od 150 mg na dan, pa zavira privzem serotonina in noradrenalina (1). Pri visokih odmerkih pa naj bi deloval inhibitorno tudi na privzem dopamina (7). V preglednici 10 so predstavljene njegove fizikalno-kemijske lastnosti.
Preglednica X: Fizikalno - kemijske lastnosti venlafaksina
Kemijska formula C17H27NO2 (24) Molekulska masa 277,4 g/mol (24)
pKa Bazični center: 8,91 (2)
logP 2,91 (2)
Topnost v vodi 267 mg/L pri 25 °C (24)
Farmakokinetika venlafaksina
Absorpcija venlafaksina je hitra in obsežna, vendar podleže precej obsežnemu metabolizmu prvega prehoda (2). Najvišjo plazemsko koncentracijo doseže v dveh urah po odmerjanju (2).
Venslafaksin se na proteine veže v manjši meri, izloča pa se tudi v materino mleko (2). Presnova v glavnem poteka v jetrih z encimom CYP2D6, ki sodeluje pri presnovi venlafaksina v njegov glavni, farmakološko aktivni presnovek O-desmetilvenlafaksin (2). Poleg tega nastanejo v manjši meri tudi drugi presnovki po sekundarnih presnovnih poteh s CYP3A4, CYP2C9 in CYP2C19, kot so N-desmetilvenlafaksin in N,O-didesmetilvenlafaksin, ki nimajo farmakološkega učinka (1,2,16). Je substrat prenašalca glikoproteina P (ABCB1) (16).
V preglednici 11 so predstavljene farmakokinetične lastnosti venlafaksina.
Slika 5: Strukturna formula venlafaksina
8
Preglednica XI: Farmakokinetične lastnosti venlafaksina
Biološka uporabnost 45 % (2)
Volumen porazdelitve 6 – 7 L/kg (11)
Vezava na plazemske proteine 27 % (2)
Presnovki O-desmetilvenlafaksin (glavni), N-desmetilvenlafaksin, N,O- didesmetilvenlafaksin in drugi konjugirani presnovki (11)
Razpolovni čas izločanja 5 ur (2)
Izločanje urin: 87 % (2)
1.2 Optimizacija farmakoterapije s pomočjo terapevtskega spremljanja koncentracij zdravil
1.2.1 Terapevtsko spremljanje koncentracij zdravil
Prenašanje in učinkovitost terapije sta različna med posamezniki, saj na povezave med odmerkom, koncentracijo učinkovine v krvi v stacionarnem stanju in učinkom zdravljenja vpliva veliko dejavnikov, ki jih v grobem lahko razdelimo na genetske, fiziološke in okoljske (16). Za zmanjšanje teh razlik in težav lahko uporabimo individualni pristop k zdravljenju, katerega cilji so za posameznika prilagojeni zgodnje prepoznavanje, diagnostika, ovrednotenje tveganja ter režim terapije, ki bi izkazal najboljši odziv ter najmanj zapletov. To je koncept personalizirane medicine, ki predstavlja naslednji korak k zvišanju učinkovitosti in izboljšanju razmerja stroški-učinek zdravstvenega varstva (25,26). Orodja personalizirane medicine so farmakogenomika, različni vprašalniki, testi z napovedovalnimi biomarkerji in terapevtsko spremljanje koncentracij zdravil (angl. Therapeutic Drug Monitoring – TDM) (27,28).
TDM vključuje pridobivanje informacij o značilnostih bolnikov, meritve koncentracij zdravilne učinkovine v biološki tekočini, kvantifikacijo ter interpretacijo rezultatov. Namen je ustvariti personalizirani režim zdravljenja, ki bi zagotavljal najvišjo učinkovitost terapije in najmanj možnosti za pojav toksičnosti, neželenih učinkov ali recidiva (16,29). Uporabno je za zagotavljanje varnosti pri zdravilih z ozkim terapevtskim oknom ali pričakovanimi hujšimi neželenimi učinki (29), pri polifarmakoterapiji, pri vprašljivi adherenci, pričakovani spremenljivosti zaradi farmakokinetičnih nepravilnosti ali pri doživljanju neželenih učinkov (16).
9
1.2.2 Terapevtsko spremljanje koncentracij zdravil v nevropsihiatriji
Na področju nevropsihiatrije se TMD lahko uporablja za rutinsko nadzorovanje, pri čemer se titrira odmerke in ohranja ustrezne koncentracije učinkovine v krvi za preprečevanje recidiva bolezni, ali pa za reševanje specifičnih problemov, ki so ponavadi nezadosten odziv, neželeni učinki pri terapevtskih odmerkih, ali pa potencialne interakcije z drugimi zdravili (16).
Vzroki za inter- in intraindividualne razlike v odzivih in prenašaju terapije
Razlike v koncentracijah nevropsihofarmakov v krvi povzroča farmakokinetična variabilnost pri posamezniku in med posamezniki. Vzrok za to so lahko variabilnosti presnovnih encimov ali prenašalnih proteinov, ki jih povzročajo genetski polimorfizmi, fiziološki dejavniki, jetrne ali ledvične patologije, ali pa drugi dejavniki kot so ksenobiotiki, stresorji, hormoni, cigaretni dim in drugi, ki imajo vpliv na ekspresijo, inhibicijo ali indukcijo encimov in proteinov, ki vplivajo na farmakokinetiko učinkovine (16).
Razlike v odzivih na terapijo z nevropsihofarmaki so lahko tudi posledica razlik v farmakodinamičnih profilih. Te so lahko tudi posledica okoljskih ali fizioloških dejavnikov ali pa genetskih polimorfizmov, ki povzročajo razlike med posamezniki v interakcijah učinkovin z njihovimi tarčami, kot so prenašalni proteini, ionski kanalčki, receptorji, encimi ipd (16).
Potek terapevtskega spremljanja koncentracij zdravil v nevropsihiatriji
Standardni čas jemanja vzorca je tik pred aplikacijo naslednjega odmerka, ko so plazemske koncentracije v stacionarnem stanju. Tako pridobijo vrednosti, ki predstavljajo minimalne koncentracije (cmin), torej najnižje koncentracije v stacionarnem stanju. Nujni so interni standardi v vzorcih, ter interne in zunanje kontrole. Preferenčna analizna metoda je tekočinska kromatografija visoke zmogljivosti (HPLC) (16). Meritvam v laboratoriju sledi interpretacija rezultatov plazemskih koncentracij s parametri ter sprejemanje kliničnih odločitev, kot so sprememba odmerka, nadaljevanje s terapijo, sprememba zdravila ipd. Če so pri presnovi vpleteni encimi, za katere je znan polimorfizem, je lahko priporočena tudi genotipizacija (16).
Parametri za analizo rezultatov
Pri vodenju terapije z nevropsihofarmaki s TDM se določi, če se učinkovina v krvi nahaja v referenčnem terapevtskem območju. S tem se oceni, če se lahko pričakuje ustrezen odziv in prenašanje zdravila. Nato se oceni ostale, v nadaljevanju opisane parametre, ki se lahko
10
uporabijo za ovrednotenje ali je razlog za te dogodke slaba adherenca ali farmakokinetične spremembe oziroma nepravilnosti (16).
Na sliki 6 je prikazan plazemski profil hipotetičnega nevropsihofarmaka. Slika je povzeta po Hiemke et al. (16). Čeprav so maksimalne koncentracije v stacionarnem stanju izven terapevtskega območja, je učinkovina v ciljnem območju, saj so minimalne koncentracije v stacionarnem stanju v terapevtskem območju. Za večino nevropsihofarmakov so koncentracije, ki povzročajo večje tveganje za toksičnost, veliko višje od zgornje meje terapevtskega območja (16).
Referenčno terapevtsko območje (TRR) je interval, v
katerem si želimo, da bi se nahajala plazemska koncentracija učinkovine v stacionarnem stanju.
Kjer nosijo farmakološke učinke v večji meri tudi presnovki, se TRR nanaša na koncentracijo, ki je seštevek koncentracije učinkovine in njenega farmakološko aktivnega presnovka (16).
Za interpretacijo rezultatov se uporablja tudi referenčno območje, povezano z odmerkom (DRRR), ki prikaže kakšno korelacijo pričakujemo med izmerjeno koncentracijo učinkovine in pričakovanim območjem koncentracije učinkovine. S pomočjo tega parametra in odvzemom večih vzorcev čez dan lahko identificiramo razloge za odstopanja (16,30). Uporaba tega območja je farmakokinetični pristop, uporaba TRR pa farmakodinamični pristop za interpretacijo rezultatov (16).
Spodnja meja toksičnega območja je meja vrednosti plazemskih koncentracij učinkovine, nad katero je znatno večja verjetnost za pojav neželenih učinkov (16).
Razmerje med koncentracijo in odmerkom (Cmin/D) je razmerje med minimalno koncentracijo in odmerkom. Visoka vrednost tega kaže na počasen celokupni očistek in obratno (16).
Razmerje med presnovki in učinkovino (MPR) je razmerje med koncentracijo aktivnega presnovka in koncentracijo učinkovine. S tem parametrom lahko ocenimo kako aktivni so določeni presnavljalni encimi (16).
Slika 6: Plazemski profil hipotetičnega nevropsihofarmaka, apliciranega peroralno
11
V preglednici 12 so prikazani nekateri parametri, navedeni v smernicah (16), za kvantifikacijo in interpretacijo rezultatov terapevtskega spremljanja koncentracij za učinkovine, ki so naši izbrani analiti.
Preglednica XII: Vrednosti parametrov za kvantifikacijo in interpretacijo rezultatov TDM za analite
Učinkovina in aktivni
metaboliti DE DU MI SE VE in DE
Referenčno terapevtsko
območje v krvi [ng/ml] 100 – 400 30 – 120 30 – 80 10 – 150 100 – 400 Spodnja meja toksičnega
območja [ng/ml] 800 240 160 300 800
Razmerje med metabolitom in
učinkovino [/] / / 0,2 – 1,2 1,7 – 3,4 2,7 – 7,7
*DE = desvenlafaksin; DU = duloksetin; MI = mirtazapin; SE = sertralin; VE = venlafaksin
Za venlafaksin lahko glede na podatek v smernicah, da je razmerje med metabolitom in učinkovino 2,7 – 7,7 (16) izračunamo, da je referenčno terapevtsko območje za venlafaksin 10 – 350 ng/mL.
1.3 Pregled literature na področju analitike desvenlafaksina, duloksetina, mirtazapina, sertralina in venlafaksina
V literaturi so izbrane analite analizirali iz vzorcev plazme ali seruma, Meineke et al. so razvili metodo, ki je uporabna tudi za analizo urina (31), Berm et al. pa so uporabili posušene krvne madeže (32). Pri pripravi delovnih raztopin so kot topilo najpogosteje uporabljali metanol.
Vzorce za analizo so večinoma pripravljali z ekstrakcijo tekoče-tekoče (33–44) ali z ekstrakcijo na trdnih nosilcih (45–54). Poleg tega so uporabljali tudi ekstracije tekoče-trdno (31) in čiščenje centrifugiranega vzorca plazme na posebnih kolonah (55).
Pri ekstrakciji tekoče-tekoče so plazemske vzorce pripravili tako, da so jih naalkalili in dodali interne standarde, ki so predstavljeni v preglednici 13. Malfará et al. so vzorcem dodali še NaCl (33). Pripravljenim plazemskim vzorcem so dodali ekstrakcijsko topilo in sicer izoamilni alkohol:heksan 1:99 (v/v) (33,35,37,41), izoamilni alkohol:heksan 2:98 (v/v) (34), izoamilni alkohol:heksan 7,5:92,5 (v/v) (38), etilacetat (36), izopropanol:heksan 1:99 (v/v) (39), etilacetat:heksan 1:9 (v/v) (40), heksan (42) ali metil terc-butil eter (43). Vzorce so stresali 10 ali 15 minut in centrifugirali. Nato so odvzete organske faze posušili in raztopili suhi ostanek.
12
Tako so dobili vzorce, pripravljene za injiciranje v kromatografski sistem. Malfará et al. so po ekstrakciji in raztapljanju suhega preostanka dodali heksan, stresali in injicirali vodno fazo z namenom očiščenja biološkega vzorca (33). Nekateri pa tekočega vzorca po ekstrakciji niso sušili, ampak so izvedli t.i. dvojno ekstrakcijo, saj so po prvi ekstrakciji organski fazi dodali kislino, ponovno stresali in centrifugirali, ter injicirali vodno fazo (34,35,37,38,41).
Za ločevanje analitov so večinoma uporabljali tekočinsko kromatografijo visoke zmogljivosti (HPLC), ostale v literaturi predstavljene metode pa so še UFLC (54) in UHPLC (56–58).
Analite so detektirali z ultravijoličnim detektorjem (UV) (33–35,37,39,41,43,46–48,55), fluorescenčnim detektorjem (FLD) (36,38,40,42,44,49,53), masnim spektrometrom (MS) (54,57–66) in tudi z elektrokemičnim detektorjem (50).
Pregled člankov, kjer so analite pridobili z ekstrakcijo tekoče-tekoče (LLE), za ločevalno tehniko uporabili HPLC in za detekcijo UV ali FLD, je v preglednici 13.
13
Preglednica XIII: Pregled raziskav na področju analitike preiskovanih analitov z ekstrakcijo tekoče-tekoče in analizo s HPLC
Članek Ana-
liti IS Priprava vzorca
Pretok MF [mL
/ min]
Mobilna faza Kolona Detekcija [nm]
Malfará, 2007 (33)
DU, MI,
SE
etido- kain
1 mL plazme (pl.) + 25 µL IS + 200 mg NaCl + 50 µL NaOH 1,5 M + 5 mL heksan:izoamilni alkohol (99:1, v/v);
mešanje, centrifugiranje, sušenje, raztapljanje preostanka s 150 µL MF in 100
µL heksana, vorteks 10 s; injiciranje 100 µL MF
1,0
35 % ACN:
metanol (92:8, v/v) in 65 % 0,25 M Na-
acetat pufer (pH 4,5) izokratsko
LiChro- spher 60 RP-select B
UV (230)
Duverneuil, 2003 (34)
DE, MI, SE, VE
protri- ptilin
1 mL pl. + 50 µL IS + 200 µL NaOH 2M + 7 mL heksan:izoamilni alkohol (98:2, v/v);
stres., centr.; OF + 200 µL 0,01 M HCl;
str., cen.; inj. 60 µL
1,0
ACN - fosfatni pufer pH 3,8,
gradientno
Hypurity C18 (ThermoHy
persil)
UV (V, DE in S
– 220;
M - 290) Titier, 2003
(35)
DE, MI, SE, VE
F 2570
1 mL pl. + 100 µL IS + 200 µL NaOH 0,1 N + 7 mL heksan:izoamilni alkohol (99:1, v/v); stresanje, centr.; OF + 200 µL HCl
0,05 N; stres., centr.; inj. 100 µL VF
1,0
ACN - fosfatni pufer, pH 3,8;
gradientno nato izokratsko
Symmetry C8
UV (230 in 290)
Ardakani, 2010 (36)
DE, VE
O-des- metil- dehidro-
venla faksin
200 µL pl. + 50 µL IS + 50 uL 2M NaOH + 1,2 mL etilacetat; str., centr., suš., raztapljanje preos. s 120 µL MF; injiciranje
100 µL
2,0
Metanol/voda (35:65, v/v); pH
2,5; izokr.
Chromolith TM Performanc
e RP-18e
FLD (eks.
200, emis.
300)
Matoga, 2001 (37)
DE, VE
opi- pramol
1 mL pl. + 50 µL IS + 200 µL 0,1 M
NaOH + 7 mL heksan:izoamilni alkohol 1,4 ACN / fosfatni pufer (30:70); +
Spherisorb
S5 C8 UV (229)
14 (99:1, v/v); str., centr.; OF + 200 µL 0,05 M
HCl, mešanje, centr.; injic. 25 µL VF
500 µL dietil- amina; pH 5,5
Vu, 1997 (38)
DE, VE
mapro- tilin
1 mL pl. + 50 µL IS + 400 µL bikar. pufra (0,7 M, pH 9,7); mešanje + 1,5 mL 7,5 % izoamilni alk.v heksanu; stres., centr.; OF +
200 µL 0,05% H3PO4; meš.; injic. 100 µL VF
1,5
ACN / Na- fosfatni pufer (pH
6,8; 50:50, v/v)
MetaChem Technologi
es C4/E column
FLD (eks.
276, emis.
598)
Kaza, 2014
(39) DU fluok-
setin
1 mL pl. + IS + 100 µL 0,25 M Na2CO3; + 3 mL heksan:izopropanol (99:1, v/v); meš., centr., zamrznitev; suš. OF, raztap. pr. v
metanol/fosfat pH 3.0 (3:2, v/v)
1,0
NaH2PO4 pufer pH 3,0 in ACN (62:38, v/v),
izokratsko
Orbit 100
C18 UV (230)
Wald- schmitt, 2007 (55)
DU venla- faksin
Centr. plazme, 99 µL supernatanta + 1 µL IS v čistilno kolono – spiranje z deionizirano vodo z 8 % (v/v) ACN (0,8
mL/min, 6 min)
1,25
ACN / voda / KH2PO4x3H2O pufer (50:50), pH
6,4; izokr.
Kolona polnjena z LiChrosphe r 100 CN
UV (218)
Lavasani,
2014 (40) MI zolpi- dem
150 μL pl. + 50 µL IS + 50 µL NaOH (1 N) + 1,5 mL heksan:etilacetat (90:10, v/v);
str., centr., sušenje, raztapljanje preos. v 150 μL MF; inji 100 μL
2
ACN / KH2PO4
pufer (pH 3) (20:80, v/v), izokratsko
Chromolith TM Performanc
e RP-18e
FLD (eks.
290, emis.
370)
Romi- guieres, 2002
(41)
MI opi- pramol
1 mL pl. + 100 µL IS + 200 µL 0,1 M NaOH + 7 mL heksan:izoamilni alkohol (99:1, v/v); str., centr.; OF + 200 µL 0,05 M
HCl, stresanje, centr.; injiciranje 40 µL
0,8
ACN / fosfatni pufer (30/70, v/v),
izokratsko
XTerra MS
C18 UV (294)
Maris, 1999
(42) MI
izomer mirta- zapina
1 mL pl. + 20 µL IS, mešanje, + 50 µL 25
% v. razt. NH3, meš.; + 3 mL n-heksana;
mešanje, centr.; OF + 50 uL vod.raz.
amonijaka + 3 mL n-heksana, meš., centr.;
1,7
amonijev acetat, ACN; izokratsko,
gradientno, spet izokratsko
µBondapak Phenyl
FLD (eks.
290, emis.
350)
15 suš. OF, raztaplj.s 200 µL n-heksana, suš.,
razt. v 50 µL izopropanola; injic. 5 µL Patel, 1996
(43) SE fene-
tazin
200 µL pl. + 20 µL IS + 100 µL Tris pufra (2 M, pH 10,6); meš; + 200 µL MTBE;
meš., centr.; inj. 100 µL
1,2
Metanol / voda (19:1), vsebuje NH4ClO4 pH 7,0
Spherisorb
S5SCX UV (215)
16
2 NAMEN DELA
Pri zdravljenju z antidepresivi je priporočeno nadzorovanje terapije s terapevtskim spremljanjem koncentracij zdravil, da bi se lahko v čim večji meri izognili neželenim učinkom terapije, recidivu, nezadostnemu odzivu na terapijo, ali da bi lahko spremljali adherenco bolnikov.
V ta namen želimo razviti in validirati metodo, s katero bi lahko sočasno iz plazemskih vzorcev določili koncentracije antidepresivov desvenlafaksina, duloksetina, mirtazapina, sertralina in venlafaksina. Metoda bo temeljila na pripravi vzorcev z ekstrakcijo tekoče-tekoče (LLE) in sušenjem ter raztapljanjem suhega preostanka. Pripravljene vzorce bomo analizirali na HPLC z UV-VIS in FLD detektorji. Iz že obstoječih metod iz literature, kjer so analizirali omenjene antidepresive s pripravo z LLE in analizo na HPLC, bomo zastavili izhodiščno metodo in jo nato optimizirali. Optimizirali bomo proces ekstrakcije in sušenja ter kromatografsko metodo z izbiro ustrezne mobilne in stacionarne faze, pretoka, gradienta, temperature in valovnih dolžin detektorja.
Razvito metodo bomo na koncu validirali po smernicah Evropske agencije za zdravila, da bi ovrednotili točnost, natančnost, območje linearnosti in selektivnost metode. Določili bomo mejo kvantifikacije LLOQ in stabilnost vzorcev v avtomatskem vzorčevalniku. Ovrednotili bomo tudi učinkovitost ekstrakcije z določanjem izkoristka ekstrakcije.
17
3 MATERIALI
3.1 Biološki material
Pri delu smo uporabljali humano plazmo, ki smo jo pridobili z Zavoda Republike Slovenije za transfuzijsko medicino. Plazma je bila odvzeta z vakuumskimi epruvetami z dodanim EDTA kot antikoagulantom. Shranjevali smo jo pri -20 °C. Pred delom smo vsak dan vzeli svež, zamrznjen alikvot ter počakali, da se je plazma odtalila in segrela na sobno temperaturo, ter jo premešali.
3.2 Standardi
Uporabljeni standardi analitov in internega standarda so prikazani v preglednici 14.
Preglednica XIV: Uporabljeni standardi
Kemikalija Formula M [g/mol] Proizvajalec
D,L-O-Desmetil venlafaksin C16H25NO2 269,418 Carbosynth Limited, Compton, Berkshire, UK Duloksetin hidroklorid C18H20ClNOS 333,874 Carbosynth Limited,
Compton, Berkshire, UK Mirtazapin C17H19N3 265,36 Carbosynth Limited,
Compton, Berkshire, UK Paroksetin hidroklorid
hemihidrat C38H44Cl2F2N2O7 749,674 Carbosynth Limited, Compton, Berkshire, UK Sertralin hidroklorid C17H18Cl3N 342,688 Carbosynth Limited,
Compton, Berkshire, UK D,L-Venlafaksin hidroklorid C17H28ClNO2 313,866 Carbosynth Limited,
Compton, Berkshire, UK
3.3 Reagenti in topila
Preglednica XV: Uporabljeni reagenti in topila
Reagent/ topilo Proizvajalec
1 M raztopina natrijevega hidroksida NaOH Titrisol® Merck KGaA, Darmstadt, Germany Acetonitrile (C2H3N) CHROMASOLV™, for HPLC,
gradient grade, ≥ 99,9 %; M= 41,05 g/mol
Honeywell Riedel-de Haën™, Steinheim, Germany
18 Bidestilirana voda (pridobljena z aparatom Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System (Millipore, Bedford, ZDA); specifična upornost > 18,2 mΩcm, celokupni organski ogljik < 6 ppb, pri 25 °C)
Fakulteta za farmacijo, Ljubljana
Certipur® buffer solution (citric acid/ sodium hydroxide/ hydrogen chloride) (standardna pufrska raztopina s pH=4), traceable to SRM from MIST and PTB, pH = 4,00 (20 °C)
Merck, Darmstadt, Germany
Cikloheksan pro analysi (C6H12), M= 84,16 g/mol Kemika, Zagreb, Croatia EMSURE® Diethyl ether for analysis, ACS, ISO,
Reag. Ph Eur; M= 74,12 g/mol
Merck KGaA, Darmstadt, Germany
EMSURE® Isoamyl alcohol, ACS, ISO, Reag. Ph Eur; M= 88,15 g/mol
Merck KGaA, Darmstadt, Germany
Ethyl acetate (C4H8O2), ≥ 99,9 % Honeywell Riedel-de Haën™, Steinheim, Germany
Methanol (CH4O) CHROMASOLV™, for HPLC, ≥ 99,9 %; M = 32,04 g/mol
Honeywell Riedel-de Haën™, Steinheim, Germany
n-Hexane, ChromasolvTM, for HPLC, ≥ 97,0 % Honeywell Riedel-de Haën™, Steinheim, Germany
Ortho-Phosphoric acid 85 % EMSURE® (orto- fosforna kislina), ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Merck KGaA, Darmstadt, Germany
Potassium dihydrogen phosphate for analysis KH2PO4, 136,086 g/mol
Merck, Darmstadt, Germany Sodium hydroxide pellets for analysis NaOH, 40,00
g/mol
Merck, Darmstadt, Germany
Stisnjen dušik N2 za prepihavanje Messer, Ruše, Slovenija Tert-Buthyl methyl ether (C5H12O), HPLC grade, for
HPLC, 99,8 %; M= 88,15 g/mol
Sigma- Aldrich, Steinheim, Germany
3.4 Naprave in pribor
• Analitična tehtnica AG245 (Mettler Toledo, Schwarzenbach, Švica)
• Analitična tehtnica XPE105 (Mettler Toledo, Schwarzenbach, Švica)
• Celulozno acetatni filter 0,45 µm (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen, Nemčija)
• Centrifuga Centric 322A (Tehtnica®, Železniki, Slovenija)
• Centrifuga Eppendorf 5415R (Eppendorf research, Hamburg, Nemčija)
19
• Hladilnik 5 °C z zamrzovalnikom -20 °C (Gorenje, Velenje, Slovenija)
• HPLC kolona: Luna® 5 µm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm (Phenomenex®, Torrance, Kalifornija, ZDA)
• HPLC kolona: ZORBAX Eclipse, XDB – C8, 80Å, 5 µm, 4,6 x 150 mm (Agilent®, Santa Clara, Kalifornija, ZDA)
• HPLC kolona: ZORBAX Eclipse, XDB-C18, 80Å, 5 µm, 4,6 x 150 mm (Agilent®, Santa Clara, Kalifornija, ZDA)
• HPLC sistem Agilent 1100 series z UV in FLD detektorjem (Agilent technologies, Santa Clara, Kalifornija, ZDA)
• Magnetno mešalo HI 190M (Hanna instruments, Koper, Slovenija)
• pH meter MA 5750 (Iskra, Kranj, Slovenija)
• Plastične epruvete 1,5, 2 in 4 ml (Eppendorf research, Hamburg, Nemčija)
• Polavtomatske pipete 20 - 200 μl, 100 - 1000 μl in 1 - 10 ml (Eppendorf research, Hamburg, Nemčija)
• Predkolona za HPLC: Phenomenex® 4 × 3 mm C18 (Phenomenex®, Torrance, Kalifornija, ZDA)
• Stresalnik VibroMix 403 EVT (Tehtnica®, Železniki, Slovenija)
• Turbovap®LV (Caliper, Hopkinton-MA, ZDA)
• Ultrazvočna kadička BANDELIN SONOREX (Bandelin electronic, Berlin, Nemčija)
• Ultrazvočna kadička SONIS 4 (Iskra, Kranj, Slovenija)
• Vibromix 10 mešalo na ekscenter (Tehtnica®, Železniki, Slovenija)
• Zamrzovalnik (T = -20 °C) (Gorenje, Velenje, Slovenija)
• Stekleni inventar: merilne bučke, merilni valji, čaše, 1000 mL in 2000 mL steklenice, presejalna buča in lij za presejalno bučo.
• Ostali inventar: nastavki za pipete za 20 – 200 μl, 100 - 1000 μl in 1 - 10 ml pipete, spatule, lateks rokavice, Parafilm®M, komplet za filtriranje, dimna omara, magneti in magnetna palica za odstranjevanje.
