UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
NINA SOBOČAN (GRABNER)
NAPOVEDNA VREDNOST MERITEV CELOKUPNEGA HEMOSTATSKEGA POTENCIALA IN SPREMLJANJA TVORJENJA TROMBINA ZA POGOSTOST
RESTENOZE PO ANGIOPLASTIKI STEGENSKE ARTERIJE
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
NINA SOBOČAN (GRABNER)
NAPOVEDNA VREDNOST MERITEV CELOKUPNEGA HEMOSTATSKEGA POTENCIALA IN SPREMLJANJA TVORJENJA TROMBINA ZA POGOSTOST
RESTENOZE PO ANGIOPLASTIKI STEGENSKE ARTERIJE
USING OVERALL HEMOSTATIC POTENTIAL AND THROMBIN GENERATION ASSAY FOR PREDICTING PREVALANCE OF RESTENOSIS
AFTER FEMORAL ARTERY ANGIOPLASTY
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
Ljubljana, 2021
Magistrsko nalogo sem opravljala v Laboratoriju za hemostazo in aterotrombozo na Kliničnem oddelku za žilne bolezni, Univerzitetni klinični center Ljubljana, pod mentorstvom doc. dr. Mojce Božič Mijovski, spec. med. biokem.
Zahvala
Posebna zahvala gre mentorici, doc. dr. Mojci Božič Mijovski, spec. med. biokem., za vso strokovno pomoč in vodenje pri izvajanju raziskovalnega dela ter za vse usmeritve in koristne nasvete pri pisanju naloge. Zahvaljujem se tudi celotnemu kolektivu Laboratorija za hemostazo in aterotrombozo, ki so mi omogočili izvedbo praktičnega dela naloge.
Zahvalila bi se še vsem prostovoljcem, ki so darovali kri in pripomogli k oblikovanju skupine kontrolnih vzorcev v raziskavi.
Na koncu se zahvaljujem še vsem prijateljem, ki so me spremljali ob študiju, družini, ki mi je študij omogočila, in Blažu, ki je bil ves čas moja opora.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko delo samostojno izdelala pod vodstvom mentorice doc. dr.
Mojce Božič Mijovski, spec. med. biokem.
Naloga je del raziskovalnega programa Ateroskleroza in tromboza pod vodstvom Mirze Šabović.
Nina Sobočan
I
VSEBINA
VSEBINA ... I KAZALO SLIK ... III KAZALO TABEL ... IV KAZALO ENAČB ... IV POVZETEK ... V ABSTRACT ... VI SEZNAM OKRAJŠAV ... VII
1 UVOD ... 1
1.1 HEMOSTAZA ... 1
1.1.1 Fiziologija koagulacije krvi ... 1
1.1.2 Vloga mikrodelcev pri koagulaciji krvi ... 4
1.1.3 Fibrinoliza ... 5
1.2 MOTNJE HEMOSTAZE POVEZANE S TROMBOZO ... 6
1.3 MEHANIZEM NASTANKA TROMBOZE V ARTERIJAH ... 7
1.4 PERKUTANA TRANSLUMINALNA ANGIOPLASTIKA STEGENSKE ARTERIJE ... 8
1.5 RESTENOZA IN REOKLUZIJA PO PERKUTANI TRANSLUMINALNI ANGIOPLASTIKI ... 8
1.6 LABORATORIJSKE PREISKAVE ZA OCENO HIPERKOAGULABILNOSTI……….10
1.6.1 Celokupni hemostatski potencial ... 11
1.6.2 Spremljanje tvorjenja trombina ... 12
1.6.3 D-dimer ... 14
1.6.4 Fibrinogen ... 15
II
2 NAMEN DELA IN HIPOTEZE ... 16
3 PREISKOVANCI IN METODE ... 17
3.1 PREISKOVANCI ... 17
3.2 ODVZEM KRVI IN PRIPRAVA PLAZME ... 17
3.3 CELOKUPNI HEMOSTATSKI POTENCIAL ... 18
3.4 SPREMLJANJE TVORJENJA TROMBINA ... 21
3.5 KONCENTRACIJA D-DIMERA IN FIBRINOGENA ... 25
3.6 STATISTIČNA OBDELAVA PODATKOV ... 26
4 REZULTATI ... 28
4.1 ZNAČILNOSTI BOLNIKOV ... 28
4.2 OCENA PONOVLJIVOSTI GLOBALNIH KOAGULACIJSKIH PREISKAV………...29
4.3 VPLIV POSEGA NA PREISKAVE HEMOSTAZE ... 30
4.3.1 Pojav restenoze pri bolnikih po opravljeni perkutani transluminalni angioplastiki ... 32
4.3.2 Spremembe v hemostazi glede na čas nastanka restenoze ... 32
4.4 POVEZAVE MED SPREMENLJIVKAMI HEMOSTAZE ... 37
4.5 Multivariatna analiza ... 39
5 RAZPRAVA ... 42
6 SKLEP ... 48
7 LITERATURA ... 50
III
KAZALO SLIK
Slika 1: Proces hemostaze na ravni interakcije beljakovin s prikazom vseh treh poti koagulacije, fibrinolize in delovanja naravnih antikoagulantov ... 3 Slika 2: Vloga tkivnega faktorja pri aktivaciji tarčnih celic. ... 4 Slika 3: Celokupni hemostatski potencial (CHP), celokupni koagulacijski potencial (CKP) in celokupni fibrinolitični potencial (CFP) ... 11 Slika 4: Prikaz parametrov trombograma (A – faza mirovanja, B – trombinski vrh, C – čas do trombinskega vrha, D – endogeni trombinski potencial) ... 13 Slika 5: Prikaz nanosa vzorcev na mikrotitrsko ploščo ... 19 Slika 6: Prikaz nanosa vzorcev na mikrotitrsko ploščo ... 24 Slika 9: Prikaz korelacije med koncentracijo fibrinogena in celokupnim koagulacijskim potencialom (CKP) pred PTA. ... 37 Slika 10: Prikaz korelacije med koncentracijo fibrinogena in celokupnim koagulacijskim potencialom (CKP) po PTA. ... 37
IV
KAZALO TABEL
Preglednica I: Značilnosti bolnikov s prehodnimi arterijami in restenozo ... 28
Preglednica II: Koeficient variacije (%) za CHP in STT znotraj serij in med serijami ter celokupen koeficient variacije (%) ... 30
Preglednica III: Primerjava parametrov pred in po posegu ... 31
Preglednica IV: Število bolnikov s prehodnimi arterijami in restenozo v času ... 32
Preglednica V: Rezultati preiskav hemostaze (1 mesec po PTA) ... 33
Preglednica VI: Rezultati preiskav hemostaze (6 mesecev po PTA) ... 34
Preglednica VII: Rezultati preiskav hemostaze (12 mesecev po PTA) ... 35
Preglednica VIII: Pregled medsebojnih povezav med metodama STT in CHP (plazma odvzeta pred PTA) ... 38
Preglednica IX: Pregled medsebojnih povezav med metodama STT in CHP (plazma odvzeta po PTA) ... 39
Preglednica X: Pregled variabilnosti v odvisni spremenljivki ... 40
Preglednica XI: Prikaz občutljivosti, specifičnosti in napovedne vrednosti CHP in STT. . 41
KAZALO ENAČB
Enačba 1……….21Enačba 2……….25
Enačba 3……….26
V
POVZETEK
Perkutana transluminalna angioplastika je minimalno invaziven postopek za ponovno vzpostavitev pretoka krvi skozi zožano ali zamašeno arterijo. Gre za varno in tehnično zelo uspešno metodo. Glavno omejitev predstavlja ponovna zožitev žilne svetline (restenoza), ki se v šestih do dvanajstih mesecih pojavi pri 40 do 60 % bolnikov. Z dobrim poznavanjem kazalnikov tveganja za restenozo lahko pri bolnikih njihovo tveganje za restenozo napovemo. Ob izvedbi angioplastike pogosto pride do poškodbe žilne stene, ki ima zelo pomembno vlogo v hemostazi. Iz tega sklepamo, da ima hemostaza pomembno vlogo pri nastanku restenoze po angioplastiki. V okviru magistrske naloge smo želeli s pomočjo globalnih preiskav hemostaze oceniti povezavo med hemostazo in restenozo.
Preučevali smo naslednjo hipotezo: bolniki z restenozo dvanajst mesecev po perkutani transluminalni angioplastiki so imeli dan pred in takoj po posegu pomembno spremenjen celokupni koagulacijski potencial ter hiperkoagulabilni trombogram.
V ta namen smo analizirali plazmo bolnikov odvzeto pred in po perkutani transluminalni angioplastiki. Bolnikom razdeljenim v dve skupini (bolniki s prehodnimi arterijami in bolniki z restenozo) smo z uporabo dveh metod (celokupni hemostatski potencial in spremljanje tvorjenja trombina) določili parametre za oceno hemostatskega ravnovesja.
Testiranje hipoteze je pokazalo, da lahko s spremljanjem tvorbe trombina pomembno razlikujemo med bolniki s prehodnimi arterijami in bolniki z restenozo, saj so imeli slednji daljšo fazo mirovanja in daljši čas do dosega maksimalne koncentracije trombina. Metoda celokupnega hemostatskega potenciala ni razlikovala med bolniki z restenozo in bolniki s prehodnimi arterijami. Z regresijo smo za vse spremenljivke spremljanja tvorjenja trombina določili neodvisno povezavo z restenozo. Z večjim tveganjem za restenozo povezujemo daljšo fazo mirovanja, povečan endogeni trombinski potencial, povečano maksimalno koncentracijo trombina in daljši čas do dosega trombinskega vrha. Celokupni hemostatski potencial v nobeni od spremenljivk ni bil neodvisno povezan z restenozo. Pri tem smo ugotovili, da ima spremljanje tvorjenja trombina dobro napovedno vrednost za restenozo, medtem ko se celokupni hemostatski potencial ni izkazal kot dober kazalnik.
Ključne besede: celokupni hemostatski potencial, hemostaza, perkutana transluminalna angioplastika, restenoza, spremljanje tvorjenja trombina
VI
ABSTRACT
Percutaneous transluminal angioplasty is a minimally invasive procedure for repeated establishment of blood flow through occluded or stenosed arteries. It is a safe and technically very successful method. The main limitation is the re-narrowing of the lumen (restenosis), which occurs in 40 to 60 % of patients within six to 12 months. With a good knowledge of restenosis risk indicators, we can predict prevalence of restenosis. When angioplasty is performed, the vascular wall, which plays a very important role in haemostasis, is often damaged. This suggests that haemostasis plays an important role in the development of restenosis after angioplasty. Therefore, the aim of this thesis was to investigate the relationship between haemostasis and restenosis using two global haemostasis tests (overall haemostatic potential and thrombin generation assay).
We tested the following hypothesis: patients who develop restenosis within 12 months after angioplasty have had significantly altered overall coagulation potential and hypercoagulable thrombogram before and after the procedure.
Patients plasma was analysed before and after percutaneous transluminal angioplasty.
Alterations in haemostasis were detected by measuring overall haemostatic potential, thrombin generation, D-dimer and fibrinogen levels. Haemostasis tests results were compared with the prevalence of restenosis after angioplasty. Hypothesis testing of the difference between the two samples showed that thrombin generation significantly differentiated between subjects who developed restenosis and those who did not. Subjects who developed restenosis had a longer lag time and time to peak. There was no significant difference in overall haemostatic potential. Using regression, we demonstrated an independent association with restenosis for all angioplasty variables. Prolonged lag time and time to peak and increased endogenous thrombin potential and peak height are associated with a higher risk of restenosis. Overall haemostatic potential was not independently associated with restenosis in any of the variables. We found that thrombin generation assay has a fairly good predictive value for restenosis, while the overall haemostatic potential method did not prove to be a good indicator.
Key words: hemostasis, overall hemostatic potential, percutaneous transluminal angioplasty, restenosis, thrombine generation assay
VII
SEZNAM OKRAJŠAV
CFP celokupni fibrinolitični potencial CHP celokupni hemostatski potencial CKP celokupni koagulacijski potencial ETP endogeni trombinski potencial FI faktor I (fibrinogen)
FII faktor II (protrombin)
FV faktor V
FVII faktor VII FVIII faktor VIII FIX faktor IX
FX faktor X
FXII faktor XII FXIII faktor XIII GI gleženjski indeks
NZP normalna zmesna plazma PBM plazma brez mikrodelcev
PPP plazma revna s trombociti (platelet poor plasma) PTA perkutana transluminalna angioplastika
STT spremljanje tvorjenja trombina tPA tkivni aktivator plazminogena
TTP čas do maksimalne plazemske koncentracije trombina (time to peak) UZ1 ultrazvočni pregled po 1 mesecu
UZ6 ultrazvočni pregled po 6 mesecih UZ12 ultrazvočni pregled po 12 mesecih
1
1 UVOD
1.1 HEMOSTAZA
Hemostaza je skupek procesov, ki z natančnim uravnavanjem in hitrim odzivom v normalnih razmerah ohranja kri tekočo. Hkrati pa omogoča, da se ob poškodbi kri čimprej strdi in prepreči krvavitve (1). In vivo se hemostaza doseže z ravnovesjem med nalepljanjem in agregacijo trombocitov na žilnem endoteliju ter aktivacijo koagulacijske kaskade na eni in fibrinolitičnimi ter antikoagulantnimi mehanizmi na drugi strani. Občutljivo ravnovesje med različnimi hemostatskimi komponentami omogoča normalno hemostazo, preprečuje trombozo v nepoškodovanih delih žil ter ob poškodbah žil prekine krvavitev (2).
Uravnavanje hemostaze poteka na površini trombocitov, endotelijskih celic in subendotelija, ne poteka pa v tekoči krvi (3). V procesu hemostaze sodelujejo trombociti, koagulacijske in fibrinolitične beljakovine, inhibitorji koagulacije in fibrinolize ter žilna stena (4). Za lažje razumevanje procesa hemostazo delimo na primarno in sekundarno (1). Primarna in sekundarna hemostaza se ob poškodbi žile sprožita hkrati, potekata pa različno hitro.
Primarno hemostazo delimo na žilno in trombocitno fazo, sekundarno hemostazo pa na proces koagulacije in proces razgradnje fibrina (fibrinoliza). Tako primarna kot sekundarna hemostaza sta pozitivni povratni zanki, ki se medsebojno pospešujeta (5).
1.1.1 Fiziologija koagulacije krvi
Klasični model koagulacije razdeli hemostazo na intrinzično, ekstrinzično in skupno pot koagulacije. Je zelo uporaben koncept za vrednotenje testov hemostaze in vitro, ne predstavi pa fiziološke koagulacije (6). Novejši pristop za vrednotenje testov je celični model koagulacije, kjer imajo poleg faktorjev koagulacije in njihovih inhibitorjev pomembno vlogo tudi celični elementi krvi in endotelijske celice (1). Model na celični osnovi predstavlja velik napredek pri opisovanju hemostaze in vivo, prispevek dodatnih celičnih elementov se intenzivno raziskuje (7).
Ob poškodbi žile se sproži koagulacija krvi, v nekaj sekundah na mestu žilne poškodbe nastane strdek (1). Takoj po poškodbi pride do izločanja vazokonstriktornih snovi iz živčnih končičev in endotelijskih celic. Povečanje tonusa gladke mišičnine v žilni steni
2
(vazokonstrikcija) povzroči zoženje žil, kar lahko začasno zaustavi krvavitev in tako podpre druge procese hemostaze (5).
Notranjo vezivno plast žilne stene sestavljata plast endotelijskih celic na bazalni membrani ter glikoproteinski plašč na površini endotelijskih celic. V nepoškodovani žili glikoproteinski plašč z vsebnostjo inhibitorjev koagulacije določa, da površina ni trombogena. Ob poškodbi žilne stene je ta plast prekinjena, izpostavljene so trombogene molekule subendotelijske plasti (kolagen, von Willebrandov faktor, tkivni faktor in drugi proteini) (1).
Plazemske membrane celic vsebujejo različne vrste fosfolipidov. Na zunanji strani membranskega dvosloja so prisotni nenabiti fosfolipidi, notranja stran pa vsebuje negativno nabite fosfolipide (npr. fosfatidilserin). Močna stimulacija trombocitov s trombinom in kolagenom povzroči prokoagulacijsko aktivnost fosfatidilserina. Izpostavljeni fosfatidilserin predstavlja veliko območje za sprožitev koagulacijske kaskade, ki povzroči izbruh trombina (8).
Izpostavljenost kolagena povzroči vezavo von Willebrandovega faktorja na trombocitni receptor glikoprotein Ib in vodi v aktivacijo trombocitov. Preko pozitivnih povratnih zank se število aktiviranih trombocitov povečuje (9). Aktivirani trombociti se začnejo sprijemati med seboj, kar imenujemo agregacija. Pri tem nastane plast trombocitov, sprijetih na mestu poškodbe, kar imenujemo trombocitni čep (5).
Tekoča kri v normalnih razmerah nikoli ni izpostavljena tkivnemu faktorju, saj je tkivni faktor transmembranska molekula na površini celic. Pri poškodbi se kri izlije iz žile in pride v stik s tkivnim faktorjem, kar sproži koagulacijsko kaskado (10). Tkivni faktor tvori kompleks s FVII, ki pod vplivom učinkovanja proteinaz preide v aktivno obliko FVIIa.
Aktivirani kompleks tkivni faktor-VIIa v prisotnosti FV, ki se izloča iz trombocitnih zrnc α, aktivira FIX v FIXa in FX v FXa (4). Nastali FIXa skupaj s kofaktorjem VIIIa pretvori FX v FXa. Medtem ko je kompleks tkivni faktor-VIIa pomemben začetni korak za aktivacijo FXa, pozneje prevlada aktivacija FXa preko FIXa. FXa se nadalje veže s kofaktorjem Va in skupaj s protrombinom tvori protrombinazni kompleks. Protrombinazni kompleks v prisotnosti Ca2+ in fosfolipidov pretvori manjšo količino protrombina v trombin; slika 1 (9).
3
Slika 1: Proces hemostaze na ravni interakcije beljakovin s prikazom vseh treh poti koagulacije, fibrinolize in delovanja naravnih antikoagulantov. Okrajšave: PAI-1 – zaviralec aktivatorja plazminogena; TAFI – zaviralec fibrinolize aktiviran s trombinom; TFPI – zaviralec poti tkivnega faktorja; tPA – tkivni aktivator plazminogena. Povzeto po (1).
V tej fazi še ne nastane dovolj trombina za cepitev fibrinogena. Po delovanju pozitivne povratne zanke nastane intrinzična tenaza, ki katalizira nastanek zadostne količine trombina za cepitev fibrinogena in nastanek fibrinskega strdka (9). V koagulacijski kaskadi trombin sam pospeši in poveča svoj nastanek preko aktivacije FXI, poleg trombina ga aktivira tudi FXIIa (11). V prisotnosti kalcija poteče vezava koagulacijskih faktorjev na fosfatidilserin, pri čemer se tvori kompleks intrinzična tenaza (FIXa, FVIIIa in FX, kalcij, fosfolipidi).
Intrinzična tenaza aktivira FX v FXa, kar vodi v nastanek protrombinaznega kompleksa (FXa, FVa in protrombin) in močno pospešeno nastajanje trombina (trombinski izbruh) (9).
Količina tako nastalega trombina se poveča za nekaj tisočkrat (1). Odpornost strdka na fibrinolizo prek aktivacije zaviralca fibrinolize spodbuja FXI, ki ima pomembno vlogo pri stabilizaciji in širjenju tromba (11).
Trombin, ki nastane s trombinskim izbruhom, deluje na fibrinogen in odcepi fibrinopeptida A in B, pri čemer nastane monomer fibrina. Izpostavijo se mesta polimerizacije, ki se lahko vežejo na druge fibrinske monomere. Monomeri polimerizirajo in skupaj tvorijo ohlapen
4
strdek. Faktor XIIIa nato stabilizira strdek s tvorbo amidnih vezi med stranskimi verigami fibrinskih monomerov (9).
Koagulacija je regulirana in lokalizirana s številnimi naravnimi antikoagulanti, med najpomembnejše štejemo antitrombin, protein C in protein S (1). Antitrombin zavira trombin in FXa, v manjši meri pa tudi FIXa in FXIa. Protein C in protein S sta od vitamina K odvisna antikoagulacijska proteina in zavirata proces koagulacije z inaktivacijo FVa in FVIIIa. Aktivacijo proteina C in proteina S spodbuja trombin in s tem prepreči prekomerno nastajanje novega trombina (12). Pri zaviranju procesa koagulacije je pomemben tudi zaviralec poti tkivnega faktorja, ki zavira kompleks tkivni faktor-FVIIa (4).
1.1.2 Vloga mikrodelcev pri koagulaciji krvi
Mikrodelci so majhni membranski mehurčki s premerom od 0,1 do 1,0 μm (13). Sprostijo se s površine različnih vrst celic kot odziv na celično aktivacijo ali razgradnjo celic. Večina mikrodelcev v krvi izvira iz trombocitov, sproščajo pa se tudi iz levkocitov, eritrocitov, endotelijskih celic, gladkih mišičnih celic in rakavih celic. Mikrodelci opravljajo vlogo nosilca tkivnega faktorja, ki v glavnem prispeva k aktivaciji koagulacijskega sistema.
Prenašajo pa tudi nekatere druge snovi, kot so integrini, celične adhezijske molekule, kemokini in negativno nabiti fosfolipidi; slika 2. Med aktivacijo ali propadom celice se negativno nabiti fosfolipidi izpostavijo na zunanji strani membrane. Iz celic se zato sproščajo mikrodelci z izpostavljenimi negativno nabitimi fosfolipidi (npr. fosfatidilserin) (8).
Slika 2: Vloga tkivnega faktorja pri aktivaciji tarčnih celic. Okrajšave: CAM – celična adhezijska molekula; FS – fosfatidilserin; TF – tkivni faktor. Povzeto po (8).
5
V krvi zdravih posameznikov so mikrodelci prisotni v manjši meri. Njihova koncentracija je povečana pri različnih boleznih, vključno s srčno-žilnimi boleznimi, diabetesom, sepso in rakom (13). Sprva so mikrodelce povezovali s pospešeno koagulacijo zaradi izražanja prokoagulantnih fosfolipidov, vendar pa se takšen koagulacijski sistem ne aktivira le v bolezenskih stanjih, temveč tudi pri zdravih posameznikih. Visoke strižne sile v tekoči krvi poleg agregacije trombocitov spodbudijo tudi izločanje mikrodelcev, ki vsebujejo prokoagulante. Izpostavljenost fosfatidilserina predstavlja veliko območje za sprožitev koagulacijske kaskade in olajša tvorbo koagulacijskih kompleksov. Tkivni faktor na površini mikrodelcev postane aktiven ob nalepljanju in združitvi mikrodelcev z aktiviranimi trombociti. Ko kri pride v stik s tkivnim faktorjem na površini mikrodelca se sproži koagulacijska kaskada (8).
Na površini mikrodelcev so prisotni tudi proteini, ki zavirajo koagulacijo. Ti proteini so inhibitor poti tkivnega faktorja, protein C ali trombomodulin. Zaradi prisotnosti teh proteinov lahko mikrodelci prispevajo tudi k antikoagulacijski poti. Ravnovesje med tkivnim faktorjem in zaviralcem poti tkivnega faktorja na površini mikrodelcev je ključno pri začetku koagulacije krvi (8).
1.1.3 Fibrinoliza
Za ponovno vzpostavitev prehodnosti žilja in obnovo tkiva ob zaključku celjenja žilne stene poskrbi proces fibrinolize. Fibrinoliza se aktivira sočasno s koagulacijo, njena vloga je omejitev nastanka strdka na mestu poškodbe (1). V začetnem obdobju tvorbo fibrinskega strdka spremlja sproščanje aktivatorjev plazminogena. Plazminogen je neaktivni prekurzor plazmina, ki ga aktivirata tkivni aktivator plazminogena (tPA) in urokinaza, ki se sproščata v kri iz poškodovanega endotelija (7). Na fibrinu nastane kompleks med tPA in plazminogenom, ki močno pospeši aktivacijo plazminogena v plazmin (3). Plazmin ima v tem encimskem procesu glavno vlogo in fibrinski strdek razgradi v produkte razgradnje fibrina; slika 1 (7). Produkte razgradnje, ki pri tem nastanejo, lahko merimo za oceno neželene koagulacije pri trombozah (5). Eden od produktov razgradnje je fragment fibrina D-dimer, katerega prisotnost je specifičen kazalnik razgradnje premreženega fibrinskega strdka (7).
6
Fibrinolitični sistem je aktiviran le v prisotnosti fibrina, tako je preprečeno delovanje fibrinolize, kadar strdki niso prisotni. V tekoči krvi nepoškodovanih žil fibrinoliza miruje zaradi prisotnosti zaviralcev fibrinolize (7). Fibrinolizo zaustavljajo zaviralci aktivatorjev plazminogena (PAI-1 in PAI-2) in α2-antiplazmin, ki neposredno zavira ali preprečuje delovanje plazmina (5). Pri uravnavanju fibrinolize sodeluje tudi trombin, tako da aktivira zaviralce fibrinolize (4). Zavrta fibrinoliza lahko prispeva h klinično opredeljenim hiperkoagulabilnim stanjem (14).
1.2 MOTNJE HEMOSTAZE POVEZANE S TROMBOZO
Motnje hemostaze se razvijejo, kadar pride do iztirjenja normalnih procesov hemostaze, in so povezane s številnimi kliničnimi stanji (5). Motnje hemostaze, povezane s trombozo, so najpogosteje posledica motenj v koagulaciji in fibrinolizi. Ravnovesje med nastankom in razgradnjo fibrina je nagnjeno v smer nastanka fibrina. Ravnovesje se lahko poruši zaradi sprememb v sestavi krvi, lastnostih žilne stene ali sprememb v toku krvi (3).
Patološki mehanizmi, ki lahko vodijo v nastanek tromboze, so (3):
− moteno zaviranje FVa in FVIIIa,
− pospešeno nastajanje trombina,
− moteno zaviranje trombina,
− zmanjšana vezava plazminogena na fibrin,
− poškodba žilnega endotelija,
− zmanjšana aktivnost proteina C.
Med prirojene motnje spadajo predvsem bolezni, pri katerih pride do pomanjkanja fizioloških antikoagulantov ali njihovega neustreznega delovanja. Najpogostejša prirojena motnja koagulacije je neodzivnost na aktivirani protein C, pri kateri je zaradi genske spremembe FV Leiden onemogočeno inaktiviranje FVa z aktiviranim proteinom C. Vzroki za motnje koagulacije, ki vodijo v trombozo so še: genska sprememba v genu za protrombin, primanjkljaj antitrombina, proteina C ali proteina S ter zvišane koncentracije FVIII (3).
Nagnjenost k trombozi se lahko pojavi tudi kot posledica zmanjšane aktivnosti fibrinolize.
Najpogostejši vzrok za moteno razgradnjo fibrina je v pomanjkanju plazminogena ali pa v
7
zmanjšanem sproščanju tPA iz žilnega endotelija in zmanjšani vezavi tPA na fibrin. Zaradi spremembe na molekuli fibrinogena se število vezavnih mest za tPA na fibrinu zmanjša.
Posledici zmanjšane vezave tPA sta hipofibrinoliza in nagnjenost k trombozi (3).
Pogosto je tromboza povezana s prehodnimi dejavniki tveganja, kot so operacija, poškodba, maligna bolezen, dolgotrajno ležanje, nosečnost, porod ali jemanje hormonske kontracepcije (3).
1.3 MEHANIZEM NASTANKA TROMBOZE V ARTERIJAH
Pri venski in arterijski trombozi patološki procesi premagajo regulativne mehanizme hemostaze. Tvorijo se ogromne količine trombina, kar sproži trombozo. Tromboza je ključen zaščitni odziv, ki zaustavi izgubo krvi z nastankom trombina ter nalaganjem fibrina in trombocitov na mestih poškodovanega žilnega endotelija. V proces je vključenih več elementov, vključno s trombociti in visokim strižnim stresom, tesno povezanih z razvojem tromba in njegovo končno strukturo (12).
Pri aterotrombozi je primarni sprožilec poškodba žil, ki prek molekularnih in celičnih komponent koagulacijske kaskade sproži in razširi vnetni odziv. Povezava med trombozo in vnetjem prispeva h kroničnim in akutnim arterijskim žilnim boleznim. Številni klinični in molekularni dokazi kažejo na tesno povezavo med vnetjem, trombozo in vensko tromboembolijo. Ti podatki dokazujejo povezavo med aterotrombotičnimi dejavniki tveganja in vensko trombozo ter vlogo vnetja kot sprožilca tromboze. Dokazi kažejo, da vnetje povečuje izražanje C-reaktivnega proteina in modulira delovanje trombocitov.
Pomembno je, da vpliva na zunanjo kaskado koagulacije krvi in fibrinolitični sistem ter tako okrepi trombotični odziv na poškodbo žil in vivo (12).
Med ključne dejavnike tveganja za trombozo štejemo endotelijsko disfunkcijo. Po prekinitvi endotelija sta kolagen in tkivni faktor izpostavljena krvnemu toku, kar sproži nastanek tromba. Izpostavljen kolagen sproži aktivacijo in kopičenje trombocitov, tkivni faktor pa sproži nastanek trombina, ki pretvori fibrinogen v fibrin in aktivira trombocite (12).
8
1.4 PERKUTANA TRANSLUMINALNA ANGIOPLASTIKA STEGENSKE ARTERIJE
Perkutana transluminalna angioplastika (PTA) je minimalno invaziven poseg, s katerim se doseže ponovna vzpostavitev pretoka krvi skozi zožano ali zamašeno arterijo (15). Je varen in tehnično uspešen poseg, ki ima nizko stopnjo zapletov in zelo nizko stopnjo umrljivosti.
PTA se uporablja predvsem za zdravljenje stanj, povezanih z aterosklerozo in zožitvami krvnih žil. Dobro je uveljavljena za zdravljenje napredovanih oblik periferne arterijske bolezni (34, 35).
Pred posegom zdravnik v krvni obtok vbrizga kontrastno sredstvo, s katerim med posegom rentgensko ugotavlja, kakšna sta položaj zožitve in prehodnost arterije. Pri PTA v krvno žilo vstavi posebej opremljen kateter z napihljivim balončkom. Balonček se na zožanem delu napihne, žila se razširi in obnovi se pretok krvi. Kadar balonski kateter ne doseže zadostne razširitve arterij, se lahko mesto dodatno ojača z žilno opornico, ki ohranja odprtost žile.
Zapleti, ki se lahko pojavijo, so podplutba na mestu vboda, nastanek strdka, razširitev ali razpok žile. Zapleti nastopijo le pri 5 % bolnikov (34, 35). Tehnični uspeh PTA in iztok v golenske arterije se oceni s kontrolnim ultrazvokom po posegu (33). Uspešnost PTA se preverja tudi z gleženjskim indeksom (GI), s katerim se odkriva zožitve ali zapore arterij na nogah. Kot bolnike z normalnimi vrednostmi se opredelili bolnike z GI med 0,91 in 1,4. GI pod 0,9 pa že pomeni zožitev ali zaporo arterije (19).
1.5 RESTENOZA IN REOKLUZIJA PO PERKUTANI TRANSLUMINALNI ANGIOPLASTIKI
Glavna pomanjkljivost PTA je pojav restenoze. Restenoza po PTA pomeni ponovno zožitev žilne svetline, ki nastopi po posegu, in je kljub napredku v tehnologiji še vedno pogost zaplet v prvem letu po PTA (18, 22). Restenoza se pojavi tudi po ostalih žilnih operacijah in ni specifična le za angioplastiko (21). Definiramo jo kot najmanj dvakratni porast največje sistolične hitrosti pretoka krvi na mestu ponovne zožitve v primerjavi s pretokom v zdravem delu arterije (16).
Zgodnja restenoza je najpogostejša vrsta restenoze. Najpogosteje se pojavi od 1‒2 meseca do 1 leta po angioplastiki (21). Restenoza stegenske arterije se pojavi pri 40 do 60 % bolnikov 6‒12 mesecev po PTA (16). Znano je, da so stopnje prehodnosti po PTA in
9
implantaciji žilne opornice v veliki meri odvisne od lokacije zdravljene lezije. Nizka stopnja pojava restenoze po PTA je značilna za arterije elastičnega tipa in ilealne arterije. Nasprotno pa se v arterijah mišičnega tipa femoropoplitealnega segmenta restenoza po PTA pojavlja pogosteje. Prepoznava zanesljivih napovedovalcev tveganja restenoze bi lahko omogočala ciljno usmerjeno uporabo ukrepov za preprečevanje restenoze (18, 20).
Na mestu PTA pride do poškodbe žilne stene, ki ji nemudoma sledijo aktivacija trombocitov, nalaganje fibrina in produktov zunajceličnega matriksa ter preoblikovanje in razrast gladkomišičnih celic. Proces predstavlja vnetni odgovor žilne stene na poškodbo ob balonski dilataciji. Ko se sproži, je proces neointimalne zadebelitve navadno neustavljiv in pripelje do preoblikovanja žile in zoženja žilne svetline. Zožitev žilne svetline lahko vodi v trombozo na mestu PTA (9).
Pojav restenoze in reokluzije po uspešno opravljeni PTA je zapleten in odvisen od več različnih dejavnikov, mehanizem nastanka še ni povsem znan (16). Dejavniki tveganja za restenozo se razlikujejo glede na lastnosti bolnika in vrsto patološke spremembe tkiva (22):
Lastnosti bolnika (16, 22):
− sladkorna bolezen
− kronična ledvična odpoved
− akutni koronarni sindromi
− biokemični dejavniki (zvišana serumska koncentracija matriksne metaloproteinaze)
− genetski dejavniki (enonukleotidni polimorfizmi v genih AGTR, GPX1, KAT2B, MMP12, FGB in VDR)
Vrsta patološke spremembe tkiva (16, 22):
− funkcionalne značilnosti prizadete arterije
− morfološke značilnosti sprememb na arterijah (dolžina in število zožitev)
− kalciniranost arterij
Številne študije so ocenjevale pomen vnetja za napovedovanje tveganja restenoze posameznika. Dokazano je, da so povišane vrednosti povezane s povečanim tveganjem za restenozo po angioplastiki. Nedorečeno ostaja, če so reaktanti akutne faze le kazalnik povečanega tveganja za restenozo ali vzročno prispevajo k njenemu pojavu (15). Znano je, da imajo pomembno vlogo pri nastajanju tromba v območju žilne opornice trombociti. Ni
10
pa jasno če je v patofiziologijo restenoze vključen tudi sistem koagulacije, ki je tesno povezan s hemostatičnimi učinki trombocitov. Hiperkoagulabilno stanje pri bolnikih z restenozo je najverjetneje posledica močnih dražljajev za aktivacijo hemostaze ob poškodbi žilnega endotelija med PTA in v zaviranju antikoagulacijske poti proteina C (23).
1.6 LABORATORIJSKE PREISKAVE ZA OCENO HIPERKOAGULABILNOSTI
Z laboratorijskimi preiskavami hemostaze želimo izključiti ali potrditi motnje v posameznih sestavinah hemostaze (3). Zaradi zapletenosti hemostatskega sistema je diagnoza motenj v hemostatskem ravnovesju zelo zahtevna. Zahtevno in ekonomsko neučinkovito je za potrditev diagnoze izvesti vse posamezne laboratorijske preiskave. Prednost imajo presejalni testi, ki dajejo pregled nad celotnim koagulacijskim sistemom, vključno z encimi, kofaktorji in zaviralci. Hkrati se lahko s presejalnimi testi določi tudi vpliv antikoagulacijskih zdravil (2). Rezultati teh testov so v pomoč pri napovedovanju poteka bolezni in pri izbiri ter vodenju zdravljenja (3).
Presejalne koagulacijske preiskave, kot sta protrombinski čas (PČ) in aktivirani parcialni tromboplastinski čas (APTČ), so namenjene spremljanju antikoagulantne terapije z varfarinom ali heparinom. Te koagulacijske preiskave niso uporabne za napovedovanje krvavitev ali ocenjevanje trombotičnega in srčno-žilnega tveganja. S tradicionalno uporabljenimi preiskavami koagulacije se beleži koagulacijski čas in vitro ob nastanku nekaj
% trombina, drugih podatkov pa presejale preiskave ne dajejo (24).
Kasnejših hemostatskih odzivov ali morebitnih nepravilnosti v hemostatskem procesu ni mogoče zaznati s preprostim določanjem časa do začetka nastajanja strdka (2). Preproste preiskave, kot sta APTČ in PČ, ne zagotavljajo karakterizacije posameznikove hemostatske funkcije. Pojavila se je potreba po učinkovitih preiskavah, ki vključujejo dodatne sestavine hemostatskega sistema in natančneje modelirajo njihove funkcije in vivo (25). Boljšo oceno strjevanja krvi in vivo in s tem oceno tveganja za trombozo in krvavitev lahko zagotovi globalna ocena sistema strjevanja. Ta namreč vključuje tudi končne produkte koagulacijske kaskade, kot sta fibrin in trombin. Idealna ocena hemostaze mora biti zanesljiva, ponovljiva ter hitra in enostavna za izvedbo. Ključno je, da lahko z njo dokažemo povezanost s tveganji za krvavitve ali trombozo (24).
11
1.6.1 Celokupni hemostatski potencial
Metoda za merjenje celokupnega hemostatskega potenciala je preprosta in hitra laboratorijska metoda za določanje celokupnega koagulacijskega potenciala (CKP), celokupnega fibrinolitičnega potenciala (CFP) in celokupnega hemostatskega potenciala (CHP) v plazmi; slika 3. CKP predstavlja sposobnost za koagulacijo krvi, po dodatku manjše koncentracije trombina. CFP predstavlja sposobnost plazme za fibrinolizo, sproženo s tkivnim aktivatorjem plazminogena (tPA). CHP pa predstavlja sposobnost hemostaze za uravnavanje ravnovesja med nastankom fibrina in fibrinolizo. Razvita je bila zaradi potrebe po globalni funkcijski preiskavi, ki bi lahko ocenila hemostatski potencial in napovedala klinične izide oz. ocenila tveganje za trombozo ali krvavitev. V nasprotju z drugimi globalnimi preiskavami, ki odražajo nastajanje trombina, tvorbo strdkov ali razgradnjo fibrina, lahko s CHP dobimo oceno celotne koagulacije in fibrinolize v preiskovanem vzorcu (2).
Metoda CHP temelji na spektrofotometričnem merjenju nastanka in razgradnje fibrina v citratni plazmi. Izvaja se v dveh paralelah. Pri eni od paralel so plazmi dodani reagenti: nizka koncentracija trombina, reagent trombocitov kot vir fosfolipidov in kalcijev klorid, ki sproži tvorbo trombina. V drugi paraleli poleg omenjenih reagentov dodamo še tPA ter tako sprožimo razgradnjo fibrinogena. Fibrin nastaja postopoma s pretvorbo iz fibrinogena, prisotnega v plazmi. Razgradi ga plazmin, ki se po dodatku tPA tvori iz plazminogena.
Metoda celokupnega hemostatskega potenciala je tako posredni način za spremljanje tvorbe trombina. Vzorcu je dodana le majhna količina trombina, ki aktivira proces koagulacije, ne katalizira pa neposrednega nastanka fibrina. Pretvorba fibrinogena v fibrin je tako predvsem rezultat in vitro nastalega trombina in je prikazana s krivuljo nastanka fibrina (4).
Slika 3: Celokupni hemostatski potencial (CHP), celokupni koagulacijski potencial (CKP) in celokupni fibrinolitični potencial (CFP). Povzeto po (2).
12
Preprosta oprema in enostavni izračuni omogočajo, da je metoda celokupnega hemostatskega potenciala enostavna in hitra za izvedbo in je primerna za rutinsko rabo v laboratoriju (4). Dodatna prednost metode je, da se lahko za analizo uporabi tako sveže kot zamrznjene vzorce. Rezultati preiskav s CHP so v korelaciji s kliničnimi ugotovitvami, tako pri krvavitvah kot pri trombotičnih motnjah, in bi jih lahko uporabljali za spremljanje farmakološkega zdravljenja (2).
CHP so ovrednotili v več raziskavah, kjer so pozornost usmerili k prepoznavanju hiperkoagulabilnosti (2). Poleg hiperkoagulabilnosti se lahko z njo zaznava tudi oslabljeno fibrinolizo (14). Metoda CHP je uporabna za diagnosticiranje in obvladovanje nekaterih hiperkoagulabilnih stanj, povezanih s povečanim tveganjem za tromboze. To so nosečnost, preeklampsija, diabetes, koronarna bolezen srca, možganska kap, antifosfolipidni sindrom in stanja pri bolnikih po operaciji žil (2, 27).
1.6.2 Spremljanje tvorjenja trombina
Trombin je ena ključnih komponent hemostatskega sistema, ki s pretvorbo fibrinogena v fibrin prispeva k nastanku strdkov. Poleg tega trombin sodeluje pri pozitivnih povratnih zankah, ki preko aktivacije FXI povzročijo trombinski izbruh (24). Občasno povečano tvorjenje trombina je običajen fiziološki pojav. Na spremljanje tvorjenja trombina in vivo vplivajo poleg tvorjenja trombina tudi drugi dejavniki, npr. čas očistka zdravila in fibrinolitična aktivnost (6).
Razvoj novih metod, ki temeljijo na občutljivih fluorogenih ali kromogenih peptidnih substratih, je pomenil večjo uporabnost v kliničnih študijah. Sprva so za diagnostiko uporabljali kromogeni substrat, ki so ga pozneje nadomestili s fluorogenim. Slabost kromogenega substrata je, da je za njegovo uporabo nujno zaviranje polimerizacije fibrina, saj nastali fibrin povzroča motnost plazme, ki moti določitev pri valovni dolžini 405 nm.
Nasprotno pa pri fluorogenem substratu motnost plazme ne ovira beleženja signala in defibrinacija ni potrebna (27). Kasneje so uvedli novo obliko STT z uporabo majhnega peptidnega substrata za trombin in opredelili endogeni trombinski potencial (ETP) kot skupno sposobnost plazme, da tvori trombin po indukciji koagulacije (28).
Metoda STT pokaže nastanek in razgradnjo trombina v krvi ali plazmi v odvisnosti od časa (6). Tvorjenje trombina v citratni plazmi sproži nizka koncentracija kompleksa
13
tkivni faktor/fosfolipid v prisotnosti kalcijevega klorida (CaCl2) (21). Trombin nastaja kot posledica aktivacije prokoagulantih faktorjev, delovanje antikoagulantnih faktorjev pa vodi v njegov razpad (27). Razpad fluorogenega substrata povzroči signal, ki je sorazmeren koncentraciji nastalega trombina (21). Iz zabeleženih signalov je mogoče z uporabo umeritvene krivulje, pripravljene iz znanih koncentracij trombina, v vseh časovnih točkah izračunati koncentracijo trombina (21).
Slika 4: Prikaz parametrov trombograma (A – faza mirovanja, B – trombinski vrh, C – čas do trombinskega vrha, D – endogeni trombinski potencial). Povzeto po (27).
Rezultat testa STT je trombogram, ki opisuje nastajanje trombina med aktivacijo koagulacijske kaskade; slika 4. Iz trombograma odčitamo več parametrov (29): fazo mirovanja (min), trombinski vrh (nmol/L), čas do trombinskega vrha (min) in površino pod krivuljo, opredeljeno kot ETP (27). Po sprožitvi tvorjenja trombina z nizko koncentracijo tkivnega faktorja nastopi faza mirovanja (LT), ki traja vsaj 4 minute (6). Faza mirovanja je čas od trenutka, ko dodamo reagent s CaCl2, do začetka nastajanja trombina. Je ekvivalent času koagulacije v tradicionalnih preiskavah koagulacije, vendar je bolj občutljiva (27).
Sledi eksponentna rast koncentracije trombina (6). Trombinski vrh predstavlja največjo koncentracijo nastalega trombina v določenem trenutku. Čas do trombinskega vrha (TTP) je čas od sprožitve tvorjenja trombina do njegove maksimalne koncentracije in predstavlja hitrost tvorjenja trombina (30). Bolniki s hiperkoagulabilnostjo dosežejo trombinski vrh hitreje kot zdrave osebe, bolniki s hipokoagulabilnostjo pa počasneje. Površina pod krivuljo je definirana kot ETP. ETP predstavlja skupno količino trombina, ki nastane v vzorcu plazme pod vplivom delovanja prokoagulantov in antikoagulantov (27).
14
S STT se lahko določa tudi vpliv mikrodelcev na nastajanje trombina (30). Vpliv mikrodelcev na tvorjenje trombina se spremlja v plazmi revni s trombociti (PPP). Vzporedno se izvede analizo na plazmi, ki ima mikrodelce ohranjene, in na plazmi brez mikrodelcev (PBM), kjer so mikrodelci odstranjeni s filtracijo.
V primerjavi z metodo določanja koncentracije D-dimera, na metodo STT manj vplivajo sočasne bolezni, kot so rak, nalezljive bolezni in bolezni srca in ožilja. Metoda STT izboljša napovedno vrednost D-dimera pri izključitvi venske tromboembolije, specifičnost se poveča (31).
1.6.3 D-dimer
D-dimer je topen razgradni produkt zamreženega fibrina. Za nastanek D-dimera je potrebno zaporedno delovanje encimov trombina, FXIIIa in plazmina. Trombin, ki nastane v sistemu koagulacije, pretvori topen fibrinogen v fibrinske monomere. Vsaka molekula fibrinogena je sestavljena iz osrednje podenote E in dveh podenot D. Vsaka od podenot pa je sestavljena iz treh polipeptidnih verig, imenovanih α, β in γ, ki so povezane z disulfidnimi vezmi.
Trombin odcepi kratke peptide z N-koncev na domeni E in nastanejo fibrinski monomeri (32). Pri razvoju tromboze plazmin cepi navzkrižno povezane netopne monomere fibrina, pri čemer nastajajo stranski produkti, znani kot produkti razgradnje fibrina. Med te produkte iz navzkrižno povezanih fibril spada tudi D-dimer, sestavljen iz dveh podenot D dveh sosednjih molekul fibrina (33).
D-dimer je globalni označevalec aktivacije koagulacijskega in fibrinolitičnega sistema ter posredni označevalec trombotične aktivnosti. Nastaja le ob nastajanju in razgradnji zamreženega fibrina (32). Za merjenje plazemskega antigena D-dimera so razvili teste, ki z uporabo protiteles reagirajo na epitopih, specifično prisotnih na molekuli D-dimera (33). Je biološki kazalnik nastanka in razgradnje fibrina, merjen v polni krvi ali v plazmi. Pri zdravih ljudeh so vrednosti D-dimera v krvi nizke, medtem ko so povišane pri stanjih povezanih s trombozo (32). Razpolovni čas D-dimera v plazmi je približno 8 ur, iz krvnega obtoka se izloči predvsem z ledvično presnovo in endotelijskim sistemom (34).
D-dimer je eden od kazalnikov hiperkoagulabilnosti. V primerih, ko je osnovna patologija povezana s povečano trombolitično aktivnostjo, ima lahko D-dimer pomembno vlogo pri kliničnem pregledu. Že sedaj je uveljavljen pri diagnosticiranju kliničnih motenj koagulacije
15
pri venski tromboemboliji. Metoda določanja koncentracije D-dimera je neinvazivna in hitra diagnostična metoda in predstavlja stroškovno učinkovito orodje za diagnosticiranje bolezni (35). D-dimer ima visoko negativno napovedno vrednost za trombozo, a le majhno pozitivno napovedno vrednost za trombozo (36). Negativna napovedna vrednost D-dimera je odvisna od bolnikove klinične verjetnosti za vensko trombozo (37).
1.6.4 Fibrinogen
Fibrinogen je prekurzor fibrina, ki se tvori v jetrih in ima razpolovni čas približno 3–4 dni.
Je reaktant akutne faze, njegova plazemska koncentracija pa ob različnih sistemskih vnetnih stanjih naraste (38). Molekula fibrinogena je sestavljena iz treh parov kovalentno povezanih polipeptidnih verig (alfa, beta in gama). Trombin povzroči, da se s fibrinogena odcepijo štirje fibrinopeptidi, po dva fibrinopeptida A in B, pri čemer nastane monomer fibrina (17). Zaradi cepitve fibrinopeptidov A in B, nastalemu monomeru fibrina primanjkuje negativno nabitih fibrinopeptidov, zaradi katerih se molekule med seboj odbijajo. Monomeri se med seboj z vodikovimi vezmi povezujejo v mrežastem vzorcu, ki je sposoben ujeti eritrocite, trombocite in trombin. Faktor XIIIa vodikove vezi spremeni v kovalentne, s čimer krepi in stabilizira strdek. Stabilizacija strdka je ključnega pomena za hemostazo, na kar kaže dejstvo, da prirojene pomanjkljivosti faktorja XIII povzročijo motnje krvavitve ob rojstvu (38).
Trenutno obstaja več metod za merjenje ravni fibrinogena v plazmi, večina laboratorijev uporablja Claussovo metodo. Claussova metoda je funkcijska metoda, ki temelji na načelu, da je čas strjevanja krvi obratno sorazmeren z vsebnostjo fibrinogena v plazmi (39). Analiza meri sposobnost fibrinogena, da tvori fibrinski strdek po izpostavitvi visoki koncentraciji prečiščenega trombina (38). Referenčno območje za odraslo populacijo je okvirno 2,0–4,0 g/L (39). Ker je fibrinogen reaktant akutne faze je njegova koncentracija pri bolnikih višja (38). Povišane ravni fibrinogena so povezane s povečanim tveganjem za trombozo (39).
16
2 NAMEN DELA IN HIPOTEZE
Perkutana transluminalna angioplastika (PTA) je minimalno invaziven proces za ponovno vzpostavitev pretoka krvi skozi zožano ali zamašeno arterijo. Glavno omejitev predstavlja ponovna zožitev žilne svetline (restenoza). Ob izvedbi PTA pogosto pride do poškodbe endotelija, ki ima zelo pomembno vlogo v hemostazi. Iz tega sklepamo, da ima pomembno vlogo pri nastanku restenoze po PTA tudi sistem koagulacije. V okviru magistrske naloge smo želeli preveriti do sedaj še neraziskano povezavo med PTA in hemostazo.
Namen magistrske naloge bo s pomočjo merjenja CHP in STT preučiti povezavo med pospešeno koagulacijo krvi in restenozo v prvem letu po opravljeni PTA. Preverili bomo razliko v preiskavah hemostaze pri bolnikih, ki so v enem letu po PTA razvili restenozo, in bolnikih, ki je niso. Preverjali bomo vpliv mikrodelcev na hiperkoagulabilna stanja in njihovo napovedno vrednost za restenozo. Določili bomo tudi spremenljivke, ki so z restenozo neodvisno povezane.
Preučili bomo naslednjo hipotezo: Bolniki z restenozo dvanajst mesecev po perkutani transluminalni angioplastiki so imeli dan pred in takoj po posegu pomembno spremenjen celokupni koagulacijski potencial ter hiperkoagulabilni trombogram. Da bi hipotezo dokazali, bomo bolnikom razdeljenim v dve skupini (bolniki s prehodnimi arterijami in bolniki z restenozo), z uporabo dveh metod (CHP in STT) določili parametre za oceno hemostatskega ravnovesja. Ker se restenoza najpogosteje pojavi v obdobju od enega do dvanajst mesecev, bomo spremljali bolnike po 1, 6 in 12 mesecih in pri njih preverjali prehodnost arterij. Dobljene podatke bomo nato statistično obdelali.
Potrjena hipoteza bi pomenila, da imata CHP in STT napovedno vrednost za razvoj restenoze femoropoplitealne arterije v enem letu po PTA. Tako bi lahko prepoznali bolnike z večjo verjetnostjo za razvoj restenoze po PTA. V primeru, da se preiskavi izkažeta kot dober kazalnik tveganja za restenozo, bi lahko koagulacijski sistem predstavljal terapevtsko tarčo za zmanjšanje visoke stopnje restenoze.
17
3 PREISKOVANCI IN METODE
3.1 PREISKOVANCI
V raziskavo smo vključili bolnike, pri katerih je bila na Kliničnem oddelku za žilne bolezni Univerzitetnega kliničnega centra Ljubljana opravljena femoropoplitealna PTA. Zajeli smo bolnike, ki so jim PTA opravili med leti 2010 in 2015. Vsi bolniki so podpisali dovoljenje za sodelovanje v raziskavi, ki jo je odobrila Komisija Republike Slovenije za medicinsko etiko.
Vsi bolniki, ki so prejemali statine in zdravila z delovanjem na renin-angiotenzinski sistem (zaviralce ACE ali zaviralce receptorjev za angiotenzin II) na dan PTA, so zdravila prejemali že pred PTA. Nihče od njih ni začel z zdravljenjem tik pred posegom PTA, predpisana zdravila so jemali tekom celotnega obdobja opazovanja (35). Vsem preiskovancem smo odvzeli kri dan pred posegom in neposredno po posegu.
Za oceno restenoze na femoropoplitealnem odseku smo pri vseh preiskovancih opravili žilni ultrazvok (UZ) 1 mesec (29 dni do 2 meseca), 6 mesecev (6 do 8 mesecev) in 12 mesecev (12 do 16 mesecev) po PTA. Kot neugoden izid po PTA smo označili ≥ 50-odstotno restenozo femoropoplitealnega odseka. To smo potrdili z najmanj dvakratnim porastom največje sistolne hitrosti na mestu restenoze v primerjavi z največjo sistolno hitrostjo na zdravem odseku arterije (16).
3.2 ODVZEM KRVI IN PRIPRAVA PLAZME
Odvzem venske krvi in pripravo plazme smo pri vseh bolnikih opravili po standardnem postopku. Bolniki so bili tešči, vsaj eno uro pred odvzemom krvi niso kadili, pili pravega čaja ali kave in vsaj 24 ur niso pili alkohola. Bolniki so pred odvzemom sedeli vsaj 5 minut (25).
Za odvzem krvi smo uporabili zaprt sistem vakuumskih epruvet z 0,109 M natrijevim citratom. Plazmo, revno s trombociti, smo dobili s centrifugiranjem polne krvi (30 minut pri 2000 g). S pasteurjevo pipeto smo posrkali supernatant nad stolpcem krvnih celic in jo prenesli v večji vsebnik. Plazmo smo nato razparcelirali v 700-mikrolitrske alikvote in jo
18
zamrznili v tekočem dušiku. Do analize smo jo hranili pri temperaturi ≤ −70°C. Vzorce smo uporabili za meritve CHP, STT, določanje koncentracije D-dimera in fibrinogena.
Za kontrolo smo uporabili plazmo zdravih prostovoljcev, katerim smo kri odvzeli na enak način kot bolnikom. Enako kot pri bolnikih smo pripravili tudi plazmo. Plazmo vseh prostovoljcev smo združili v večjem vsebniku, da smo dobili normalno zmesno plazmo (NZP) in jo razparcelirali v 700-mikrolitrske alikvote. Zamrznili smo jih v tekočem dušiku in plazmo do analize hranili pri temperaturi ≤ −70 °C.
3.3 CELOKUPNI HEMOSTATSKI POTENCIAL
Določanje CHP je posredna metoda za merjenje tvorjenja trombina namenjena oceni celotnega hemostatskega stanja. Metodo smo izvedli po postopku, ki ga je prvotno opisala He s sodelavci (40).
Oprema in pripomočki Proizvajalec
Čitalec mikrotitrskih plošč SunriseTM Tecan, Männedorf, Švica
Mikrotitrske plošče Termo Fisher Scientific, Waltham, ZDA Mešalec z možnostjo regulacije
temperature Thermomixer® Comfort Eppendorf, Hamburg, Nemčija Centrifuga MiniSpin® Eppendorf, Hamburg, Nemčija Vibracijski mešalnik TopMix Thermo Fisher Scientific, ZDA Enokanalne elektronske pipete (0,1−10 μL,
10−300 μL, 100−1000 μL, 1−5 mL) Sartorius Biohit, Göttingen, Nemčija Večkanalna elektronska pipeta Sartorius Biohit, Göttingen, Nemčija Nastavki za pipete
Vsebniki za pripravo delovnih raztopin Plastični kadički
Pred analizo smo pripravili reagente v želenih koncentracijah. Liofiliziran reagent govejega trombina smo raztopili v destilirani vodi do koncentracije 1000 NIH/mL in ga redčili z destilirano vodo v razmerju 1 : 10 (100 NIH/mL). Alikvote po 100 μL smo shranili v
19
zamrzovalni omari pri temperaturi ≤ −70 °C. Tako pripravljen trombin smo odtajali le enkrat tik pred analizo. Rekombinantni tPA s koncentracijo 338 ng/mL smo pripravili v alikvotih po 50 μL in jih shranjevali pri temperaturi ≤ −70 °C. tPA smo odtajali samo enkrat. Kalcijev klorid in pufer Tris-HCl smo do analize shranjevali v hladilniku pri temperaturi 2−8 °C.
Reagenti Proizvajalec
Goveji trombin 100 NIH/mL Sigma-Aldrich®, St. Louis, ZDA
Rekombinantni tPA 1 mg/mL Actilyse®, Boehringer Ingelheim, Nemčija
Kalcijev klorid 320 mM Lekarna UKC Ljubljana
Pufer Tris-HCl pH 7,4 Lekarna UKC Ljubljana
Destilirana voda Lekarna UKC Ljubljana
Zamrznjene vzorce plazme bolnikov in NZP smo tik pred preiskavo na hitro odtalili (5 minut pri 37 °C) in jih dobro premešali na vibracijskem mešalniku. Plazmo bolnikov in NZP smo napipetirali na mikrotitrsko ploščo: 60 μL NZP (kontrola), 60 μL plazme bolnika (odvzem pred PTA) in 60 μL plazme bolnika (odvzem po PTA). Sočasno smo na ploščo smo nanesli vzorce treh bolnikov, za vsakega smo nanesli plazmo odvzeto pred in po posegu; slika 5.
Slika 5: Prikaz nanosa vzorcev na mikrotitrsko ploščo. Okrajšave: NZP – normalna zmesna plazma;
PB1pred – plazma bolnika (odvzeta pred PTA); PB1po – plazma bolnika (odvzeta po PTA);
tPA – tkivni aktivator plazminogena.
Meritev smo izvedli na spektrofotometru (Sunrise, Tecan, Avstrija) s pomočjo programske opreme Magellan (Tecan, Avstrija). Po vklopu spektrofotometra smo nastavili temperaturo
20
na 37 °C ter v programu Magellan (Tecan, Avstrija) izbrali ustrezno metodo. Reagente, ki smo jih uporabili, smo predstavili zgoraj.
Delovni pufer smo vzeli iz hladilnika in počakali, da se je segrel na sobno temperaturo. Nato smo iz zamrzovalne omare vzeli trombin in tPA, ju odtalili in segreli do temperature 37 °C.
Pred uporabo smo tPA redčili s pufrom v razmerju 1:10 (10μL tPA smo dodali 90 μL pufra). Razredčen tPA z delovno koncentracijo 0,1mg/mL smo dodali v reagenčno mešanici s pufrom in kalcijem ter dobro premešali.
Trombin smo pred uporabo redčili v razmerju 1 : 10 (50 μL trombina smo dodali v 450 μL pufra) ter dobro premešali, da se trombin ni oprijel sten epruvete. Pripravljen reagent z delovno koncentracijo trombina 10 NIH/mL smo prenesli v obe pripravljeni delovni raztopini s pufrom in kalcijem. Pri tem smo pazili, da smo trombin vedno najprej dodali v reagenčno mešanico, ki še ni imela dodanega tPA.
- Reagenčna mešanica s trombinom (meritev CKP):
1750 μL pufer
235 μL kalcijev klorid
18 μL trombin (koncentracija 10 NIH/mL)
- Reagenčna mešanica s trombinom in tPA (meritev CHP):
1750 μL pufer
235 μL kalcijev klorid
18 μL trombin (koncentracija 10 NIH/mL) 15 μL tPA (koncentracija 0,1 mg/mL)
Reagenčni mešanici smo prelili vsako v svojo kadičko. Po 50 μL reagenčne mešanice smo nanesli na mikrotitrsko ploščo s pomočjo elektronske večkanalne pipete. V prvi, tretji in peti stolpec smo nanesli reagenčno mešanico s trombinom (meritev CKP), v drugi, četrti in šesti stolpec pa reagenčno mešanico s trombinom in tPA (meritev CHP). Nanose na ploščo smo prikazali na sliki 5. Ploščo smo takoj postavili v predhodno na 37 °C ogret čitalec mikrotitrskih plošč in sprožili meritev.
21
Meritev smo izvedli v enominutnih časovnih intervalih pri valovni dolžini 405 nm, analiza je trajala 40 minut. Po koncu analize smo odčitane meritve izvozili iz Magellana (Tecan, Avstrija) v Excel (Microsoft Corporation, ZDA), kjer smo izračunali parametre CHP.
Oblikovali smo dve krivulji nastanka in razgradnje fibrina, ter za vsako izračunali površino pod krivuljo (2). Površina pod krivuljo, izrisana ob dodatku tPA, predstavlja celokupni hemostatski potencial (CHP). Površina pod krivuljo izrisana ob odsotnosti tPA pa celokupni koagulacijski potencial (CKP) (24). Razlika med obema površinama predstavlja celokupni fibrinolitični potencial (CFP). CFP je odraz ravnotežja med nastankom in razgradnjo fibrina (enačba 1).
CFP = CKP −CHP
CKP × 100 % Enačba 1
CFP celokupni fibrinolitični potencial CHP celokupni hemostatski potencial CKP celokupni koagulacijski potencial
Vsaka vrednost absorbance predstavlja količino fibrina v trenutku zapisa, površina pod krivuljo pa odraža ravnovesje med tvorjenjem in razgradnjo fibrina v celotnem obdobju merjenja. Površina pod krivuljo je laboratorijski parameter, ki smo ga izračunali kot vsoto vseh odčitkov absorbance (2).
3.4 SPREMLJANJE TVORJENJA TROMBINA
Tvorjenje trombina smo spremljali z reagenčnim kompletom Technothrombin® TGA (Technoclone, Avstrija). Nastanek spremljamo preko merjenja fluorescence, ki nastane ob cepitvi fluorogenega substrata z nastajajočim trombinom. Trombin nastaja kot posledica aktivacije prokoagulantnih faktorjev. Reakcijo smo sprožili z dodatkom tkivnega faktorja, ki ob prisotnosti kalcijevega klorida sproži nastanek trombina, kar vodi v koagulacijo (27).
22
Oprema in pripomočki Proizvajalec
Fluorimeter za mikrotitrske plošče Infinite® F200
Tecan, Männedorf, Švica
Črne mikrotitrske plošče NUNC Termo Fisher Scientific, Waltham, ZDA Mešalec z možnostjo regulacije temperature
Thermomixer® Comfort
Eppendorf, Hamburg, Nemčija
Centrifuga MiniSpin® Eppendorf, Hamburg, Nemčija Vibracijski mešalnik TopMix Thermo Fisher Scientific, ZDA Filtracija Ceveron® MFU 500 Diapharma Group, ZDA Enokanalne elektronske pipete (0,1-10 μL
10-300 μL, 100-1000 μL, 1-5 mL)
Sartorius Biohit, Göttingen, Nemčija Večkanalna elektronska pipeta Sartorius Biohit, Göttingen, Nemčija Nastavki za pipete
Vsebniki za pripravo delovnih raztopin Plastični kadički
Reagente smo pred analizo pripravili tako, da smo liofiliziranemu reagentu dodali s strani proizvajalca določeno količino demineralizirane vode (Lekarna UKC, Ljubljana). Posebej smo pripravili reagente za umeritveno krivuljo in reagente za posamezna merjenja testnih vzorcev. Vse raztopljene reagente smo pred uporabo pustili, da so dosegli sobno temperaturo. Po 20 minutah raztapljanja in temeljitega mešanja smo imeli reagente pripravljene za uporabo.
Reagenti za umeritveno krivuljo Proizvajalec
Goveji trombin (722 nM) v pufru Technoclone Herstellung GmbH®, Dunaj, Avstrija
Pufer hepes-NaCl Technoclone Herstellung GmbH®, Dunaj,
Avstrija Fluorogeni substrat (1 mM Z-G-G-R-AMC,
15 mM CaCl2) Technoclone Herstellung GmbH®, Dunaj,
Avstrija
23
Reagenti za analizo vzorcev Proizvajalec
Fluorogeni substrat (1 mM Z-G-G-R-AMC, 15 mM CaCl2)
Technoclone Herstellung GmbH®, Dunaj, Avstrija
Reagent RC Low z nizko koncentracijo
tkivnega faktorja (5 pM) in fosfolipidov Technoclone Herstellung GmbH®, Dunaj, Avstrija
Umeritveno krivuljo za trombin smo določili iz 4 raztopine znanih koncentracij trombina, v razmerjih 1 : 2, 1 : 4, 1 : 20 in 1 : 200 (trombin : pufer):
- Raztopina 1 (koncentracija 1 : 2):
200 μL trombin iz goveje plazme z množinsko koncentracijo 722 nM 200 μL pufer
- Raztopina 2 (koncentracija 1 : 4):
100 μL raztopina 1 100 μL pufer
- Raztopina 3 (koncentracija 1 : 20):
20 μL trombin iz goveje plazme z množinsko koncentracijo 722 nM 380 μL pufer
- Raztopina 4 (koncentracija 1 : 200):
20 μL raztopina 3 180 μL pufer
Kalibracijske raztopine smo napipetirali (po 40 μL) na mikrotitrsko ploščo v 8 vdolbinic ter vsaki dodali po 50 μL substrata. Vsako raztopino smo napipetirali v dvojniku. Ploščo smo takoj vstavili v napravo in pričeli z merjenjem takoj po tem, ko smo dodali substrat.
Umeritveno krivuljo trombina smo naredili ločeno od ostalih meritev in smo jo naredili le enkrat. Merili smo 10 minut v 30-sekundnih intervalih pri temperaturi 37 °C.
Za analizo vzorcev smo uporabili reagent RC Low z nizko koncentracijo tkivnega faktorja (5 pM) in fosfolipidov. Reagent RC Low je namenjen za spremljanje trombogenosti mikrodelcev, merjenje nagnjenosti h krvavitvam, merjenje nagnjenosti k trombofiliji v plazmi, revni s trombociti, in vpliv faktorjev VII, Xa in XIa.
24
Zamrznjene vzorce plazme bolnikov in NZP smo tik pred preiskavo na hitro odtalili (5 minut pri 37 °C) in jih dobro premešali na vibracijskem mešalniku. Po 90 μL vsakega vzorca smo napipetirali na ploščo za filtracijo in ga vakuumsko filtrirali 3 minute, da smo iz plazme odstranili mikrodelce. Po filtraciji nam je v plazmi ostalo 0,4 % mikrodelcev. Nato smo v dveh paralelah po 40 μL plazme z mikrodelci in po 40 μL plazme brez njih nanesli na mikrotitrsko ploščo. Nanose na plošče smo prikazali na sliki 6. Na eno ploščo smo nanesli 11 vzorcev, za vsak vzorec po dve vdolbinici s plazmo z mikrodelci in po dve vdolbinici za plazmo brez njih. Kot kontrolo smo nanesli NZP z mikrodelci in NZP brez njih. V plastični epruveti smo nato zmešali 600 μL reagenta RC Low in 3000 μL substrata. Vsebino smo prelili v plastično kadičko in s pomočjo večkanalne pipete nanesli po 60 μL v vsako vdolbinico; slika 6. Ploščo smo po tem, ko smo dodali substrat in reagent, takoj vstavili v fluorimeter in pričeli z merjenjem. Merili smo 60 minut pri 37 °C v intervalih, dolgih 1 minuto.
Slika 6: Prikaz nanosa vzorcev na mikrotitrsko ploščo. Okrajšave: NZP – normalna zmesna plazma;
PBM – plazma brez mikrodelcev; PPP – plazma revna s trombociti; RC – reagent C; SUB – substrat.
Vsako minuto smo beležili fluorescenco s fluorimetrom, ki podatke prenaša v računalnik.
Dobljene podatke smo obdelali s programom Magellan (Tecan, Avstrija). Podatke smo izvozili v Excel (Microsoft Corporation, ZDA), kjer smo izračunali 1. odvod vsake krivulje (trombogram), nato pa iz trombograma odčitali oz. izračunali želene parametre.
Koncentracijo trombina smo dobili s pomočjo umeritvene krivulje.
25
Za vsakega preiskovanca smo izmerili fazo mirovanja (min), trombinski vrh (nM), čas do trombinskega vrha (min) in ETP (nM × min), ki predstavlja celokupen nastali trombin. Poleg omenjenih parametrov smo za vsakega preiskovanca izračunali še razliko v nastajanju trombina med plazmo z mikrodelci in plazmo brez njih. Tako smo dobili informacijo o aktivnosti trombogenih mikrodelcev. Rezultat smo izrazili kot odstotek trombina, ki je nastal zaradi vpliva mikrodelcev. Izračunali smo ga tako, da smo razliko med trombinskim vrhom pred in po filtraciji delili z vrednostjo trombinskega vrha pred filtracijo in pomnožili s 100 (enačba 1).
% trombina = trombinPPP − trombinPBM
trombinppp × 100 % Enačba 2
% trombina odstotek trombina, ki je nastal zaradi vpliva mikrodelcev trombinPPP maksimalna koncentracija trombina v plazmi z mikrodelci trombinPBM maksimalna koncentracija trombina vplazmi brez mikrodelcev
3.5 KONCENTRACIJA D-DIMERA IN FIBRINOGENA
Metoda določanja koncentracije D-dimera temelji na principu imunoturbidimetrije. Pri preiskavi smo kot reagent uporabili delce lateksa z vezanimi monoklonskimi protitelesi proti D-dimeru. Specifične in navzkrižne povezave antigen-protitelo privedejo do nastanka premreženih kompleksov (aglutinatov), ki sipajo svetlobo določene valovne dolžine. V prisotnosti D-dimera so se delci lateksa zlepili in povečali motnost vzorca. Razpršenost svetlobe je bila tako sorazmerna količini D-dimera v vzorcu.
Preiskavo smo izvedli na avtomatskem koagulacijskem analizatorju CS-2500 (Sysmex, Japonska). Uporabili smo reagenčni komplet Innovance D-dimer (Siemens, Nemčija). Z analizatorjem smo izmerili vrednosti absorbance in iz umeritvene krivulje odčitali vsebnost D-dimera v testnih vzorcih. V analizatorju je shranjena umeritvena krivulja, na podlagi katere analizator transmitnco pretvori v koncentracijo D-dimera; razmerje med koncentracijo in transmitanco je obratno sorazmerno. Kot razmejitveno vrednost za izključitev venske tromboembolije smo upoštevali 550 μg/L fibrinogenu enakovrednih enot (FEU).
26
Koncentracijo fibrinogena smo merili po Claussovi metodi. Preiskavo smo izvedli na avtomatskem koagulacijskem analizatorju CS-2500 (Sysmex, Japonska). Uporabili smo Siemensov reagenčni komplet Dade® Thrombin Reagent (Siemens, Nemčija).
3.6 STATISTIČNA OBDELAVA PODATKOV
Za statistično obdelavo podatkov in rezultatov meritev smo uporabili statistični program SPSS Statistics 25 (International Business Machines Corporation, ZDA). Normalnost porazdelitve spremenljivk smo preverjali s testom Kolmogorov-Smirnov. Iz raziskave smo izključili ponovitve meritev istega vzorca, kadar je koeficient variacije (KV) znotraj serije presegal 15 %. Izločili smo meritve, ki so se od celokupne povprečne vrednosti meritev razlikovale za več kot 3 standardne odklone. Vrednosti spremenljivk, ki so se razporejale normalno, smo prikazali z aritmetično sredino in standardnim odklonom. Vrednosti spremenljivk, ki se niso razporejale normalno, smo prikazali z mediano in razponom med prvim in tretjim kvartilom.
Oceno ponovljivosti pri globalnih koagulacijskih preiskavah znotraj serije in med serijami ter celokupni koeficient variacije smo izračunali kot koeficient variacije (KV, %) v programu Excel (Microsoft Corporation, ZDA) po spodaj navedeni enačbi (enačba 2).
KV (%) = SD
x̅ × 100 % Enačba 3
KV koeficient variacije SD standardni odklon x̅ aritmetična sredina
Za testiranje razlik med skupinama dveh neodvisnih vzorcev, smo pri normalni porazdelitvi uporabili Studentov t-test, pri nenormalni porazdelitvi pa Mann-Whitneyev U-test. Tako smo testirali razliko med povprečno starostjo moških in žensk ter med seboj primerjali skupine bolnikov (z restenozo in brez restenoze po enem, šestih in dvanajstih mesecih).
Za testiranje razlike med skupinama dveh odvisnih vzorcev smo pri normalni porazdelitvi uporabljali t-test za 2 odvisna vzorca, pri nenormalni porazdelitvi pa smo uporabili Wilcoxonov test predznačenih rangov. Povezave med normalno porazdeljenimi
27
spremenljivkami smo ugotavljali s Pearsonovim korelacijskim koeficientom, nenormalno porazdeljene spremenljivke pa s Spearmanovo korelacijo. Za statistično pomembno smo povsod vzeli vrednost p < 0,05.
Multivariatno analizo smo izvedli z uporabo regresije. Parametre smo najprej standardizirali in tako zagotovili lažjo primerljivost rezultatov posameznih parametrov. S pomočjo postopne regresije, napredujoče regresije in regresije z obratnim opuščanjem smo določili spremenljivke, ki pojasnijo največ variabilnosti v odvisni spremenljivki. Kot interval zaupanja smo vzeli CI = 95 %. Tako smo določili, katere spremenljivke so neodvisno povezane z nastankom restenoze. Z regresijo smo pridobili podatke za izračun občutljivosti, specifičnosti ter pozitivne in negativne napovedne vrednosti.
28
4 REZULTATI
4.1 ZNAČILNOSTI BOLNIKOV
V raziskavo je bilo vključeno 202 bolnikov povprečne starosti 67 ± 9 let, minimalna starost je bila 37, maksimalna starost pa 88 let. Od 202 bolnikov je bilo 143 moških in 59 žensk.
Povprečna starost moških je bila 65 ± 8 let, povprečna starost žensk 70 ± 10 let. Ženske so bile statistično pomembno starejše od moških (p = 0,001), a spol ni statistično značilno vplival na razvoj restenoze v obdobju enega leta (preglednica I).
Eno leto po PTA je do restenoze prišlo pri 73 bolnikih, prehodne arterije pa je ohranilo 118 bolnikov. Za 11 bolnikov eno leto po PTA nismo imeli podatka o restenozi. Klinične značilnosti bolnikov s prehodnimi arterijami in restenozo so prikazane v preglednici I.
Preglednica I: Značilnosti bolnikov s prehodnimi arterijami in restenozo. Vrednosti so mediana (1. kvartil – 3. kvartil) oz. število bolnikov.
Vsi bolniki (N = 202)
Prehodne arterije 12 mesecev po PTA (N = 118)
Razvoj restenoze v 12 mesecih po
PTA (N = 73)
p
Starost (leta) 66 (60–72) 66 (59–72) 69 (62–73) NZ
Spol (moški/ženski) 143/59 84/34 54/19 NZ
Hipertenzija (da/ne) 180/22 112/6 60/13 0,004
Kajenje (da/prekinil/ne) 70/93/39 37/60/21 26/31/16 NZ
Sladkorna bolezen (da/ne) 78/124 44/74 32/41 NZ
Hiperlipidemija (da/ne) 186/16 110/8 67/6 NZ
Gleženjski indeks (pred PTA) 0,62 (0,53–0,75) 0,63 (0,53–0,75) 0,61 (0,50–0,74) NZ Gleženjski indeks (po PTA) 0,90 (0,80–1,00) 0,91 (0,83–1,00) 0,88 (0,74–0,97) 0,019
p = statistična značilnost; NZ – ni statistično značilno (p > 0,05)
Skupini bolnikov s prehodnimi arterijami in bolnikov z restenozo se nista razlikovali v starosti in nekaterih drugih dejavnikih tveganja za aterosklerozo (spol, kajenje, sladkorna bolezen ter hiperlipidemija). Skupini sta se razlikovali v pogostosti hipertenzije (p = 0,004);
prisotnost hipertenzije je bila statistično značilno višja pri skupini bolnikov, ki so imeli v roku enega leta restenozo.
