UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
EDVIN PURIĆ
MAGISTRSKA NALOGA
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
Ljubljana, 2021
EDVIN PURIĆ
Spremljanje internalizacije fluorescentno označene α-D-manozilirane sonde v dendritične celice s superločljivostnim slikanjem
Internalization monitoring of a fluorescently labelled α-D-mannosylated probe into dendritic cells by super-resolution imaging
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
Ljubljana, 2021
Magistrsko nalogo sem opravljal na Katedri za farmacevtsko kemijo na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani, pod mentorstvom prof. dr. Marka Anderluha, mag. farm., in somentorstvom izr. prof. dr. Janeza Mravljaka, mag. farm. Spektroskopske meritve so bile opravljene na Fakulteti za farmacijo (spektrofluorimetrija), fluorescenčna mikroskopija pa na oddelku Fizike kondenzirane snovi (F5), Biofizikalni laboratorij na Institutu Jožef Stefan.
Zahvala
Zahvaljujem se prof. dr. Marku Anderluhu, ki me je vpeljal v svet raziskovanja, za vse nasvete, ideje ter odlično vodenje raziskovalnega dela. Poleg tega se zahvaljujem izr. prof.
dr. Janezu Mravljaku za koristne nasvete, prijaznost in pomoč pri spektroskopskih meritvah.
Hvala tudi Matjažu Weissu za pripravo celic ter pomoč pri pretočni citometriji. Z Instituta Jožef Stefan bi se posebej rad zahvalil dr. Iztoku Urbančiču in Ani Krišelj za pomoč pri pripravi celic in fluorescenčni mikroskopiji.
Za konec bi se rad zahvalil tudi prijateljem in družini za vso podporo ter potrpežljivost tekom študija.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelal pod vodstvom mentorja prof. dr.
Marka Anderluha, mag. farm., in somentorja izr. prof. dr. Janeza Mravljaka, mag. farm.
Edvin Purić
Predsednik komisije: izr. prof. dr. Tomaž Vovk, mag. farm.
Članica komisije: doc. dr. Anja Pišlar, mag. farm.
I KAZALO VSEBINE
POVZETEK ... V ABSTRACT ... VI SEZNAM OKRAJŠAV ... VII
1 UVOD ... 1
1 1 Fluorescenca ... 1
1 1 1 Osnove fluorescence ... 1
1 1 2 Jabłońskijev diagram ... 1
1 1 3 Kvantni izkoristek in življenjska doba fluorescence ... 3
1 2 Fluorescenčna mikroskopija ... 3
1 2 1 Fluorescenčna mikroskopija širokega polja (angl. Wide-field fluorescent microscopy) ... 4
1 2 2 Konfokalna fluorescenčna mikroskopija ... 5
1 2 3 Mikroskopija z vzbujenim praznjenjem emisije ... 6
1 3 Imunski sistem ... 8
1 3 1 Prirojeni in pridobljeni imunski sistem ... 8
1 3 2 Dendritične celice ... 9
1 3 3 Receptor DC-SIGN ... 11
1 3 4 Zgradba DC-SIGN ... 12
1 3 5 Sinteza fluorescentne sonde za DC-SIGN ... 13
2 NAMEN IN NAČRT DELA ... 16
3 MATERIALI IN METODE ... 18
3 1 Materiali ... 18
3 1 1 Reagenti in topila ... 18
3 1 2 Laboratorijska oprema ... 19
3 1 3 Računalniška oprema ... 20
3 2 Metode ... 20
3 2 1 Fluorescenčna spektroskopija ... 20
3 2 2 Pretočna citometrija ... 20
3 2 3 Fluorescenčna mikrospektroskopija (FMS) ... 21
3 2 4 STED (angl. Stimulated Emission Depletion) mikroskop... 22
3 2 5 Priprava vzorcev ... 22
4 EKSPERIMENTALNI DEL ... 24
II
4 1 Merjenje spektrov fluorescentne sonde ... 24
4 2 Določanje pH odvisnosti fluorescentne sonde ... 25
4 3 Fotostabilnost fluorescentne sonde v kiveti ... 25
4 4 Protokol barvanja celičnih membran ... 26
4 4 1 Označevanje LA-4 in MH-S ... 26
4 4 2 Označevanje nezrelih dendritičnih celic ... 27
4 4 3 Blokada DC-SIGN z uporabo neoznačenega protitelesa ... 27
4 4 4 Označevanje velikanskih veziklov iz plazemskih membran (angl. Giant Plasma Membrane Vesicles) ... 28
4 5 Fluorescenčna mikroskopija ... 28
4 5 1 FMS ... 28
4 5 2 STED ... 29
5 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 32
5 1 Absorpcijski in emisijski spektri fluorescentne sonde ... 32
5 2 pH odvisnost sonde ... 34
5 3 Fotostabilnost fluorescentne sonde v kiveti ... 37
5 4 Mikroskopija širokega polja LA-4 IN MH-S ... 40
5 5 Mikroskopija širokega polja iDC-jev ... 41
5 5 1 Morfologija iDC-jev ... 43
5 6 Blokada DC-SIGN receptorjev ... 44
5 7 Študij citotoksičnosti sonde ... 45
5 8 Preverjanje kompatibilnosti sonde s STED laserjem ... 47
5 9 STED mikroskopija iDC-jev ... 49
5 10 Življenjska doba fluorescence ... 51
5 11 Fotostabilnost sonde v celicah ... 52
6 SKLEP ... 53
7 LITERATURA ... 55
III KAZALO SLIK
Slika 1: Jabłońskijev diagram. ... 3
Slika 2: Pot snopa svetlobe pri konfokalni mikroskopiji. ... 5
Slika 3: Prikaz dogajanja pri STED mikroskopiji ... 7
Slika 4: Povezava med prirojenim in pridobljenim imunskim sistemom. ... 9
Slika 5: Struktura receptorja DC-SIGN. ... 12
Slika 6: Struktura 1 in 2 ter izgled raztopin 1 (a) in 2 (b) (1,0 mg/mL v MeOH) pod UV (λ = 364 nm). ... 14
Slika 7: Shema sinteze BODIPY sonde za vrednotenje internalizacije na različnih celičnih linijah .. 14
Slika 8: Osnovna struktura BODIPY. ... 15
Slika 9: Struktura spojine 1. ... 17
Slika 10: Fluorescenčna mikrospektroskopija.. ... 22
Slika 11: Izvedba eksperimenta fotostabilnosti fluorescentnega barvila v kiveti. ... 26
Slika 12: UV-VIS absorpcijski in emisijski spektri spojine 1 v oktanolu in PBS. ... 32
Slika 13: Emisijski in ekscitacijski spekter spojine 1 v oktanolu pri različnih valovnih dolžinah. ... 33
Slika 14: Razširjeni absorpcijski in emisijski spektri spojine 1 v oktanolu, posneti pri dodatnih valovnih dolžinah ekscitacije oz. emisije. ... 34
Slika 15: Graf titriranja koncentracije polisorbata. ... 35
Slika 16: Prikaz emisijskih spektrov spojine 1 v citrat-Na2HPO4 pufru pri pH = 2,6-7,6 v odvisnosti od pH okolice. ... 36
Slika 17: Intenzitete emisijskih spektrov pri 580 nm spojine 1 v odvisnosti od pH raztopine. ... 37
Slika 18: Nastanek singletnega kisika, ki vodi v nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti, kar je vzrok za močno ireverzibilno fotobledenje. ... 38
Slika 19: Emisijski spektri spojine 1 v oktanolu po različnih časih obsevanja z UVA LED diodami (GKMY). ... 39
Slika 20: Prikaz odvisnosti maksimumov emisijskih vrhov spojine 1 v odvisnosti od časa obsevanja z UVA LED diodami. ... 39
Slika 21: Posnetki označenih LA-4 celic s fluorescenčnega mikroskopa (FMS). ... 41
Slika 22: Sliki LA-4 celic s fluorescenčnega mikroskopa (FMS).. ... 41
Slika 23: Posnetki s fluorescenčnega mikroskopa. ... 43
Slika 24: Nezrele dendritične celice označene s spojino 1. ... 43
Slika 25: Slika iDC-jev z uporabo FMS... 44
Slika 26: Blokada DC-SIGN receptorjev z uporabo neoznačenega protitelesa anti-CD209 in nato 1 (desno) v koncentraciji 10 μM... 45
Slika 27: Posnetki iDC (a) in MH-S (b) celic 15 oz. 30 min po označevanju z 10 μM raztopino spojine 1. ... 46
Slika 28: STED mikroskopija GPMV-jev. ... 48
Slika 29: Konfokalne (a) in 3D-STED (b) slike iDC-jev, predhodno označenih z 10 μM raztopino spojine 1. ... 50
Slika 30: Življenjska doba fluorescence.. ... 51
Slika 31: Ocena fotostabilnosti spojine 1 s snemanjem s časovnim zamikom.. ... 52
IV KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: Razlike med nezrelimi in zrelimi dendritičnimi celicami. ... 10
Preglednica II: Priprava citrat-Na2HPO4 pufrov z različnimi pH. Prirejeno po (58). ... 19
Preglednica III: Lastnosti UVA lučke (LED dioda GKMY). ... 20
Preglednica IV: Polnitev prostorov mikrotitrske ploščice. ... 24
Preglednica V: Uporabljene kombinacije filtrov na fluorescenčnem mikroskopu. ... 29
V
POVZETEK
S superločljivostno mikroskopijo lahko opazujemo znotrajcelične procese pod magično mejo valovne dolžine vidne svetlobe 200 nm na nanometrskem nivoju. Za mikroskopijo z vzbujenim praznjenjem emisije, ki je ena izmed izvedbenih variant superločljivostne mikroskopije, so primerne le fluorescentne sonde, ki so kompatibilne z dodatnim laserskim žarkom, ki omogoča praznjenje emisije. Karakterizacija tovrstne sonde je bila osrednji cilj naših raziskav.
V magistrski nalogi smo preučevali proces internalizacije fluorescentne sonde v različne tipe celic. Največ pozornosti smo namenili dendritičnim celicam in receptorju DC-SIGN (za dendritične celice specifični, intracelularno adhezijsko molekulo–3 vezoč neintegrin), ki igra izredno pomembno vlogo pri okužbah z mnogimi patogeni, kot je npr. okužba z virusom humane imunske pomanjkljivosti (HIV). Njegove glavne naloge so prepoznavanje patogenov oz. njihovih površinskih molekul in internalizacije ter prispevek k uničenju patogenov. Kljub vsem tem lastnostim pa lahko DC-SIGN s tem, ko zagotovi vstop patogenov v dendritične celice, tudi pospeši razvoj okužbe, kar je značilno ravno za virus HIV. DC-SIGN veže različne manozilirane proteine, oligomanozide in molekule, ki vsebujejo le eno enoto D-manoze. Preiskovali smo α-D-manozilirano fluorescentno sondo, ki je odporna na glikozidaze in tako zagotavlja stabilnost v celičnih testih. S fluorescenčno spektrofluorimetrijo smo ugotovili, da se njeni emisijski spektri ne spreminjajo v odvisnosti od pH okolice. Nadalje smo dokazali, da sonda prehaja v notranjost celic le, če te na svoji membrani izražajo DC-SIGN receptorje oz. druge lektine, ki vežejo manozo (angl. Mannose binding lectins, MBL). Dodana vrednost preiskovane sonde je primernost za mikroskopijo z vzbujenim praznjenjem emisije, saj je nabor sond, primernih za tovrstno mikroskopijo, precej omejen. Fluorescentna sonda predstavlja visoko učinkovito orodje za opazovanje bioloških procesov, kot je z lektini posredovan celični privzem v različnih bioloških okoljih.
Ključne besede: Fluorescenčna mikroskopija, BODIPY, DC-SIGN, STED mikroskopija
VI
ABSTRACT
Super-resolution microscopy allows observation of cellular phenomena below the “magic”
limit of the visible light wavelength of 200 nm to the nanometer level. For Stimulated Emission Depletion microscopy, only fluorescence probes compatible with an additional laser beam that allows emission depletion are suitable. Characterisation of such a probe was an overarching aim of our research work.
In the master thesis we studied the process of internalisation of a fluorescent probe into different cell types. Most attention was paid to the dendritic cells and the DC-SIGN receptor (Dendritic Cell-Specific, Intracellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin), which plays an important role in infections with many pathogens, such as human immunodeficiency virus (HIV) infection. The main roles of the DC-SIGN are recognition of pathogens/their molecules and internalisation, as well as their contribution to pathogen destruction. Despite all these properties, the DC-SIGN receptor can also accelerate the development of infection, which is a hallmark of HIV virus, by ensuring pathogen entry into dendritic cells. DC-SIGN binds various manosylated proteins, oligomanosides, and molecules containing only one unit of D-mannose. We have investigated an α-D- mannosylated fluorescent probe that is resistant to glycosidases. Fluorescence spectrometry showed that its emission spectra did not change as a function of environmental pH. The behaviour of the probe in different cell types was observed using a fluorescence microscope.
It was demonstrated that the probe passes the interior of cells only when they express DC- SIGN receptors or other Mannose binding lectins (MBL) on their membranes. The added value of the probe is its suitability for Stimulated Emission Depletion Microscopy, as the choice of probes suitable for this type of microscopy is quite limited. All these experiments demonstrated that the fluorescent probe is a highly effective tool for observing biological processes, such as lectin-mediated cell uptake in a variety of biological environments.
Key words: Fluorescence microscopy, BODIPY, DC-SIGN, STED microscopy
VII
SEZNAM OKRAJŠAV
APC – antigen predstavitvena celica (angl. antigen presenting cell)
Atto647N DPPE – 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin označen z Atto barvilom BODIPY – 4,4-difluoro-4-boro-3a,4a-diaza-s-indacen
CD209/SIGNR5 – označevalec pripadnosti 209 (angl. clusters of differentiation 209) CD34 – označevalec pripadnosti 34 (angl. clusters of differentiation 34)
CD4/CCR5 – označevalec pripradnosti 4/kemokinski receptor tipa 5 (angl. clusters of differentiation 4/C-C chemokine receptor type 5)
CLR – lektinski receptor tipa C (angl. C-type lectin receptor)
CRD – domena, ki prepoznava ogljikove hidrate (angl. carbohydrate recognition domain) DAMP – molekularni vzorci povezani s poškodbami (angl. damage-associated molecular pattern)
DC – dendritične celice
DC-SIGN – za dendritične celice specifični, medcelično adhezijsko molekulo-3 vezoči neintegrin (angl. dendritic cell-specific intracellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin)
DMSO – dimetil sulfoksid
DNA – deoksiribonukleinska kislina (angl. deoxyribonucleic acid) DTT – ditiotreitol
FITC – fluorescein izotiocianat
FMS – fluorescenčna mikrospektroskopija
gp120 – glikoprotein, ki se nahaja na površini virusne ovojnice virusa humane imunske pomanjkljivosti
GPMV – velikanski vezikli iz plazemskih membran celic (angl. giant plasma membrane vesicles)
VIII
HEPES – N-(2-hidroksietil)piperazin-N`-2-etansulfonska kislina
HIV – virus humane imunske pomanjkljivosti (angl. human immunodeficiency virus) HPLC – tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (angl. high-performance liquid chromatography)
I – tok
ICAM-3 – medcelična adhezijska molekula 3 (angl. intracellular adhesion molecule-3) iDC – nezrele dendritične celice (angl. immature dendritic cells)
IL-12 – interlevkin 12
ISO – mednarodna organizacija za standardizacijo (angl. international organization for standardization)
LA-4 – mišje celice adenoma pljuč (angl. mouse lung adenoma cells-4) LAF – komora z laminarnim pretokom zraka (angl. laminar air flow) LCIS – fiziološki medij za slikanje celic (ang. live cell imaging solution) LED – svetleča dioda (angl. light-emitting diode)
LFA-1 – levkocitni adhezijski protein (angl. leukocyte function-associated antigen-1) MH-S – mišje celice alveolarnih makrofagov (angl. murine alveolar macrophage) NADPH – reducirana oblika nikotinamid adenin dinukleotid fosfata
Pel – električna moč
PAMP – molekulski vzorci povezani s patogeni (angl. pathogen-associated molecular pattern)
PBMC – mononuklearne celice periferne krvi (angl. peripheral blood mononuclear cells) PBS – fosfatni pufer s soljo (angl. phosphate buffer saline)
PFA – paraformaldehid
PHK II – poglavitni histokompatibilnostni kompleks II (angl. major histocompatibility complex-II)
IX PLL – poli-L-lizin
PRR – receptor, ki prepoznava različne patogene molekulske vzorce (angl. pattern recognition receptor)
rhGM-CSF – rekombinantni humani granulocitno-makrofagne kolonije stimulirajoči dejavnik (angl. recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) rhIL-4 – rekombinantni humani interlevkin-4 (angl. recombinant human interleukin-4) SARS-CoV-2 – koronavirus, ki povzroča resen akutni respiratorni sindrom (angl. severe acute respiratory syndrome coronavirus-2)
STED – mikroskopija z vzbujenim praznjenjem emisije (angl. stimulated emission depletion)
TLR – Toll-u podoben receptor (angl. Toll-like receptor) U – napetost
UV – ultravijolično λ – valovna dolžina
1
1 UVOD
1 1 Fluorescenca
1 1 1 Osnove fluorescence
Pojav fluorescence je leta 1845 odkril Sir Frederik W. Herschel, ki je prišel do spoznanja, da ultravijolična (UV) svetloba vzbudi raztopino kinina, kjer pride do emisije modre svetlobe. Leta 1852 je Sir George Gabriel Stokes pomembno vplival na razumevanje tega procesa. Fenomen, ki ga je odkril Herschel, je podrobno opisal in s tem pomembno prispeval k razumevanju fluorescence (1). Ponovil je poskus z raztopino kininijevega sulfata in ugotovil, da je vpadna svetloba izgubila moč oz. da je svetloba, ki je prečkala plast raztopine, kvalitativno različna. Ta spoznanja so mu omogočila, da je oblikoval danes poznani Stokesov zakon ali Stokesov premik, ki pravi, da je valovna dolžina emitirane svetlobe oz.
emisije vedno večja od valovne dolžine vzbujajoče svetlobe oz. ekscitacije (2). Ena prvih tovrstnih fluorescenčnih molekul kinin, je spodbudila razvoj prvih spektrofluorimetrov v 50.
letih prejšnjega stoletja.
Fluorescenca je vrsta luminiscence, povzročena z vpadnimi fotoni, ki vzbujajo molekulo, elektroni pa slednje preidejo iz osnovnega singletnega stanja v višje oz. vzbujeno elektronsko stanje (3). Vpadli foton pri tem v vidnem delu spektra nosi 2-3 eV energije, sam proces pa se dogodi v zelo kratkem času (10-15 s). Ker je vzbujeno elektronsko stanje nestabilno, traja običajno le nekaj nanosekund (10-9 s). V nekaj pikosekundah (10-12 s) sledi vibracijska relaksacija elektronov najprej v nižje vzbujeno stanje in nato še v osnovno energijsko stanje. Pri tem pride do sproščanja energije v obliki fotonov in pojava fluorescence. Nastala izsevana svetloba ima posledično daljšo valovno dolžino kot svetloba vpadnega žarka (4).
1 1 2 Jabłońskijev diagram
Proces, ki se zgodi med absorpcijo in emisijo svetlobe, nazorno prikazuje t.i. Jabłońskijev diagram, ki se uporablja za prikaz molekularnih procesov, ki se lahko zgodijo v vzbujenem stanju. Diagram je poimenovan po poljskem profesorju Alexandru Jabłońskem, ki velja za očeta fluorescenčne spektroskopije. Gre za energijski diagram, ki opisuje različne procese, ki se dogajajo med in po obsevanju (ekscitaciji). Diagram vsebuje ordinatno os, na kateri so energijske vrednosti, prikazana pa so tudi različna energijska singletna stanja elektronov (5).
2
Na sliki 1 je osnovno singletno stanje prikazano z S0, vzbujeno stanje pa z S1. Fluorofor, tj.
spojina ali del molekule, ki spodbujena s svetlobo določene valovne dolžine, oddaja svetlobo z višjo valovno dolžino, ima lahko več osnovnih singletnih energijskih stanj. Po ekscitaciji oz. absorpciji vpadne svetlobe pride do porasta energije in na ta način preidejo elektroni v višje energijsko stanje (S1). Za vzbujanje uporabljamo svetlobo in ne toplote. Razlog za to je, da z ustrezno svetlobo vzbujamo dokaj selektivno bolj proste elektrone, pri vzbujanju s toploto pa vzbujamo precej neselektivno vse elektrone, hkrati pa lahko vplivamo na neselektivne cepitve (npr. termoliza, nastanek radikalov). Pri molekulah v kondenzirani fazi pride hitro do relaksacije v nižje vibracijsko stanje S1. Proces, ki se zgodi v nekaj pikosekundah, imenujemo interna konverzija (angl. internal conversion). Vzbujeno stanje elektronov je relativno nestabilno. V tem stanju so elektroni le kratek čas (femtosekunde), zato pride do vibracijske relaksacije v nižje vzbujeno (S1) oz. osnovno stanje (S0), običajno z malenkost višjo energijo kot pred vzbujanjem. Zelo zanimiva posledica tovrstne emisije v malenkost višje energijsko stanje je emisijski spekter, ki je prezrcaljena slika absorpcijskega spektra. Vzrok za to je, da ekscitacija ne vpliva na geometrijo jeder. Ta proces emisije svetlobe z višjo valovno dolžino v vidnem delu spektra (400-700 nm) imenujemo fluorescence, kar opisuje že prej omenjeni Stokesov premik (6). Druga možnost je znotrajsistemsko križanje (angl. intersystem crossing) oz. spinska konverzija, ki je na diagramu Jabłońskega označeno kot prehod iz S1 v T1. Emisija, ki izhaja iz tega stanja, je poimenovana kot fosforescenca. Gre pravzaprav za prehod iz singletnega (S1) v tripletno (T1) vzbujeno stanje, kar pa se zgodi ob obratu spina elektronov (5). Ponavadi je tu energijski prehod večji oz. se emisija pojavi pri še višji valovni dolžini v primerjavi s fluorescenco.
Fosforescenca je značilna za molekule z večjimi atomi, kot sta Br2 in I2, kjer elektroni zasedajo višje orbitale (npr. orbitale d) in s preskokom iz slednjih lažje zasedajo druga spinska stanja (6).
3
Slika 1: Jabłońskijev diagram. Prikazani sta obe možnosti, in sicer interna konverzija ter znotrajsistemsko križanje, ki je kvantnomehansko prepovedan prehod.
1 1 3 Kvantni izkoristek in življenjska doba fluorescence
Življenjska doba fluorescence in kvantni izkoristek sta zelo pomembni lastnosti fluoroforov.
Kvantni izkoristek (ϕ) je po definiciji razmerje med številom izsevanih in absorbiranih fotonov (enačba 1). Zavzema vrednosti med 0,01 in 100 (6).
𝜙 = š𝑡𝑒𝑣𝑖𝑙𝑜 𝑖𝑧𝑠𝑒𝑣𝑎𝑛𝑖ℎ 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑛𝑜𝑣
š𝑡𝑒𝑣𝑖𝑙𝑜 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑖𝑟𝑎𝑛𝑖ℎ 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑛𝑜𝑣 (𝑒𝑛𝑎č𝑏𝑎 1)
Življenjska doba fluorescence (τF) je intrinzična lastnost fluorofora in opredeljuje čas, ki ga fluorofor v povprečju prebije v vzbujenem stanju pred emisijo fotona in vrnitvijo v osnovno energijsko stanje. Je neodvisna od koncentracije fluorofora, absorpcije vzorca, metode meritve, intenzitete fluorescence, bledenja in intenzitete ekscitacije (7). Nanjo pa vplivajo temperatura, polarnost in gašenje fluorescence. Življenjska doba fluorescence v splošnem znaša okoli 10 nanosekund. Zelo lep primer so spojine s težkimi atomi (npr. I2), ki imajo krajšo življenjsko dobo fluorescence in nižji kvantni izkoristek (6).
1 2 Fluorescenčna mikroskopija
Leta 1908 sta August Köhler in Henry Wilhelm Siedentopf razvila prvi fluorescenčni mikroskop. Kljub temu je fluorescenčna mikroskopija ostala nepraktična, dokler niso razvili
4
vir UV svetlobe v stanju dinamičnega ravnotežja. Prvi komercialno dostopen fluorescenčni mikroskop so razvili leta 1911 na Dunaju. Uporaba te tehnike je bila v tistem času omejena na avtofluorescenco vzorcev, tj. naravna fluorescenca nekaterih celičnih ali tkivnih sestavin (8). Opazovali so lahko le biomolekule, ki naravno emitirajo/oddajajo fluorescentno svetlobo. Najpogosteje opažene avtofluorescenčne molekule so NADPH in flavini. K avtofluorescenci lahko prispeva tudi zunajcelični matriks zaradi kolagena in elastina. Na splošno proteini, ki vsebujejo povečano količino aminokislin triptofana, tirozina in fenilalanina, kažejo določeno stopnjo avtofluorescence (9,10). Razvoj novih fluoroforov in doprinos metode selektivnega barvanja celičnih struktur sta pomenili uspeh na področju fluorescenčne mikroskopije. V začetku 90. letih prejšnjega stoletja je postala fluorescenčna mikroskopija nepogrešljiva in najpomembnejša tehnika za raziskovanje bioloških procesov na subceličnem nivoju in v realnih fizioloških pogojih (11).
Na začetku so se ti instrumenti uporabljali za osvetljevanje z bližnjo UV svetlobo, kar so omogočale le kompaktne visokotlačne živosrebrove žarnice. V ta namen so uporabljali filtre, narejene iz črnega stekla (Wood-ovi filtri), ki so dobro prepuščali svetlobo valovne dolžine 300-420 nm. Izum dielektričnih premazov, ki je omogočil nanos več plasti na stekleno podlago, je prispeval k izboljšanju same metode (12).
1 2 1 Fluorescenčna mikroskopija širokega polja (angl. Wide-field fluorescent microscopy)
Gre za osnovni fluorescenčni mikroskop, kjer vzporedni žarek svetlobe osvetli celoten vzorec ali široko vidno polje in s tem vzbudi fluorofor (13). Za osvetljevanje vzorcev se uporabljajo živosrebrove ali ksenonske žarnice pod visokim tlakom, željena valovna dolžina ekscitacije in emisije pa je zagotovljena z ustrezno kombinacijo filtrov. Novost na tem področju je uporaba LED diod, ki imajo v primerjavi z ostalimi viri svetlobe daljšo življenjsko dobo in omogočajo boljši nadzor nad valovno dolžino. Svetloba najprej potuje skozi ekscitacijski filter, kar omogoča izbor točno določene valovne dolžine ali območja vzbujanja. Temu sledi dvobarvno zrcalo oz. ˝dichroic˝ filter, ki ločuje svetlobo ekscitacije od svetlobe emisije, poleg tega pa preusmeri svetlobo proti vzorcu. Izsevana svetloba gre skozi emisijski filter, ki prepusti le pas nastavljene valovne dolžine do detektorja (14). Pri širokopasovni fluorescenčni mikroskopiji predstavljajo problem debelejši vzorci (> 2 μm), ki odražajo visoko stopnjo emisije, posledično pa se večina podrobnih lastnosti vzorca izgubi.
5 1 2 2 Konfokalna fluorescenčna mikroskopija
Fluorescenčna mikroskopija se pogosto kombinira s konfokalno mikroskopijo, katere namen je izboljšanje optičnega rezinjenja preučevanega vzorca. Gre za tehniko mikroskopiranja, ki zagotavlja pravo tridimenzionalno optično resolucijo. Slednje omogoča zmanjševanje kakršnega koli signala, ki prihaja iz nefokusirane (angl. out-of-focus) svetlobe, kar izboljša kontrast slike. Je priročno orodje za opazovanje lokalizacije označenih delov v vzorcu. Pot snopa svetlobe pri konfokalni mikroskopiji je prikazana na sliki 2. Bistvena razlika v primerjavi s fluorescenčno mikroskopijo širokega polja je, da svetlobo oddaja laser. Svetloba določene valovne dolžine prehaja skozi luknjo, ogledalo pa jo usmeri proti vzorcu.
Konfokalna mikroskopija zagotavlja le manjše izboljšanje aksialne (ravnina z) in lateralne (ravnini x in y) optične ločljivosti, a je ta vseeno precej manjša v primerjavi s prenosnim elektronskim mikroskopom (15). S konfokalno mikroskopijo izboljšamo tudi razmerje med signalom in šumom. Detektor je pravzaprav fotopomnoževalka, za katero je značilen hiter odziv. Z namenom odpravljanja slabosti konfokalne fluorescenčne mikroskopije je bila razvita fluorescenčna mikrospektroskopija (FMS), ki združuje tako fluorescenčno mikroskopijo kot tudi spektroskopijo (14).
Slika 2: Pot snopa svetlobe pri konfokalni mikroskopiji.
6
1 2 3 Mikroskopija z vzbujenim praznjenjem emisije
Leta 1994 je prišlo do izuma mikroskopije z vzbujenim praznjenjem emisije (angl.
Stimulated Emission Depletion Microscopy, STED), za kar je bila leta 2014 tudi podeljena Nobelova nagrada za kemijo. Ta tehnika je široko uporabljena na področju biomedicine in znanosti materialov ter je tudi ena najuspešnejših metod visokoločljivostne mikroskopije (16). Glavna prednost je izboljšana ločljivost. Poleg konfokalnega mikroskopa je tu še dodatni STED žarek točno določene valovne dolžine, ki ima profil intenzivnosti v obliki kolobarja/torusa in omogoča, da se vzbujeni fluorofori izpraznijo s stimulirano emisijo, kar preprečuje spontano emisijo. Fluorofore, ki se nahajajo na sredini tega žarka, pa stimulira aktivacijska svetloba, kar povzroči spontano fluorescenco. Emisijski spekter večine fluorescentnih barvil je širok, nasprotno pa velja za stimulirano emisijo, kjer je emisijski spekter precej ozko pasoven. Ker je življenjska doba fluorofora v vzbujenem stanju dolga le nekaj nanosekund, zahteva STED visoko intenziteto praznjenja emisije. Na ta način je torej stimulirana emisija dosti hitrejša od spontane emisije, kar je ena od pomembnejših razlik v primerjavi s konvencionalno fluorescenčno mikroskopijo. STED mikroskopija je bila najprej razvita za opazovanje fiksiranih celičnih preparatov, a se je kmalu izkazalo, da dovoljuje tudi opazovanje procesov v živih celicah (17).
STED mikroskopija se torej lahko izvaja z uporabo dveh laserskih žarkov z različnima valovnima dolžinama. Prvi žarek pretvori fluorofor v vzbujeno singletno stanje S1, kar ima za posledico emisijo, medtem ko drugi žarek ustavi proces fluorescence s potiskom že vzbujenih molekul v osnovno energijsko stanje S0, kar imenujemo stimulirana emisija (angl.
Stimulated emission). V praksi to pomeni, da je prvi vzbujevalni žarek pravzaprav Gaussov snop, ki osvetljuje le področja goriščne ravnine, medtem ko je drugi (močnejši) žarek prav t. i. STED žarek, ki zadane vzorec nekaj pikosekund kasneje od prvega vzbujevalnega žarka.
S STED žarkom s tipičnim Gaussovim profilom pride do praznjenja emisije vseh vzbujenih molekul, pri čemer ima ta obliko kolobarja z visoko intenziteto v kolobarju in ničelno v središču, kar je prikazano na sliki 3. Na ta način ostanejo vzbujene le molekul v središču in edine oddajajo fluorescenco (18).
7
Slika 3: Prikaz dogajanja pri STED mikroskopiji (19).
Cilj STED mikroskopije je torej ustvariti učinkovite goriščne volumne subdifrakcijske velikosti, kar je doseženo ravno z omejevanjem regije, v kateri lahko molekule emitirajo svetlobo. Zelo pomembna je izbira fluorofora, kajti zavedati se moramo, da ni vsak fluorofor uporaben za STED mikroskopijo, in tudi strategijo barvanja oz. označevanja. Prvi pogoj je, da mora biti emisijski spekter fluorofora združljiv z valovno dolžino uporabljenega STED laserja, ki je običajno v rdečem delu emisijskega spektra barvila. V nasprotnem primeru je stimulirana emisija neučinkovita. Drugi osnovni pogoj pa je, da morajo imeti fluorofori relativno dolgo življenjsko dobo, saj s tem omogočajo učinkovito stimulirano emisijo. V idealnem primeru ima fluorofor dolgo življenjsko dobo, visok kvantni izkoristek, je fotostabilen, njegov emisijski spekter pa ustreza STED žarku (20).
Ker je preiskovana fluorescentna sonda specifična za DC-SIGN receptorje, katerih izraženost je najvišja pri nezrelih dendritičnih celicah, bomo v naslednjem podpoglavju opisali vlogo dendritičnih celic.
8
1 3 Imunski sistem
Imunski sistem je zelo pomemben sistem človeškega telesa, ki omogoča obrambo oz. zaščito pred mikroorganizmi, kot so virusi, bakterije, glive in paraziti. Daleč nazaj so opazili, da so ljudje, ki so preživeli bolezen po okužbi, razvili zaščito proti tej bolezni, kar danes imenujemo imunost. Obramba proti mikroorganizmom poteka na različnih frontah, vključene so imunske celice in prirojene komponente imunskega sistema vsakega tkiva in organa (21).
1 3 1 Prirojeni in pridobljeni imunski sistem
Imunski sistem delimo na prirojeni in pridobljeni imunski sistem. Prvi predstavlja t. i. prvo linijo obrambe proti patogenom. Molekule in receptorje prirojenega imunskega sistema smatramo kot nespecifične, zagotavljajo pa velik obseg zaščite (21). Vzrok za to je narava receptorjev. Prirojene imunske celice razlikujejo med tujimi mikroorganizmi in lastnim tkivom. Prepoznava antigena tujka torej vodi v aktivacijo signalnih poti in prirojenega imunskega sistem. Za razliko od pridobljenega imunskega sistema najdemo elemente prirojenega imunskega sistem v celotnem živalskem kraljestvu, slednji pa sicer ne zagotavlja imunološkega spomina oz. dolgotrajne zaščite proti okužbam. Med glavne komponente prirojenega imunskega sistema uvrščamo fizikalne bariere, kot sta koža in mukozni epitelij, kemične bariere (npr. protimikrobni peptidi in reaktivne kisikove zvrsti), prirojene imunske celice (npr. monociti, granulociti, dendritične celice in naravne celice ubijalke) ter sestavine humoralne imunosti (npr. sestavine komplementa) in citokine. Imunske celice prirojenega sistema prispevajo k prepoznavi tujka in razlikovanju med ˝svojim in tujim˝, uničevanju patogenov/okuženih celic in odstranjevanju tujkov oz. njihovih delcev s procesom fagocitoze ali citotoksičnosti ter zagotavljanju signalov za začetek vnetja in aktivacijo pridobljenih imunskih celic (22). Pridobljeni imunski sistem sestoji iz visoko specializiranih celic, ki imajo zmožnost prilagoditve novim in divergentnim patogenim mikroorganizmom.
Glavne celice so limfociti T in B, ki nastajajo v kostnem mozgu (21). Sposobne so natančne in specifične prepoznave različnih tujih antigenov, kar je tudi razlog, da pridobljeni imunski sistem označujemo kot specifičnega. Poleg tega so sposobne proizvesti tudi imunološki spomin, torej odpornost proti točno določenemu antigenu po ponovnem stiku z mikrobom, in dolgotrajno zaščito pred mikrobi (23). To je tudi vzrok, da nas lahko nekatere bolezni doletijo ˝le˝ enkrat v življenju. Odgovor, ki ga posreduje pridobljeni imunski sistem, je počasnejši, a vendar bolj učinkovit. Govorimo o parih dneh ob prvem stiku z antigenom,
9
medtem ko je odziv na ponovni stik takojšen (21). Kljub temu, da sta oba sistema med seboj ločena ter imata različne lastnosti in naloge, prihaja do medsebojnih interakcij, kar prikazuje tudi slika 4.
Slika 4: Povezava med prirojenim in pridobljenim imunskim sistemom.
1 3 2 Dendritične celice
Dendritične celice (DC) so najmočnejše in najvplivnejše antigen predstavitvene celice (APC), ki nastajajo iz prekurzorskih celic kostnega mozga. Iz pluripotentne matične celice (CD34+) se razvijeta multipotentna matična celica limfoidne in mieloidne vrste. Nato se iz multipotentne matične celice limfoidne vrste razvijejo plazmacitoidne DC, iz multipotentne matične celice mieloidne vrste pa Langerhansove celice (podvrsta DC) ter intersticijske in dermalne DC (24). Najdemo jih lahko praktično v vseh tkivih. Nahajajo se v dveh različnih stanjih, in sicer kot zrele ali nezrele DC. Nezrele DC so šibki induktorji limfocitov T, saj je zanje značilna nizka izraženost kostimulacijskih molekul in kemokinskih receptorjev na površini. Funkcija nezrelih DC je vzorčenje po periferiji in zajetje antigenov. Pri tem pride do endocitoze posredovane z receptorji, oz. internalizacije celotnega tujka ali antigena, ki se razgradi v endosomih/lizosomih in nato izpostavi na površini DC preko konjugacije s poglavitnim histokompatibilnostnim kompleksom II (PHK II) (25). Tako izražene dele antigena DC prenesejo do posebnih limfocitov T (t. i. CD4+ celice), ki nadalje uravnavajo
10
pridobljeno imunost. Dozorevanje DC sprožijo motnje v homeostazi tkiv, ki jih zaznajo s prepoznavanjem molekularnih vzorcev, povezanih s patogeni (PAMP), ali molekularnih vzorcev, povezanih s poškodbami (DAMP). Med procesom dozorevanja DC izgubijo adhezivne strukture, pride torej do reorganizacije citoskeleta, hkrati pa se pospeši gibanje.
Posledično je znotrajcelična aktivnost manjša in kot že omenjeno se poveča izražanje molekul poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa PHK II, ki so prenašalni proteini (26). Najbolj so poznane po svoji zmožnosti začenjanja pridobljenega imunskega odgovora, ki je včasih celo neodvisen od aktivacije celic T in migracije v sekundarne limfne organe, čeprav so DC znane po tem, da imajo največjo sposobnost aktivacije limfocitov T (27).
Pogosto so nekakšna kritična vez med prirojenim in pridobljenim imunskim sistemom.
Učinkovito prepoznajo potencialno škodljive mikroorganizme preko sistema molekul na celični površini oz. receptorjev, kot so Tollu podobni receptorji (TLR) in lektinski receptorji tipa C (CLR), ki prepoznavajo določene vzorce (angl. pattern recognition receptors).
Aktivacija signalov preko prepoznavanja vzorcev povezanih s patogeni povzroči sproščanje IL-12 iz DC in njihovo migracijo v bezgavke. Citokin IL-12 potem pripravi limfocite T za aktivacijo, zgradba bezgavk pa predstavlja idealno mesto za predstavitev antigena celicam T. Eksogeni antigeni so podvrženi procesu endocitoze in razgradnje v manjše delce oz.
peptide, ki se konjugirajo s prenašalnimi proteini, znanimi pod imenom MHC-II. Ta proces je ključen za začetek pridobljenega imunskega odziva. Limfociti T (poseben tip – limfociti CD4+) so sposobni prepoznati nastali kompleks peptid-MHC preko T celičnih receptorjev, kar je tudi prvi signal za aktivacijo limfocitov T (22). Razlike med nezrelimi in zrelimi dendritičnimi celicami so prikazane v preglednici I.
Preglednica I: Razlike med nezrelimi in zrelimi dendritičnimi celicami.
Nezrele dendritične celice Zrele dendritične celice Manj kostimulacijskih molekul Več kostimulacijskih molekul Manjša izraženost molekul MHC-II Večja izraženost molekul MHC-II Večja kapaciteta fagocitoze Manjša kapaciteta fagocitoze
Manjše izločanje provnetnih citokinov Večje izločanje provnetnih citokinov
11
Za popolno aktivacijo limfocitov T je potrebna tudi vezava kostimulacijskih molekul (CD80 in CD86), prisotnih na APC, in ustreznih ligandov na limfocitih T, kot je npr. CD28. Takšne kostimulacijske molekule so sposobni izražati le DC, makrofagi in limfociti B (28).
1 3 3 Receptor DC-SIGN
Za dendritične celice specifični, intracelularno adhezijsko molekulo – 3 vezoč neintegrin (DC-SIGN) je receptor na DC, ki spada v družino lektinskih receptorjev tipa C (29). Odkrili so ga z opazovanjem intracelularne adhezijske molekule-3 (ICAM-3), ko so opazili, da se ta veže na receptor z visoko afiniteto. Kljub temu, da se ICAM-3, znana tudi kot CD50, ki sicer spada v družino imunoglobulinov, veže na levkocitni adhezijski protein LFA-1, pa to ne vpliva na vezavo ICAM-3 na DC (30–32). Izražanje receptorja je visoko v monocitih in iz monocitov pridobljenih DC CD34+, pa tudi v nezrelih in zrelih DC v različnih tkivih in organih, kot so usnjica, mukoza, vranica, placenta in pljuča (alveolarne DC). Udeležen je tako v prirojenem kot tudi pridobljenem imunskem odgovoru, kjer ima zelo pomembno vlogo. DC-SIGN prepozna širok nabor mikroorganizmov, ki na površini vsebujejo proteine s pripetimi monosaharidi D-manozo in L-fukozo, kot so virus Ebola, virus hepatitisa C, virus Denga, citomegalovirus, virus HIV, virus SARS-CoV, bakterije Mycobacterium tuberculosis in Helicobacter pylori ter parazit Leischmania pifanoi. Ko se patogen oz.
njegov antigen veže na DC-SIGN, nastane kompleks, ki z internalizacijo preide v celico oz.
natančneje v lizosome/endosome. Kisel pH v lizosomih/endosomih sproži razpad nastalega kompleksa, kar povzroči tudi razgradnjo patogena na manjše delce, kateri potem, vezani na protein MHC II in izpostavljeni na površini DC, prispevajo k sprožitvi imunskega odgovora (33). Še posebej je njegova vloga zanimiva pri prepoznavanju in zajetju virusa imunske pomanjkljivosti 1 (HIV-1), kjer pride do vezave gp120 na DC-SIGN (34). Virus HIV-1 na ta način vstopi v celico, vendar se nastali kompleks virus-DC-SIGN izogne internalizaciji v lizosome. DC-SIGN se posledično reciklira nazaj na celično površino. Virus HIV-1 s
˝prikrivanjem˝ v celici ostane zaščiten med procesom migracije v limfna tkiva, kar omogoča okuženim DC prenos virusa na CD4+ celice, kar imenujemo prenos trans ali transfekcija.
DC-SIGN pa lahko alternativno služi tudi kot receptor za prenos cis, kjer se virus prenese na CD4/CCR5 receptorje, izražene na nezrelih DC, in tako preko različnih mehanizmov omogoči po sprostitvi DNA tudi funkcionalno okužbo DC (35–39). Letno na svetovni ravni zaradi okužbe z virusom HIV umre cca. 1,5 milijona ljudi, kar je več kot pri ostalih okužbah z izjemo SARS-CoV-2 (40). Heteroseksualni prenos je glavna pot širjenja okužbe z virusom
12
HIV in predstavlja kar 80 % vseh okužb s tem virusom. Ravno zaradi dejstva, da se nahajajo v mukozi in limfnem tkivu, so DC ene prvih celic, ki pridejo v stik z virusom HIV-1 (41).
DC imajo pomembno vlogo pri patogenezi tako aktivne kot tudi latentne okužbe, kjer DC- SIGN veže glikoprotein ovojnice (gp120) virusa HIV in na ta način pospeši oz. olajša transfekcijo celic CD4+ (40). DC-SIGN ima torej jasno vlogo v imunskem odgovoru, vendar izjemoma lahko tudi pospeši razvoj okužbe s tem, ko zagotovi vstop patogenov v DC (29).
1 3 4 Zgradba DC-SIGN
DC-SIGN receptor vsebuje štiri različne domene: transmembransko, citoplazemsko, vratno in domeno za prepoznavanje ogljikovih hidratov (CRD), od katerih sta najpomembnejši zadnji dve, zunajcelični domeni (42). Zgradba DC-SIGN receptorja je prikazana na sliki 5.
Slika 5: Struktura receptorja DC-SIGN. Prirejeno po (43).
13
CRD je od kalcija odvisna domena za prepoznavanje ogljikovih hidratov, ki predstavlja srce procesa prepoznavanja molekul, ki ga narekuje DC-SIGN. Odgovorna je za interakcijo visoko glikoziliranih struktur na površini patogenov (npr. ovojnični glikoprotein gp120), posledično internalizacijo kompleksa patogen-receptor in predstavitev na površini celic kot del obrambe. Veže torej predvsem specifične strukture, ki vsebujejo manozo, fukozo ali galaktozo (44). Hidrofobna vratna domena je sestavljena iz sedem in pol ponovitev, kjer vsaka izmed ponovitev vsebuje 23 aminokislinskih ostankov, le zadnja jih ima 15. Velika je med 20 in 30 nm in ima pomembno vlogo pri vezavi patogena, saj omogoča tetramerizacijo receptorja DC-SIGN. Ta domena naj bi tudi stabilizirala oligomere in usmerjala CRD stran od celične površine, kar omogoča multivalentno interakcijo CRD z ligandi glikanov (42,45,46).
1 3 5 Sinteza fluorescentne sonde za DC-SIGN
DC-SIGN specifično prepoznava antigene z D-manozo ali L-fukozo, zato je treba pri ciljanju receptorja DC-SIGN v strukturo sonde vključiti enega od naštetih sladkorjev. Raziskovalci Univerze v Firencah v Italiji so pripravili po en BODIPY-manozni konjugat (v nadaljevanju spojina 1), ki smo ga kasneje tudi preizkusili na več celičnih linijah, in en BODIPY-glukozni konjugat (v nadaljevanju spojina 2), ki pa ga nismo uporabili pri študiju internalizacije, saj so raziskovalci v Italiji ugotovili, da nima afinitete do DC-SIGN receptorja (47). Strukturno sta konjugata predstavljena na sliki 6, medtem ko je sintezna pot konjugatov prikazana na sliki 7.
14
Slika 6: Struktura 1 in 2 ter izgled raztopin 1 (a) in 2 (b) (1,0 mg/mL v MeOH) pod UV (λ = 364 nm) (47).
Slika 7: Shema sinteze BODIPY sonde za vrednotenje internalizacije na različnih celičnih linijah (47).
15
BODIPY (4,4-difluoro-4-boro-3a,4a-diaza-s-indacen) fluorescentna barvila, katerih osnovna struktura je prikazana na sliki 8, so bila predstavljena že davnega leta 1968 (48).
Gre za visoko fluorescirajoča barvila, ki imajo visok molarni absorpcijski koeficient, ozkopasovno širino emisije, visok kvantni izkoristek in relativno visoko fotokemijsko stabilnost (48–50). Pomembna značilnost te vrste fluorescentnih sond je visoka celična permeabilnost in biokompatibilnost, zaradi česar so primerno orodje za biološko označevanje. Pravzaprav gre za malce nenavadna fluorescentna barvila, saj so relativno nepolarna, kromofor pa je elektronevtralen. Ravno te lastnosti minimizirajo z barvili povzročene motnje konjugiranih funkcionalnih lastnosti. Uporabljajo se za tvorbo fluorescentnih konjugatov s proteini, nukleotidi, oligonukleotidi in dekstrani, pa tudi za pripravo fluorescentnih encimskih substratov, fosfolipidov, lipopolisaharidi, receptorskih ligandov in polistirenskih mikrosfer. Zaradi visoke intenzivnosti vrhov so fluorescentna barvila vrste BODIPY med najbolje zaznavnimi amino derivatnimi reagenti za uporabo pri HPLC in kapilarni elektroforezi (51).
Slika 8: Osnovna struktura BODIPY.
Ker gre za na prvi pogled dokaj lipofilno osnovo, je potrebna konjugacija BODIPY z ogljikovimi hidrati, s tem pa se izboljša vodotopnost in selektivnost za specifične CLR (52).
Zlasti derivati mono- in disaharidov so bili konjugirani na mezo položaju in položajih 2,3,5,6 jedra BODIPY ter tudi atoma bora s principom azid-alkin ˝klik˝ kemije, kjer so kot katalizator uporabili Cu(I). Pri BODIPY fluoroforu je prisotna C-glikozidna vez z aril- azidno skupino na mezo položaju, kar zagotavlja metabolno stabilnost proti glikozidazam (53–57).
Namen raziskovalnega dela je karakterizacija BODIPY-manozne fluorescentne sonde, kar je zelo pomemben del pri razvoju novih sond.
16
2 NAMEN IN NAČRT DELA
Lastnosti DC-SIGN receptorja so poznane že kar dolgo časa. Na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani, je bilo v preteklosti izvedenih mnogo raziskav tovrstnih receptorjev, sintetiziranih pa je bilo tudi precej potencialnih antagonistov receptorja. Zaradi pomembnosti procesa internalizacije pri mnogih okužbah je zato zelo pomembno, da se razvijajo visoko zmogljiva fluorescentna orodja, ki bi omogočala spremljanje tovrstnega procesa. To pa je tudi namen našega raziskovalnega dela.
V magistrski nalogi želimo ovrednotiti selektivno internalizacijo BODIPY-manozne sonde po vezavi na DC-SIGN s fluorescenčno mikroskopijo. Pri tem bomo uporabili različne celične linije, ki imajo različno stopnjo izraženosti DC-SIGN receptorjev, in sicer: LA-4 oz.
mišje celice adenoma pljuč, ki služijo kot negativna kontrola, saj nimajo izraženih DC- SIGN, MH-S oz. mišje celice alveolarnih makrofagov, ki imajo izražene DC-SIGN, in iDC- je oz. nezrele dendritične celice, ki imajo najvišjo stopnjo izraženosti DC-SIGN.
Najprej bomo ovrednotili fluorescentne lastnosti spojine 1, katere struktura je prikazana na sliki 9. Posneli bomo absorpcijski in emisijski spekter spojine 1, da lahko predvidimo, v katerem delu spektra bi bilo idealno vzbujati fluorescenčno sondo. Poiskali bomo topilo, v katerem se bo sonda dobro topila. Po posnetem absorpcijskem in emisijskem spektru bomo določili optimalno območje valovnih dolžin ekscitacije in emisije, kar nam bo omogočilo kakovostno vizualizacijo sonde v različnih tipih celic. Čeprav na prvi pogled fluorescentno barvilo ne vsebuje kislih ali bazičnih centrov, kjer bi lahko prišlo do ionizacije, bomo preverili njegovo občutljivost na pH. Pričakujemo, da bo emisijski vrh sonde pri vseh izbranih pH vrednostih pri enaki valovni dolžini in približno enake intenzitete. V ta namen bomo pripravili raztopine pufrov z različnimi pH vrednostmi in pomerili emisijski spekter spojine s pomočjo spektrofluorimetra. Ker so fluorescentna barvila občutljiva na svetlobo in morajo biti zato shranjena v temnem prostoru, bomo pomerili tudi njeno fotostabilnost po obsevanju s svetlobo iz LED-diod.
17
Slika 9: Struktura spojine 1.
Na Institutu Jožef Stefan bomo fluorescentno sondo preizkusili na izbranih celicah. S pomočjo fluorescenčne mikrospektroskopije (FMS) bomo z uporabo spojine 1 vrednotili njeno internalizacijo po vezavi na receptor DC-SIGN. Predvidevamo, da se bo spojina 1 vezala na DC-SIGN receptor, po internalizaciji liganda in receptorja pa se bo sonda kopičila v strukturnih delih celice, za katere domnevamo, da bi lahko bili lizosomi oz. endosomi.
Uporabili bomo torej različne tipe celic, ki imajo različno ekspresijo DC-SIGN receptorjev.
Pričakujemo, da bo sonda pri barvanju membran LA-4 celic ostala zunaj celice oz. ne bo prešla v znotrajcelične dele, medtem ko pri barvanju membran MH-S celic in še posebej iDC-jev pričakujemo, da bo sonda z internalizacijo DC-SIGN vstopila v znotrajcelične dele.
Predvidevamo, da je internalizacija z vezavo na DC-SIGN receptor specifična.
Na koncu želimo preveriti, ali je spojina 1 dejansko uporabna tudi za študij internalizacije z uporabo STED mikroskopije, za katero je značilna bistveno večja ločljivost. Nabor fluorescentnih barvil, ki so kompatibilne s STED laserjem, je namreč precej omejen. Poleg tega želimo izboljšati resolucijo slik, pridobljenih z FMS, in na ta način preveriti, kakšna je porazdelitev sonde v celicah. V tem primeru bomo za študij internalizacije izbrali celice, v katerih je stopnja izraženosti DC-SIGN in drugih manoza-vezočih lektinov na njihovih membranah zelo visoka.
18
3 MATERIALI IN METODE 3 1 Materiali
3 1 1 Reagenti in topila
Pri raziskavi smo v laboratoriju uporabili reagente in topila različnih proizvajalcev, kot so:
Acros Organics, ATCC, Fluka, Gibco, Merck in Sigma-Aldrich. Za vrednotenje internalizacije DC-SIGN smo uporabili spojino 1. Osnovno raztopino fluorescentnega barvila smo pripravili v DMSO tako, da je bila končna koncentracija sonde 1 mM. Pufer PBS smo pripravili tako, da smo 2 g NaCl, 0,05 g KCl, 0,36 g Na2HPO4 in 0,06 g KH2PO4
raztopili v destilirani vodi do 250 mL. pH nastalega PBS pufra je bil 7,4, kar smo tudi preverili s pH metrom. Citratni-Na2HPO4 pufer smo pripravili tako, da smo najprej pripravili posamezni raztopini citronske kisline (21,01 g v 1 L vode) in Na2HPO4 (28,40 g v 1 L vode) ter ju nato z določenim volumskim razmerjem pomešali, da smo dobili pufre z različnimi pH, kar je predstavljeno v preglednici II (58,59). Pri določanju občutljivosti na pH smo uporabili še polisorbat (Tween® 80) iz osnovne raztopine (10% v vodi). Raztopino polisorbata smo pripravili z redčenjem, in sicer tako, da smo 500 mg Tween® 80 (ρ = 1,06 g/mL) redčili s 4500 μL prečiščene vode. Vsi reagenti in topila so bili ustrezne čistosti, kot jih je navedel proizvajalec. Fluorescentno sondo smo pred označevanjem celic redčili z LCIS (angl. Live Cell Imaging Solution, Molecular Probes®). Gre za fiziološki medij, ki je namenjen za slikanje živih celic in tudi za spiranje. Je optično čist pufer s pH = 7,4, ki ohranja celice zdrave na sobni temperaturi in atmosferskem tlaku tudi do 4 ure (60). Pri fluorescenčni mikroskopiji smo z namenom blokade DC-SIGN receptorjev uporabili neoznačena mišja anti-humana CD209 protitelesa (mAB AZND1, Beckman Coulter, Indianapolis, IN, ZDA).
Pri tem eksperimentu smo uporabili tudi s FITC označena mišja anti-humana CD209 protitelesa (Biolegend, San Diego, CA, ZDA). Pri analizi celic s pretočno citometrijo smo uporabili anti-CD14 Pacific Orange (ThermoFisher Scientific, MA, ZDA), anti-DC-SIGN APC/Fire 750, anti-CD80 AF 488, anti-CD83 APC/Fire 750, anti-CD86 Pacific Blue, anti- HLA-DR PerCP, anti-CD85k APC, anti- CD207a PE (vsa Biolegend, San Diego, CA, ZDA).
Pri določanju fotostabilnosti fluorescenčne sonde smo za primerjavo uporabili tudi široko uporabljano sondo Atto647N DPPE.
19
Preglednica II: Priprava citrat-Na2HPO4 pufrov z različnimi pH. Prirejeno po (58).
pH pufra mL 0,1 M citronska kislina mL 0,2 M Na2HPO4
2,6 89,10 10,90
3,0 79,45 20,55
3,6 67,80 32,20
4,0 61,45 38,55
4,6 53,25 46,75
5,0 48,50 51,50
5,6 42,00 58,00
6,0 36,85 63,15
6,6 27,25 72,75
7,0 17,65 82,35
7,6 6,35 93,65
3 1 2 Laboratorijska oprema
• Tehtnica Mettler Toledo AE240
• Magnetno mešalo IKA® RCT basic IKAMAG Magnetic stirrer
• Pipete (0,5-10 μL, 10-100 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL)
• Mikrocentrifugirke (0,5 mL in 1,0 mL)
• Plošče z x vdolbinicami za gojenje celic (ibidi)
• Mikrotitrska ploščica
• Sušilnik
• Centrifuga
• pH-meter The SevenCompactTM Mettler Toledo
• Fluorescenčni spektrometer Perkin Elmer LS-55
• LAF komora za pripravo vzorcev (na IJS)
• Fluorescenčni mikrospektrometer (FMS)
• STED mikroskop Abberior Instruments
• Pretočni citometer Attune NxT
• Čitalec mikrotitrskih plošč Tecan Safire
20 3 1 3 Računalniška oprema
Pri snemanju spektrov s pomočjo spektrofluorimetra Perkin Elmer LS-55 smo uporabljali program FT WinLab, ki povezuje spektrofluorimeter in računalnik (61). Številčni zapis dobljenih spektrov smo s pomočjo tega programa pretvorili iz binarnega v ASCII sistem, kar nam je omogočilo izvoz podatkov v Microsoft Excel in kasnejše risanje spektrov. Za pretvorbo in izvoz mikroskopskih slik smo uporabljali prosto-dostopna programa IrfanView 64-bit, proizvajalca Irfan Skiljan, in FIJI ImageJ 64-bit.
3 2 Metode
3 2 1 Fluorescenčna spektroskopija
Fluorescenčne spektre spojine 1 smo posneli s spektrofluorimetrom Perkin Elmer LS-55.
Meritve smo opravljali na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani. Tako za merjenje spektra kot tudi za ugotavljanje pH odvisnosti spojine 1 smo uporabili kvarčno kiveto z dolžino optične poti 10 mm, proizvajalca Perkin Elmer. Emisijski in ekscitacijski spekter smo posneli pri različnih valovnih dolžinah, hitrost snemanja pa je bila pri vseh 300 nm/min.
Pri merjenju fotostabilnosti preiskovane fluorescentne sonde smo za vzbujevalno svetlobo uporabili LED diode z valovno dolžino 365-368 nm, njene lastnosti pa so navedene v preglednici III. Po meritvah smo spektre izvozili v Microsoft Excel in narisali grafe.
Preglednica III: Lastnosti UVA lučke (LED dioda GKMY).
U (napetost na diodi) 3,1 V
I (tok čez diodo) 340 mA
Pel (električna moč na diodi) 1 mW λ max (maksimalna valovna dolžina) 373 nm
% Popt 375 nm (delež izsevane moči svetlobe pod določeno valovno dolžino)
45
% Popt 370 nm 16
% Popt 350 nm 0
3 2 2 Pretočna citometrija
Meritve nivojev membranskih označevalcev so bile opravljene na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani, kjer smo uporabili pretočni citometer Attune NxT proizvajalca
21
Thermo Fisher Scientific. V ta namen smo uporabili fluorescentno označena protitelesa dveh proizvajalcev, in sicer: Thermo Fisher Scientific in Biolegend. Določili smo odstotek izoliranih monocitov, tj. čistost populacije (celice CD14+), po diferenciaciji pa smo nato določili ekspresijo specifičnih markerjev za nezrele dendritične celice (CD209, CD80, CD86 in HLADR). Na ta način smo potrdili uspešnost diferenciacije monocitov do nezrelih dendritičnih celic. Podatki so bili obdelani s programom FlowJo.
3 2 3 Fluorescenčna mikrospektroskopija (FMS)
Porazdelitev spojine 1 v celicah smo opazovali s pomočjo fluorescenčnega mikroskopa, prikazanega na sliki 10. Fluorescenčni mikroskop je povezan s programom MATLAB, ki zapisuje vse korake in nastavitve, ki jih tekom meritev spreminjamo in po potrebi zapisuje tudi možne napake. Glavni del je inverzni mikroskop Nikon Eclipse TE2000-E, ki je opremljen z visoko natančno motorizirano premično mizico Prior Scientific ProScan II, na katero položimo vzorec, in številnimi objektivi. Uporabljali smo 10x in 60x vodni imerzijski objektiv. Vir vzbujevalne svetlobe je Xe-Hg obločna svetilka (Sutter Lambda LS). Slike opazovanih objektov zagotavlja QImaging Rolera MGi EMCCD kamera, ki se nahaja pravokotno glede na optično pot žarka (62–64). Termoelektrično hlajenje tipala na temperaturo -10 °C pa zagotavlja manjši vpliv šuma pri daljših časih vzbujanja (65). Zelo pomemben del fluorescenčnega mikroskopa so tudi filtri, ki prepuščajo svetlobo določene valovne dolžine. Med ekscitacijskimi in emisijskimi filtri se nahaja še dvobarvno zrcalo (angl. dichroic filter). Pri opazovanju celic s fluorescentno sondo smo uporabili sledečo kombinacijo filtrov: ekscitacijski filter je bil nastavljen na 604-644 nm, dvobarvno zrcalo na 655 nm in emisijski filter na 658-734 nm. Meritve smo izvajali na Institutu Jožef Stefan pri sobni temperaturi, mikroskop pa se nahaja v čistem prostoru po standardu ISO 6 (66).
22
Slika 10: Fluorescenčna mikrospektroskopija. Gre za specifični mikroskop, s katerim smo na Institutu Jožef Stefan opazovali s spojino 1 označene celice.
3 2 4 STED (angl. Stimulated Emission Depletion) mikroskop
Meritve so potekale na Institutu Jožef Stefan pri sobni temperaturi v čistem prostoru po standardu ISO 6 (61). Za konfokalno in superločljivostno snemanje smo torej uporabili Abberior Instruments STED mikroskop opremljen s 60x/NA1.2 vodnim imerzijskim objektivom proizvajalca Olympus (67,68). Fluorescenco smo vzbujali z dvema impulznima laserjema valovnih dolžin 561 in 640 nm, zaznali pa smo jo s fotodiodami preko emisijskih filtrov, nastavljenih na območje 580-630 nm oz. 650-720 nm. Ločljivost slik smo dodatno izboljšali z uporabo laserja valovne dolžine 775 nm, kar je omogočilo pridobitev 2D-STED in tudi z-STED profilov. Nastale slike smo po koncu poskusov obdelali v prosto dostopnem programu Fiji ImageJ.
3 2 5 Priprava vzorcev
3 2 5 1 Priprava dendritičnih celic pridobljenih iz monocitov
Plast bogato z levkociti in trombociti (angl. Buffy coat) je iz venske krvi zdravih prostovoljcev v skladu z institucionalnimi smernicami pridobil Zavod Republike Slovenije za transfuzijsko medicino. Nato smo izolirali mononuklearne celice periferne krvi (PBMC)
Nadzorna plošča 2
Nadzorna plošča 1 Vzorec
Kamera FMS, LCTF filter Filtri, ki prepuščajo svetlobo ustreznih valovnih dolžin
Mikroskop
23
z uporabo Lymfoprep (Stemcell Technologies, Vancouver, Kanada). Celice smo nadalje dvakrat sprali s PBS, jih prešteli in uporabili kot vir za imunomagnetno negativno izolacijo CD14 pozitivnih celic (EasySep, Stemcell Technologies, Vancouver, Kanada). Te celice, katerih čistost je bila vedno večja od 95% (določeno s pretočno citometrijo), smo gojili v mediju RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, MO, ZDA), ki je bil dopolnjen z 10 % fetalnim govejim serumom (Gibco, NY, ZDA), 50 U/mL penicilina in 50 μg/mL streptomicina (Sigma- Aldrich, MO, ZDA), 800 U/mL rhGM-CSF in 1000 U/mL rhIL-4 (Biolegend, San Diego, CA). Koncentracija celic je bila 1x106 celic/mL. Tretji dan smo polovico medija zamenjali z dodatkom začetnih količin rhGM-CSF in rhIL-4. Po 5 dneh smo nepritrjene iDC-je prenesli v novo centrifugirko, jim določili koncentracijo ter jih označili za določevanje lastnosti s pretočno citometrijo.
3 2 5 2 Postopek označevanja celic za fluorescenčno mikroskopijo
Celice smo pripravili in označili v laboratoriju za biofiziko na Institutu Jožef Stefan, kjer smo uporabili plošče z različnim številom vdolbinic (ibidi), ki smo jih predhodno prekrili z 0,1 % raztopino poli-L-lizina. Pred označevanjem smo pripravili raztopine fluorescentne sonde z različnimi koncentracijami (1 in 10 μM). Celice smo nato označili tako, da smo raztopine fluorescentne sonde odpipetirali v vdolbinice s celicami, nakar je sledila inkubacija (pogoji so odvisni od vrste uporabljenih celic) oz. spiranje celic z namenom odstranitve prebitne količine fluorescentne sonde. Z namenom blokade DC-SIGN oz. CD209/SIGNR5 receptorjev smo uporabili raztopino prečiščenih mišjih CD209 protiteles (mAB AZND1, Beckman Coulter, Indianapolis, IN, ZDA), ki so monoklonska protitelesa proti receptorju DC-SIGN. Pri tem smo v vdolbinice z iDC-ji najprej odpipetirali raztopino protiteles in jih inkubirali 15 min, čemur je sledilo označevanje celic s fluorescentno sondo. Na ta način so bile celice na voljo za fluorescenčno mikroskopijo.
24
4 EKSPERIMENTALNI DEL
4 1 Merjenje spektrov fluorescentne sonde
Spojino 1 smo hranili ves čas zaščiteno pred svetlobo in v hladilniku. Najprej smo pomerili absorpcijski spekter spojine 1. Ker ima fluorescentna sonda tako lipofilne kot tudi hidrofilne dele (dve manozi), smo se odločili, da kot topilo uporabimo oktanol, kar se je v tem primeru izkazalo za dobro. Poleg oktanola smo uporabili še PBS, ki smo ga pripravili tik pred meritvijo. V 1 mL mikrocentrifugirkah smo pripravljali raztopine spojine 1 s koncentracijo 10 μM z različnimi topili. Pripravili smo po 500 μL testne raztopine sonde in oktanola (5:495), barvila in PBS (5:495) ter po 500 μL slepe raztopine DMSO in oktanola (5:495) ter DMSO in PBS (5:495). Nato smo iz pripravljenih raztopin pripravili tudi manj koncentrirane raztopine (0,1 μM), in sicer tako, da smo iz vsake raztopine odpipetirali po 5 μL v nove centrifugirke in dopolnili do 500 μL z enakimi topili. Mikrotitrsko ploščico smo razdelili na dva dela in nazadnje smo raztopine odpipetirali v ustrezne vdolbinice mikrotitrske ploščice (A1, C1, E1, G1 in A7, C7, E7 in G7). Končni volumen raztopin v mikrotitrski ploščici je bil 300 μL, uporabljeni koncentraciji spojine 1 pa 10 μM in 0,1 μM. Vsebina vdolbinic mikrotitrske ploščice je prikazana v preglednici IV.
Preglednica IV: Polnitev prostorov mikrotitrske ploščice.
črka/številka 1 7
A sonda (10 μM) + oktanol sonda (0,1 μM) + oktanol
C DMSO + oktanol DMSO + oktanol
E sonda (10 μM) + PBS sonda (0,1 μM) + PBS
G DMSO + PBS DMSO + PBS
Mikrotitrsko ploščico smo zaradi občutljivosti fluorescentnega barvila shranili zaščiteno pred svetlobo in s čitalcem mikrotitrskih plošč Tecan pomerili absorpcijske in emisijske spektre. Pred samo meritvijo smo v programu nastavili lokacijo slepih raztopin, kar pa je instrument pred izrisom spektrov tudi samodejno upošteval.
Emisijske in ekscitacijske spektre spojine 1 pri različnih valovnih dolžinah vzbujanja smo posneli tudi s spektrofluorimetrom Perkin Elmer LS-55. Namen snemanja spektrov je bil določiti optimalne valovne dolžine vzbujanja in emisije, saj smo lahko le tako s pomočjo
25
fluorescenčne mikroskopije dobili kakovostne posnetke celic s fluorescentno sondo. V 1 mL mikrocentrifugirki smo pripravili 1 μM raztopino spojine 1 v oktanolu. Pomerili smo emisijske spektre pri valovnih dolžinah vzbujanja: 540 nm, 560 nm, 580 nm, 600 nm. Poleg tega pa smo posneli tudi ekscitacijski spekter pri nastavljeni valovni dolžini emisije 720 nm.
Uporabili smo kvarčno kiveto z dolžino optične poti 10 mm. Pri vseh meritvah je bila hitrost snemanja 300 nm/min. Spektri so prikazani v poglavju Rezultati in Razprava na sliki 13.
Posneli smo tudi spektre pri več valovnih dolžinah, saj smo se želeli prepričati, da smo postopek izvedli pravilno, ter tako tudi preveriti samo ponovljivost meritev. Tokrat smo izbrali še sledeče valovne dolžine vzbujanja: 360 nm, 380 nm, 475 nm, 560 nm, 600 nm, 640 nm in 780 nm, ter valovno dolžino emisije pri 720 nm. Hitrost snemanja spektrov je bila kot v prejšnjem primeru 300 nm/min, uporabili pa smo enako kiveto. Spektri so prikazani v poglavju Rezultati in Razprava na sliki 14.
4 2 Določanje pH odvisnosti fluorescentne sonde
Najprej smo ločeno pripravili raztopini citronske kisline in Na2HPO4. Nato smo iz teh dveh raztopin pripravili citrat-Na2HPO4 pufre z različnimi pH (opisano v poglavju Materiali).
Vsem pufrnim raztopinam smo nato pomerili pH s pH-metrom in korigirali pH po potrebi z dodatkom citronske kisline oz. Na2HPO4 do želene vrednosti. Poleg tega smo uporabili tudi 10 % osnovno raztopino polisorbata (Tween® 80, Sigma-Aldrich), ki smo jo predhodno redčili. Kasneje smo optimalno količino polisorbata določili s titracijo, saj smo želeli doseči maksimalen možen kvantni izkoristek v modificiranem vodnem okolju s polisorbatom. Na koncu smo pripravili raztopine spojine 1 s citrat-Na2HPO4 pufrom in polisorbatom. V kvarčno kiveto z dolžino optične poti 10 mm smo za vsako meritev posebej odpipetirali po 468 μL pufra (vsakič drug pH), 30 μL 10 % raztopine polisorbata in 2 μL spojine 1.
Koncentracija spojine 1 v kiveti je bila 4 μM.
Nato smo pomerili spektre spojine 1 pri različnih pH-jih s pomočjo spektrofluorimetra Perkin Elmer LS-55. Spektre smo posneli v območju valovnih dolžin od 620 do 900 nm in pri valovni dolžini vzbujanja 580 nm. Hitrost snemanja spektrov je bila 300 nm/min.
4 3 Fotostabilnost fluorescentne sonde v kiveti
V prozorno kiveto z dolžino optične poti 10 mm smo odpipetirali 3 mL oktanola in 2 μL spojine 1, katere osnovna raztopina je pripravljena v DMSO. Koncentracija spojine 1 v tako
26
pripravljeni raztopini je bila 0,666 μM. Kiveto s fluorescentno sondo smo obsevali z dvema UVA LED diodama (GKMY), ki sta bili vpeti v aluminijast okvir višine 40 mm, in nato v t
= 5 min intervalih od t = 0 do t = 60 min pomerili emisijske spektre s spektrofluorimetrom Perkin Elmer LS-55. Razdalja od kivete do LED diod je bila na obeh straneh natanko 3 cm (slika 11). Spektre smo posneli v območju valovnih dolžin vzbujanja od 630 do 800 nm, pri čemer je bila hitrost snemanja spektrov 300 nm/min.
Slika 11: Izvedba eksperimenta fotostabilnosti fluorescentnega barvila v kiveti. Na levi strani je prikazan pretvornik z napetostjo in tokom, na desni strani pa postavitev kivete med LED diodami, ki so nameščene v aluminijast okvir višine 40 mm. Kiveta je nad magnetnim mešalom, ki s pomočjo magneta v kiveti meša raztopino vzorca s 680 rpm.
4 4 Protokol barvanja celičnih membran
4 4 1 Označevanje LA-4 in MH-S
Celice LA-4 in MH-S so bile predhodno pripravljene v laboratoriju za biofiziko na Institutu Jožef Stefan, ki ustreza standardu ISO4/5, kar se tiče čistosti prostora (66). Najprej smo pripravili raztopine fluorescentne sonde in LCIS (Live Cell Imaging Solution, Molecular Probes®). V eno 0,5 mL mikrocentrifugirko smo odpipetirali 495 μL LCIS in 5 μL spojine 1, v drugo pa 499,5 μL LCIS in 0,5 μL spojine 1. Koncentracija fluorescentne sonde je bila v tako pripravljenih raztopinah 10 μM oz. 1 μM. Ploščo s štirimi vdolbinicami (4-well) smo predhodno prekrili z 0,1 % raztopino poli-L-lizina (PLL). Celice v suspenziji smo
