UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO DIANA DAMJANOVIĆ OPREDELITEV SPREMEMB V ŠTEVILU KOPIJ GENA ZA STEREOCILIN (STRC) PRI BOLNIKIH Z IZGUBO SLUHA MAGISTRSKA NALOGA MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM LABORATORIJSKA BIOMEDICINA Ljubljana, 2021

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

DIANA DAMJANOVIĆ

OPREDELITEV SPREMEMB V ŠTEVILU KOPIJ GENA ZA STEREOCILIN (STRC) PRI BOLNIKIH Z IZGUBO SLUHA

MAGISTRSKA NALOGA

MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM LABORATORIJSKA BIOMEDICINA

Ljubljana, 2021

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

DIANA DAMJANOVIĆ

OPREDELITEV SPREMEMB V ŠTEVILU KOPIJ GENA ZA STEROCILIN (STRC) PRI BOLNIKIH Z IZGUBO SLUHA

STEREOCILIN (STRC) GENE COPY NUMBER VARIATIONS IN PATIENTS WITH HEARING LOSS

MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM LABORATORIJSKA BIOMEDICINA

Ljubljana, 2021

Magistrsko nalogo sem opravljala na Kliničnem inštitutu za specialno laboratorijsko diagnostiko Pediatrične klinike v Ljubljani pod mentorstvom izr. prof. dr. Katarine Trebušak Podkrajšek, univ. dipl. kem., spec. med. biokem. in izr. prof. dr. Sabo Batellino, dr. med.

Zahvala

Iskreno se zahvaljujem menotrici izr. prof.dr. Katarini Trebušak Podkrajšek za odzivnost, strokovno pomoč, nasvete in potrpežljivost. Želela bi se zahvaliti tudi somentorici izr. prof.

Sabi Battelino za strokovno podporo pri izvedbi magistrske naloge.

Hvala kolektivu Kliničnega inštituta za specialno laboratorijsko diagnostiko za vso pomoč in napotke pri delu.

Hvala staršema, ker sta mi omogočila študij. Predvsem, bi se želela zahvaliti mami. Mama, hvala, ker si verjela vame in me spodbujala. Hvala tudi prijateljem za vso podporo tekom študija; predvsem pa hvala Tebi, ki me znaš nasmejat na še tako siv dan.

Izjava

Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom izr. prof. dr.

Katarine Trebušak Podkrajšek, spec. med. biokem., spec. lab. med. genet in somentorstvom izr. prof. Sabe Battelino, dr. med.

Diana Damjanović

KAZALO VSEBINE

POVZETEK ... I ABSTRACT ... II SEZNAM OKRAJŠAV IN SIMBOLOV ... III

1. UVOD ... 1

1.2 ANATOMIJA UŠESA ... 1

1.3 ČUTILO ZA SLUH ... 2

1.4 FIZIOLOGIJA SLUHA ... 3

1.5 IZGUBA SLUHA ... 4

1.6 SENZORINEVRALNA IZGUBA SLUHA ... 4

1.6.1 Nesindromska izguba sluha ... 5

1.6.2 Geni in proteini vpleteni v nastanek avtosomno recesivne nesindromske izgube sluha ... 5

1.7 GEN STRC IN PROTEIN STEREOCILIN ... 7

1.7.1 Pojavnost genetskih sprememb v genu STRC ... 8

1.8 GENETSKI VZROKI OKVARE SLUHA V SLOVENSKI POPULACIJI ... 10

1.9 GENETSKA DIAGNOSTIKA IZGUBE SLUHA ... 11

2. NAMEN DELA, CILJI, HIPOTEZE ... 13

3. METODE ... 14

3.1 PREISKOVANCI ... 14

3.2 METODE ... 15

3.2.1 Laboratorijska oprema ... 16

3.2.1 Spektrofotometrična meritev koncentracije DNA ... 17

3.2.2 Kvantitativna fluorescentna verižna reakcija s polimerazo (QF-PCR) ... 17

3.2.3 Preverjanje dolžine pomnoženih odsekov ... 20

3.2.4 Analiza fragmentov DNA s kapilarno elektroforezo ... 21

3.2.5 MLPA ... 23

3.2.6 Interpretacija rezultatov ... 29

4. REZULTATI ... 30

4.1 PREISKOVANCI ... 30

4.2 OPTIMIZACIJA REAKCIJE QF-PCR ... 30

4.3 PRESEJANJE ZA PRISTONOST SPREMEMB V ŠTEVILU KOPIJ GENA STRC Z QF-PCR ... 32

4.4 REZULTATI DOLOČANJA CNV V ŠIRŠEM PODROČJU GENA STRC Z METODO MLPA ... 35

5. RAZPRAVA ... 43

5.1 UTEMELJITEV METODOLOŠKEGA PRISTOPA ... 43

5.2 REZULTATI ANALIZE GENA STRC ... 47

5.3 POMEN TESTIRANJA SPREMEMB V STRC V SLOVENSKI POPULACIJI ... 51

6. SKLEP ... 53

7. LITERATURA ... 54

KAZALO SLIK

Slika 1: Anatomija ušesa ... 2

Slika 2: Shematski prikaz eksperimentalnega dela. ... 15

Slika 3: Postopek MLPA ... 25

Slika 4: Elektroferogram nespecifičnega pomnoževanja. ... 31

Slika 5: Elektroferogram preiskovanca brez patoloških sprememb v STRC ... 32

Slika 6: Elektroferograma preiskovanca 37 z heterozigetno duplikacijo gena STRC ... 33

Slika 7: Elektroferogram preiskovanke 91 z heterozigetno delecijo gena STRC. ... 34

Slika 8: Elektroferogram preiskovanke 142 z homozigotno delecijo gena STRC. ... 34

Slika 9: Prikaz kontrolnih fragmentov v elektroferogramu moškega referennega vzorca .. 35

Slika 10: Rezultat analize MLPA (sonde Probemix P461-A1 DIS) pri preiskovanki 17 s heterozigotno delecijo gena CATSPER2 ... 36

Slika 11: Rezultat analize MLPA (sonde Probemix P461-A1 DIS) pri preiskovancu 37 s heterozigotno duplikacijo gena STRC in CKMT1B ... 37

Slika 12: Rezultat analize MLPA (sonde Probemix P461-A1 DIS) pri preiskovanki 99 s heterozigotno delecijo gena CATSPER2 in homozigotno delecijo genov STRC in CKMT1B ... 38

Slika 13: Rezultat analize MLPA (sonde Probemix P461-A1 DIS) pri preiskovanki 91 s heterozigotno delecijo gena CKMT1B, STRC in CATSPER2 ... 39

Slika 14: Rezultat analize MLPA (sonde Probemix P461-A1 DIS) pri preiskovanki 142 s homozigotno delecijo gena CKMT1B, STRC in CATSPER2 ... 40

Slika 15: Shematski prikaz gena STRC.. ... 45

Slika 16: Avdiograma preiskovanke 142 (levo) in preiskovanke 99 (desno) ... 49

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica II: Seznam laboratorijske opreme. ... 16

Preglednica III: Nukleotidno zaporedje oligonukleotidnih začetnikov ... 19

Preglednica IV: PCR reakcijska mešanica. ... 19

Preglednica V: Reakcijski pogoji QF-PCR reakcije ... 20

Preglednica VI: CNV status s pripadajočim doznim količnikom ... 28

Preglednica VII: Klinični podatki preiskovancev in spremembe z metodo QF-PCR in MLPA ... 41

Preglednica VIII: Delež vseh genetskih sprememb v genu STRC in delež CNV glede na vse genetske spremembe v nekaterih evropskih študijah. ... 47

KAZALO ENAČB

Enačba 2: Izračun volumna vode za redčenje gDNA za reakcijo MLPA. ... 24

POVZETEK

Najpogostejši vzrok senzorinevralne izgube sluha so spremembe v dednem zapisu, zato je genetsko testiranje bolnikov z izgubo sluha ključnega pomena pri dokončni opredelitvi bolezni. V populaciji bolnikov z izgubo sluha so vzroki povezani s spremembami v genih GJB2 in GJB6 dobro raziskani. Z razvojem sekvenciranja naslednje generacije pa se obsežneje analizirajo tudi drugi geni povezani z izgubo sluha. To pa ne velja za vzročne spremembe v genu STRC, čeprav po navedbah raziskav predstavljajo signifikanten delež vzrokov nesindromske izgube sluha. Analiza STRC je namreč s klasičnim sekvenciranjem ali sekvenciranjem naslednje generacije izredno otežena, delno zaradi prisotnega psevdogena STRCP1, ki kaže skoraj 100% podobnost z genom, delno pa tudi zato, ker s sekvenčno analizo težko določimo prisotnost sprememb v številu kopij.

Namen magistrske naloge je v populaciji bolnikov z izgubo sluha, kjer genetski vzrok še ni bil dokončno razjasnjen, opredeliti spremembe v številu kopij gena STRC in sicer z vzpostavitvijo stopenjskega analitskega pristopa. V raziskavo smo vključili 174 bolnikov z različnimi vrstami izgube sluhe in različnih starosti. Pri vseh je bilo predhodno že opravljeno sekvenciranje po Sangerju gena GJB2 in GJB6 ter sekvenciranje kliničnega eksoma s sekvenciranjem naslednje generacije. Določanje sprememb v številu kopij gena smo opravili stopenjsko z uvedbo kvantitativne fluorescenčne verižne reakcije (QF-PCR), ki je služila kot presejalna analiza, dobljene rezultate smo nato potrdili z metodo hkratnega pomnoževanja od ligacije odvisnih sond (MLPA).

Spremembe v številu kopij gena STRC smo opredelili pri 7 preiskovancih, kar predstavlja 4% vseh preiskovancev vključenih v magistrsko nalogo. Izgubo sluha kot posledico prisotne bolezenske spremembe v STRC pa smo določili le pri dveh preiskovankah s homozigotno delecijo, kar predstavlja le 1,15% naše raziskovane skupine. Ostalim 5 preiskovancem smo določili heterozigotno spremembo, od tega 1 duplikacijo in 4 heterozigotne delecije, ki pa ne morejo biti samostojen vzrok izgube sluha. Pojavnost sprememb v številu kopij gena STRC v preiskovani skupina je tako nižja od pričakovane. Za dokončno opredelitev pomena gena STRC za izgubo sluha pri teh bolnikih pa bi bilo potrebno izvesti še analizo točkovnih sprememb ter majhnih delecij in duplikacij gena STRC.

ABSTRACT

The most common cause of sensorineural hearing loss is hereditary in nature, thus genetic testing of patients with hearing loss is crucial to genetically clarify the disease. In the population of patients with hearing loss, the genetic causes associated with variants in the GJB2 and GJB6 genes are well researched. Nevertheless, with the development of new generation sequencing (NGS) also other genes associated with hearing loss are being numerously analyzed. However, this does not apply to genetic variants in the STRC gene, eventhouhg they represent a significant proportion of the non-syndromic hearing loss causes.

Namely, STRC analysis is difficult when using Sanger or next generation sequencing. This is partly because of the pseudogene STRCP1, which is highly homologous, and partly because sequencing makes it difficult to determine the presence of copy number variants.

The aim of this master's thesis is to identify changes in the copy number variations of the STRC gene in the population of patients with hearing loss with not definitively determined genetic cause of the disease by establishing a step-by-step analytical approach.

The study included 174 patients with different degree of hearing loss and of different ages.

All of them had previously sequenced GJB2 and GJB6 genes by Sanger sequencing, and had already sequenced clinical exons by next generation sequencing. Determination of the copy number variations was performed step-by-step, by introducing the quantitative fluorescent polymerase chain reaction (QF-PCR), which was performed as a screening approach. The results were then confirmed by multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA).

Copy number variations in the STRC gene were identified in 7 subjects, representing 4% of all subjects included in the master's thesis. However, we identified the STRC deletion as a cause of hearing loss only in 2 subjects which were homozygous for the deletion, therefore only in 1.15% of our study group. The other 5 subjects were heterozygous carriers, of which 1 was a heterozygous carrier of the STRC duplication and 4 were heterozygous carriers of the STRC deletion. The frequency of the copy number variants of the STRC gene in the analysed group of patients is thus lower than expected. In order to definitively determine the significance of the STRC gene for hearing loss in these patients, it would be necessary to perform an analysis of substitution and small indels in the STRC gene.

SEZNAM OKRAJŠAV IN SIMBOLOV

°C stopinje Celzija

µL mikroliter

aCGH primerjalna genomska hibridizacija oligonukleotidna niza (angl. array comparative genomic hybridization

c koncentracija

CNV različica/sprememba v številu kopij (angl. copy number variant) ddPCR kapljična digitalna verižna reakcija s polimerazo (angl. Droplet Digital

polymerase chain reaction) DNA deoksiribonukleinska kislina

DQ dozni količnik (angl. dosage quotient)

EDTA etilendiamintetraocetna kislina; antikoagulant

FISH fluorescenčna in situ hibridizacija (angl. fluorescence in situ hybridization)

gDNA genomska deoksiribonukleinska kislina

HGMD zbirka podatkov Human Gene Mutation Database

LR-PCR Pomnoževanje zelo dolgih odsekov z verižno reakcijo s polimerazo (angl. long range polymerase chain reaction)

mL mililiter

MLPA metoda hkratnega pomnoževanja od ligacije odvisnih sond (angl.

multiplex ligation-dependent probe amplification) AR- NSHL avtosomno recesivna nesindromska izguba sluha

NGS sekvenciranje naslednje generacije (angl. new generation sequencing) PCR verižna reakcija s polimerazo (angl. polymerase chain reaction) SNHL senzorinevralna izguba sluha

UV ultravijolični svetlobni spekter

QF-PCR kvantitativna fluorescenčna verižna reakcija (angl. quantitative fluorescent polymerase chain reaction)

qPCR kvantitativna verižna reakcija s polimerazo (angl. quantitative polymerase chain reaction)

V volumen

VIS vidna spektrofotometrija

WGS sekvenciranje celotnega genoma (angl. whole genome sequencing) WES Sekvenciranje celotnega eksoma (angl. whole exome sequencing)

1. UVOD

Senzorinevralna izguba sluha (SNHL) je najpogostejša prirojena okvara sluha, ki prizadene približno 2 na 1000 novorojenčkov (1). Najpogostejši vzrok za pojav te motnje senzoričnih sistemov je okvara dednega zapisa (2). Genetska izguba sluha je lahko prisotna v sindromski obliki, kjer je izguba sluha povezana z drugimi kliničnimi znaki, kot so npr. slepota (Usherjev sinfrom), golša (Pendredov sindrom) ali nefritis (Alportov sindrom), lahko pa je prisotna kot izolirana okvara v obliki nesindromske izgube sluha (3). Po podatkih Hereditary Hearing Loss Homepage (HGMD), dostopni junija 2021 (4), trenutno poznamo kar 124 genov povezanih z nesindromsko izgubo sluha. Kljub temu, da je genetska diagnostika izgube sluha napredovala in je čedalje več genov tudi vključenih v rutinsko diagnostiko, ostaja delež genetsko opredeljenih bolnikov v evropskih populacijah le približno 50% (5).

Zgodnja diagnoza in zdravljenje sta pomembna, saj okvara sluha ni le fiziološke in anatomske narave, ampak vpliva tudi na psihosocialni razvoj otroka (6), pri starostnikih pa lahko povzroči občutek socialne izolacije in depresije (7).

1.2 ANATOMIJA UŠESA

Čutilo za ravnotežje in sluh leži v ušesu. Anatomsko je uho sestavljeno iz treh delov:

zunanje, srednje in notranje uho. Za zaznavo zvoka so potrebni vsi trije deli ušesa - zunanje in notranje uho služita prevajanju zvočnih valov do notranjega ušesa, notranje uho pa nato te zvočne valove pretvori v električno energijo, ki se prenaša po živčnem sistemu.

Zunanje uho je sestavljeno iz uhlja, ki je ovalno oblikovana struktura iz elastične hrustančevine, in zunanjega sluhovoda, ki je z zrakom napolnjen zavit kanal. Zunanji sluhovod je zaprt s timpansko membrano oz. bobničem. Srednje uho leži znotraj senčnice in je navzad povezano z zrakom napolnjeno bobnično votlino in navzpred preko Evstahijeve cevi z žrelom. Evstahijeva cev se odpre le med požiranjem in zehanjem in tako omogoča izravnavno zračnega tlaka med srednjim in zunanjim ušesom. V steni srednjega ušesa sta okroglo in ovalno okence, slednje je z bobničem povezano preko treh slušnih koščic:

kladivca, nakovalca in stremenca. Notranje uho leži v piramidi senčnice in omogoča pretvorbo mehanskega signala v akcijske membranske potenciale. Sestavljeno je iz

koščenega in membranskega labirinta. Koščeni labirint sestavljajo preddvor, trije polkrožni kanali, ki so si pravokotni in koščeni polž. Membranski labirint, delimo na vestibularni oz.

ravnotežni in polžev labirint (9, 10). Struktrue ušesa so označene na Sliki 1.

1.3 ČUTILO ZA SLUH

Receptorji za zaznavo zvoka se nahajajo v polžu. Polž je spiralasto zavita koščena votlina - podobna polževi hišici z dvema in pol zavojema. V notranjosti polža so trije vijačno zaviti kanali: preddvorni (vestibularni) in bobnični (timpanalni) kanal, v katerih je perilimfa z visoko vsebnostjo natrijevih ionov, in polžev (kohlearni) kanal, ki vsebuje endolimfo z relativno visoko vsebnostjo kalijevih ionov. Timpalno in vestibularno skalo loči bazilarna membrana, na kateri leži Cortijev organ, ki je čutilo za sluh. V Cortijevem organu so oporne celice in migetalčne oz. cilijarne čutne celice (dlačnice), katere razdelimo na zunanje in notranje, vendar je osnovni način delovanja pri obeh enak. Čutnice pokriva krovna (tektorialna) membrana, pritrjena ob notranjem robu polža. Vestibularni in kohlearni kanal pa loči Reissnerjeva ali vestibularna membrana. Slušni živec vodi iz Cortijevega organa do centra za zaznavo sluha (10, 11).

Slika 1: Anatomija ušesa (povzeto po 10).

1.4 FIZIOLOGIJA SLUHA

Zvočni valovi se najprej pretvorijo v mehansko nihanje in nato v živčne dražljaje.

Mehanizem je naslednji:

1. Zunanje uho usmerja zvočne valove v slušni kanal, ki prenaša zvočne valove do bobniča.

2. Zvočni valovi povzročijo nihanje bobniča, kar se najprej prenese na verigo slušnih koščic in preko ovalnega okenca na perilimfo v notranjem ušesu. Perilimfno nihanje se nato v vestibulnem kanalu prenese na vestibulno membrano in preko timpaničnega kanala na bazilarno membrano.

3. Nihanje endolimfe v polževem vodu povzroči nihanje bazilarne membrane, na kateri ležijo mehanoreceptorji - slušne dlačnice povezane z živčnimi končiči. Na zgornji ploskvi dlačnic so lasom podobni izrastki - stereocilije, ki so v tesnem stiku s tektorialno membrano.

4. Bazilarna membrana je bolj elastična kot tektorialna. Ob nihanju se tako bazilarna premakne navzgor, kar povzroči upogib stereocilj, ki so vpete v tektorialno membrano.

Upogibanje stereocilij povzroči spremembo prevodnosti membran dlačnic za kalijeve ione. Upogibanje v eno smer povzroči povečanje prevodnosti za kalijeve ione in depolarizacijo; upogibanje v drugo smer pa povzroči zmanjšanje prevodnosti za kalijeve ione in hiperpolarizacijo. Ob depolarizaciji se odprejo tudi napetostno odvisni kalcijevi kanalčki in tako v dlačnico vdrejo kalcijevi ioni, kar povzroči sproščanje glutamata.

Glutamat je ekscitatorni živčni prenašalec, ki sproži električni akcijski potencial v aferentnih živčnih vlaknih. Signal se prenese preko slušnega živca do možganske skorje, do centra za zaznavo sluha. (9, 12)

1.5 IZGUBA SLUHA

Izgubo sluha lahko klasificiramo na več načinov - glede na čas nastopa, stopnjo, predel ušesa in vzročnost. Odvisno od časovnega nastanka izgubo sluha razdelimo na prirojeno ali pridobljeno, prav tako pa lahko znotraj te kategorije bolnike razdelimo glede na čas osvojitve govora. Prelingvalna izguba sluha nastopi pred razvojem govora, postlingvalna pa po razvoju govora. (11). Stopnjo izgube sluha opišemo kot rahlo, zmerno, težko in globoko odvisno od razpona pri zaznavanju zvoka v decibelih (13). Anatomsko razdelimo izgubo sluha na centralno izgubo sluha, ki obsega motnje v delovanju slušnega živca, in periferno izgubo sluha. Slednjo delimo v konduktivno, senzorinevralno in mešano. Izgubo sluha definiramo kot konduktivno ob okvari zunanjega ali srednjega ušesa, senzorinevralno ob okvari notranjega, mešana pa je kombinacija obeh (14). Vzroki so lahko genetski ali negenetski oz. okoljski. Med okoljske prištevamo razne okužbe (npr. okužba s toksoplazmo, citomegalovirusom, herpes virusom), poškodbe ušes itd (15). Genetsko obliko lahko razvrstimo na nesindromsko in sindromsko, znotraj slednje je opisanih več kot 400 sindromov, posamezniki pa imajo poleg okvare sluha še druge klinične znake. Sindromska okvara sluha se najpogosteje deduje avtosomno recesivno (npr. Usherjev sindrom, Pendredev sindrom itd.) (16). V magistrski nalogi se bomo podrobneje posvetili senzorinevralni izgubi sluha, nesindromskega genetskega izvora.

1.6 SENZORINEVRALNA IZGUBA SLUHA

V razvitih državah je senzorinevralna izguba sluha (SNHL) najpogostejša motnja v senzornem sistemu (17). Nastane zaradi okvar v polžu in/ali v slušnem živcu, razpon izgube sluha pa je lahko od blage do globoke guhosti (16).

Senzorinevralna izguba sluha je lahko posledica naslednjih patofizioloških mehanizmov:

1. Strukturne nepravilnosti polževih struktur, ki lahko nastanejo zaradi različnih poškodb ali prirojenih stanj.

2. Motnje v transportu ionov lahko nastanejo zaradi genetskih ali pridobljenih bolezni, kar povzroči spremembe v endolimfi.

3. Nepravilnosti v ožilju, se lahko pojavijo ob poškodbah zaradi hrupa, ototoksičnosti in sistemskih vaskularnih nepravilnostih, ki vplivajo na strio vascularis.

4. Gibljivost in transdukcijske sposobnosti zunanjih in notranjih celic so lahko okrnjene zaradi njihovega prevelikega števila na bazilarni membrani, prenasičenost celic se pogosto pojavi ob sladkorni bolezni.

5. Pri poškodbi zaradi hrupa se poveča nihajni premik med tektorialno in baziliarno membrano, kar posledično poškoduje stereocilije zunanjih dlančnic.

6. Aminoglikozidni antibiotiki so inhibitorji kalijevega kanala, kar prepreči dlačnici, da se depolarizira, to vodi v spremenjeno koncentracijo ionov (18).

Vzroki za te patofiziološke procese so lahko genetski (nesindromski ali sindromski), okoljski (npr. zdravila, razne poškodbe glave, barotravma, razne okužbe - meningitis, hrup), epigenetski (starostna gluhost, angl. presbyacusis) ali idiopatski, ko vzroka ni mogoče določiti (18).

1.6.1 Nesindromska izguba sluha

Nesindromska okvara sluha (NSHL) prispeva k 70% podedovane izgube sluha in za razliko od sindromske ni povezana z drugimi kliničnimi znaki (19). Najpogosteje se deduje avtosomno recesivno (75-80%), sledi avtosomo dominantno dedovanje (20%), redko pa se deduje X-vezano (2 - 5%) ali mitohondrijsko (1%). Pojav in klinični znaki podedovane okvare sluha sledijo podobnemu kliničnemu vzorcu, tako je za avtosomno dominantno značilna progresivna izguba sluha, ki se pojavi v postlingvalnem obdobju; za avtosomno recesivno obliko pa je značilen pojav v prelingvalnem obdobju, sama izguba sluha pa ni progresivna in je lahko težka do globoka (20).

1.6.2 Geni in proteini vpleteni v nastanek avtosomno recesivne nesindromske izgube sluha

Do sedaj je bilo odkritih že kar 77 genov povezanih z nesindromsko avtosomno recesivno izgubo sluha oz. krajše DFNB (21). Gene lahko razvrstimo v skupine glede na funkcijo proteinov, ki jih kodirajo (prikazano v Preglednici I). Med njimi so najpogostejše bolezenske spremembe v genih GJB2 in GJB6, ki skupaj tvorita DFNB1 lokus. Ostali geni, ki so pogosteje povezani z avtosomno recesivno dedovano izgubo sluha, so še SLC26A4, MYO15A, OTOF, CDH23, TMC1, CDH23 in TPMPRSS3 (22).

Vrsta proteina Primer genov

Proteini dlačnic

Proteini citoskeleta ESPN, RDX, TRIOBP

Adhezijski proteini CDH23, PCDH15, LHFPL5, Motorični proteini MYO6, MYO7A, MYO15A,

MYO3A

Ogrodni protein WHRN, USH1C,

Proteini ekstracelularnega matriksa TECTA, COL11A2, STRC, OTOA

Proteini ionske homeostaze

Presledkovni stik CLDN14, MARVELD2,

Koneksini GJB2, GJB6

Proteini ionskih kanalčkov SLC26A4, SLC26A5

Transkripcijski faktorji ESRRB

Proteini s slabo poznano funkcijo TMPRSS3, TMC1, PJVK, TMIE, OTOF

Preglednica I: Prikaz najpogostejših genov in proteinov vpletenih v nastanek avtosomno recesivne nesindrosmke izgube sluha (Povzeto po (4)).

1.7 GEN STRC IN PROTEIN STEREOCILIN

Cortijev organ sestavljata dve vrsti senzoričnih celic oz. dlačnic - zunanje in notranje.

Slednje imajo izključno senzorično vlogo, saj kodirajo in prenašajo informacije preko slušnega živca do možganov, nasprotno pa zunanje dlačnice delujejo kot ojačevalci specifičnih frekvenc (24). Obe vrsti celic stimulirata stereocilije, ki se kot odgovor na zvočno potovanje ukrivijo, kar posledično privede do spremembe prevodnosti dlačnic za kalijeve in kalcijeve ione in sproščanje ekscitatornega živčnega prenašalca (25, 26). Stereocilije so togi aktinski izrastki, razvrščeni v več vrst, odvisno od njihove višine in vrste dlačnic. Na zunanjih dlačnicah so tako stereocilije razporejene v tri vrste - od najnižjih do najvišjih, povezane so s štirimi različnimi vrstami povezav, omogočajo optimalno kohezijo snopov stereocilij in povečujejo njihovo togost, kar omogoča transdukcijo. Pri teh povezavah sodeluje več proteinov, med njimi tudi ekstracelularni strukturni protein stereocilin (27).

Študija iz leta 2001 je dokazala, da se protein sterocilin nahaja izključno v notranjem ušesu v povezavi z dlačnicami (28), kasneje leta 2011 so preučili porazdelitev in vlogo stereocilina v razvijajočem se in zrelem notranjem mišijem ušesu. Protein je prisoten v horizontalnih povezavah v zrelih zunanjih dlačnicah in v povezavah, ki pritrdijo najvišje stereocilije na tektorialno membrano (29). Prav tako so strukturo in funkcijo stereocilij opazovali v STRC negativnih miših (STRC -/-). Do devetega dne postnatalno je bila funkcija in struktura dlačnic normalna, vendar se je postopoma slabšala. Do 60 dne postnatalno, stereocilije niso bile več povezane med seboj in s tektorialno membrano, kar posledično vpliva na sposobnost dlačnic za vzdrževanje povezav in mehanoelektrično transdukcijo - upogib stereocilij (29).

Protein stereocilin je sestavljen iz 1809 aminokislin (28), kodira ga gen STRC (OMIM

#606440), ki se nahaja na kromosomu 15q15.3 (30). Gen sestavlja 29 eksonov in obsega približno 19 kb (31). Nahaja se v območju tandemske ponovitve s tremi drugimi geni PPIP5K1 (OMIM #610979), CATSPER2 (OMIM #607249) in CKMT1A (OMIM #613415) (26, 32, 33, 34). 100 kb navzdol genetskega zaporedja se nahaja psevdogen STRCP1 zaradi katerega je diagnostična analiza STRC močno otežena. Psevdogen je izredno homologen genu; kodirajoče zaporedje je enako v 99.6%, zaporedje intronskih sekvenc pa v 98.8% (26).

Psevdogen je neaktiven zaradi nesmiselne genetske spremembe v eksonu 20 (28).

Spremembe v genu STRC se dedujejo avtosomno recesivno (OMIM #603720, DFNB16) (35). Bolniki z DFNB16 imajo običajno bilateralno, blago do zmerno izgubo sluha (25).

V podatkovni bazi HGMD, dostopni maja 2021, je bilo dokumentiranih 76 sprememb v genu STRC, povezanih z izgubo sluha (36). Največji delež genetskih sprememb predstavljajo drugačnosmiselne spremembe, sledijo velike delecije, nato majhne delecije, manjši odstotek pa predstavljajo majhne insercije, kompleksne preureditve, velike insercije ter majhne delecije in insercije (angl. “small indels”).

1.7.1 Pojavnost genetskih sprememb v genu STRC

Pomen genetskih sprememb v genu STRC je bil ocenjen v različnih tujih raziskavah. Ena večjih je bila ameriška raziskava objavljena leta 2016, ki je ovrednotila pomen genetskih sprememb pri 1119 bolnikih z okvaro sluha. Pri 440 (39%) bolnikih različnih etičnih skupin so odkrili različne genetske spremembe, ki bi lahko bile vzročne. Patološke spremembe so določili v 49 genih, največji odstotek patoloških sprememb je bil v genu GJB2 pri 22%

preiskovancih. Presenetljivo so sledile vzročne spremembe v genu STRC, ki so bile prisotne pri 16% preiskovancev. Delež genetskih sprememb v genih SLC26A4 (7%) in TECTA (5%) je bil nižji. Glede na stopnjo izgube sluha, so bile v skupini bolnikov z blago do zmerno izgubo sluha najpogostejše ravno patološke spremembe v genu STRC, ki so bile odgovorne za kar 30% izgube sluha. V študiji je bila opisana tudi prevalenca sprememb gena STRC pri bolnikih z izgubo sluha v posameznih etničnih skupinah. Tako sta v kavkazijski in latinoameriški skupini najpogostejši vzročni spremembi v genih GJB2 in STRC. V skupini preiskovancev azijskega in afriškega porekla ter bližnjega vzhoda pa se je sprememba v genu STRC pokazala za redkejšo. Najpogosteje opisana sprememba gena STRC je bila sprememba v številu kopij (angl. copy number variation; CNV) in sicer je bila opredeljena pri kar 99%

mutiranih STRC alelov (37). Pogostost sprememb v genu STRC so ovrednotili tudi v ameriški populaciji pediatričnih bolnikov. S tremi različnimi metodami genotipizacije in Sangerjevo metodo sekvenciranja so določili zaporedje pri 659 GJB negativnih bolnikih z okvaro sluha. Opredelili so 17 delecij v genu STRC, od tega je bilo sedem sprememb homozigotnih in devet heterozigotnih; v šestih spremembah od devetih so določili nove, neopisane spremembe v genu STRC. Pojavnost vzročnih sprememb pri pediatričnih bolnikih z blago do srednjo izgubo sluha so ocenili na 6.3% (38).

Vzročne spremembe v genu STRC so pomemben vzrok za nastanek avtosomno recesivne nesindromske izgube sluha (AR-NSHL) tudi v češki populaciji. Rezultati študije iz leta 2018 so potrdili prisotnost bolezenskih sprememb v genu STRC pri 5,5% posameznikov z izgubo

sluha, v podskupini posameznikov z avtosomno recesivno obliko je bil delež višji, in sicer 13,6%. Najpogosteje opisane spremembe so bile CNV, čemur so sledile točkovne spremembe (39). Rezultati se ujemajo z opaženo frekvenco vzročnih sprememb v Nemčiji, kjer so v pediatrični populaciji potrdili bolezenske spremembe v genu STRC pri 6%

bolnikov. Spremembe gena STRC kot vzrok za AR-NSHL so opisali tudi v drugih evropskih državah (40). Pri vseh populacijah so bile v tem genu najpogosteje prisotne spremembe CNV, predvsem velike delecije. Iz navedenih študij lahko sklepamo, da DFNB16 predstavlja signifikanten delež v skupini AR-NSHL, kjer velike CNV predstavljajo pomemben delež vzročnih sprememb.

Velike delecije gena STRC pogosto vključujejo tudi gen CATSPER2, kar povzroči senzorinevralno izgubo sluha pri obeh spolih in pridruženo moško neplodnost (25). Sindrom gluhosti in neplodnosti (angl. deafness-infertiliy sindrome; DIS - OMIM #611102) (41) so prvič opisali Avidan in sodelavci v družini francoskega izvora. Sorojenci so bili nosilci 70kb delecije na kromosomu 15q15, ki je zajemala prvih 24 eksonov gena PPIP5K1, celotno regulatorno in kodirajoče zaporedje CKMT1 in STRC ter zadnja dva eksona CATSPER2.

Ravno slednja gena pa naj bi bila odgovorna za senzorinevralno izgubo sluha in neplodnost (42). O DIS so poročali tudi v treh iranskih družinah, kjer so pri moških posameznikih z izgubo sluha in astenozoospermijo določili približno 100 kb delecijo v kromosomu 15q15, ki je zajemala tudi gena STRC in CATSPER2 (43).

Protein CATSPER tvori napetostni kalcijev kanalček, sestavljen iz 4 α podenot:

CATSPER1, CATSPER2, CATSPER3, CATSPER4 in 3 pomožnih podenot: CATSPERβ, CATSPERγ, CATSPERδ. α podenote tvorijo poro in so sestavljene iz 6 transmembranskih domen (S1 - S6). CATSPER kanalček je lokaliziran na glavnem delu repa spermija in omogoči privzem kalcijevih ionov v celico. Povišana intracelularna koncentracija kalcija je ključnega pomena za hiperaktivno gibanje spermijev, kar omogoča spermiju penetracijo in fuzijo z jajčno celico (44).

1.8 GENETSKI VZROKI OKVARE SLUHA V SLOVENSKI POPULACIJI

Najpogostejši vzrok za nesindromsko izgubo sluha so bolezenske spremembe v genih za koneksin 26 (GJB2) in koneksin 30 (GJB6). Evropska študija objavljena leta 2000 je zaključila, da je med vzročnimi spremembami najpogostejša enonukleotidna delecija c.35delG v GJB2 genu, z najvišjo prevalenco v južni Evropi (45). Ugotovitve je potrdila slovenska raziskava iz leta 2011, ki je v populaciji slovenskih bolnikov s kongenitalno izgubo sluha določila pogostost sprememb v genih GJB2 in GJB6. Med 218 bolniki je bila genetska sprememba v genu GJB2 prisotna pri 33,0%; od tega so pri 31,6% preiskovancev določili delecijo c.35delG, ki je odgovorna za nastanek skrajšanega proteina, saj se translacija ustavi pri kodonu 13. V izbrani skupina slovenskih bolnikov ni bilo nobenega nosilca delecije del(GJB6-13S1830) (46, 47), ki je pogosta v določenih populacijah (Francozi, Izraelci, Španci) (47); v nekaterih drugih kot so Hrvati in Grki pa ni prisotna (48, 49).

Bolezenske spremembe v genu TMPRSS3, ki kodira transmembransko serinsko proteazo je v kavkaški populaciji odgovorna za manj kot 1% avtosomne recesivne nesindromske izgube sluha. V študiji iz leta 2015 so pri 38 slovenskih bolnikih z verjetno avtosomno recesivno podedovano izgubo sluha in GJB2/GJB6 negativnim rezultatom določili frekvenco bolezenskih sprememb v genu TMPRSS3. Delecijo, c.208delC, ki povzroči premik bralnega okvirja so določili pri 13,1% preiskovancev, kar je višje od kavkaškega povprečja (50).

DFNB42 je zelo redka oblika avtosomno recesivne okvare sluha, o kateri poročajo v državah Srednjega vzhoda, predvsem v Pakistanu, Savdski Arabiji, Iranu in Turčiji. Nastane zaradi bolezenskih sprememb v genu ILDR1. V evropski populaciji je bila bolezenska sprememba v genu ILDR1 prvič opisana v primeru dveh slovenskih sorojencev. Sorojencema so s sekvenciranjem naslednje generacije (NGS) potrdili homozigotno varianto c.942C>A (p.Cys314Ter), ki najverjetneje vpliva na tricelularni tesni spoj in posledično na funkcijo dlačnih celic (51).

V raziskavi objavljeni leta 2018 so analizirali klinični eksom pri 30 posameznikih iz Slovenije in 26 iz Bosne. Posameznike so razdelili v dve skupini glede na klinične znake. V prvi skupini je bilo 32 posameznikov z domnevno nesindromsko izgubo sluha, v drugi pa 17 posameznikov s sindromsko izgubo sluha. Namen raziskave je bil določiti vzrok okvare

sluha ter določiti ali je izguba sluha del kompleksnejšega sindromskega stanja ali ločena klinična značilnost. Genetsko spremembo, ki je bila vzrok za izgubo sluha, so potrdili pri 30% posameznikov. V 10 genih (CHD7, HDAC8, MITF, NEFL, OTOF, SF3B4, SLC26A4, TECTA, TMPRSS3, in USH2A) so opisali patološke spremembe, med katerimi jih je bila polovica edinstvenih, le dve v genih USH2A in MITF sta bili prisotni pri po dveh posameznikih. Bolezenske spremembe so bile najpogosteje prisotne v genih SLC26A4, USH2A, TECTA in OTOF (52).

1.9 GENETSKA DIAGNOSTIKA IZGUBE SLUHA

Cilj genetskega testiranja bolnikov z izgubo sluha je predvsem opredeliti etiološko diagnozo ter tako bolniku, vsaj v nekaterih primerih, omogočiti individualizirano zdravljenje ter po potrebi usmerjeno spremljanje kliničnih značilnosti, ki so povezane s posamezno genetsko okvaro. Postavitev etiološke diagnoze pa je tudi podlaga za genetsko svetovanje s katerim lahko ocenimo verjetnost ponovitve izgube sluha v družini (53).

Smernice Ameriške akademije za medicinsko genetiko in genomiko (ACMG) za diagnozo izgube sluha iz leta 2014 priporočajo vključitev genetskega testiranja v zgodnjo diagnostiko za oceno NSHL. Po začetni anamnezi in avdiometrični oceni tako svetujejo, da bi naslednji korak moral biti opredelitev vzročnih sprememb v genih GJB2 in GJB6 ali takojšnje obsežnejše genetsko testiranje (54). V zadnjem času pa večina centrov, ki se ukvarjajo z genetsko diagnostiko izgube sluha, ne uporablja več stopenjske analize ampak direktno analizo panela genov povezanih z izgubo sluha z NGS. To je tudi pristop, ki ga trenutno uporabljajo na Kliničnem inštitutu za specialno laboratorijsko dagnostiko na Pediatrični kliniki UKC Ljubljana.

Sekvenciranje po Sangerju velja za visoko občutljivost in specifično metodo, ki velja za zlati standard genetskega testiranja, a vendar metodo zaradi visoke cene analize in nizkega izkupička hitro nadomeščajo metode, ki temeljijo na NGS (53). Glavna prednost NGS je sposobnost reševanja problema genetske heterogenosti NSHL, saj omogoča paralelno sekvenciranje različnih genov povezanih z izgubo sluha, medtem ko se s Sangerjem lahko določi le zaporedje izbranega odseka posameznega gena (55). Diagnostika na podlagi NGS ima lahko različne pristope. Prvi določa zaporedje v kodirajočih regijah DNA (angl. whole exome sequencing, WES). Z omenjenim pristopom lahko opredelimo genetske spremembe v eksonih vseh genov, vpletenih v razvoj NSHL, omogoča pa tudi opredelitev genetskih

sprememb v celotnemu eksomu, torej tudi novih sprememb v genih, ki z izgubo sluha še niso povezani. Drugi pristop pa omogoča določanje zaporedja celotnega genoma (angl.

whole genome sequencing, WGS) in vključuje tudi spremembe v intronskih regijah, ki ravno tako lahko vplivajo na nastanek NSHL (56, 55). Čeprav je NGS hitrejša in cenejša metoda in pogosto prva izbira pri določanju vzročnih sprememb pri nastanku NSHL, je za metodo značilna višja stopnja napak (56), ki pa se z večjo pokritostjo tarčnih regij lahko izboljša.

Analiza CNV je bistvenega pomena pri genetski opredelitvi izgube sluha. Za določanje CNV se uporabljajo citogenetske in genetske metode, ki se med seboj razlikujejo, saj uporabljajo različne pristope. Te metode so: kvantitativni PCR (qPCR), primerjalna genomska hibridizacija (angl. array comparative genomic hybridization - aCGH), fluorescenčna in situ hibridizacija (angl. Fluorescence in situ hybridization - FISH) in metoda hkratnega pomnoževanja od ligacije odvisnih sond (angl. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification - MLPA) (55, 57). Bistvenega pomena pri izbiri metode je ali želimo opredeliti znane spremembe ali spremembe, ki niso bile še opisane. Pomembna je tudi velikost spremembe, saj z molekularnimi genetskimi metodami, razen z MLPO, ne moremo določiti večjih delecij, duplikacij oz. insercij. Tako je MLPA izbrana metoda za določanje znanih večjih in manjših delecij in duplikacij; za določanje še neopredeljenih CNV je priporočena uporaba aCGH metode, ki temelji na tekmovanju fluorescentno označene referenčne in preiskovančeve DNA za vezavo na mikromreže (56).

2. NAMEN DELA, CILJI, HIPOTEZE

Namen magistrske naloge je v populaciji slovenskih bolnikov, ki še nimajo dodončno pojasnenega genetskega vzroka izgube, opredeliti CNV gena STRC in sicer z vzpostavitvijo stopenjskega analitskega pristopa. Tako bomo ovrednotili pogostost CNV gena STRC v slovenski populaciji in s tem opredelili pomen uvrstitve analize v algoritem rutinske genetske diagnostike bolnikov z izgubo sluha.

Cilj bomo dosegli s/z:

-

-

S tem želimo preveriti naslednje hipoteze:

-

-

-

3. METODE

3.1 PREISKOVANCI

V magistrsko nalogo smo vključili 174 preiskovancev, ki se vodijo na Kliniki za otorinolaringologijo in cervikofacialno kirurgijo Kliničnega centra v Ljubljani, in so bili zaradi izgube sluha napoteni na genetsko testiranje v genetski laboratorij Kliničnega inštituta za specialno laboratorijsko diagnostiko Pediatrične klinike Univerzitetnega kliničnega centra v Ljubljani, kjer so bili v genetski banki že zbrani njihovi vzorci DNA. Klinične podatke o fenotipskih značilnosti smo pridobili iz razpoložljive medicinske dokumentacije.

V preiskovano skupino smo vključili tiste preiskovance z nesindromsko izgubo sluha, katerim z predhodno opravljenim sekvenciranjem po Sangerju gena GJB2 in GJB6 ter s sekvenciranjem kliničnega eksoma s sekvenciranjem naslednje generacije niso dokončno opredelili genetskega vzroka za izgubo sluga. Bolnike, ki so sluh izgubili zaradi okoljskih povzročiteljev ali drugih znanih razlogov, nismo vključili v raziskavo.

Vključeni preiskovanci, oziroma skrbniki mladoletnih oseb, so podali pisno privolitev za genetsko testiranje. Protokol raziskave z naslovom “Opredelitev sprememb v številu kopij gena STRC pri bolnikih z izgubo sluha” je odobrila Komisija Republike Slovenije za medicinsko etiko (št. 0120-396/2020/6).

3.2 METODE

Za eksperimentalni del magistrske naloge smo uporabili DNA vzorce, izolirane iz periferne krvi s postopkom, ki je rutinsko v uporabi v genetskem laboratoriju Kliničnega inštituta za specialno laboratorijsko diagnostiko Pediatrične klinike v Ljubljani. Vzorci so v kodirani obliki shranjeni v DNA banki v prostorih Kliničnega inštituta za specialno laboratorijsko diagnostiko.

Potek eksperimentalnega dela je predstavljen na spodnji shemi (Slika 2).

Spektrofotometrična določitev koncentracije DNA

QF-PCR

Kapilarna elektroforeza (fragmentna analiza) Agarozna elektroforeza Redčenje in priprava vzorcev

negativen rezultat

pozitiven rezultat

MLPA

Redčenje in priprava vzorcev

MLPA reakcija

Denaturacija Hibridizacija Ligacija

PCR

Kapilarna elektroforeza (fragmentna analiza)

Analiza rezultatov (Coffalyser.Net)

CNV CNV

Slika 2: Shematski prikaz eksperimentalnega dela.

3.2.1 Laboratorijska oprema

LABORATORIJSKA OPREMA MODEL IN PROIZVAJALEC

Sterilna komora za delo z DNA UVC/T-M-AR, DNA/RNA UV-cleaner box, Biosan (Riga, Latvija)

Avtomatske pipete

(0,2-2; 1-10; 10-100; 100-1000) µL, Gilson (Middleton, WI, ZDA)

(0,5-10; 10-100) µL, Eppendorf (Hamburg, Nemčija)

(0,5-10) µL, Transferpette-8, BrandTech Scientific (Essex, CT, ZDA)

Elektronska pipeta 1 µL-50 mL, Multipette® E3, Eppendorf (Hamburg, Nemčija)

Sterilni nastavki za pipete

(0,1-10; 2-100, 100-1000) µL, Biosphere® Filter Tips, Sarstedt AG & Co. (Nümbrecht, Nemčija)

(0,1; 0,5) mL, Combitips® advanced, Eppendorf (Hamburg, Nemčija)

Sterilne mikrocentrifugirne epruvete Safe-Lock Tubes 1,5 mL, Eppendorf (Hamburg, Nemčija) Mikrotitrska ploščica s 96

vdolbinicami in pripadajočimi pokrovčki

MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate,

MicroAmp® Optical 8-Tube Strip , Applied Biosystems by Life Technologies (Carlsbad, CA, ZDA)

Magnetno mešalo Rotamix S-10, Tehtnica (Železniki, Slovenija)

Vibracijski mešalnik Vibromix 10, Tehtnica, Domel, d.o.o. (Železniki, Slovenija) VX-200 Vortex Mixer, Labnet (Edison, NJ, ZDA)

Centrifuge MiniSpin® plus, Eppendorf (Hamburg, Nemčija) Universal 320R, Hettich (Kirchlegern, Nemčija)

Ciklični termostat

GeneAmp® PCR System 9700, Applied Biosystems (Waltham, MA, ZDA)

SimpliAmp™ Thermal Cycler, Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, ZDA)

Genetski analizator ABI 3500, Applied Biosystems (Waltham, MA, ZDA) Mikrovalovna pečica SHARP (Osaka, Japonska)

Kadička in vir napetosti za elektroforezo

Wide Mini-Sub Cell GT (kadička), PowerPacTM HC (vir napetosti), Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, ZDA) Komora in program za slikanje gelov G:Box (komora), GeneSnap (program), Syngene (Cambridge,

Velika Britanija)

Spektrofotometer DS-11 FX+ Spectrophotometer, DeNovix (Wilmington, DE, ZDA)

Preglednica II: Seznam laboratorijske opreme.

3.2.1 Spektrofotometrična meritev koncentracije DNA Reagenti in raztopine: vzorec gDNA, deionizirana voda.

Instrumenti in oprema: UV spektrofotometer, centrifuga, pipete in sterilni nastavki, 1,5 mL sterilne mikrocentrifugirke, mikro-kvarčne kivete.

Delovni postopek:

Koncentracijo gDNA, smo določili z UV/VIS spektrofotometrom. Najprej smo pripravili vzorce - v mikrocentrifugirko smo napipetirali 990 μL dH2O in 10 μL izhodne raztopine DNA. Dobljeno raztopino smo premešali. Nato smo izmerili absorbanco slepe raztopine (destilirana voda) in nadaljevali z meritvijo absorbance posameznih vzorcev pri valovni dolžini 260 nm in 280 nm, pri čemer smo med meritvami kiveto vedno spirali z destilirano vodo. Vsakemu vzorcu smo določili razmerje abosrbanc (R) in koncentracijo.

3.2.2 Kvantitativna fluorescentna verižna reakcija s polimerazo (QF-PCR)

Priprava vzorcev gDNA

Reagenti in raztopine: vzorec gDNA, voda.

Material: pipete, sterilni nastavki za pipete, reakcijske epruvete s pripadajočimi pokrovčki (0,2 mL).

Delovni postopek:

Vzorec gDNA smo razredčili z vodo, pri čemer smo uporabili Enačbo 1, upoštevali smo, da je želena končna koncentracija gDNA 100 ng/μL.

𝑉(𝑔𝐷𝑁𝐴) =100𝑛𝑔/𝜇𝐿𝑥50𝜇𝐿 𝑐(𝑣ℎ𝑜𝑑𝑛𝑒𝐷𝑁𝐴)

Enačba 1: Izračun volumna vode za redčenje gDNA za reakcijo QF-PCR.

Pomnoževanje odsekov gena STRC z QF-PCR

Z verižno reakcijo s polimerazo lahko pomnožimo izbrane odseke DNA s pomočjo termostabilne DNA-polimeraze in dveh oligonukleotidnih začetnikov, ki DNA omejita na poljuben odsek. Reakcija poteka v treh korakih ob kontrolirani temperaturi, ki se ciklično ponavljajo. Prvi je denaturacija, pri kateri se DNA denaturira v dve ločeni vijačnici. Drugi korak je vezava oligonukleotidnih začetnikov na komplementarno zaporedje DNA, v tretjem pa DNA-polimeraza obe novi verigi podaljšuje od 5’ - 3’ konca matrice. Reakcija poteka verižno, kar pomeni, da jo večkrat ponovimo, ponavadi je teh ciklov 35. Pri vsaki ponovitvi se število kopij pomnoževanega odseka podvoji. Na koncu sledi še dodatno podaljševanje verig, ki niso bile do konca dograjene, in zaključi s hlajenjem (58). Za pomnoževanje smo uporabili izpeljanko osnovne reakcije PCR in sicer kvantitativno fluorescentno verižno reakcijo s polimerazo (QF-PCR), ki omogoča kvantifikacijo pomnoženih odsekov. Uporabili smo dva seta oligonukleotidnih začetnikov s katerima smo ločeno pomnožili eksona 18 in 26 gena STRC in sta bila že predhodno uporabljena v raziskavah na češki populaciji bolnikov (39). Pri tem je bil smerni oligonukleotid v posameznem paru fluorescentno označen z barvilom FAM, kar je omogočalo kasnejšo detekcijo s kapilarno elektorforezo. Začetna oligonukleotida sta sočasno pomnoževala gen STRC in tudi psevdogen STRCP1, pri tem so bili produkti zaradi prisotnih sprememb v psevdogenu različnih dolžin, kot je to prikazano v Preglednici III.

Reagenti in raztopine: voda brez nukleaz, vzorci gDNA (c = 100 ng/μL), delovna raztopina oligonukleotidnih začetnikov (zaporedje R in F oligonukleotidnih začetnikov so v Preglednici III), PCR reakcijska mešanica Invitrogen Platinum Hot Start PCR 2X Master Mix (vsebuje Taq DNA polimerazo in optimiziran pufer, ki vsebuje deoksiribonukleotide (dNTP) in MgCl2).

Delovno raztopino začetnih oligonukleotidov smo pripravili v 1,5 mL mikrocentrifugirki, tako, da smo napipetirali 10 μL izvorne raztopine oligonukleotidnih začetnikov in 90 μL vode ter premešali.

Oligonukelotidni

začetnik Oligonukelotidni začetnik

Dolžina fragmentov

STRC

Dolžina fragmentov

STRCP1 Oligonukleotid

na začetnika, ki omejita ekson 18

Forward primer CCTCTGATTTCGGGTAAAAGG^a

267 bp 264 bp Reverse primer GAAATTCGAGACCACCCTGA

Oligonukleotid na začetnika, ki omejita ekson 26

Forward primer ATGGGTGGACTGGATGGAAG^a

104 bp 106 bp Reverse primer GCCCTATCATAGACCTTCCCC

Material in aparature: 5 mL sterilne mikrocentrifugirne epruvete, pipete, tray-i, vibracijski mešalnik, komora za sterilno delo, aparat za PCR GeneAmp PCR System 9700.

Delovni postopek:

Pred pričetkom dela smo s 70% etanolom obrisali delovno površino, pipete in ostalo opremo, ki smo jo uporabili med delom. Nato smo iz zamrzovalne skrinje vzeli reagente, med odtajanjem smo izračunali potrebne količine reagentov (Preglednica IV) in pripravili reakcijske epruvete. Odtaljene reagente smo na kratko premešali na vibracijskem mešalniku in pripravili delovno PCR reakcijsko mešanico. Dobljeno raztopino smo kratko premešali in centrifugirali nato napipetirali v reakcijske epruvete, v vsako 19 μL in dodali 1 μL predhodno redčenega DNA vzorca.

1 x [μL]

H2O 8,5

Platinum Master mix 10

Primer F 0,5

Primer R 0,5

vzorec gDNA 0,5

SKUPAJ 20

Preglednica III: Nukleotidno zaporedje oligonukleotidnih začetnikov (a označuje vezano barvilo FAM).

Preglednica IV: PCR reakcijska mešanica.

Reakcijske epruvete smo zaprli in kratko premešali na vibracijskem mešalniku, da smo se znebili morebitnih mehurčkov ali tekočine na steni epruvet. Epruvete smo nato namestili v aparat za PCR, določili reakcijske pogoje (Preglednica V) in aparat zagnali. Ko smo zaključili, smo reagente pospravili v zamrzovalnik in delovno površino in uporabljeno opremo prebrisali s 70% etanolom.

Temperatura in čas Začetna denaturacija 94 °C, 2 '

Pomnoževanje 94 °C, 30 ''

35x cikel*

40x cikel**

59 °C, 30 '' 72 °C, 30 '' Končno podaljševanje 72 °C, 30 '

Hlajenje 10°, ∞

3.2.3 Preverjanje dolžine pomnoženih odsekov

Elektroforeza na agaroznem gelu

Velikost pomnoženih fragmentov med optimizacijo pomnoževanja smo preverili z elektroforezo na agaroznem gelu. Metoda temelji na ločevanju molekul DNA glede na njihovo velikost, kar dosežemo s premikanjem negativno nabitih delcev v raztopini pod vplivom električnega polja.

Priprava agaroznega gela

Reagenti in raztopine: agaroza, destilirana voda, SYBR Safe barvilo, 1x TBE pufer (pripravili smo ga, tako, da smo 10x redčili TBE pufer).

Material in aparature: tehtnica, pipete, erlenmajerica, merilni valj, urno steklo, mikrovalovna pečica, sistem za agarozno gelsko elektroforezo (nosilec za gel in glavniček).

Preglednica V: Reakcijski pogoji QF-PCR reakcije

* 35 ciklov smo uporabili pri pomnoževanju eksona 26

** 40 ciklov smo uporabili pri pomnoževanju eksonu 18

Delovni postopek:

2% agarozni gel smo pripravili tako, da smo v erlenmajerico zatehtali 1,6 g agaroze in dolili 80 mL 1x TBE pufra ter s pipeto dodali 8 μL barvila SYBR Safe ter vse dobro premešali. Erlenmajerico z vsebino smo stehtali ter si to zapisali. Na erlenmajerico smo položili urno steklo ter postavili v mikrovalovno pečico, kjer smo mešanico kuhali dvakrat po 1 minuto, da se je agaroza popolnoma raztopila. Erlenmajerico z vsebino smo ponovno stehtali ter dolili toliko vode, da je teža bila enaka teži pred izhlapevanjem vode. Gel smo nato ohladili na 60°C in ga vlili v kalup ter dodali glavniček, pri čemer smo pazili, da smo z nastavkom za pipeto odstranili vse mehurčke zraka. Ko se je gel strdil smo odstranili glavniček. Agarozni gel smo lahko uporabili takoj ali ga shranili v hladilniku na 4°C.

Elektroforeza v agaroznem gelu

Reagenti in raztopine: nanašalni pufer za elektroforezo, označevalec velikosti, vzorec (pomnoženi odsek eksona 18 in eksona 26 gena STRC)

Material in aparature: elektroforezna kadička in napajalnik, transluminator G:Box Sygene.

Delovni postopek:

V elektroforezno kadičko smo položili agarozni gel ter prelili z 1X TBE pufrom. V žepke agaroznega gela smo nanesli vzorce, katerim smo predhodno dodali barvilo in standard (lestvico DNA fragmentov z znanimi dolžinami). Elektroforeza je potekala pri napetosti 90V. Po 30 minutah smo gel prenesli iz elektroforezne kadičke v transluminator za slikanje gelov G:Box. Rezultate smo posneli s programom GeneSnap. V primeru uspešne PCR reakcije so bile na gelu vidne jasne lise produktov.

3.2.4 Analiza fragmentov DNA s kapilarno elektroforezo

Reagenti in raztopine: vzorci (pomnoženi odseki - omejeni ekson 18 in ekson 26 gena STRC, formamid, katodni pufer, anodni pufer, polimer POP-7TM, velikostni standard GeneScan^TM 600 LIZ^TM.

Material in aparature: ABI 3500 genetski analizator.

Delovni postopek:

Po PCR reakciji in elektroforezi na agaroznem gelu, s katero smo preverili uspešnost PCR reakcije, smo ločili fragmente s kapilarno elektroforezo na avtomatskem genetskem analizatorju ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems). Na ta način smo določili natančno dolžino pomnoženih odsekov in jih tudi relativno kvantificirali in sicer s primerjavo višine vrha specifičnega za gen z vrhom specifičnim za psevdogen. Najprej smo označili mikrotitrsko ploščico in pripravili reakcijsko mešanico formamida in velikostnega standarda GeneScan 600 LIZ. Reakcijsko mešanico smo pripravili tako, da smo število vzorcev, ki smo jih želeli analizirati pomnožili z 13,5, da smo dobili končen volumen formamida in množili z 0,5, da smo dobili končni volumen 600 LIZ standarda. Pripravljeno reakcijsko mešanico smo premešali na vibracijskemu mešalniku. Na mikrotitrsko ploščico smo v vsako posamezno reakcijsko posodico napipetirali 14 μL reakcijske mešanice formamida in 600 LIZ standarda in dodali 0,5 μL pomnoženega vzorca DNA ter premešali s pipeto. Ploščico smo nato dobro zaprli s pripadajočimi pokrovčki ter v cikličnem termostatu denaturirali na 94°C za 3 minute, nato ohladili na 4 °C. Denaturirane vzorce smo premešali na vibracijskemu mešalniku.

Pred začetkom fragmentne analize smo na genetskem analizatorju preverili stanje reagentov, ki jih je potrebno menjati na dva tedna. Reagente - polimer POP-7, anodni in katodni pufer smo menjali tako, da smo jih predhodno ogreli na sobni temperaturi in jih vstavili v aparat na njihovo predpisano mesto. Nato smo v program sekvenciranja ABI 3500 Series Data Collection Software V1.0 vnesli podatke o analizi, nastavili smo ime analize, število in oznako vdolbinic z vzorcem, tip testa in določili pozicijo mikrotitrske plošče v aparatu. Ko smo nastavili vse potrebne podatke smo mikrotitrsko ploščo postavili v adapter, pokrili s čisto septo in pokrovom adapterja. Ploščo smo vstavili v avtomatski vzorčevalnik, na predhodno označeno pozicijo in zagnali analizo.

V kapilari fluorescenčno označeni produkti PCR potujejo pod električno napetostjo, in sicer tako, da krajši fragmenti hitreje dosežejo detektor, daljši pa počasneje. V detektorski celici laser ekscitira vezana fluorescentna barvila, kar ujame kamera. Fluorescenčni signal generira vrh v končnem signalu, katerega programska oprema primerja s standardno krivuljo internega standarda 600 LIZ (59, 60).

3.2.5 MLPA

Princip metode

MLPA je metoda hkratnega pomnoževanja od ligacije odvisnih sond. Je semikvantitativna metoda s katero lahko določimo relativno število kopij specifičnega DNA zaporedja, dolžine do približno 60 nukleotidov. MLPA reakcijo lahko razdelimo na pet korakov: (1) denaturacija DNA in hibridizacija sond; (2) reakcija ligacije; (3) PCR pomnoževanje; (4) ločevanje produktov z kapilarno elektroforezo ter (5) analiza podatkov s Coffalyser.Net.

V prvem koraku se DNA denaturira in inkubira z mešanico MLPA sond. Vsaka sonda je sestavljena iz dveh polovičnih sond - 5’ in 3’ sond. Polovični sondi sta sestavljeni iz ciljno specifičnega zaporedja in univerzalnega zaporedja, ki omogoča PCR pomnoževanje. Vsaj ena, pogosto obe polovični sondi, vsebujeta tudi zaporedje, ki omogoča njihovo razlikovanje. Sondi prepoznata neposredno sosednji mesti v tarčnem zaporedju DNA.

Le v prisotnosti popolnega ujemanja na neposredno sosednji mesti se polovični sondi lahko ligirata, čemur sledi reakcija PCR. Med PCR reakcijo se vse ligirane sonde istočasno pomnožijo z uporabo istega para oligonukleotidnih začetnikov, od katerih je eden fluorescentno označen. Četrti korak je ločevanje fragmentov po dolžini s kapilarno elektroforezo, vsak fragment ustreza določeni sondi MLPA. Zadnji korak je analiza podatkov s programom coffalyser.net (61). MLPA je relativna metoda, zato lahko le s primerjavo relativne višine vrhov sond posameznega vzorca z relativnimi višinami sond različnih referenčnih vzorcev zaznamo relativne razlike v številu kopij tarčne DNA. Delecija enega ali več tarčnih zaporedij je vidna kot relativno znižanje v višini vrhov, duplikacija pa kot relativno zvišanje v višini vrhov (52).

Priprava vzorcev

Reagenti in raztopine: voda brez nukleaz, vzorci izolirane gDNA, stabilizator vzorcev SALSA

Material: pipete, sterilni nastavki za pipete, reakcijske epruvete s pripadajočimi pokrovčki (0,2 mL).

Delovni postopek:

Pred začetkom reakcije smo na podlagi rezultatov dobljenih s QF-PCR reakcijo določili tiste vzorce, pri katerih je bil prisoten sum na delecijo gena STRC. Samo te vzorce smo nato analizirali z MLPO. Prav tako smo po priporočilih proizvajalca izbrali tri referenčne vzorce, ti so pripadali posameznikom brez sprememb v zaporedju, ki jih zazna ciljna in referenčna sonda, ter slepi vzorec, ki ni vseboval DNA.

Vzorce gDNA in tri referenčne vzorce smo razredčili z vodo brez nukleaz. Uporabili smo Enačbo 2, pri čemer smo upoštevali, da je željena koncentracija gDNA 25 ng/μL in končni volumen 5 μL, saj se pri večjih volumnih zniža koncentracija sond in soli ter posledično zmanjša stabilnost in hitrost hibridizacije. Vzorce smo razredčili tik pred začetkom reakcije.

𝑉(𝑔𝐷𝑁𝐴) =25𝑛𝑔/𝜇𝐿𝑥50𝜇𝐿

𝑐(𝑣ℎ𝑜𝑑𝑛𝑒𝐷𝑁𝐴)

Reakcija MLPA

Reagenti in raztopine: redčeni vzorci gDNA, referenčni vzorci, slepa, voda brez nukleaz, SALSA MLPA Probemix P461-A1 DIS.

SALSA MLPA Probemix P461-A1 DIS vsebuje 40 MLPA sond, ki pomnožujejo produkte dolžine med 130 in 463 nt. 5 sond se veže na gen STRC, 5 na gen CATSPER2, 6 na gen OTOA in 12 sond se veže na gene v območju 15q15.3 in 16q12.2 (npr. na CKMT1B, PPIP5K1, PDIA3, UQCRC2.), kar omogoča določanje večjih delecij oz. duplikacij, ki zajemajo širša genetska področja in več genov. Preostanek sond so referenčne sonde, ki omogočajo prepoznavo avtosomnih kromosomov (63).

Material: pipete, sterilni nastavki za pipete, reakcijske epruvete, mikrotitrska ploščica s 96 vdolbinicami, ciklični termostat Applied Biosystems, ABI 3500 genetski analizator,

Enačba 2: Izračun volumna vode za redčenje gDNA za reakcijo MLPA.

Delovni postopek:

Reakcija MLPA sestoji iz 4. korakov, ki smo jih predstavili v nadaljevanju. Prvi dan smo vzorce denaturirali in hibridizirali sonde na tarčno zaporedje DNA, drugi dan je sledila ligacija in pomnoževanje ligiranih sond. Koraki so prav tako predstavljeni na spodnji sliki.

1. korak: Denaturacija DNA

Prvi dan analize smo iz zamrzovalnika vzeli pufer SALSA MLPA in mešanico sond SALSA MLPA Probemix P461-A1 DIS, da so se lahko odtalili medtem ko smo vzorce denaturirali.

Nato smo označili epruvete, volumna 0,2 mL ter vanje s pipeto dodali 5 μL predhodno razredčene vzorce gDNA, referenčne vzorce in negativno kontrolo. Reakcijske epruvete smo nato tesno zaprli ter jih postavili v ciklični termostat in izbrali program denaturacije (program 1 in 2) - 5 min na 98 °C, ohladitev na 25 °C.

2. korak: Hibridizacija sond na tarčno zaporedje DNA

Med denaturacijo vzorcev smo odtaljena reagenta kratko premešali na vibracijskem mešalniku in nato še centrifugirali. Nato smo pripravili hibridizacijski mešanico tako, da smo za vsako reakcijo v mikrocentrifugirno epruveto napipetirali 1,5 μL pufra in 1,5 μL mešanice sond. Reakcijsko zmes smo dobro premešali na vibracijskem mešalniku. Ko so bili vsi vzorci ohlajeni na 25°C smo jih prenesli iz cikličnega termostata in v vsako reakcijsko epruveto napipetirali 3 μL izhodiščne hibridizacijske zmesi in nežno premešali s pipeto. Reakcijske epruvete smo tesno zaprli ter nadaljevali s programom hibridizacije v cikličnem termostatu (program 3 in 4) - 1 min na 95 °C in 16-20 ur na 60 °C (oz. čez noč).

3. korak: Ligacija hibridiziranih sond

Drugi dan analize smo iz zamrzovalnika vzeli reagente za pripravo ligacijske reakcijske (angl. Ligase-65 master mix) in polimerazne mešanice (angl. Polymerase master mix), katere

Slika 3: Postopek MLPA (prirejeno po (62)).

smo uporabili v 4. koraku. V sterilno mikrocentrifugirko smo za vsako reakcijo napipetirali 25 μl vode brez nukleaze, 3 μl ligaznega pufra B in nato dodali 1 μl ligaze-65, katero smo pred uporabo greli v dlani, da zmanjšamo viskoznost. Reakcijsko mešanico smo nato premešali s pipeto. Po pripravi reakcijske mešanice smo ciklični termostat v kateremu so bili naši vzorci nastavili na 54°C. Medtem ko so vzorci bili v cikličnem termostatu, smo v vsako reakcijsko epruveto napipetirali 32 μl ligacijske reakcijske mešanice in premešali s pipeto.

Pri petiranju smo poskušali biti zelo hitri, saj so vzorci podvrženi čezmerni evaporaciji, kar lahko privede do povišane koncentracije soli in tvorbe sekundarnih DNA struktur, ki preprečujejo vezavo sond na tarčno zaporedje. Nato smo reakcijske epruvete tesno zaprli in nadaljevali s programom ligacije (program 6 - 8) - 15 min na 54°C, 5 min na 98°C in ohladitev na 20°C.

4. korak: Pomnoževanje ligiranih sond s PCR

Medtem ko so bili vzorci v cikličnem termostatu, smo pripravili polimerazno reakcijsko mešanico. Za vsako reakcijo smo v sterilno mikrocentrifugirko napipetirali 7,5 μl vode brez nukleaz, 2 μl SALSA PCR mešanice oligonukleotidnih začetnikov in 0,5 μl SALSA polimeraze, katero smo pred uporabo segreli v dlani, da bi zmanjšali viskoznost. Mešanico smo nežno premešali s pipeto. Pri sobni temperaturi smo v vsako reakcijsko epruveto dodali 10 μl polimerazne reakcijske mešanice ter nežno premešali s pipeto. Reakcijske epruvete smo tesno zaprli in jih vrnili v ciklični termostat, kjer smo nadaljevali s programom verižne reakcije s polimerazo (program 9 - 11). Program PCR sestoji iz 35 ciklov (30 sekund pri 95°C, 30 sekund pri 60°C in 1 min pri 72°C), 20 minut 72°C ter ohladitev na 15°C.

5. korak: Kapilarna elektroforeza

Po končani reakciji MLPA smo dobljene fragmente ločili s kapilarno elektroforezo na avtomatskem genetskem analizatorju ABI 3500. Pripravili smo mikrotitrsko ploščico MicroAmp® Optical, jo označili ter v vsako reakcijsko reakcijsko posodico napipetirali 9 μL formamida, 0,2 μL velikostnega standarda GS 600 LIZ in 0,7 μL vzorca (PCR produkta).

Reakcijske posodice smo dobro zaprli s pripadajočimi pokrovčki in jo postavili v ciklični termostat za 3 min na 86°C. Vzorce smo nato ohladili na 4 °C, ter pustili pri tej temperaturi še dodatni 2 minuti.

Po navodilih, ki smo jih opisali v poglavju “Analiza fragmentov DNA s kapilarno elektroforezo” smo nato zagnali kapilarno elektroforezo. Dobljene rezultate smo analizirali s programom Coffalyser.Net (61) proizvajalca MRC Holland.

6. korak: Analiza rezultatov s programsko opremo coffalyser.Net

Za zanesljivo analizo in interpretacijo rezultatov je pomembno, da se vrhovi v neobdelanih podatkih pravilno prepoznajo kot signali posameznih sond in fragmentov, ki so nastali med postopkom MLPA. Zato smo pred samo analizo podatkov s programom coffalyser.Net posodobili tudi Coffalyser knjižnico. Knjižnica vsebuje vse potrebne informacije, značilne za posamezne mešanice sond, katere razlikujemo z LOT številko. Po posodobitvi knjižnice smo v program vpisali potrebne podatke - izbrali smo ABI 3500 sistem za kapilarno elektroforezo, za velikostni standard smo izbrali GS600 ter vpisali LOT identifikacijsko številko mešanice sond, ki smo jo uporabili pri reakcijah. Po vpisu standardnih podatkov smo vpisali še podatke specifične za našo analizo, in sicer smo analizo poimenovali (datum, preiskovani gen, oznake vzorcev) in rezultate prenesli v program. Po prenosu smo še definirali tip vzorca bodisi je bil preiskovani vzorec, referenčni vzorec ali slepi vzorec, brez DNA in zagnali fragmentno in primerjalno analizo.

Pred pregledom končnih rezultatov smo preverili kakovost vsake reakcije MLPA. Mešanica sond P461-A1 DIS vsebuje devet kontrolnih fragmentov - štiri Q-fragmente (angl. Quantity Fragments), dva D-fragmenta (angl. DNA Denaturation Fragments), en Benchmarkov fragment, en X-fragment (angl. X chromosome specific) in en Y-fragment (Y chromosome specific).

Benchmarkov fragment dolžine 92 nukleotidov se uporablja kot merilo ostalim kontrolnim fragmentom. Štiri Q fragmente, dolžine 64, 70, 76 in 82 nukleotidov uporabljamo kot oceno za zadostno količino DNA in uspešnost ligacije. Višina fragmentov je premosorazmerna količini DNA, ki smo jo uporabili pri pripravi vzorcev. Fragmenta D dolžine 88 in 96 nukleotidov vsebujeta območja CpG otokov. CpG otočki vsebujejo več CG ponovitev in se zaradi trojne vezi med nukleotidi težje denaturirajo. Ravno zato se fragmenta D uporabljata pri oceni uspešnosti denaturacije. Njuna višina je premosorazmerna uspešnosti denaturacije.

X-fragment in Y-fragment sta kontroli spola, saj sta pomnožka odsekov na kromosomih X oziroma Y in kontaminacije med vzorci.

Fluorescenco, ki smo jo določili s kapilarno elektroforezo, ni mogoče neposredno uporabiti za določanje CNV, zato je potrebna normalizacija signala vsake sonde. Normalizacija je dvostopenjska - znotraj enega vzorca (angl. intrasample normalisation) in med različnimi vzorci (angl. intersample normalisation). Program normalizira podatke znotraj enega vzorca tako, da primerja signal vsake posamezne sonde v vzorcu s signalom referenčnih sond, ki imajo normalno število CNV.

Normalizacija med različnimi vzorci omogoči določitev relativnega števila CNV. Relativne vrednosti program izračuna tako, da primerja vsak vzorec z referenčnimi vzorci v dveh korakih. V prvem koraku, se intenzivnost signala tarčne sonde 1 (Tp1) deli z intenzivnostjo signala referenčne sonde 1 v vzorcu 1, enako se naredi v referenčnem vzorcu 1. Prvo vrednost se nato deli z drugo vrednostjo. Temu principu sledi izračun z vsemi referenčnimi sondami, ki so vključene v reakcijsko mešanico. Program nato povzame srednjo vrednost teh izračunov.

V drugem koraku program ponovi 1. korak z vsemi referenčnimi vzorci, vključenimi v analizo. Rezultat je toliko srednjih vrednosti za tarčno sondo 1 v vzorcu 1, kolikor je vključenih referenčnih vzorcev v analizi. coffalyser.Net izračuna povprečje srednjih vrednosti (mediano), kar je končno razmerje tarčne sonde v vzorcu 1. Oba koraka se nato aplicirata za vse sonde v reakcijski mešanici in vse vzorce. Končni rezultat obdelave podatkov je podan v obliki doznega količnika (ang. dosage quotient - DQ) oziroma diagramom razmerja sond (angl. probe ratio chart). Iz vrednosti DQ razberemo status CNV, kar je prikazano v spodnji preglednici:

CNV Dozni količnik

Normalno 0.80 < DQ < 1.20

Homozigotna delecija DQ = 0

Heterozigotna delecija 0.40 < DQ < 0.65 Heterozigotna duplikacija 1.30 < DQ < 1.65 Heterozigotna triplikacija / homozigotna duplikacija 1.75 < DQ < 2.15

Neznano število kopij Ostale vrednosti

Preglednica VI: CNV status s pripadajočim doznim količnikom (povzeto po (63)).