UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
VESNA BRICMAN MAGISTRSKO DELO
MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM LABORATORIJSKA BIOMEDICINA
Ljubljana, 2022
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
VESNA BRICMAN
VPLIV Z GASTRINOM SPODBUJENIH ZUNAJCELIČNIH VEZIKLOV NA MIGRACIJO NAIVNIH CELIC RAKA ŽELODCA
EFFECT OF GASTRIN-INDUCED EXTRACELLULAR VESICLES ON NAIVE GASTRIC CANCER CELL MIGRATION
MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM LABORATORIJSKA BIOMEDICINA
Ljubljana, 2022
iii
Magistrsko nalogo sem opravljala na Inštitutu za biokemijo, v Medicinskem centru za molekularno biologijo, na Medicinski fakulteti, Univerze v Ljubljani pod mentorstvom izr.
prof. dr. Katarine Trebušak Podkrajšek in somentorstvom izr. prof. dr. Petre Hudler, univ.
dipl. mikr. Meritve s pretočnim citometrom smo izvajali na Inštitutu za mikrobiologijo, na Medicinski fakulteti, pod mentorstvom doc. dr. Andreje Nataše Kopitar, univ. dipl. biol.
Optično sledenje posameznemu delcu (angl. NTA) je izvedla asist. dr. Alja Zottel, na Inštitutu za biokemijo, v Medicinskem centru za molekularno biologijo, na Medicinski fakulteti. Slikanje pod mikroskopom za funkcijske teste, smo izvajali v Centru za funkcijsko genomiko in bio-čipe, na Medicinski fakulteti.
Zahvala
Zahvaljujem se mentorici izr. prof. dr. Katarini Trebušak Podkrajšek in somentorici izr.
prof. dr. Petri Hudler, univ. dipl. mikr. za hitro odzivnost, nasvete in vodenje tekom izvajanja magistrske naloge. Asist. Pii Pužar Dominkuš se zahvaljujem za potrpežljivost, vodenje, nasvete in pomoč pri delu v laboratoriju. Zahvaljujem se dr. Mariji Holcar in asist. Teji Lavrin, mag. mikrobiol. za pomoč pri ultracentrifugiranju in asist. dr. Alji Zottel za izvajanje metode NTA. Zahvaljujem se doc. dr. Andreji Nataši Kopitar, univ. dipl. biol.
za pomoč pri izvajanju meritev s pretočnim citometrom. Zahvaljujem se asist. razisk. Roku Razpotniku za nasvete in pomoč pri izvajanju migracijskih testov. Zahvala gre tudi vsem ostalim zaposlenim v Medicinskem centru za molekularno biologijo.
Posebno zahvalo si zasluži moja družina za podporo, spodbujanje, poslušanje in pomoč tekom celotnega študija; brez njih ta naloga ne bi nastala.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko delo samostojno izvedla pod vodstvom mentorice izr. prof.
dr. Katarine Trebušak Podkrajšek in somentorice izr. prof. dr. Petre Hudler, univ. dipl.
mikr.
Vesna Bricman
iv KAZALO VSEBINE
1. UVOD ... 1
1.1. OKOLJSKI DEJAVNIKI ZA RAZVOJ RAKA ŽELODCA ... 1
1.2. GENETSKI DEJAVNIKI ZA RAZVOJ RAKA ŽELODCA ... 2
1.3. GASTRIN ... 2
1.4. VLOGA GASTRINA PRI RAZVOJU RAKA ŽELODCA ... 2
1.4.1. VPLIV GASTRINA NA CELIČNO RAZMNOŽEVANJE ... 3
1.4.2. VPLIV GASTRINA NA ANGIOGENEZO ... 3
1.4.3. VPLIV GASTRINA NA APOPTOZO ... 3
1.4.4. VPLIV GASTRINA NA INVAZIVNOST IN MIGRACIJO ... 4
1.5. ZUNAJCELIČNI VEZIKLI ... 4
1.5.1. VLOGA ZUNAJCELIČNIH VEZIKLOV ... 5
1.5.2. RAZVRŠČANJE ZUNAJCELIČNIH VEZIKLOV ... 5
i. EKSOSOMI ... 6
ii. MIKROVEZIKLI ... 6
iii. ONKOSOMI ... 7
1.6. ZUNAJCELIČNI VEZIKLI IN RAK ŽELODCA ... 7
1.6.1. VPLIV VEZIKLOV IZ CELIC RAKA ŽELODCA NA ANGIOGENEZO IN METASTAZIRANJE ... 8
2. NAMEN DELA IN HIPOTEZE ... 9
3. MATERIALI IN METODE ... 10
3.1. MATERIALI ... 10
3.1.1. CELIČNE LINIJE ... 10
3.1.2. REAGENTI IN KEMIKALIJE ... 10
3.1.3. MATERIALI IN LABORATORIJSKA OPREMA ... 12
3.1.4. MEDIJI ZA GOJENJE CELIČNIH KULTUR ... 13
3.1.5. PROTITELESA ZA PRENOS WESTERN ... 14
3.1.6. PUFRI IN RAZTOPINE ZA ELEKTROFOREZO IN PRENOS WESTERN ... 15
3.1.7. PRIPRAVA GELA ZA POLIAKRILAMIDNO GELSKO ELEKTROFOREZO .. 16
3.2. METODE ... 17
3.2.1. PRIPRAVA CELIČNIH LINIJ (ODMRZOVANJE IN NASAJANJE CELIC)... 17
3.2.2. GOJENJE CELIČNIH LINIJ MKN45 IN MCF-10A ... 17
3.2.3. ŠTETJE CELIC ... 18
3.2.4. TRETIRANJE CELIČNE LINIJE MKN45 Z GASTRINOM ... 18
v
3.2.5. IZOLACIJA ZUNAJCELIČNIH VEZIKLOV ... 18
i. IZOLACIJA ONKOSOMOV ... 19
ii. IZOLACIJA MIKROVEZIKLOV ... 19
iii. IZOLACIJA EKSOSOMOV ... 19
3.2.6. MERJENJE KONCENTRACIJE PROTEINOV ... 20
3.2.7. PRENOS WESTERN ... 21
3.2.8. DETEKCIJA PROTEINOV PO PRENOSU WESTERN ... 21
3.2.9. OPTIČNO SLEDENJE POSAMEZNEMU DELCU (ANGL. NTA) ... 22
3.2.10. PRETOČNA CITOMETRIJA ... 22
3.2.11. OPTIMIZACIJA TESTOV MIGRACIJE CELIC MKN45 IN MCF-10A ... 24
3.2.12. ANALIZA CELIČNE MIGRACIJE ... 24
4. REZULTATI ... 26
4.1. ANALIZA ZUNAJCELIČNIH VEZIKLOV S POVRŠINSKIMI OZNAČEVALCI ... 26
4.2. DOLOČANJE KONCENTRACIJE PROTEINOV ... 27
4.3. OPTIČNO SLEDENJE POSAMEZNEMU DELCU (ANGL. NTA) ... 28
4.4. ANALIZA VEZIKLOV S PRETOČNO CITOMETRIJO... 30
4.5. OPTIMIZACIJA TESTOV MIGRACIJE ... 33
4.6. ANALIZA CELIČNE MIGRACIJE ZA CELIČNO LINIJO MKN45 ... 35
4.7. ANALIZA CELIČNE MIGRACIJE ZA CELIČNO LINIJO MCF-10A ... 39
5. RAZPRAVA ... 44
i. PRENOS WESTERN ... 45
ii. OPTIČNO SLEDENJE POSAMEZNEMU DELCU (ANGL. NTA) ... 45
iii. PRETOČNA CITOMETRIJA ... 46
iv. ANALIZA CELIČNE MIGRACIJE ... 47
6. SKLEP ... 50
7. LITERATURA ... 51
8. PRILOGA ... 62
vi KAZALO SLIK
Slika 1: Privzem zunajceličnih veziklov (ZV) v tarčno celico. ... 5
Slika 2: Prikaz velikosti zunajceličnih veziklov v primerjavi z mikrobi in celičnimi organeli. ... 6
Slika 3: Shematski prikaz biogeneze eksosomov. ... 6
Slika 4: Shematski prikaz vpliva zunajceličnih veziklov iz celic raka želodca na druge celice ... 7
Slika 5: Shema celotne izvedbe poizkusa... 20
Slika 6: Enačba za določanje koncentracije mikroveziklov in onkosomov, s pomočjo fluorescenčnih kroglic znanih koncentracij ... 23
Slika 7: Shema izvedbe testa migracije za celični liniji MKN45 in MCF-10A. ... 25
Slika 8: Karakterizacija zunajceličnih veziklov s prenosom Western. ... 26
Slika 9: Koncentracije proteinov na površini veziklov, izoliranih iz kontrolnih vzorcev in vzorcev, spodbujenih z gastrinom... 28
Slika 10: Grafični prikaz povprečne velikosti mikroveziklov in eksosomov izmerjenih z metodo NTA... 28
Slika 11: Grafični prikaz rezultatov metode NTA za povprečno količino izločenih eksosomov (A.) in mikroveziklov (B.), preračunan na milijon celic MKN45 ... 29
Slika 12: Grafični prikaz velikostne porazdelitve eksosomov (A.) in mikroveziklov (B.) ... 30
Slika 13: Prikaz rezultatov pretočnega citometra in histogram kroglic različnih velikosti. ... 31
Slika 14: Grafični prikaz povprečnega števila mikroveziklov na milijon celic.. ... 32
Slika 15: Primer točkovnega diagrama 2. meritve za vzorec mikroveziklov. ... 33
Slika 16: Prikaz optimizacije migracijskega testa celic MKN45 pri najvišji koncentraciji celic, v časovnih obdobjih 0 h, 24 h, 48 h in 54 h. ... 34
Slika 17: Grafičen prikaz optimizacije migracijskega testa celic MKN45 pri najvišji koncentraciji, v časovnih obdobjih 0 h, 24 h, 48 h in 54 h. ... 34
Slika 18: Prikaz optimizacije migracijskega testa celic MCF-10A pri najvišji koncentraciji celic, v časovnih obdobjih 0 h, 24 h, 48 h in 54 h. ... 35
Slika 19: Prikazi migracije naivnih celic MKN45, pridobljeni 0 h, 6 h, 24 h, 30 h, 48 h po dodatku zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celic MKN45. ... 35
Slika 20: Prikazi migracije celic MKN45, ob 0 h, 6 h, 24 h, 30 h in 48 h po dodatku zunajceličnih veziklov, ki so bili izolirani iz celic MKN45, spodbujenih z gastrinom.. ... 36
Slika 21: Grafični prikazi hitrosti zapiranja reže med celicami MKN45 po dodatku onkosomov (A.), mikroveziklov (B.) ali eksosomov (C.), v časovnih obdobjih. ... 38
Slika 22: Grafični prikaz hitrosti migracije celic MKN45 po dodatku zunajceličnih veziklov.. ... 39
Slika 23: Prikazi migracije celic MCF-10A, pridobljeni 0 h, 6 h, 24 h, 30 h, 48 h po dodatku zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celic MKN45 ... 40
Slika 24: Prikazi migracije celic MCF-10A, pridobljeni 0 h, 6 h, 24 h, 30 h, 48 h po dodatku zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celic MKN45, spodbujenih z gastrinom. ... 40
Slika 25: Grafični prikazi hitrosti zapiranja reže med celicami MCF-10A po dodatku onkosomov (A.), mikroveziklov (B.) ali eksosomov (C.), v časovnih obdobjih.. ... 42
Slika 26: Grafični prikaz hitrosti migracije celic MCF-10A po dodatku zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celic MKN45, ki so bile tretirane z gastrinom, v primerjavi s celicami MCF-10A po dodatku zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celic MKN45, ki niso bile izpostavljene gastrinu.. .. 43
vii KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: Seznam uporabljenih reagentov in kemikalij ... 10
Preglednica II: Seznam materialov in laboratorijske opreme ... 12
Preglednica III: Medij za celično linijo MKN45 ... 13
Preglednica IV: Medij brez seruma (FBS) za celice MKN45 ... 14
Preglednica V: Medij za celično linijo MCF-10A ... 14
Preglednica VI: Seznam uporabljenih protiteles za prenos Western... 15
Preglednica VII: Seznam uporabljenih raztopin in njihova sestava ... 15
Preglednica VIII: Ločitveni (A.) in koncentracijski gel (B.) za poliakrilamidno gelsko elektroforezo in prenos Western ... 16
Preglednica IX: Koncentracije površinskih proteinov zunajceličnih veziklov ... 27
Preglednica X: Povprečne koncentracije površinskih proteinov in razmerje koncentracij za posamezno podskupino zunajceličnih veziklov. ... 27
Preglednica XI: Koncentracije mikroveziklov in onkosomov izračunane iz podatkov dobljenih s pretočnim citometrom ... 31
Preglednica XII: Povprečne vrednosti zapiranja reže med celicami MKN45 po dodatku zunajceličnih veziklov. ... 36
Preglednica XIII: Povprečne vrednosti zapiranja reže med celicami MCF-10A po dodatku zunajceličnih veziklov. ... 41
viii POVZETEK
Najpogostejši dejavniki za razvoj raka želodca so okužba s patogeno bakterijo Helicobacter pylori, spremembe v izražanju genov in gastro-ezofagealni refluks. Povečano izločanje peptidnega hormona gastrina, zaradi refluksa ali okužbe s H. pylori, stimulira proliferacijo želodčnih celic, kar poveča pojavnost karcinoidov v želodcu. Gastrin v patoloških pogojih zavira apoptozo, spodbuja celično proliferacijo in migracijo, kar vodi v povečano tveganje za nastanek raka želodca. Študije so pokazale, da na procese nastanka in napredovanja rakov med drugim vplivajo tudi zunajcelični vezikli, ki jih izločajo predrakave in rakave celice. Zunajcelični vezikli sodelujejo pri zapleteni medcelični komunikaciji, saj vsebujejo različne molekule, ki delujejo na tarčne celice. Zunajcelični vezikli so zanimivi za preučevanje, saj njihova sestava odraža sestavo celice izvora in je odvisna od stanja v celici. Glede na nastanek, velikost in izvor, razdelimo zunajcelične vezikle na tri podskupine: eksosomi, mikrovezikli in apoptotska telesca. Večji vezikli, ki jih izločajo rakave celice, se imenujejo onkosomi. V naši raziskavi nas je zanimalo, ali zunajcelični vezikli, izolirani iz celične linije raka želodca MKN45, spodbujene z gastrinom, pospešijo migracijo naivnih celic raka želodca MKN45 ter ali pospešijo migracijo naivnih normalnih epitelijskih celic MCF-10A. Z diferencialnim ultracentrifugiranjem smo ločili izolirane vezikle na eksosome, mikrovezikle in onkosome.
Nato smo njihove lastnosti ovrednotili s pretočno citometrijo in optičnim sledenjem posameznemu nanodelcu. Preverili smo njihov vpliv na migriranje naivnih celic raka želodca MKN45 in naivnih zdravih celic MCF-10A, s testom celjenja ran (angl. wound healing assay). Primerjali smo migracijo celic, ki smo jim dodali vezikle, izolirane iz celic, spodbujenih z gastrinom, in migracijo celic, ki smo jim dodali vezikle, izolirane iz celic, ki niso bile spodbujene z gastrinom. Ugotovili smo, da onkosomi in mikrovezikli, izolirani iz celic MKN45, spodbujenih z gastrinom, ne vplivajo na migracijo naivnih celic MKN45.
Eksosomi pa njihovo migracijo zavirajo. Na migracijo naivnih normalnih epitelnih celic MCF-10A nobena podskupina zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celic MKN45, spodbujenih z gastrinom, ni imela vpliva.
Ključne besede: rak želodca, celična linija MKN45, gastrin, zunajcelični vezikli, migracija
ix ABSTRACT
The most common factors for developing stomach cancer are infection with pathogenic bacteria Helicobacter pylori, changes in gene expression and acid reflux. Over-expression of peptide hormone gastrin due to acid reflux or H. pylori infection stimulates proliferation of gastric cells, which increases the formation of carcinoids in the stomach. In pathological conditions gastrin inhibits apoptosis, increases cell proliferation and migration, which leads to increased stomach cancer risk. Studies have shown that extracellular vesicles, secreted from pre-cancerous and cancerous cells, influence both the development and the progression of cancer. Extracellular vesicles are involved in complex cell-to-cell communication, because they carry different biomolecules, which have an effect on target cells. The composition of vesicles reflects the composition of cells of origin and it depends on the state the secreting cell is in. This makes extracellular vesicles interesting for studying. Based on their biogenesis, size and origin we divide extracellular vesicles into three subpopulations: exosomes, microvesicles and apoptotic bodies. Larger vesicles secreted form cancer cells are known as oncosomes. We were interested if extracellular vesicles isolated from gastric cancer cell line MKN45, induced with gastrin, increase the migration of naïve gastric cancer cell line MKN45 and normal epithelial cells MCF-10A.
Using differential centrifugation, we separated isolated extracellular vesicles into three populations: exosomes, microvesicles and oncosomes. They were evaluated by flow cytometry and nanoparticle tracking analysis. We tested their ability to affect cell migration on MKN45 cells and on MCF-10A cells using a “wound healing assay”. We compared the migration of cells exposed to extracellular vesicles isolated from MKN45 cells induced with gastrin, and migration of cells exposed to extracellular vesicles isolated from MKN45 cells that were not induced with gastrin. Our results showed that oncosomes and microvesicles isolated from MKN45 cells induced with gastrin did not affect the migration of naïve MKN45 cells, while exsosomes reduced their migration. Oncosomes, microvesicles and exosomes isolated from MKN45 cells induced with gastrin did not affect the migration of naïve MCF-10A cells.
Key words: gastric cancer, MKN45 cell line, gastrin, extracellular vesicles, migration
x SEZNAM OKRAJŠAV
APS – amonijev persulfat
CAF – z rakom povezani fibroblasti, aktivirani fibroblasti v tumorskem mikrookolju CCK-2 – holecistokininski receptor
CDH1 – gen za E-kadherin
CFSE – karboksifluorescein sukcinimidil ester CK18 – citokeratin 18
COX-2 – ciklooksigenaza-2 Cyt C – citokrom C
DMSO – dimetil sulfoksid
DPBS –fiziološka raztopina Dulbecco s fosfatnim pufrom DTT – ditiotreitol
ECL – enterokromafinom-podobne celice EGF – epidermalni rastni faktor
EGFR – receptor za epidermalni rastni faktor EKSO – eksosomi
FBS – fetalni goveji serum (angl. fetal bovine serum) MMP-9 – matriksna metalopeptidaza 9
MV – mikrovezikli
NTA – optično sledenje posameznemu delcu ONKO – onkosomi
PE – fikoeritrin
xi qH2O – ultračista voda
RIPA – lizirni pufer pri prenosu Western SDS – natrijev dodecil sulfat
TEMED – tetrametiletilendiamin ZV – zunajcelični vezikli
1
1. UVOD
Rak želodca je pogosta oblika raka tako v razvitih državah kot v državah v razvoju (1).
Zaradi nespecifičnih znakov v zgodnjih obdobjih bolezni ga običajno odkrijejo pozno, kar vodi v slabo prognozo. Po podatkih WHO, Mednarodne agencije za raziskave raka (angl.
International Agency for Research on Cancer, IACR), ki vzdržuje podatkovno zbirko GLOBOCAN, je bil rak želodca leta 2020 šesti najpogostejši rak na svetu, po smrtnosti pa na četrtem mestu. Leta 2020 je bil rak želodca četrti najpogostejši rak pri moških in sedmi najpogostejši rak pri ženskah. Rak želodca je dvakrat pogostejši pri moških kot pri ženskah. Največ novih primerov raka želodca je bilo leta 2020 odkritih v vzhodni Aziji, medtem ko je bilo novih primerov v razvitih državah manj (1).
Po podatkih GLOBOCAN-a je bil rak želodca leta 2020 v Sloveniji dvanajsti najpogostejši rak. Dvakrat pogostejši je pri moških kot pri ženskah. V Sloveniji je rak želodca šesti najpogostejši vzrok smrti zaradi raka (2).
1.1. OKOLJSKI DEJAVNIKI ZA RAZVOJ RAKA ŽELODCA
Rak želodca je neposredno povezan z okužbo s patogeno bakterijo Helicobacter pylori, ki jo svetovna zdravstvena organizacija uvršča v prvi razred rakotvornih snovi (3, 4).
Plummer et al. so leta 2015 s prenosom Western ugotovili, da je poleg 660 000 primerov raka, ki so jih povezali s H. pylori leta 2008, ta bakterija vzrok za razvoj raka še pri dodatnih 120 000 primerih. To kaže, da je H. pylori najmočnejši dejavnik tveganja za razvoj raka želodca (5). Okužba s H. pylori poveča tveganje za razvoj raka želodca do šestkrat, saj je povezana s kroničnim vnetjem želodčne sluznice in epigenetskimi spremembami celic želodčne sluznice, ki povzročajo celično preoblikovanje in metastaziranje (6). H. pylori ni edini patogen, ki je povezan z razvojem raka želodca – okoli 9 % primerov je posledica okužbe z virusom Epstein-Barr (7). Virus vstopi v celico gostitelja in izraža latentne proteine, ki vplivajo na metilacijo DNA gostitelja. Poleg tega latentni geni virusa vplivajo na zmanjšano izražanje E-kadherina, kar je ključni korak v razvoju raka želodca, povezanega z okužbo z virusom Epstein-Barr (8).
Drugi dejavniki tveganja za razvoj raka želodca so starost nad 65 let, kajenje, prekomerna telesna teža, prevelik vnos soli in nezadosten vnos svežega sadja in zelenjave (3, 9, 10).
2
1.2. GENETSKI DEJAVNIKI ZA RAZVOJ RAKA ŽELODCA
Genetski vzroki so najpogostejši razlog za razvoj raka želodca pred 45. letom starosti (10
% primerov) in pogosteje prizadenejo ženske (11, 12). Genetska sprememba v genu za E- kadherin (CDH1) poveča tveganje za razvoj dedne oblike difuznega raka želodca od 1,5 do 3-krat (13). Raziskave genetskih sprememb, predvsem polimorfizmov posameznega nukleotida, in študije na ravni celotnega genoma so odkrile še številne druge potencialne gene, povezane s povečanim tveganjem za razvoj raka želodca.
1.3. GASTRIN
Gastrin je gastrointestinalni hormon, ki nastaja v celicah G antruma želodca. Njegovo izločanje spodbujajo aminokisline v zaužiti hrani, razširitev želodca ob obroku, gastrin sproščujoči peptid ter povišana vrednost pH v želodčnem lumnu. Postenje in znižana vrednost pH želodčnega soka zavirata njegovo izločanje (14, 15). Gastrin z vezavo na holecistokininski receptor (CCK-2) neposredno stimulira parietalne celice, ki začnejo izločati želodčno kislino v želodčni lumen. Na izločanje kisline lahko gastrin deluje tudi posredno z vezavo na CCK-2 na enterokromafinom-podobnih celicah (ECL), v svodu in telesu želodca, ki izločajo histamin. Ta se nato veže na receptor H2 na parietalnih celicah in sproži izločanje želodčne kisline (15). Amidirane oblike gastrina vplivajo na uravnavanje razmnoževanja želodčnih mukoznih celic, ker povečajo izražanje različnih rastnih dejavnikov kot posrednikov proliferacijskih odzivov želodčne sluznice (16). Pomembna vloga gastrina pri vzdrževanju homeostaze želodčnega epitelija je vodila v raziskave njegove možne vloge pri spodbujanju nastanka in napredovanja raka želodca.
1.4. VLOGA GASTRINA PRI RAZVOJU RAKA ŽELODCA
Hipergastrinemija pomeni povišano koncentracijo gastrina v serumu nad 100 pg/mL oziroma več kot 47,7 pM (15). Hipergastrinemija je prisotna pri bolnikih z gastritisom in gastrično atrofijo, povezana je z okužbo s H. pylori in zdravljenjem z zaviralci protonskih črpalk. Številne študije preučujejo povezavo med hipergastrinemijo in rakom želodca.
Gastrin deluje z vezavo na receptor CCK-2, ki je prekomerno izražen na rakavih celicah pri želodčnem adenokarcinomu, kolorektalnem karcinomu ter pankreatičnem in ezofagealnem raku (17, 18, 19). Vezava gastrina na CCK-2 spodbuja razmnoževanje in zavira apoptozo celic, kar pomembno vpliva na nastanek gastrointestinalnih rakov (14).
Receptor CCK-2 se izraža že v premalignih spremembah želodčne sluznice in odstotek celic, ki izražajo receptor, narašča z napredovanjem rakavih sprememb (8 % celične
3
populacije pri intestinalni metaplaziji, 33,5 % celične populacije pri želodčnem adenokarcinomu) (20). Okužba s H. pylori in posledična hipergastrinemija sta povezani s povečanim izražanjem ciklooksigenaze-2 (COX-2) v želodčni sluznici. COX-2 prispeva h karcinogenezi s spodbujanjem celičnega razmnoževanja, angiogeneze in inhibicije apoptoze (21, 22).
1.4.1. VPLIV GASTRINA NA CELIČNO RAZMNOŽEVANJE
Amidirani obliki gastrina G-17 in G-34 in vitro povečata izločanje želodčne kisline in posledično spodbujata celično razmnoževanje (16). Hipergastrinemija spodbuja razmnoževanje želodčnih celic ECL z vezavo gastrina na receptor CCK-2 in posledično vpliva na povečano pojavljanje karcinoidov v želodcu (23). Pri bolnikih s kronično hipergastrinemijo so ugotovili, da višje vrednosti gastrina korelirajo s stopnjo hiperplazije celic ECL in da stanje hipergastrinemije od 1,7- do 4-krat poveča število celic ECL (24).
1.4.2. VPLIV GASTRINA NA ANGIOGENEZO
Gastrin vpliva na angiogenezo s spodbujanjem izražanja COX-2. Njegovo povišano izražanje v rakavih celicah je povezano z gostoto mikrožilja in invazivnostjo tumorja ter metastaziranjem v limfne vozle (25). Bolniki z okužbo s H. pylori in sekundarnim atrofičnim gastritisom so imeli v krvi povišane vrednosti gastrina in posledično povišano raven informacijske RNA (angl. messenger RNA, mRNA) za COX-2 v premalignih lezijah v želodčni sluznici, v primerjavi s kontrolno skupino, ki ni bila okužena s H. pylori.
Mesece po ozdravljeni okužbi se vrednosti gastrina v krvi in mRNA za COX-2 v želodčni sluznici normalizirajo (26). Ni še znano, ali je povišano izražanje COX-2 povezano le s hipergastrinemijo zaradi okužbe s H. pylori in posledično atrofijo želodca, ali k temu prispevajo še drugi dejavniki.
1.4.3. VPLIV GASTRINA NA APOPTOZO
Pri posameznikih, okuženih s H. pylori in hipergastrinemijo, so v želodčnem tkivu, odvzetem z biopsijo, opazili povišano celično apoptozo (14). Gastrin z vezavo na receptorje CCK-2 poveča dovzetnost normalnih želodčnih epitelijskih celic za apoptozo.
Po transfekciji s plazmidom, ki je nosil zapis za receptor CCK-2, in dodatkom gastrina je bila celična linija raka želodca MKN45 bolj dovzetna za apoptozo. Pri dodajanju antagonista receptorja CCK-2 in inhibitorja COX-2 je prišlo do zaviranja razmnoževanja in povečane apoptotske dejavnosti celic, kar nakazuje na to, da sta za razvoj raka potrebna tako povečano razmnoževanje kot tudi zmanjšanje apoptoze (27). Vloga gastrina v celični
4
apoptozi je torej odvisna od fizioloških in patoloških dejavnikov ter celičnega mikrookolja.
Za boljše razumevanje njegove vloge pri uravnavanju apoptoze so potrebne dodatne raziskave.
1.4.4. VPLIV GASTRINA NA INVAZIVNOST IN MIGRACIJO
Gastrin deluje na celične adhezijske molekule (npr. β-katenini, E-kadherin) z aktivacijo kinaze JAK2 ali premika kateninov v citoplazmo, kar vodi do rahljanja stikov med celicami, izgube celične adhezije in povečane migracije (28). Gastrin spodbuja izražanje matriksne metalopeptidaze 9 (MMP-9), encima, ki razgradi proteine zunajceličnega matriksa in aktivira citokine, vključene v preoblikovanje tkiva. Izražanje MMP-9 je povečano pri pacientih z želodčnim adenokarcinomom, kar se odraža v povišani celični invazivnosti in povečani migraciji celic (17, 29). Pri raku želodca so pretirano izraženi epidermalni rastni faktor (EGF) in njegovi receptorji (družina ErbB oziroma HER), ki uravnavajo celično rast in vplivajo na razmnoževanje in migracijo. Gastrin spodbuja povečano izražanje receptorjev EGFR oziroma HER1 in HER2 (30, 31). Prisotnost ligandov EGFR pri raku želodca korelira s stopnjo invazije in metastaziranjem v limfne vozle ter slabšim 5-letnim preživetjem (32).
Pri celični linija raka želodca AGS, ki ima izražen receptor CCK-2, so po dodatku gastrina- 17 zaznali povečano migracijo celic in vitro. Hitrost migracije je bila odvisna od koncentracije gastrina (14). Gastrin in CCK-2 skupaj spodbujata migracijo z aktivacijo signalne poti MAP-kinaz. S ko-kulturo celic AGS z receptorjem CCK-2 in celic AGS, označenih z zelenim fluorescentnim proteinom, so dokazali, da amidiran gastrin vsaj delno vpliva na migracijo po parakrini aktivaciji (14, 33).
1.5. ZUNAJCELIČNI VEZIKLI
Zunajcelični vezikli so sferični delci, obkroženi s fosfolipidnim dvoslojem, ki jih celice uravnavano sproščajo v zunajcelični prostor. So heterogena populacija membranskih veziklov in se nahajajo v vseh telesnih tekočinah (kri, likvor, urin, bronhoalveolarna lavaža, sinovijska tekočina, plodovnica, semenska tekočina, materino mleko, slina) ter v celičnem mediju celičnih kultur (34-39). Sestava zunajceličnih veziklov odraža sestavo izvorne celice in je odvisna od stanja v celici, kot na primer od stopnje diferenciacije, transformacije… (40).
5 1.5.1. VLOGA ZUNAJCELIČNIH VEZIKLOV
Glavna vloga zunajceličnih veziklov je medcelična komunikacija, saj v svoji notranjosti vsebujejo biološke molekule, kot so lipidi, proteini ter molekule mikro RNA (angl. micro RNA, miRNA) in mRNA (41), ki jih prenašajo med celicami in tkivi. Zunajcelični vezikli vplivajo na tarčne celice po treh mehanizmih: z neposrednim stikom, z endocitozo vezikla ali s fuzijo s celično membrano in sprostitvijo vsebine v citosol tarčne celice (42-44) (slika 1).
Slika 1: Privzem zunajceličnih veziklov (ZV) v tarčno celico.
Na tarčne celice delujejo v fizioloških in patoloških pogojih. Pomembno vlogo imajo pri hemostazi, delovanju imunskega odziva, razvoju in napredovanju rakavih obolenj ter nevrodegenerativnih boleznih – ti zadnji področji sta še posebej dobro raziskani (45-47).
Zunajcelični vezikli predstavljajo velik potencial kot vir bioloških označevalcev (biooznačevalcev) za številne bolezni (34, 48), kot terapevtska sredstva pri obnovi tkiv (49) in kot dostavni sistemi zdravilnih učinkovin (50, 51).
1.5.2. RAZVRŠČANJE ZUNAJCELIČNIH VEZIKLOV
Glede na mehanizem nastanka, velikost, izvor, sestavo in biološko vlogo delimo zunajcelične vezikle na podskupine. Najpogostejša je delitev po velikosti in mehanizmu nastanka v tri podskupine: eksosomi, mikrovezikli in apoptotska telesca (52) (slika 2).
Glede na izvorno celico se uporablja še izraz onkosomi, ki opisuje zunajcelične vezikle, ki jih izločajo rakave celice. Ker smo v naši raziskavi preučevali eksosome, mikrovezikle in onkosome, se bomo v nadaljevanju osredotočili na njihove značilnosti.
6
Slika 2: Prikaz velikosti zunajceličnih veziklov v primerjavi z mikrobi in celičnimi organeli, ustvarjen v programu Biorender (prirejeno po 40).
i. EKSOSOMI
Eksosomi so trenutno najbolj proučevana skupina zunajceličnih veziklov. Veliki so približno 30 do 100 nm. Nastajajo z notranjim uvihanjem membrane v poznih endosomih, nato dozorijo v multivezikularnih telescih; ta se nato zlijejo s plazemsko membrano in tako sprostijo eksosome v zunajcelični prostor (42, 53, 54) (slika 3). Eksosomi vsebujejo holesterol, ceramid, sfingomielin in fosfatidilserin (55). V notranjosti in na zunanji membrani imajo različne proteine, vpletene v membranski transport in fuzijo (npr.
GTPaze), stresne proteine (Hsp70, Hsp90), proteine, vpletene v biogenezo multivezikularnih telesc (Alix, TSG101) (56, 57), vsebujejo pa tudi molekule mRNA in miRNA (52).
Slika 3: Shematski prikaz biogeneze eksosomov.
ii. MIKROVEZIKLI
Mikrovezikli so delci velikosti 100 do 1000 nm in so po velikosti podobni bakterijam ali netopnim imunskih kompleksom (58). Nastanejo z brstenjem plazemske membrane navzven; torej se neposredno sproščajo v zunajcelični prostor. Njihova značilnost je, da imajo zaradi brstenja membrane fosfatidilserin na zunanji strani membrane (59, 60).
Značilen protein za mikrovezikle je ARF6 (ADP-ribozilacijski faktor 6), ki je ključen za brstenje mikroveziklov in je pomemben pri selektivnem vnosu tovora v mikrovezikle (61,
7
62). Proteini, značilni za mikrovezikle, so integrini, selektini, tetraspanini (npr. CD9), citokeratin 18 (CK 18) in aneksin A1 (62-65). V svoji notranjosti prenašajo še druge proteine, mRNA in miRNA (41, 66).
iii. ONKOSOMI
Tumorske celice spontano sproščajo velike zunajcelične vezikle, ki so povezani z napredovanjem rakavih bolezni. Ti vezikli, ki vsebujejo onkogeni material, se imenujejo onkosomi. Premer onkosomov je 1 do 10 µm. Nastajajo z brstenjem membrane kot mikrovezikli, zato tudi onkosomi vsebujejo ARF6, vendar brstijo z membrane živih rakavih celic, torej niso podobni apoptotskim telescem. Proteinski tovor onkosomov je drugačen od tovora v eksosomih in mikroveziklih ter ima drugačne funkcijske lastnosti (67-69). Najbolj zastopan protein v onkosomih je CK18, zato ga uporabljajo pri detekciji onkosomov v krvnem obtoku in tkivu rakavih bolnikov (70, 71). Proteini znotraj onkosomov so encimi, vključeni v metabolizem glukoze, glutamina in aminokislin; vsi ti metabolni procesi so ključni pri razvoju raka (72). Vsebujejo tudi metalopeptidaze in sodelujejo pri migraciji tumorskih celic znotraj čvrstih tkiv (67, 73).
1.6. ZUNAJCELIČNI VEZIKLI IN RAK ŽELODCA
Zunajcelični vezikli so vključeni v rast raka, angiogenezo, izogibanje imunskemu odzivu gostitelja in metastaziranje (slika 4).
Slika 4: Shematski prikaz vpliva zunajceličnih veziklov iz celic raka želodca na druge celice, ustvarjen v programu Biorender. (CAF-z rakom povezani fibroblasti oziroma aktivirani fibroblasti v tumorskem mikrookolju)
Ni še jasno, ali tumorji izločajo več zunajceličnih veziklov kot netumorske celice. Funkcija tumorskih veziklov je močno odvisna od mikrookolja tumorja. Za napredovanje tumorja je
8
potrebna komunikacija med rakavimi celicami, ter med rakavimi celicami in zdravimi celicami v tumorskem mikrookolju – zunajcelični vezikli horizontalno prenašajo proteine, tumorske miRNA, mRNA in onkogene lncRNA med celicami (66, 74-77).
1.6.1. VPLIV VEZIKLOV IZ CELIC RAKA ŽELODCA NA ANGIOGENEZO IN METASTAZIRANJE
Zunajcelični vezikli, izolirani iz celičnih linij raka želodca MKN74 in MKN45, spodbudijo migracijo in invazivnost prejemnih epitelijskih celic, nimajo pa vpliva na mezenhimske celice. Celice difuznega tipa raka želodca (celična linija KATO Ⅲ) nimajo vpliva na invazivnost epitelijskih celic, a zmanjšajo invazivnost prejemnih mezenhimskih celic.
Večji učinek na migracijo imajo zunajcelični vezikli, izolirani iz slabo diferenciranih celic raka želodca (78). Ti rezultati kažejo na to, da je učinek zunajceličnih veziklov na prejemne celice odvisen od histološkega tipa celic, ki izločajo zunajcelične vezikle.
9
2. NAMEN DELA IN HIPOTEZE
Namen magistrske naloge je preučiti vpliv z gastrinom spodbujenih zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celične linije raka želodca, na migracijo naivnih celic raka želodca in normalnih epitelijskih celic raka dojke. Z diferencialnim ultracentrifugiranjem bomo ločili zunajcelične vezikle na podskupine (eksosomi, mikrovezikli, onkosomi). Nato bomo preučili njihovo funkcionalno vlogo z migracijskimi testi na celičnih modelih naivnih rakavih in normalnih celic.
Hipoteze:
- Zunajcelični vezikli, spodbujeni z gastrinom in izolirani iz celične linije raka želodca MKN45, pospešijo migracijo naivnih celic raka želodca MKN45
- Zunajcelični vezikli, spodbujeni z gastrinom in izolirani iz celične linije raka želodca MKN45, pospešijo migracijo naivnih normalnih epitelijskih celic MCF- 10A
10
3. MATERIALI IN METODE
3.1. MATERIALI
3.1.1. CELIČNE LINIJE
Za raziskave smo uporabili celični liniji MKN45 (JCRB0254 MKN45; JCRB Cell Bank, Japonska) in MCF-10A (ATCC CRL-10317; dar UL MF, Inštituta za biokemijo in molekularno genetiko, Laboratorija za proučevanje molekularnih osnov in biokemijskih označevalcev hormonsko odvisnih bolezni; vodja: prof. dr. Tea Lanišnik Rižner). MKN45 so človeške celice adenokarcinoma želodca, ki so slabo diferencirane, okrogle oblike in rastejo pritrjene v monosloju ali skupkih, le redko v suspenziji. MCF-10A je celična linija normalnih epitelijskih človeških celic dojke, ki rastejo pritrjene v monosloju.
3.1.2. REAGENTI IN KEMIKALIJE
Preglednica I: Seznam uporabljenih reagentov in kemikalij
Reagenti/kemikalije Proizvajalec oziroma sestava kemikalije
Tekoči dušik Messer Slovenija, d.o.o., Ljubljana,
Slovenija / Istrabenz plini d.o.o., Koper, Slovenija
Dulbecco fiziološka raztopina s fosfatnim pufrom (angl. Dulbecco's phosphate buffered saline, DPBS)
Sigma-Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
0,25 % raztopina tripsina-EDTA (angl. Trypsin – EDTA)
Sigma-Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
Medij RPMI-1640 Sigma-Aldrich®, Merck KGaA,
Darmstadt, Nemčija
Fetalni goveji serum (angl. FBS) Sigma-Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
Antibiotik/antimikotik (penicilin, streptomicin/amfotericin B)
Gibco®, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, Ma, ZDA
GlutaMAX™-I (100x) Gibco®, Thermo Fisher Scientific
Inc. Waltham, Ma, ZDA
Človeški gastrin I Bachem AG, Bubendorf, Švica
Medij DMEM/F12 (DF-041-B) Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
Inzulin Sigma-Aldrich®, Merck KGaA,
Darmstadt, Nemčija Rekombinantni človeški epidermalni rastni faktor
(angl. Epidermal growth factor, EGF) (PHG0314)
Gibco®, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, Ma, ZDA
11 1 % goveji serumski albumin/DPBS (angl. bovine serum albumine/Dulbecco's phosphate buffered saline, BSA/DPBS)
Sigma-Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
Hidrokortizon Sigma-Aldrich®, Merck KGaA,
Darmstadt, Nemčija Tripansko modrilo 0,4 % (angl. Trypan Blue
Stain)
Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, Ma, ZDA
Dimetil sulfoksid Hybri-Max™ (angl. DMSO) (D2650)
Sigma-Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
Ultračista voda (qH2O) (angl. Ultra Pure™
Distilled water, DNA/RNA free)
Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, Ma, ZDA
Standardi za določanje koncentracije proteinov:
goveji serumski albumin (angl. Protein Assay BSA Set)
Pierce™, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, Ma, ZDA
Reagenta za določanje koncentracije proteinov (angl. BCA Protein Assay Kit)
Pierce™, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, Ma, ZDA
Etanol, 70 % Itrij d.o.o., Kropa, Slovenija
20 % saharoza (20 g saharoza/100 mL DPBS) Sigma-Aldrich® by Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
Barvilo Ponceau rdeče 0,1 % Ponceau rdeče, 5 % etanojska kislina
Barvilo Comassie modro 0,1 % Comassie modro, 50 %
metanol, 10 % etanojska kislina Raztopina proteinskih fragmentov z znanimi
molekulskimi masami BlueStar (proteinska velikostna lestvica)
NIPPON Genetics Europe, Düren, Nemčija
Pico-reagent za detekcijo Pt na membrani (angl.
SuperSignal™ West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate)
Thermo Fisher Scientific Inc.
Waltham, Ma, ZDA Femto-reagent za detekcijo Pt na membrani (angl.
Supersignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate)
Thermo Fisher Scientific Inc.
Waltham, Ma, ZDA
Ditiotreitol (angl. DTT), D1532 Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, Ma, ZDA
1-kratni lizirni pufer RIPA 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 0.5 % Na-deoksiholat (DOC), 0.1 % SDS, 50 mM Tris, pH=8.0
BD Horizon™ Karboksiflurescein sukcinimidil ester (BD Horizon™-CFSE)
BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA
12
3.1.3. MATERIALI IN LABORATORIJSKA OPREMA Preglednica II: Seznam materialov in laboratorijske opreme
Material/oprema Proizvajalec
Zamrzovalnik -20 ºC /
Zamrzovalnik -80 ºC /
Centrifuga MPW-260 MPW® Med. Instruments, Varšava, Poljska
Centrifuga 5910R Eppendorf Eppendorf, Hamburg, Nemčija
Centrifuga 5418R Eppendorf, Hamburg, Nemčija
Centrifuga Megafuge 16R, HERAEUS Thermo Scientific Inc. Waltham, MA, ZDA
Ultracentrifuga Optima XFN-80 Beckman Coulter®, Brea, CA, ZDA Mikrocentrifugirke z navojem za
zamrzovanje Crio-vial 2 mL
TPP®, Trasadingen, Švica Koničaste centrifugirke z navojem 15 mL,
50 mL
TPP®, Trasadingen, Švica Mikrocentrifugirke Protein LoBind® 1,5
mL
Eppendorf, Hamburg, Nemčija Ultracentrifugirke 30 mL s pokrovčki
(Optiseal polypropylene cent. tubes)
Beckman Coulter®, Brea, CA, ZDA Pipete 0,5-10 L, 1-2 L, 2-20 L, 20-200
L, 200-1000 L
Eppendorf, Hamburg, Nemčija Gilson, Inc., Middleton, WI, ZDA
Avtomatski pipetor S1 Pipet Filler Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA, ZDA
Serološki pipetni nastavki 10 mL, 25 mL TPP®, Trasadingen, Švica Aspiracijska pipeta 2 mL TPP®, Trasadingen, Švica Svetlobni mikroskop AE2000 Motic, Wetzlar, Nemčija
Inkubator HERAcel 150i (37 ºC, 5 % CO2) Thermo Scientific Inc. Waltham, MA, ZDA
Inkubator z vodno kopeljo (37ºC) GFL®, Burgwedel, Nemčija Komora z laminarnim pretokom zraka
Esco Class ⅡBSC, Airstream DUO
Esco, Singapur
Gojilne posode 150 TPP®, Trasadingen, Švica Gojilne posode z nagnjenim vratom T25,
T75, T300
TPP®, Trasadingen, Švica
Komora za štetje celic Countess Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc.
Waltham, MA, ZDA
Naprava za štetje celic Coutness Ⅱ Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc.
Waltham, MA, ZDA Ultrafiltracijske membrane Ultracel® -
100kDA
Merck Millipore Ltd., Merck KGaA, Darmstadt, Germany
13
Filtri PALL® Membrane PES 0,2 µm Pall Laboratory, MA, ZDA
Inkubator/stresalnik C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific Inc. Edison, NJ, ZDA
Mikrotitrska plošča 96F s 96 luknjicami TPP®, Trasadingen, Švica Mikrotitrska plošča 24 s 24 luknjicami TPP®, Trasadingen, Švica Vstavki za migracijske teste No. 80209 Ibidi GmBH Gräfelfing, Nemčija
Sterilna pinceta /
Mikroskop Incellis cell imager s kamero za slikanje mikrotitrskih ploščic
Bertin INSTRUMENTS, Montigny-le- Bretonneux, Francija
Čitalec mikrotitrskih plošč Synergy H4 BioTek™, Winooski, VT, ZDA Naprava za suho segrevanje/hlajenje
vzorcev v mikrocentrifugirkah CH-100
BIOSAN, Riga, Latvia
Spektrofotometer LAS4000 Fujifilm Life Science, NY, ZDA Polistirenske epruvete FALCON® 5mL Corning, NY, ZDA
BD FACSCanto™ Citometer BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA Velikostno kalibrirane fluorescentne
kroglice (fluorosfere), 2 µm in 3 µm (angl.
FluoSpheres™ Carboxylate-Modified Microspheres)
Thermo Scientific Inc. Waltham, MA, ZDA
BD™ kroglice z znano koncentracijo (335925), 1004 kroglic/µL
BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA Citokrom 18 konjugiran s fikoeritrinom
(PE) (ORB485481)
Biorbyt, St Louis, ZDA Naprava za optično sledenje posameznemu
delcu (angl. NTA) Nanosight NS300TM
Malvern Panalytical, Velika Britanija
3.1.4. MEDIJI ZA GOJENJE CELIČNIH KULTUR
i. V sterilnih posodah smo namešali vse sestavine, podane v preglednicah III in IV, vsebino premešali in medija shranili pri 4 °C.
Preglednica III: Medij za celično linijo MKN45
Sestavina Končna koncentracija v mediju
Medij RPMI-1640 /
FBS 10 %
Antibiotik/antimikotik 1 %
glutaMAX 1 %
14
ii. Preglednica IV: Medij brez seruma (FBS) za celice MKN45
Sestavina Končna koncentracija v mediju
Medij RPMI-1640 /
Antibiotik/antimikotik 1 %
glutaMAX 1 %
iii. Medij za izolacijo zunajceličnih veziklov za celice MKN45
Medij za izolacijo zunajceličnih veziklov smo pripravili podobno kot osnovni hranilni medij, s to razliko, da smo raztopini FBS predhodno odstranili vezikle, tako da smo jo 24 ur centrifugirali pri 100 000 x g, pri 4 °C v ultracentrifugi. Po centrifugiranju smo raztopino prefiltrirali skozi filter z velikostjo por 0,2 µm. Opisani medij smo uporabili za gojenje celic, ki so nam služile kot kontrola. Za izločanje zunajceličnih veziklov, spodbujenih z gastrinom, smo mediju dodali še gastrin s končno koncentracijo 10 nM.
iv. Medij za celično linijo MCF-10A
Medij za celično linijo MCF-10A smo pripravili tako, da smo 100 µg EGF v prahu dodali 1 % BSA/DPBS in premešali na mešalu. Mediju DMEM/F12 smo dodali inzulin, raztopino EGF v 1 % BSA/DPBS in hidrokortizon ter vsebino prefiltrirali skozi filter z velikostjo por 0,2 µm. Nato smo dodali še raztopino FBS in antibiotik/antimikotik (preglednica Ⅴ).
Pripravljen medij smo shranili pri 4 °C.
Preglednica V: Medij za celično linijo MCF-10A
Sestavina Končna koncentracija v mediju
Medij DMEM/F12 /
Inzulin 10 mg/mL
EGF 100 µg/mL
hidrokortizon 1 mg/mL
FBS 5 %
Antibiotik/antimikotik 1 %
3.1.5. PROTITELESA ZA PRENOS WESTERN
Za metodo prenos Western, s katerim smo določili proteinsko sestavo zunajceličnih veziklov, smo uporabili protitelesa za proteine, ki so značilni za zunajcelične vezikle in so navedeni v preglednici Ⅵ.
15
Preglednica VI: Seznam uporabljenih protiteles za prenos Western
Primarno mišje monoklono protitelo razreda IgG
Proizvajalec Končna redčitev
Alix (sc-53540) Santa Cruz Biotechnology Inc, Dallas, Tx, ZDA
1:1000 v 5 % mleku HSC 70 (sc-7298) Santa Cruz Biotechnology
Inc, Dallas, Tx, ZDA
1:500 v 5 % mleku Tsg 101 (sc-7964) Santa Cruz Biotechnology
Inc, Dallas, Tx, ZDA
1:1000 v 5 % mleku Citokeratin 18 (sc-32329) Santa Cruz Biotechnology
Inc, Dallas, Tx, ZDA
1:1000 v 5 % mleku CD 9 (sc-13118) Santa Cruz Biotechnology
Inc, Dallas, Tx, ZDA
1:500 v 5 % mleku Citokrom C (sc-13156) Santa Cruz Biotechnology
Inc, Dallas, Tx, ZDA
1:500 v 5 % mleku Sekundarno protitelo Proizvajalec Končna redčitev Proti-mišje (sc-525409) Santa Cruz Biotechnology
Inc, Dallas, Tx, ZDA
1:4000 v 5 % mleku
3.1.6. PUFRI IN RAZTOPINE ZA ELEKTROFOREZO IN PRENOS WESTERN
Za izvedbo metode prenos Western smo pripravili pufre in raztopine navedene v preglednici Ⅶ.
Preglednica VII: Seznam uporabljenih raztopin in njihova sestava
Pufri in raztopine Priprava
20 % saharoza 20 g saharoza/100 mL DPBS
20 % natrijev dodecilsulfat (angl.SDS) 20 g SDS/100 mL DPBS 5 % mleko za blokiranje membrane (50 mL) 2,5 g mleka v prahu
do 50 mL 1-kratni pufer TBS-Tween
10-kratni pufer TBS (1L) 24 g Tris
88 g NaCl dH2O
uravnati pH na 7,6 dodati dH2O do 1L
1-kratni pufer TBS-Tween (1L) 100 mL 10-kratni pufer TBS 900 mL dH2O
1 mL Tween 10-kratni pufer za izvedbo ELISE (1L)
(angl. running buffer)
30,275 g Tris 144 g glicin 50 mL 20 % SDS
16
dodati dH2O do 1L
redčimo z dH2O do 1-kratnega pufra 10-kratni pufer za prenos proteinov (1L)
(angl. transfer buffer)
30,275 g Tris 144 g glicin dodati dH2O do 1L 1-kratni pufer za prenos proteinov (1L)
(angl. transfer buffer)
100 mL10-kratni pufer za prenos proteinov
200 mL metanol 700 mL dH2O Nanašalni pufer za pripravo vzorcev za
prenos Western (angl. loading buffer)
NuPAGE® LDS Sample Buffer 4x NP0007, Invitrogen Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA, ZDA Razbarvalni pufer za gele 50 % dest. H2O, 40 % metanol, 10 %
etanojska kislina Blag pufer za odstranjevanje protiteles iz
membrane (1L)
15 g glicin 1 g SDS
10 mL Tween 20 dodati dH2O do 800 mL uravnati pH na 2,2 dodati dH2O do 1L Pufer za umerjanje pH metra (pH=7,00) Na₂HPO₄*2H₂O/K₂HPO₄ Pufer za umerjanje pH metra (pH=4,00) Citronska kislina/NaOH/HCl Pufer za umerjanje pH metra (pH=10,00) H3BO3/KCl/NaOH
3.1.7. PRIPRAVA GELA ZA POLIAKRILAMIDNO GELSKO ELEKTROFOREZO
Pomemben je vrstni red dodajanja raztopin, kot je naveden v preglednici VIII. APS in TEMED smo dodali v komori z laminarnim pretokom zraka. V originalnem predpisu navajajo 10 % SDS in 30 % akrilamid. V laboratoriju MCMB smo imeli 20 % SDS in 37,5
% akrilamid, zato smo prilagodili predpis tako, da smo upoštevali redčenje z destilirano vodo.
Preglednica VIII: Ločitveni (A.) in koncentracijski gel (B.) za poliakrilamidno gelsko elektroforezo in prenos Western
A.
Ločitveni gel, SDS PAGE, 12 % Količina za 2 gela (V=10 mL)
H2O 4,05 mL
Tris (pH= 8,8) 2,5 mL
10 % SDS 50 µL 20 % SDS + 50 µL H2O
37,5 % akrilamid 3,2 mL
APS 100 µl
TEMED 5 µl
17 B.
Koncentracijski gel, SDS PAGE, 12 % Količina za 2 gela (V=10 mL)
H2O 6,21 mL
Tris (pH= 6,8) 2,5 mL
10 % SDS 50 µL 20 % SDS + 50 µL H2O
37,5 % akrilamid 1,08 mL
APS 100 µl
TEMED 10 µl
3.2. METODE
3.2.1. PRIPRAVA CELIČNIH LINIJ (ODMRZOVANJE IN NASAJANJE CELIC)
Celice MKN45 (približno 3 milijone celic) so bile shranjene v mikrocentrifugirkah z navojem v raztopini FBS in DMSO v razmerju 9:1 in zmrznjene v tekočem dušiku.
Vsebino mikrocentrifugirke smo prenesli v centrifugirko z gojitvenim medijem RPMI- 1640, tako da smo raztopino celic počasi nadplastili v medij. Raztopino celic v mediju smo centrifugirali 5 minut pri 1000 x g pri sobni temperaturi, da smo odstranili DMSO. Po centrifugiranju smo odstranili supernatant in celice resuspendirali v 1 mL medija za celično linijo MKN45. Ustrezen volumen celic smo prenesli v gojilne posode T25, v katere smo predhodno dodali 5 mL medija. Celice smo inkubirali v inkubatorju pri 37 °C in v atmosferi s 5 % CO2. Enak postopek smo uporabili za celice MCF-10A, s to razliko, da smo uporabili gojitveni medij DMEM/F12.
3.2.2. GOJENJE CELIČNIH LINIJ MKN45 IN MCF-10A
Celice MKN45 in MCF-10A smo presadili, ko so dosegle 80 % preraščenost (konfluentnost). Običajno so to stopnjo dosegle po treh dneh gojenja pri 37 °C in v atmosferi s 5 % CO2. Medij za gojenje celic smo odpipetirali v centrifugirko, pritrjene celice sprali z raztopino DPBS in jim dodali raztopino tripsin-EDTA. Ko so se celice odlepile s površine, smo jih prestavili v centrifugirko z medijem za gojenje in centrifugirali 5 minut pri 1000 x g pri sobni temperaturi. Po centrifugiranju smo odstranili supernatant z aspiracijsko pipeto in celicam dodali 1 mL gojitvenega medija. Ustrezen volumen celic smo nasadili v gojitvene posode T75 ali gojitvene plošče 150 cm2, v katere smo dodali ustrezen medij za gojenje celic. Celice smo inkubirali v inkubatorju pri 37 °C in v atmosferi s 5 % CO2.
18 3.2.3. ŠTETJE CELIC
Štetje celic smo izvedli po centrifugiranju, ko smo jih ponovno resuspendirali v mediju ali DPBS. S serološko pipeto smo izmerili končni volumen resuspendiranih celic. Del zmesi celic v suspenziji smo odpipetirali v mikrocentrifugirko in jim dodali barvilo tripansko modrilo v razmerju 1:1. V komoro za štetje celic Countess smo odpipetirali 10 L te zmesi. Naprava za štetje celic Countess Ⅱ nam je podala celokupno koncentracijo celic v komori, pri čemer je bilo že upoštevano redčenje zaradi barvila, ter odstotek živih in mrtvih celic. Končno celokupno koncentracijo živih celic smo izračunali tako, da smo podatek o koncentraciji živih celic pomnožili s končnim volumnom, ki smo ga prej izmerili. Na podlagi tega podatka smo po potrebi redčili zmes celic.
3.2.4. TRETIRANJE CELIČNE LINIJE MKN45 Z GASTRINOM
Za pripravo poizkusa z gastrinom smo celično linijo MKN45 nasadili v gojišče za izolacijo zunajceličnih veziklov in dodali gastrin. Komercialni gastrin je v obliki prahu, zato smo ga raztopili v DPBS. V epruveto z gastrinom smo dodali raztopino DPBS, da se je gastrin raztopil in pazili, da pri dodajanju DPBS-a niso nastajali skupki. Nato smo tako raztopljeno zmes gastrina in DPBS še 5-krat redčili z DPBS do končne koncentracije 60 µM.
Raztopino gastrina v DPBS smo alikvotirali po 100 µL v mikrocentrifugirke in jih zamrznili pri -80 ºC. Mikrocentrifugirke, ki smo jih potrebovali za eksperiment, smo odtajali v ledeni kopeli.
Celice MKN45 smo najprej za 24 ur izpostavili mediju brez seruma (FBS). Nato smo z aspiracijsko pipeto odstranili gojišče brez seruma. Večina celic je bila pritrjenih na površino, prisotnih pa je bilo nekaj prosto plavajočih celic. Celic nismo spirali in celicam nismo dodajali tripsina, temveč smo v gojilne posode 150 cm2 dodali gojišče za izolacijo zunajceličnih veziklov in gastrin do končne koncentracije 10 nM. Za kontrolo smo pripravili celice MKN45, ki smo jih gojili v 16 mL gojišča za izolacijo zunajceličnih veziklov, brez dodatka raztopine gastrina. Celice smo inkubirali 48 ur pri 37 ºC v atmosferi s 5 % CO2, da so se v medij lahko izločili zunajcelični vezikli.
3.2.5. IZOLACIJA ZUNAJCELIČNIH VEZIKLOV
Medij z izločenimi zunajceličnimi vezikli smo prestavili v ustrezno označene centrifugirke in jih centrifugirali 5 minut pri 1000 x g pri sobni temperaturi, da smo odstranili celice in/ali celične ostanke. Supernatant z zunajceličnimi vezikli smo prestavili v nove, ustrezno
19
označene centrifugirke. Celice na ploščah smo sprali z DPBS in jim dodali raztopino tripsin-EDTA, da so se odlepile od podlage. Nato smo celice prešteli.
i. IZOLACIJA ONKOSOMOV
Centrifugirke z zunajceličnimi vezikli smo centrifugirali 10 minut pri 2800 x g pri 20 ºC.
Tako smo zagotovili, da so se na dno centrifugirke najprej posedli večji zunajcelični vezikli in onkosomi. Supernatant smo prenesli v nove centrifugirke za nadaljnje ločevanje zunajceličnih veziklov z ultracentrifugiranjem. Usedlini večjih zunajceličnih veziklov oziroma onkosomov smo dodali raztopino DPBS, ki smo jo predhodno prefiltrirali skozi filter s porami velikosti 0,2 µm. Nato smo celotno vsebino prenesli v mikrocentrifugirke, ki na stene ne vežejo proteinov. Mikrocentrifugirke smo centrifugirali 10 minut pri 2800 x g pri 20 ºC. Po centrifugiranju smo usedlino zunajceličnih veziklov na zunanji strani mikrocentrifugirke označili in previdno odstranili ves supernatant. Usedlini smo dodali 50 µL filtrirane raztopine DPBS in vzorce shranili pri -80 ºC.
ii. IZOLACIJA MIKROVEZIKLOV
Centrifugirke s supernatantom, ki smo ga pridobili po prvem centrifugiranju raztopine zunajceličnih veziklov, smo centrifugirali v ultracentrifugi 30 minut pri 10 000 x g pri 4 ºC. Po centrifugiranju smo označili položaj usedline mikroveziklov na zunanji strani mikrocentrifugirke in hitro prenesli večino supernatanta v nove centrifugirke. Iz centrifugirke z usedlino mikroveziklov smo previdno odstranili ves preostali supernatant.
Nato smo tej usedlini dodali 50 µL filtrirane raztopine DPBS in centrifugirke shranili v ledeni kopeli. Z mešanjem s pipeto smo razbili skupke mikroveziklov in vzorce prenesli v mikrocentrifugirke, ki na stene ne vežejo proteinov, in jih shranili pri -80 ºC.
iii. IZOLACIJA EKSOSOMOV
Za izolacijo eksosomov smo najprej pripravili ultracentrifugirke s 5,6 mL raztopine 20 % saharoze. Supernatant z eksosomi, ki smo ga pridobili po drugem centrifugiranju raztopine zunajceličnih veziklov, smo najprej prefiltrirali, da smo se znebili možnih nečistoč in večjih veziklov, in nato še koncentrirali vzorce pri 4000 x g in 20 ºC do končnega volumna okoli 20 mL. Nato smo počasi dodali vzorce v ultracentrifugirke s predpripravljeno raztopino 20 % saharoze tako, da se raztopini supernatanta z eksosomi in saharoze nista zmešali. Centrifugiranje smo izvedli v ultracentrifugi, v vakuumu pri 100 000 x g in 4 ºC.
Čas centrifugiranja je bil 2h in 15 minut. Usedlino eksosomov smo označili na zunanji strani centrifugirke in z aspiracijsko pipeto odstranili ves supernatant. Dodatno smo
20
odrezali vrhove ultracentrifugirk, zato da smo s papirnato brisačo previdno obrisali odvečno gojišče, nato smo odrezane ultracentrifugirke položili v posodo z ledom. Usedlini eksosomov smo dodali 50 µL filtrirane raztopine DPBS in mešanico inkubirali v posodi z ledom 30 minut. Med inkubacijo smo mešanico večkrat premešali s pipeto. Po 30 minutah smo raztopine eksosomov prestavili v mikrocentrifugirke, ki na stene ne vežejo proteinov, in jih shranili pri -80 ºC.
Slika 5: Shema celotne izvedbe poizkusa (ZV-zunajcelični vezikli, gastrin-označuje celice, z dodanim gastrinom v gojišču).
3.2.6. MERJENJE KONCENTRACIJE PROTEINOV
Za merjenje koncentracije proteinov smo uporabili predhodno pripravljene reagente za določanje koncentracije proteinov (angl. BCA protein assay kit). Za pripravo umeritvene krivulje smo izbrali standardne raztopine s koncentracijami 2000 µg/mL, 1500 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL in 125 µg/mL. Reagenta A in B, ki sta del kompleta reagentov za določanje koncentracije proteinov (angl. BCA protein assay kit), smo zmešali v razmerju 50:1. Nato smo v luknjice 96-mestne mikrotitrske ploščice prenesli po 200 µL mešanice reagentov A in B. Mikrocentrifugirke z vzorci zunajceličnih veziklov smo pred nanosom v mikrotitrsko ploščico za kratek čas centrifugirali pri 4 ºC, da smo se znebili skupkov veziklov. Nato smo v mikrotitrsko ploščo dodali po 5 µL standardih raztopin z znanimi koncentracijami proteina, po 5 µL qH2O, DPBS in pufra RIPA, ki so služile kot negativne kontrole. Nato smo nanesli po 5 µL raztopin vzorcev zunajceličnih veziklov, raztopljenih v DPBS, za določanje koncentracije zunajceličnih veziklov za migracijske teste, in po 5 µL raztopin vzorcev zunajceličnih veziklov, raztopljenih v pufru RIPA, za določanje
21
koncentracije zunajceličnih veziklov za prenos Western. Mikrotitrsko ploščo smo zavili v aluminijasto folijo in jo 30 minut inkubirali pri 37 ºC. Po inkubaciji smo v spektrofotometru Synergy H4 izmerili absorbance v vidnem spektru pri valovni dolžini 562 nm. Iz podatkov o izmerjeni absorbanci, smo izračunali mase in koncentracije proteinov na površini veziklov po enačbi: y=ax+b, kjer x predstavlja maso proteinov.
Koncentracijo proteinov [µg/µL] smo izračunali tako, da smo maso proteinov delili z volumnom vzorca v luknjici. Končne volumne vzorcev veziklov smo izmerili s pipeto, saj smo ta podatek potrebovali za izračun koncentracije.
3.2.7. PRENOS WESTERN
Prenos Western je semi-kvantitativna metoda za določanje in opredelitev velikosti specifičnih proteinov. Prvi korak je izločanje proteinov iz zunajceličnih veziklov s pomočjo lizirnega pufra RIPA in priprava gela. Sledi nanos vzorcev na gel, elektroforezna ločba proteinov, prenos proteinov na nitrocelulozno membrano. Pri prenosu proteinov gre za zrcalno migracijo proteinov z gela na nitrocelulozno membrano, pod mokrimi pogoji.
Zadnji korak je kemiluminiscentna detekcija proteinov s specifičnimi primarnimi in sekundarnimi protitelesi.
Najprej smo pripravili ločitveni in koncentracijski gel po zgoraj opisanem postopku (preglednica ⅤⅢ), nato pa smo pripravili vzorce. V mikrocentrifugirke, ki na stene ne vežejo proteinov, smo za en vzorec napipetirali 5 µL nanašalnega pufra (angl. loading buffer), 14 µL vzorca in 1 µL DTT, v tem vrstnem redu, ter vsebino hitro premešali na mešalu za epruvete in pripravljene vzorce 10 minut segrevali pri 70 °C. V luknjice v gelu smo nanesli 2,5 µL vzorca proteinske velikostne lestvice in po 20 µg vzorca.
Poliakrilamidno gelsko elektroforezo smo izvajali 10 min pri 150 V v pufru za elektroforezo (angl. running buffer). Nato smo izvedli prenos proteinov na membrano v 1- kratnem pufru za prenos proteinov (angl. transfer buffer). Postopek smo izvajali pri 100 V, 1 uro in 15 min.
3.2.8. DETEKCIJA PROTEINOV PO PRENOSU WESTERN
Po prenosu proteinov smo odstranili gel in membrano. Membrano smo barvali s Ponceau rdečim barvilom približno 10 minut, nato smo jo spirali z destilirano vodo. Ko smo odstranili barvilo, smo membrano potopili v 5 % mleko in jo nežno stresali na stresalniku za 1 uro. Membrano smo razrezali in na različne dele dodali različna primarna mišja protitelesa, ter membrano stresali 24 ur pri 4 °C. Membrano oziroma dele membran smo
22
odstranili iz raztopine primarnih protiteles in jo/jih spirali z 1-kratnim pufrom TBS-Tween približno 30 minut. Na vsak del membrane smo dodali sekundarno proti-mišje protitelo in jih stresali 2 uri. Po koncu smo odstranili sekundarno protitelo, dele membran spirali z 1- kratnim pufrom TBS-Tween približno 30 minut in nato s kemiluminiscenco detektirali proteine na membrani s kompletom reagentov Pico ali Femto.
3.2.9. OPTIČNO SLEDENJE POSAMEZNEMU DELCU (ANGL. NTA)
S to metodo analiziramo delce v suspenziji, glede na analizo Brownovega gibanja, v realnem času. Metoda je primerna za delce velikosti od 50 do 1000 nm. V primeru, da imamo znan tudi volumen vzorca, lahko določimo še koncentracijo delcev. S posebnim računalniškim algoritmom hkrati sledimo gibanju posameznih delcev v realnem času tako, da snemamo video približno v 30 sekundnih intervalih. S programsko opremo nato določimo velikost posameznega delca. Za določanje koncentracije izvedemo kalibracijo, s setom standardov znanih velikosti in koncentracij, in na podlagi volumna vzorcev, ki smo jih vnesli v napravo, izračunamo še koncentracijo (79).
Z napravo Nanosight NS300TM smo izvedli analizo mikroveziklov in eksosomov. V mikrocentrifugirko, ki na stene ne veže proteinov, smo napipetirali 5 µL vzorca in ga redčili v 995 µL filtriranega DPBS ter vsebino premešali na mešalu. Najprej smo posneli video za filtriran DPBS, nato pa smo še za vsak vzorec posneli 5 videov; vsak je bil dolg 60 s. Vse meritve smo izvedli s kamero na nivoju 14, s pragom 5, pri temperaturi 25 °C.
Detekcijo in analizo vzorcev smo izvedli s programom NTA 3.4 – Sample Assistant Build 3.4.4-SA.
3.2.10. PRETOČNA CITOMETRIJA
Pretočna citometrija je tehnika, s katero analiziramo lastnosti posameznih delcev, v suspenziji, ki drug za drugim prehajajo ozek snop laserske svetlobe (80). Količina prejete svetlobe na fotodetektorju FSC (angl. forward scatter) in fotodetektorju SSC (angl. side scatter) je sorazmerna z velikostjo in granuliranostjo (kompleksnostjo) delca. Delce lahko dodatno označimo s fluorescenčnimi barvili in tako pridobimo dodatne informacije o delcih. Podatke prikažemo s točkovnim diagramom (81). Za določanje značilnosti naših vzorcev smo izbrali karboksifluorescein sukcinimidil ester (CFSE) (521 nm), ki sveti zeleno in protitelo CK18, ki je konjugirano s fikoeritrinom (PE) (576 nm) in sveti oranžno (82). Lastnost CFSE, da pasivno difundira skozi membrano, tam pa se hidrolizira z
23
znotrajcelično esterazo in tako postane fluorescenten, smo izkoristili za jasno razlikovanje zunajceličnih veziklov z intaktno membrano od celičnega drobirja (83).
S pretočnim citometrom lahko dobro ovrednotimo delce večjih velikosti, zato smo s to metodo analizirali onkosome in mikrovezikle, ne pa eksosomov. Najprej smo naredili optimizacijo protokola in ugotovili, da se tako onkosomi kot tudi mikrovezikli lepo barvajo s 4,5 µM raztopino CFSE, ki je specifična za proteine. Za označevanje CK18 smo izbrali monoklonsko protitelo anti-CK18, označeno s PE. Za CK18 smo se odločili, ker se je to protitelo, v predhodnih poizkusih prenosa Western, izkazalo kot najbolj specifično za določanje onkosomov in mikroveziklov (neobjavljeni rezultati, Pia Pužar Dominkuš).
Preverili smo tudi avtofluorescenco onkosomov in mikroveziklov in ugotovili, da je zanemarljivo majhna. Uporabili smo dvojno barvanje, da smo ločili med zunajceličnimi vezikli in proteinskimi agregati, ki lahko motijo analizo. V prvem koraku smo z mešanico velikostno kalibriranih flourescentnih kroglic (fluorosfere), velikosti 2 µm (nizka svetilnost) in 3 µm (srednja in močna svetilnost), določili, kje na točkovnem diagramu se nahajajo onkosomi in mikrovezikli. V mikrocentrifugirkah, ki na stene ne vežejo proteinov, smo pripravili po 25 µL vzorcev in jih 4-krat redčili s filtrirano raztopino DPBS.
Vsebino smo nežno premešali na mešalu. 50 µL redčenih vzorcev smo prenesli v nove mikrocentrifugirke. Vzorcem smo dodali 7,5 µL raztopine CK18 in raztopino CFSE v končni koncentraciji 4,5 µM ter vsebino premešali na mešalu. Vzorce smo 20 minut inkubirali v temi pri sobni temperaturi. Nato smo vzorce mikroveziklov centrifugirali 30 minut pri 10 000 x g pri 4 °C, vzorce onkosomov pa 10 minut pri 2800 x g pri 4 °C.
Supernatant smo previdno odstranili in vzorce resuspendirali v filtrirani raztopini DPBS do končnega volumna 150 µL. Vzorce smo prenesli v polistirenske epruvete in premešali vsebino. Za določanje koncentracije veziklov smo vzorcem dodali še kroglice z znano koncentracijo; 10 µL za onkosome in 50 µL za mikrovezikle. Koncentracijo posameznih veziklov smo izračunali po formuli navedeni v sliki 6.
Slika 6: Enačba za določanje koncentracije mikroveziklov in onkosomov, s pomočjo fluorescenčnih kroglic znanih koncentracij. (ZV-zunajcelični vezikli; v tem primeru onkosomi ali mikrovezikli, R-redčitev, N-število, V- volumen, FS-fluorescenčne kroglice znane koncentracije, c-koncentracija)
